CN103554242B - 七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用 - Google Patents
七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用，所述七鳃鳗李蛋白本发明是从七鳃鳗李氏小体的细胞培养液中分离提纯的纯天然蛋白，命名七鳃鳗李蛋白（Li proteins），具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain ），可通过异源表达系统表达合成七鳃鳗李蛋白重组蛋白，不但具有肿瘤细胞特异性杀伤功能，而且不损伤正常细胞，对人体无副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，尤其是一种能够特异性杀伤肿瘤细胞且具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）的七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。
背景技术
世界卫生组织预计：至2030年全球每年的癌症死亡人数将可能在现有的基础上增加一倍，届时每年将有1700万人死于癌症。虽然人们对肿瘤发生和恶化的认识不断提高，也有大量文献报道在肿瘤治疗领域取得了一些重大突破，然而，至今仍然没有一种安全有效的药物用于肿瘤疾病的预防及治疗，因此肿瘤常被喻为“不治之症”。
七鳃鳗与盲鳗是现存最古老的脊椎动物，特殊的进化地位和独特的生活习惯造就了七鳃鳗独有的生命特征。七鳃鳗做为一种新的发育和进化生物学模式动物，最为代表性的特征是具有完善的适应性免疫系统，其核心免疫分子可变淋巴细胞受体几乎可以与有颌类脊椎动物的免疫球蛋白相媲美。七鳃鳗李氏小体位于七鳃鳗背部脊柱的正上方，由第三鳃孔起，终至第二背鳍前端。组织内有多种不同类型的细胞并含有丰富的脂肪成分，该组织分泌丰富的调节因子及其它功能蛋白，随血液循环运至全身。近年来大量实验数据表明，七鳃鳗李氏小体是免疫防御系统中最重要的免疫器官，尤其是在适应性免疫系统中发挥重要作用。但是，迄今为止没有关于从七鳃鳗李氏小体细胞培养液中分离得到的具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）蛋白及此蛋白应用于制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种能够特异性杀伤肿瘤细胞且具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）的七鳃鳗李蛋白、制备方法及在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。
本发明的技术解决方案是：一种七鳃鳗李蛋白，其特征在于是从七鳃鳗李氏小体细胞培养液分离得到的蛋白，所述蛋白具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）。
上述七鳃鳗李蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a．取新鲜的李氏小体，放入胰蛋白酶中4℃过夜消化；
b. 收集消化后的细胞，PBS清洗两次；
c．转入无血清的1640培养液中培养72小时；
d. 收集七鳃鳗李氏小体细胞的培养液，加入终浓度为2 mmol/L的苯甲基磺酰氟；
e．以0.1 M KCl/ buffer A（20 mM KPB, 5% Glycerol, pH 7.0）为透析液，在4℃条件下对所收集的细胞培养液透析2 hr~O/N，共透析3次；
f．透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤；
g. 将过滤后样品上样至柱体积为10 ml的Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm羟基磷灰石吸附层析柱中，线性梯度洗脱 0～250 mM KPB pH7.0/0.1 M KCl / buffer A ，流速为1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，共80管；
h．合并第8~23管洗脱液，置于1L buffer B（20 mM Tris-HCl, 5% Glycerol, pH 8.0）中4℃下透析，2 hr~O/N更换一次透析液，共透析3次；
i．透析后的样品通过0.45 μm滤膜过滤；
j．取20 ml Q Sepharose Fast Flow（购自GE Healthcare）填料灌装层析柱，用于对上一步样品进行离子交换层析，将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱 0～0.3 M KCL / buffer B ，流速1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，80管；
