CN111041102A - 一种对d-柠檬烯混合物抗肿瘤活性敏感患者的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及受到d‑柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合的筛选方法，还涉及基因构成集合，定义为基因差异指标，提供基于上述基因构成集合评估癌症患者是否对d‑柠檬烯混合物敏感的计算方法，步骤如下：1)分别检测所述基因构成集合中每个基因在癌与癌旁组织中的表达值；2)计算同一个基因在癌与癌旁组织的基因表达差异比值，后经自然对数处理，得到患者差异基因指标；3)计算基因差异指标和患者差异基因指标的乘积；4)所述乘积经过符号函数处理后，计算所有基因差异乘积符号加和；所述加和对应一个癌症患者，根据计算得到的加和值判断患者是否对d‑柠檬烯混合物抗癌效用敏感。本发明方法能够筛选到对所述d‑柠檬烯混合物抗癌效用敏感的患者。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种对d-柠檬烯混合物抗肿瘤活性敏感患者的筛选方法。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一。恶性肿瘤生长速度快，呈侵润性生长，易发生出血、坏死、溃疡，并常伴有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热及严重的脏器功能受损，最终造成患者死亡。之前的研究显示以d-柠檬烯混合物为主要成份的混合物有一定治疗肿瘤效用，但在人群试验上的结果始终未能达到预期，随着精准医学发展，研究个人的基因表达情况能够为后续的疾病指导提供重要信息。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种对d-柠檬烯混合物抗肿瘤活性敏感患者的筛选方法，以为后续的疾病指导提供重要信息。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案一：提供一种受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合的筛选方法，具体包括以下步骤：
1)经过d-柠檬烯混合物处理后的腺癌细胞系与无d-柠檬烯混合物处理对照细胞系对比，计算得到受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因集合；
2)通过人群数据，比较一定年限内死亡与存活患者的差异基因，在步骤1)所述受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因集合基础上，暴露和生存相关、且功能一致的基因集合；
3)通过对步骤2)所得基因功能分析，保留与d-柠檬烯混合物生物功能一致的基因集合，即为最终的受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合，即差异基因集合。
在本发明的一个实施方式中，所述d-柠檬烯混合物生物功能包括促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤细胞侵袭等功能。
本发明的技术方案二：提供基于上述筛选方法得到的受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合。
所述基因构成集合的名称和对应的基因差异指标下表所示
表中，FC为差异表达基因上调倍数；logFC值为对应差异比值的自然数对数，称为d-柠檬烯混合物影响的基因差异指标(DGDI)，FDR为false discovery rate，含义是错误发现率。
本发明的技术方案三：提供基于上述基因构成集合评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法，主要步骤如下：
1)分别检测所述基因构成集合中每个基因在癌与癌旁组织中的表达值；
2)计算同一个基因在癌与癌旁组织的基因表达差异比值，后经自然数对数处理，得到患者差异基因指标的表述方式(也为logFC值)；
3)计算基因差异指标和患者差异基因指标的乘积；
4)所述乘积经过符号函数处理后，计算所有基因差异乘积加和(评估得分)；所述加和对应一个癌症患者，根据计算得到的加和值判断患者是否对d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中基因在癌与癌旁组织中的表达值包括TPM、FPKM、芯片数据、reads counts等描述基因表达的数据值。
在本发明的一个实施方式中，所述癌与癌旁组织可以取自手术或活检中获得的癌与癌旁组织。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，所述加和越小，所述d-柠檬烯混合物对患者的效用越明显。
本发明的技术方案四：基于上述基因构成集合、以及评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法，提供一种筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备，所述医疗设备含有所述基因构成集合。
进一步的，所述医疗设备含有关于评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法的说明书。
