CN108169476A - 以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒 - Google Patents

以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。因所制得的重组李蛋白rLi protein具有比抗体分子更高的稳定性、特异性和亲合力，其溶解状态4℃放置一年以上，仍然保持完整的抗原结合能力，对肿瘤细胞抗原的识别更加灵敏。本发明具有检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉等优点。

Description

以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种肿瘤检测试剂盒，尤其是一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒。
背景技术
肿瘤标志物己经有很多种，常见的肿瘤标志物分为糖类抗原、胚胎抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶及激素、天然自身抗原等等，有些肿瘤标志物对不同类型的癌症检测具有广谱性，有些则对特定类型的肿瘤具有高灵敏性及特异性。例如：甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、胰胚胎抗原（pancreatic oncofetal antigen,POA）、糖类抗原（carbohydrate antigen, CA、乳腺癌标志物CA153及胃癌标志物CA724等均是现在较为常见的肿瘤标记物。
以七鳃鳗为代表的无颌类脊椎动物，是现存具有适应性免疫系统最古老的物种，其独特的特异性抗原受体和白细胞表面抗原等为重要的免疫分子。近年来大量实验数据表明，七鳃鳗李氏小体是免疫防御系统中最重要的免疫器官，尤其是在适应性免疫系统中发挥重要作用。在七鳃鳗免疫小体的研究中，已发现了一种细胞毒作用的蛋白，并命名为七鳃鳗李蛋白（Li protein），七鳃鳗李蛋白（Li protein ）作为无颌类脊椎动物适应性免疫系统的核心免疫分子，具有特异性识别并结合外来抗原的功能。生物信息学分析表明七鳃鳗李蛋白cDNA全长共1120 bp，共有两个功能域，位于N端的Jacalin_like domain和位于C端的Aerolysin domain，空间结构主要以β折叠片层组成，相对分子质量在34kDa左右，可以利用基因工程菌实现原核表达，生产成本低，适合大规模工业化生产。但是，迄今为止还没有关于将七鳃鳗李蛋白（Li protein）替代捕获试剂及检测试剂应用于肿瘤检测试剂盒的相关报道。
发明内容
本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉的以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒。
本发明的技术解决方案是：一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，其特征在于：所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。
所述可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白按如下方法制备：
（1）七鳃鳗重组李蛋白rLi protein的诱导表达
①以1μL pColdⅠ-rLi protein质粒DNA转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板；
②挑选阳性克隆，接种至10 mL含有Amp＋的LB培养基中37℃、120 rpm震荡培养过夜；
③次日按上述培养菌液/含有Amp＋的LB培养基以体积比1:100比例接种，37℃、180rpm震荡培养；
④至培养基中菌生长达到对数生长期，即OD600 为0.4 ~ 0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG，15℃、100 rpm 诱导24 h；
⑤菌液7000 rpm离心4℃、15 min，收集上清，得到重组蛋白rLi protein；
（2）重组蛋白rLi protein的纯化
①将收集的上清液用0.45 μm滤膜过滤，用于蛋白纯化；
②配制纯化溶液，配方如下：
溶液 配方
Binding Buffer 15 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer 1 30 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer 2 50 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer3 70 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Eluting Buffer 350 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Dialysis Soution 20 mM Tris-HCl，pH 8.0
③安装层析柱调节液体流速为2 mL/min，用10倍柱床体积的1×Binding Buffer对柱子进行平衡；
④调节液体流速为0.5 mL/min，将过滤好的上清液上样；
⑤调节液体流速为1 mL/min，用10倍柱床体积的Binding Buffer洗柱；
⑥依次用10倍柱体积的Washing Buffer 1，Washing Buffer 2，Washing Buffer 3洗柱；
⑦用5倍柱床体积的Eluting Buffer洗脱；
⑧将Eluting Buffer洗脱得到的目的蛋白，置于20倍体积的Dialysis Soution透析液中透析除盐；
⑨透析12 h后，得到纯化重组蛋白rLi protein；
（3）纯化重组蛋白rLi protein的Alexa flour 488荧光标记。
本发明是以可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白替代捕获试剂及检测试剂，制备肿瘤检测试剂盒。因所制得的重组李蛋白rLi protein具有比抗体分子更高的稳定性、特异性和亲合力，其溶解状态4 ℃放置一年以上，仍然保持完整的抗原结合能力，对肿瘤细胞抗原的识别更加灵敏。本发明具有检测灵敏度高、储存与运输方便、有效期长且生产成本低廉等优点。