k．收集29-35管，使用PBS透析2 hr~O/N，共透析3次，得到产物即为纯化的七鳃鳗李蛋白，具有一个凝集素结构域和一个成孔毒素结构域。
所述的七鳃鳗李蛋白在制备预防和治疗肿瘤疾病药物中的应用。
所述七鳃鳗李蛋白的重组蛋白以及对七鳃鳗李蛋白进行分子修饰、突变、截短或七鳃鳗李蛋白与其它分子或多肽融合改造后的蛋白在制备预防和治疗及肿瘤疾病药物中的应用。
本发明是从七鳃鳗李氏小体的细胞培养液中分离提纯的纯天然蛋白，是一种免疫蛋白（lampery immune protein，简称Li protein ）,命名七鳃鳗李蛋白，具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain ），可通过异源表达系统表达合成七鳃鳗李蛋白重组蛋白，不但具有肿瘤细胞特异性杀伤功能，而且不损伤正常细胞，对人体无副作用。
附图说明
图1是本发明实施例天然七鳃鳗蛋白对肿瘤细胞的作用效果图。
图2是对照组未处理的肿瘤细胞在显微镜下的细胞形态图。
图3是本发明实施例重组蛋白对肿瘤细胞的作用效果图。
图4是本发明实施例对不同类型细胞的杀伤率示意图。
具体实施方式
1．七鳃鳗李氏小体分泌总蛋白的制备：
a．解剖活的成体七鳃鳗，获得新鲜的李氏小体；
b．PBS清洗除去李氏小体组织中残留的血液；
c．用剪刀将李氏小体切成1mm3的小块，放入胰蛋白酶中4℃过夜消化；
d．次日收集消化后的细胞，PBS清洗两次；
e．转入无血清的1640培养液中，待细胞分泌可溶蛋白；
f．72小时后收集七鳃鳗李氏小体细胞的培养液，经冷冻干燥制成干粉。
2．七鳃鳗李蛋白（Li proteins）的分离纯化
a．以200 ml的蒸馏水溶解总蛋白干粉，得到含有李蛋白的总蛋白溶液；
b．向总蛋白溶液中加入终浓度为2 mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF），防止总蛋白中的蛋白酶使Li proteins降解；
c．以0.1 M KCl/ buffer A（20 mM KPB, 5% Glycerol, pH 7.0）为透析液，在4℃条件下对总蛋白溶液透析2 hr~O/N，共透析3次；
d．透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤除去杂质；
e．准备好柱体积为10 ml的Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm羟基磷灰石吸附层析柱；
f．将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱 0～250 mM KPB pH7.0/0.1 M KCl / buffer A ，流速为1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，共80管；
g．李蛋白分布于第8~23管，合并含有李蛋白的洗脱液，置于1L buffer B（20 mM Tris-HCl, 5% Glycerol, pH 8.0）中4℃下透析, 2 hr~O/N更换一次透析液，共透析3次；
h．透析后的样品通过0.45 μm滤膜过滤除去杂质；
i．取20 ml Q Sepharose Fast Flow（购自GE Healthcare）填料灌装层析柱，用于对上一步样品进行离子交换层析；
j．将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱 0～0.3 M KCL / buffer B ，流速1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，80管；
k．收集29-35管，即为纯化的七鳃鳗李蛋白（Li proteins），使用PBS透析2 hr~O/N，透析3次后分装，置于-80℃保存待用。
按照现有技术的方法，对所得蛋白进行测序，序列中具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain）。
3．七鳃鳗李蛋白重组蛋白（rLi proteins）的表达及纯化
rLi protein的异源表达可以为原核表达系统，也可以是真核表达系统（如酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统）；所选取的表达载体可以为原核表达载体（如pET系列和pCold系列等），也可以是真核表达载体。本实施例优选大肠杆菌原核表达系统，优选pColdⅠ表达载体，高效获得重组蛋白rLi protein。
4．实验
（1）显微镜观察本发明实施例蛋白样品对肿瘤细胞的杀伤作用