进一步的，所述医疗设备为试剂盒。
进一步的，所述癌症优选肺腺癌。
本发明的技术方案五：提供筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备的应用，所述筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备在筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用方面的应用。
进一步的，所述癌症优选肺腺癌。
进一步的，d-柠檬烯混合物中以d-柠檬烯为核心药用成分，还含有其他必须的助剂。
进一步的，d-柠檬烯混合物中，还可以含有其它抗肿瘤药物，其它抗肿瘤药物包括顺铂和/或雷帕霉素。
进一步的，d-柠檬烯混合物中，还可以含有具有抗肿瘤活性的黄酮或生物碱等成分。
与现有技术相比，本发明从个人的基因转录表达信息设计了相关的筛选方法，能够筛选到对所述d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感的患者，继而可以提升d-柠檬烯混合物在提升癌症患者生存时间的效用。
附图说明
图1.基因构成集合在H1975细胞系中的表达情况；
图2.基因构成集合在A549细胞系中的表达情况。
图3.患者筛选流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
d-柠檬烯混合物对基因构成集合的作用
所用A549、H1975细胞购于中国科学院上海生命科学研究院保藏中心，37℃、5％CO2培养箱中培养。
主要溶液的配置(所有溶液配置用水均为超纯水)：
(1)细胞培养基(完全培养基)：DMEM培养基(高糖无血清)+10％FBS(胎牛血清)+1％PIS(双抗)，即体积比为89：10：1；封口膜封口，4℃保存备用。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：KH2PO4 0.20g、Na2HPO4.12H2O 3.56g、NaCl 8.00g、KCl0.20g，加超纯水至1000ml，调PH至7.2～7.4，高压灭菌4℃保存。
而其余未具体说明的原料、工艺、仪器以及操作方法等均为本领域的常规市售原料或常规技术。
1.1实验方法
(1)细胞培养
1)细胞复苏
①从-80℃冰箱中取出分别装有A549、H1975细胞的冻存管，立即投入37℃温水中，并摇动，使其快速融化。
②待冻存液完全溶解，吸出细胞悬液，加入到细胞培养基中，吹打均匀，1000rpm*3min离心；
③弃去上清液，加入10ml培养基，吹打细胞，移入10mm培养皿，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。
2)细胞培养
①细胞生长于含有10％FBS的DMEM培养基中，置于含5％CO2、37℃培养箱中培养；2天换液传代一次，实验时取对数生长期细胞；
②细胞传代：待细胞长满培养皿时，弃去培养液，PBS冲洗一次，向培养皿中加入胰蛋白酶1ml，摇动培养皿，使胰酶均匀分布；放入培养箱2min，加入完全培养基终止消化，吹打细胞，分装至3个培养皿中。
(2)检测组合物对肿瘤细胞的增殖抑制效果
1)将对数生长期细胞用胰酶消化后，用完全培养基终止消化并稀释至80000细胞/ml，将细胞加入96孔板中，每孔100μl；放入培养箱培养。
2)培养24h后将96孔板取出，加入含药培养基，并设置阴性对照组，每个给药组设三复孔，含药培养基的配置方法为：
①将DMSO用培养基稀释为含1％DMSO的培养基溶液。
②将d-柠檬烯混合物用DMSO进行稀释，使d-柠檬烯混合物在DMSO中的体积百分比为0.25％，将含d-柠檬烯混合物的DMSO溶液用培养基稀释100倍，使d-柠檬烯混合物在含药培养基中的体积百分比为0.0025％。
5)加入含药培养基处理48小时后，各组分别提取3份A549、H1975细胞的总RNA并分离出来，随后对所提取RNA进行全转录组二代测序。测序数据结果序列与人类Illuminai基因组(GRCh37/hg38)进行比对参考，与hg38基因组注释和默认参数进行比对，计算得所述基因构成集合，每一个基因的基因表达量。
6)分别比较不同样本基因的表达差异。基因构成集合在H1975细胞系中的表达情况如图1所示，基因构成集合在A549细胞系中的表达情况如图2所示。
7)分析差异基因的主要富集的生物功能信号通路。
1.2结果
所述基因构成集合的基因在两个细胞系，经过d-柠檬烯混合物处理后与各对照组相比，具有表达差异，且在两个细胞系中的差异表达基因作用方向一致，即同时上调和下调，具体结果见表1。这些基因的主要生物功能和信号通路都聚焦与脂质代谢、消化系统等，具体见表2和表3，这些功能均和d-柠檬烯混合物以及癌症相关。
上述结果表明d-柠檬烯混合物与癌症发生相关的生物功能，所述基因构成集合的基因能够在多个细胞系中被柠檬烯所调控，且调控方向一致。
表1基因构成集合的名称和对应的基因差异指标
表2基因构成集合内基因的富集生物功能结果
1BP:涉及生物过程；CC：涉及细胞构成；MF：设计分子功能
表3基因构成集合内基因的富集信号通路结果
实施例2：d-柠檬烯混合物对基因筛选患者的疗效
2.1数据来源与评估方法
1)选择公开数据库癌症基因组图谱(TCGA)的肺腺癌数据库(LUAD)，共519名的患者数据，包括其临床信息数据、全基因转录组数据。