附图说明
图1-图3是本发明实施例对各类传代细胞以及原代细胞的标记情况检测图。
具体实施方式
本发明的以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，同现有的肿瘤检测试剂盒一样，有捕获试剂及检测试剂，与现有技术所不同的是捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白按如下方法制备：
（1）七鳃鳗重组李蛋白rLi protein的诱导表达
①以1μL pColdⅠ-rLi protein质粒DNA转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板；
②挑选阳性克隆，接种至10 mL含有Amp＋的LB培养基中37℃、120 rpm震荡培养过夜；
③次日按上述培养菌液/含有Amp＋的LB培养基以体积比1:100比例接种，37℃、180rpm震荡培养；
④至培养基中菌生长达到对数生长期，即OD600 为0.4 ~ 0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG，15℃、100 rpm 诱导24 h；
⑤菌液7000 rpm离心4℃、15 min，收集上清，得到重组蛋白rLi protein；
（2）重组蛋白rLi protein的纯化
①将收集的上清液用0.45 μm滤膜过滤，用于蛋白纯化；
②配制纯化溶液，配方如下：
溶液 配方
Binding Buffer 15 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer 1 30 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer 2 50 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Washing Buffer3 70 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Eluting Buffer 350 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0
Dialysis Soution 20 mM Tris-HCl，pH 8.0
③安装层析柱调节液体流速为2 mL/min，用10倍柱床体积的1×Binding Buffer对柱子进行平衡；
④调节液体流速为0.5 mL/min，将过滤好的上清液上样；
⑤调节液体流速为1 mL/min，用10倍柱床体积的Binding Buffer洗柱；
⑥依次用10倍柱体积的Washing Buffer 1，Washing Buffer 2，Washing Buffer 3洗柱；
⑦用5倍柱床体积的Eluting Buffer洗脱；
⑧将Eluting Buffer洗脱得到的目的蛋白，置于20倍体积的Dialysis Soution透析液中透析除盐；
⑨透析12 h后，得到纯化重组蛋白rLi protein，置于-20 ℃保存；
（3）使用Thermo公司荧光标记染料对纯化重组蛋白rLi protein的Alexa flour 488荧光标记。
实验：
（1）人血液样品白细胞分离
①将血液于生理盐水中1:1稀释；
②于10ML离心管中加入3ML淋巴细胞分离液，随后于离心管中缓慢加入3ML稀释血液样本；
③室温离心1500rpm 15min；
④离心后离心管中间层出现白圈即为白细胞，将白细胞缓慢吸出，后于生理盐水按1:1比例稀释，于15ML离心管中1500rpm 离心15min；
⑤沉淀即为血液样品中所提取的白细胞；
⑥收集的细胞用PBS重悬再离心，重复两次清洗细胞；
（2）流式细胞术检测七鳃鳗李蛋白对各类传代细胞的标记情况
①各实验组细胞于添加10%胎牛血清的RIPM 1640培养基中培养，待细胞培养至对数期后收集细胞，每个实验组细胞数量达到1×105；
②细胞于PBS中清洗2次，1000 rpm离心5 min；
③于各细胞悬液中加入本发明实施例的Alexa flour 488—LIP（1μg/μl）至终浓度为1μg/ml室温孵育5~10min；
④1000 rpm离心5 min，收集的细胞用PBS重悬再离心，重复两次清洗细胞；
⑤加入500μl的PBS重悬浮细胞；
⑥流式细胞仪上机检测，统计被Alexa flour 488—LIP标记的细胞占总细胞数的百分比；
（3）流式细胞术检测七鳃鳗李蛋白对原代细胞（人白细胞）的标记情况
①将白细胞于500μL PBS重悬，每个实验组细胞数量达到1×105；
②于白细胞悬液中加入本发明实施例的Alexa flour 488—LIP（1μg/μl）至终浓度为1μg/ml；
③室温孵育5~10min；
④1000 rpm离心5 min，收集的细胞用PBS重悬再离心，重复两次清洗细胞；
⑤加入500μl的PBS重悬浮细胞；
⑥流式细胞仪上机检测，统计被Alexa flour 488—LIP标记的细胞占总细胞数的百分比；
图1~图2分别是本发明实施例Alexa flour 488—LIP对各类传代培养细胞的荧光标记结果，包括正常细胞人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人胃黏膜细胞（GES-1）、人肾上皮细胞（293T）、人正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）、人肺上皮细胞（L132）以及癌症细胞人乳腺癌细胞（MCF-7）、人外周血白血病T细胞（Jurkat）、人慢性髓原白血病细胞（K562）、人肝癌细胞（HepG2）、人肺鳞癌细胞（NCI-H520）和腺癌人类肺泡基底上皮细胞（A549）的荧光标记图。结果显示，Alexa flour 488—LIP对于正常细胞标记不明显，各类细胞被标记量均在20%以内，而对于各肿瘤细胞标记较强。
图3分别是本发明实施例Alexa flour 488—LIP对人白细胞的荧光标记结果，包括正常人白细胞和癌症病人白细胞图。结果显示，Alexa flour 488—LIP对于人白细胞的标记结果，正常人白细胞标记不明显，癌症病人白细胞被标记量较强。
注：图1~3中实现为对照组（各细胞未标记前检测），虚线为实验组（各细胞被标记后检测）。
以上实验结果说明Alexa flour 488—LIP作为一种肿瘤标记特异性抗原，对于肿瘤细胞有很好的标记作用，而对正常细胞标记效果较差，并且认定标记细胞百分比＞20%的样本即为肿瘤样本。

