Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koncentratu bialkowego, bogatego w orgoteine z krwi¬ nek czerwonych.Orgoteina jest to grupa pokrewnych bialek o charakterystycznym zestawie wlasciwosci fizycznych, chemicznych i farmakologicznych. Kazde z tych bialek jest pod wzgledem wlasciwosci fizycznych, wyodrebnio¬ na zasadniczo czysta forma globularnego bialka, rozpuszczalnego w roztworze buforowym i w wodzie, posiadaja¬ cego wysoce zwarta, natywna konformacje. Bialko to jest nietrwale w podwyzszonej temperaturze 65 C w wodzie lub roztworze buforowym, zawierajacym sole dwuwartosciowego metalu o promieniu jonu od 0,60 do 1,00 A. Ponadto w wyniku elektroforezy tego bialka prowadzonej na zelu, przy wartosci pH = 8,45 w roztworze buforowym, zawierajacym 0,1 m Tris-glicyny, otrzymuje sie charakterystyczny uklad wielu pasm. Z punktu widzenia chemicznego kazde z tych bialek zawiera wszystkie lub wszystkie z wyjatkiem 1-2 podstawowych aminokwasów, mala ilosc weglowodanów, nie zawiera lipidów, a zawiera 0,1 do 1,0% metalu w postaci okolo 3-5 gramoatomów na mol jednego lub wiecej zwiazku chelatowego metali dwuwartosciowych o promieniu jonu 0,60-1,00 A, i zasadniczo nie zawiera zadnych chelatowych zwiazków metali jednowartosciowych lub tez trucizn komórkowych. Z punktu widzenia farma kodynamicznego, kazde z tych bialek jest bialkiem nietoksycznym, dobrze tolerowanym immunologicznie, mozliwym do wstrzykiwania, którego aktywnosc farmakologiczna wyraza sie we wlasciwosciach przeciwzapalnych, zwiazanych podobnie, jak i ich zwarta konformacja, z obecnoscia dwuwartosciowego metalu, wystepujacego w postaci zwiazku chelatowego. Immunologiczna zaleznosc przedsta¬ wiciela orgoteiny jest wystarczajaca, aby mozna bylo przeciwciala, wytworzone u królika lub innego odpowied¬ niego zwierzecia, traktowac jako antygen co najmniej jednego przedstawiciela orgoteiny i/lub aby mozna bylo uznac tego przedstawiciela jako antygen w stosunku do jednego lub wiekszej liczby przeciwcial innych przedstawicieli orgoteiny, co widac w czasie immunoelektroforezy na zelu i/lub immunodyfuzji na zelu. Chociaz niektóre wlasciwosci fizyczne i chemiczne oraz rodzaj i stopien skutecznosci farma kodynamicznej orgotein zmieniaja sie w zaleznosci od grupy, to jednak wszystkie grupy bialek pokrewnych posiadaja wyzej opisany zestaw wlasciwosci.Z dotychczasowej literatury widac, ze metaloproteiny z rodziny orgotein sa bialkami, wczesniej wyodreb¬ nionymi w róznym stopniu czystosci i znanymi pod nazwa hepatokupreina (Mann i Keilin, Proc. Royal, Soc.2 89 367 Opisana w Biol, Sci., 126, 303 (1939)/, cerebrokupreina, /Porter, Ainsworth, J. Neurochem., 1, 260 (1957)/, erytrokupreina, /Markowitz i wspólpracownicy, J. Biol. Chem., 234, 40 (1959)/ i cytokupreina, /Carrico, Deutsch J. Biol. Chem., 244, 6087 (1969)/. Tego typu bialka zostaly opisane równiez przez Mohameda i Greenberga, J. Gen. Physiol. 