2)基于生存时间将患者分为2组，生存时间高于3年和生存时间不高于3年。
3)提取患者属于所述基因集合的基因表达值，分别对应组别(两组)的基因表达值，比较基因在两组人群的差异。
2.2结果
所述基因构成集合的基因在两组人群中的表达值有统计学差异，具体结果见表1。d-柠檬烯混合物上调的基因，在生存期高的人群组也显著上调，d-柠檬烯混合物下调的基因，在生存期高的人群组也显著下调。
上述结果表明所述基因集合的基因，在受到d-柠檬烯混合物调控的情况下，也和癌症患者的生存相关。
实施例3：所述d-柠檬烯混合物对所述基因筛选患者的干预流程
3.1数据来源与评估方法
1)选择公开数据库癌症基因组图谱(TCGA)的肺腺癌数据库(LUAD)，共519名的患者数据，包括其临床信息数据、全基因转录组数据。
2)基于生存时间将患者分为2组，生存时间高于3年和生存时间不高于3年。
3)提取其中有肿瘤组织和癌旁组织患者的配对数据
4)计算每个患者自身肿瘤组织和癌旁组织配对的差异基因，得到患者差异基因指标(PDGI)
5)利用基因差异乘积加和评估方法，计算每个患者的基因差异乘积加和，评估加和值与患者生存的关系。
3.2结果
图3为患者的筛选流程图，通过图3的流程能够计算得到每个患者基因差异乘积加和，从而指导患者对d-柠檬烯混合物的使用。
上述结果表明经过本发明所述筛选方法得到的癌症患者，能够从d-柠檬烯混合物的干预中获得生存延长的益处。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)经过d-柠檬烯混合物处理后的腺癌细胞系与无d-柠檬烯混合物处理对照细胞系对比，计算得到受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因集合；
2)通过人群数据，比较一定年限内死亡与存活患者的差异基因，在步骤1)所述受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因集合基础上，暴露和生存相关、且功能一致的基因集合；
3)通过对步骤2)所得基因功能分析，保留与d-柠檬烯混合物生物功能一致的基因集合，即为最终的受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合，即差异基因集合。
2.根据权利要求1所述受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合的筛选方法，其特征在于，所述d-柠檬烯混合物生物功能包括促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移、抑制肿瘤细胞侵袭。
3.根据权利要求1所述受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合的筛选方法，其特征在于，d-柠檬烯混合物中以d-柠檬烯为核心药用成分，还含有其他必须的助剂；
优选地，d-柠檬烯混合物中，还含有其它抗肿瘤药物，其它抗肿瘤药物包括顺铂和/或雷帕霉素；或，
优选地，d-柠檬烯混合物中，还含有具有抗肿瘤活性的黄酮或生物碱成分。
4.基于权利要求1所述筛选方法得到的受到d-柠檬烯混合物影响表达的基因构成集合，其特征在于，所述基因构成集合的名称和对应的基因差异指标下表所示
表中，logFC值为对应差异比值的自然数对数，FDR为错误发现率。
5.基于权利要求4所述基因构成集合评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法，其特征在于，步骤如下：
1)分别检测所述基因构成集合中每个基因在癌与癌旁组织中的表达值；
2)计算同一个基因在癌与癌旁组织的基因表达差异比值，后经自然数对数处理，得到患者差异基因指标的表述方式，也为logFC值；
3)计算基因差异指标和患者差异基因指标的乘积；
4)所述乘积经过符号函数处理后，计算所有基因差异乘积加和；所述加和对应一个癌症患者，根据计算得到的加和值判断患者是否对d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感。
6.根据权利要求5所述评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法，其特征在于，步骤1)中基因在癌与癌旁组织中的表达值包括TPM、FPKM、芯片数据、reads counts。
7.根据权利要求5所述评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法，其特征在于，步骤4)中，所述加和越小，所述d-柠檬烯混合物对患者的效用越明显。
8.一种筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备，其特征在于，所述医疗设备含有权利要求3所述基因构成集合。
9.根据权利要求8所述一种筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备，其特征在于，所述医疗设备含有关于评估癌症患者是否对d-柠檬烯混合物敏感的计算方法的说明书。
10.根据权利要求8所述一种筛选d-柠檬烯混合物抗癌效用敏感患者的医疗设备，其特征在于，所述医疗设备为试剂盒。
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