Claims (2)

1.一种以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，有捕获试剂及检测试剂，其特征在于：所述捕获试剂及检测试剂均为可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白。
2. 根据权利要求1所述以七鳃鳗李蛋白为标志物的肿瘤检测试剂盒，其特征在于所述可特异性标记肿瘤细胞表面脂笩上的糖和鞘磷脂的七鳃鳗重组李蛋白按如下方法制备：
（1）七鳃鳗重组李蛋白rLi protein的诱导表达
①以1μL pColdⅠ-rLi protein质粒DNA转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布平板；
②挑选阳性克隆，接种至10 mL含有Amp＋的LB培养基中37℃、120 rpm震荡培养过夜；
③次日按上述培养菌液/含有Amp＋的LB培养基以体积比1:100比例接种，37℃、180rpm震荡培养；
④至培养基中菌生长达到对数生长期，即OD600 为0.4 ~ 0.6时，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG，15℃、100 rpm 诱导24 h；
⑤菌液7000 rpm离心4℃、15 min，收集上清，得到重组蛋白rLi protein；
（2）重组蛋白rLi protein的纯化
①将收集的上清液用0.45 μm滤膜过滤，用于蛋白纯化；
②配制纯化溶液，配方如下：
溶液 配方 Binding Buffer 15 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0 Washing Buffer 1 30 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0 Washing Buffer 2 50 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0 Washing Buffer3 70 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0 Eluting Buffer 350 mM咪唑、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0 Dialysis Soution 20 mM Tris-HCl，pH 8.0
③安装层析柱调节液体流速为2 mL/min，用10倍柱床体积的1×Binding Buffer对柱子进行平衡；
④调节液体流速为0.5 mL/min，将过滤好的上清液上样；
⑤调节液体流速为1 mL/min，用10倍柱床体积的Binding Buffer洗柱；
⑥依次用10倍柱体积的Washing Buffer 1，Washing Buffer 2，Washing Buffer 3洗柱；
⑦用5倍柱床体积的Eluting Buffer洗脱；
⑧将Eluting Buffer洗脱得到的目的蛋白，置于20倍体积的Dialysis Soution透析液中透析除盐；
⑨透析12 h后，得到纯化重组蛋白rLi protein；
（3）纯化重组蛋白rLi protein的Alexa flour 488荧光标记。
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