a. 前一天将1×105的 人乳腺癌细胞（MCF-7）平铺在24孔板中；
b. 次日，向孔中分别加入本发明制备的七鳃鳗李蛋白（Li proteins）及其重组蛋白样品，至培养液中样品蛋白终浓度为2 ng/ml，对照组中加入等体积的PBS；
c. 37 ℃培养箱作用10 min，光学显微镜观察对癌细胞具有显著杀伤作用。
本发明实施例七鳃鳗李蛋白及其重组蛋白对人乳腺癌细胞（MCF-7）作用后，用OLYMPUS数码相机拍摄的图片分别如图1、图2所示，与对照组图3相比，出现细胞膜出泡膨胀，胞浆内容物外泄，最终细胞破裂死亡。说明七鳃鳗李蛋白及其重组蛋白对人乳腺癌细胞具有显著的杀伤作用。
（2）流式细胞术检测七鳃鳗李蛋白对不同类型细胞的杀伤率
a．将人乳腺癌细胞（MCF-7）、人红白血病细胞（K562）、人前列腺细胞（DU145）、人结肠癌细胞（HT-29）、宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞（SMMC-7721）、人胃粘膜细胞（GES-1）、人肺上皮细胞（L132）八种不同类型细胞培养至细胞数量达到1×106；
b．向细胞培养液中加入本发明实施例的七鳃鳗李蛋白至终浓度为2 ng/ml，37 ℃培养箱作用10 min；
c．收集作用后的细胞，悬浮细胞1000×g离心5 min收集，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心收集；
d．收集的细胞用PBS重悬再离心，重复两次清洗细胞；
e．加入500μl的PBS悬浮细胞；
f．向细胞悬液加入10μl碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，避光冰浴放置10min；
g．流式细胞术检测PI染色的细胞即为坏死的细胞，统计坏死细胞占总细胞比率，即为七鳃鳗李蛋白对不同类型细胞的杀伤率。
如图4所示，本发明实施例七鳃鳗李蛋白对人乳腺癌细胞（MCF-7）、人红白血病细胞（K562）、人前列腺细胞（DU145）、人结肠癌细胞（HT-29）、宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞（SMMC-7721）六种细胞具有较高的杀伤率；但是七鳃鳗李蛋白对正常人组织的细胞例如人胃粘膜细胞（GES-1）和人肺上皮细胞（L132）没有任何杀伤作用。说明七鳃鳗李蛋白对肿瘤细胞具有特异的杀伤作用，而对正常人的细胞没有作用。
Claims (2)
1.一种七鳃鳗李蛋白的制备方法，所述七鳃鳗李蛋白是从七鳃鳗李氏小体细胞培养液分离得到的蛋白，所述蛋白具有一个凝集素结构域（Jacalin_like domain）和一个成孔毒素结构域（Pore-forming toxin_like domain），其特征在于按如下步骤进行：
a．取新鲜的李氏小体，放入胰蛋白酶中4℃过夜消化；
b. 收集消化后的细胞，PBS清洗两次；
c．转入无血清的1640培养液中培养72小时；
d. 收集七鳃鳗李氏小体细胞的培养液，加入终浓度为2 mmol/L的苯甲基磺酰氟；
e．以0.1 M KCl/ buffer A为透析液，在4℃条件下对所收集的细胞培养液透析2~12小时，共透析3次；
f．透析后的样品通过0.45μm滤膜过滤；
g. 将过滤后样品上样至柱体积为10 ml的Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm羟基磷灰石吸附层析柱中，线性梯度洗脱 0～250 mM KPB pH7.0/0.1 M KCl / buffer A ，流速为1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，共80管；
h．合并第8~23管洗脱液，置于1L buffer B中4℃下透析，2 ~12小时更换一次透析液，共透析3次；
i．透析后的样品通过0.45 μm滤膜过滤；
j．取20 ml Q Sepharose Fast Flow填料灌装层析柱，用于对上一步样品进行离子交换层析，将过滤后样品全部上样，线性梯度洗脱 0～0.3 M KCl / buffer B ，流速1.0 ml/min，分管收集2.5 ml/管，80管；
k．收集29-35管，使用PBS透析2 ~12小时，共透析3次，得到产物即为纯化的七鳃鳗李蛋白。
2.一种如权利要求1所述方法制备的七鳃鳗李蛋白在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，其特征在于是在制备治疗乳腺癌、白血病、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌或肝癌药物中的应用。
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