CN103145825B

CN103145825B - 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法

Info

Publication number: CN103145825B
Application number: CN201310082500.XA
Authority: CN
Inventors: 李冰峰; 刘练; 管增东; 余利灯
Original assignee: MAANSHAN HUIZHI BIOTECH CO Ltd; Nanjing College of Chemical Technology
Current assignee: MAANSHAN HUIZHI BIOTECH CO Ltd; Nanjing College of Chemical Technology
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: CN103145825A

Abstract

本发明公开了一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法，将动物脾脏绞碎，溶剂提取，热变除杂，氯化镁或氯化钙盐除杂，提取液浓缩，粗品沉淀，粗品结晶。本发明所用方法既节省了生产成本又缩短了生产周期，成本低，提取料液量小，加硫酸铵少，适合于生产的规模扩大化。并且铁蛋白的提取率有显著提高，而且所用辅料部分还可收。

Description

一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法

技术领域：

本发明属生物提取领域，具体涉及一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法。

背景技术：

铁蛋白是一种含铁的蛋白质，具有电子致密特点，可对细胞抗原进行精确的定位且在电镜下可见。利用抗原与抗体特异性结合产生微量沉淀的原理，对组织细胞内的抗原和抗体进行超微结构鉴定和定位。因此铁蛋白在医学、生物学研究方面有着广泛的前途。

铁蛋白一般来自动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高，因而商品铁蛋白主要从马脾脏中获得的。

传统的提取的方法主要是取新鲜马脾用组织匀浆机粉碎，加水提取，热变除杂，去油脂，硫酸铵沉淀，粗品透析除盐，硫酸镉结晶。整个工艺提取周期长，成本高。特别是组织匀浆机处理效率比较低，加热后保温使很多铁蛋白变性失活，提取料液量大，加硫酸铵多且添加过程易使铁蛋白失活，透析处理耗时更不适合于生产的规模扩大化。

发明内容：

本发明提供一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法，该方法解决传统工艺周期长、成本高的问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于将动物脾脏绞碎，溶剂提取，热变除杂，氯化镁或氯化钙盐除杂，提取液浓缩，粗品沉淀，粗品结晶。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于该方法具体包括以下按步骤：

1）将动物脾脏粉碎成匀浆；

2）将所述的匀浆与水混合，并再粉碎以便于铁蛋白的溶出；

3）将步骤2）中再粉碎后的匀浆加热至60℃~85℃，立即降温至25℃以下；

4）将步骤3）所得匀浆加入CaCl₂或MgCl₂除杂得提取液；

5）将步骤4）所得提取液离心后取上清液超滤浓缩后得浓缩液；

6）将步骤5）所得浓缩液中加丙酮进行分级沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白，或者加硫酸铵沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白；

7）将步骤6）所得的粗品铁蛋白用水或/和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液并用硫酸镉结晶，得精品铁蛋白。可以用水溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶，重复进行几次得到精品铁蛋白；也可以用硫酸铵溶液溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶，重复进行几次得到精品铁蛋白；或者用水和硫酸铵溶液结合使用溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶，得精品铁蛋白。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤1）中将动物脾脏绞碎后用胶体磨粉碎至粒度2~50μm的匀浆。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤2）中将所述的匀浆与水混合并用胶体磨再粉碎1~2遍。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤4）中氯化镁或氯化钙的添加量为匀浆的1%~5%（w/v，即每100ml匀浆中加入1~5g氯化镁或氯化钙）。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤5）中所述的上清液经超滤浓缩至原体积的1/2~1/6。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤6）浓缩液中加丙酮进行分级沉淀，分级沉淀的过程为：（1）初沉：向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液，静置，离心留上清液；（2）复沉：向上清液中加丙酮得复沉溶液，离心得粗品铁蛋白。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于初沉时所述初沉溶液中丙酮的体积百分浓度为5%~18%，复沉时所述复沉溶液中丙酮的体积百分浓度为52%~69%。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤6）浓缩液中加硫酸铵沉淀铁蛋白时，硫酸铵的添加量为浓缩液的30%~40%（w/v，即每100ml浓缩液中加入30~40g硫酸铵），优选为35%。

上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其在于步骤7）中用来溶解粗品铁蛋白的硫酸铵溶液的质量百分浓度为0.5~1.5%，优选为1%，硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的2%~10% （w/v，每100ml粗品铁蛋白溶解液中加入2~10g硫酸镉），优选为5% 。

本发明的有益效果：

本发明所用方法既节省了生产成本又缩短了生产周期，成本低，提取料液量小，加硫酸铵少，适合于生产的规模扩大化。并且铁蛋白的提取率有显著提高（与现有方法相比铁蛋白的提取率可提高约20%左右），而且所用辅料部分还可收。

附图说明：

图1为本发明实施例方法所得精品铁蛋白经电泳检测的铁蛋白活性铁染色。

图2为铁蛋白活性考马斯亮蓝染色。

图3为铁蛋白SDS-page变性电泳。

具体实施方式:

以下通过实施实例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。

实施例1：

取马脾脏2.7 kg，绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为2~50μm的匀浆，加水4.0 L后继续胶体磨匀浆2遍以便于铁蛋白溶出，加热至75℃，立即降温至20℃以下，得匀浆约6.2 L，加入氯化镁186 g除杂得提取液，将提取液离心得上清液4.0 L，将上清液100KD超滤浓缩至1400 ml得浓缩液，向浓缩液中加入硫酸铵固体490 g（硫酸铵的添加量为浓缩液的35%，即每100ml浓缩液中加入35g硫酸铵），静置，离心得粗品铁蛋白121.5 g，将粗品铁蛋白用1600ml水溶解得粗品铁蛋白溶解液，加硫酸镉（硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的5%，即每100ml粗品铁蛋白溶解液中加入5g硫酸镉），静置结晶，结晶完全后离心取晶体以质量百分浓度为1%的硫酸铵水溶液溶解，加硫酸镉结晶2次，得精品铁蛋白5.6 g（湿重，约含水50%），以质量百分浓度为1%硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和硫酸铵溶液保存。

实施例2：

取马脾脏2.7 kg，绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为2~50μm的匀浆，加水4.0 L后继续胶体磨匀浆2遍以便于铁蛋白溶出，加热至80℃，立即降温至20℃以下，得匀浆约6.4 L，加入氯化钙128g除杂得提取液，将提取液离心得上清液4.2 L，将上清液100 KD超滤浓缩至1100 ml得浓缩液；向浓缩液中加丙酮进行分级沉淀，分级沉淀的过程为：（1）初沉：向浓缩液中加入丙酮150 ml得初沉溶液，静置，离心留上清液1250ml；（2）复沉：向上清液中加丙酮1500 ml得复沉溶液，离心得粗品铁蛋白。将粗品铁蛋白以1700 ml 质量百分浓度为1%的硫酸铵水溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液，加硫酸镉（硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的5%，即每100ml粗品铁蛋白溶解液中加入5g硫酸镉），静置结晶，结晶完全后离心取晶体以质量百分浓度为1%的硫酸铵水溶液溶解，加硫酸镉结晶2次，得精品铁蛋白5.5 g（湿重，约含水50%），以质量百分浓度为1%硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和硫酸铵溶液保存。

对比实施例：

取马脾脏2.7 kg，绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为2~50μm的匀浆，加水4.0 L，加热至65℃，降温至20℃以下，得匀浆约4.4 L，离心得上清液3.1 L，向上清液中加硫酸铵1085 g，静置，离心得粗品铁蛋白83.2 g，用1200 ml水溶解得粗品铁蛋白溶解液，加硫酸镉（硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的5%，即每100ml粗品铁蛋白溶解液中加入5g硫酸镉），静置结晶，结晶完全后离心取晶体以质量百分浓度为1%的硫酸铵水溶液溶解，加硫酸镉结晶2次，得精品铁蛋白4.4 g（湿重，约含水50%），以质量百分浓度为1%硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和硫酸铵溶液保存。

上述实施例和对比实施例所得精品铁蛋白经电泳检测如图1 铁蛋白活性铁染色、图2铁蛋白活性考马斯亮蓝染色及图3铁蛋白SDS-page变性电泳所示。

实施例1与对比实施例对比可知，超滤后硫酸铵用量仅是传统工艺的一半以下，且料液量少，处理方便；实施例2与对比实施例对比可知，超滤后加丙酮比加固体硫酸铵耗时少且不易使蛋白质失活，另外丙酮可以回收，成本相应降低。故本发明从收率和能耗上均优于传统工艺，适用于工业生产。

表1为实施例1、实施例2和对比实施例的工艺参数及产品量

Claims

1.一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于将动物脾脏绞碎，溶剂提取，热变除杂，氯化镁或氯化钙盐除杂，提取液浓缩，粗品沉淀，粗品结晶；

该方法具体包括以下按步骤：

1）将动物脾脏粉碎成匀浆；

2）将所述的匀浆与水混合，并再粉碎以便于铁蛋白的溶出；

4）将步骤3）所得匀浆加入CaCl₂或MgCl₂除杂得提取液；

7）将步骤6）所得的粗品铁蛋白用水或/和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液并用硫酸镉结晶，得精品铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤1）中将动物脾脏绞碎后用胶体磨粉碎至粒度2~50μm的匀浆。

3.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤2）中将所述的匀浆与水混合并用胶体磨再粉碎1~2遍。

4.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤4）中氯化镁或氯化钙的添加量为匀浆的1%~5%。

5.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤5）中所述的上清液经超滤浓缩至原体积的1/2~1/6。

6.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤6）浓缩液中加丙酮进行分级沉淀，分级沉淀的过程为：（1）初沉：向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液，静置，离心留上清液；（2）复沉：向上清液中加丙酮得复沉溶液，离心得粗品铁蛋白。

7.根据权利要求6所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于初沉时所述初沉溶液中丙酮的体积百分浓度为5%~18%，复沉时所述复沉溶液中丙酮的体积百分浓度为52%~69%。

8.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤6）浓缩液中加硫酸铵沉淀铁蛋白时，硫酸铵的添加量为浓缩液的30%~40%。

9.根据权利要求8所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于所述硫酸铵的添加量为浓缩液的35%。

10.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于步骤7）中用来溶解粗品铁蛋白的硫酸铵溶液的质量百分浓度为0.5~1.5%，硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的2%~10%。

11. 根据权利要求10所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法，其特征在于所述硫酸铵溶液的质量百分浓度为1%，所述硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的5%。