37, 433 (1954), Portera i Folcha, Arch. Neurol. Psychiat., 77, 8 (1957), Portera i Ainsworth, J. Neurochem., 5, 91 (1959), Krimmela i wspólpracowników, J. Biol. Chem., 234, 46 (1959), Wymana, Biochem. Biophys. Acta, 45, 387 (1960), Shieldsa i wspólpracowników, J. Clin. Inv.f 40, 2007 (1961), Markowitza i wspólpracowników, Anal. Chem., 33 1594 (1961), Portera i wspólpracowników, Arch. Biochem.Bioph., 105, 319 (1964), Stansella i Deutscha, J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965), ibid, 240, 4306 (1965), Stansella i Deutscha, Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1966), McCorda i Fridovicha, J. Biol. Chem., 244, 5753 (1969), Hartza i Deutscha, J. Biol. Chem., 244, 4665 (1969), McCorda i Fridovicha, J. Biol. Chem., 244, 6056 (1969) oraz Carrico'a i Deutscha, ibid, 245, 723 (1970). W literaturze podano, ze te metaloproteiny wykazuja bardzo wysoka aktywnosc nadtlenkowej dismutazy (sodazy) McCord, Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969), Keele, McCord, Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970). ibid 246, 2875 (1971).W belgijskim opisie patentowym nr 687 828 i brytyjskim opisie patentowym nr 1 160 151 opisano wielo¬ etapowy sposób wyodrebniania orgoteiny z tkanki zwierzecej, na przyklad z watroby bydlecej. Przedmiotem opisu patentowego St. Zjedn. Amer. nr 3 687 927 jest ulepszony sposób wyodrebniania orgoteiny, w którym zmniejszono liczbe etapów i znacznie zwiekszono wydajnosc.W opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 579 495 opisano wieloetapowy sposób wyodrebniania orgoteiny z czerwonych krwinek, polegajacy na wstepnym oczyszczaniu rozpuszczalnikiem w celu usuniecia hemoglobiny, a nastepnie ogrzewaniu. Calkowita wydajnosc w tym procesie wynosi okolo 0,01% w przeliczeniu na upakowane krwinki czerwone.Niektórzy z wyzej wymienionych autorów, jako jeden z etapów wieloetapowego sposobu wyodrebniania orgoteiny z czerwonych krwinek, stosuja etap oczyszczania chromatograficznego na DEAEcelulozie (dwuetylo- aminoetylocelulozie — przyp. tlum.). W najprostszym sposobie krwinki czerwone uwalnia sie od hemoglobiny przez wytracanie rozpuszczalnikiem, a nastepnie K2 HP04 i frakcjonowanie acetonem. Czesc rozfrakejonowa- nych rozpuszczalnych bialek z czerwonych krwinek bydlecych poddanych lizie, poddano chromatografii przy pH o wartosci 7,4 otrzymujac z 3 litrów upakowanych krwinek 190 mg orgoteiny, wykazujacej aktywnosc nadtlenkowej dismutazy o wartosci 3 300 jednostek/mg. (Calkowita wydajnosc wynosila 0,006%, a stopien odzysku orgoteiny — 60%). Sposób ten, przydatny w skali laboratoryjnej, nie bylby ekonomiczny w skali przemyslowej w stosunku do sposobów, opracowanych pózniej. Na przyklad, gdyby sposób ten zastosowac bez zmian w skali wiekszej, w celu wyprodukowania 1 kg orgoteiny trzeba by bylo zuzyc ponad 7500 litrów chloroformu, 4500 litrów etanolu, 7000 kg K2 HP04 i 5000 litrów acetonu.Jednoetapowy sposób Wolfganga Hubera i wspólpracowników pozwala na uzyskanie zasadniczo czystej orgoteiny, bez uzycia rozpuszczalników, bezposrednio z poddanych lizie krwinek czerwonych za pomoca chromatografii jonowymiennej. Sposób ten, w którym ominieto trudnosci, zwiazane z zastosowaniem rozpusz¬ czalnika zmieszanego z siarczanem amonowym jako srodków stracajacych, ma wade, polegajaca na koniecznosci rozdzielenia chromatograficznego duzych objetosci cieczy, co z kolei wymaga stosowania kolumn chromatografi¬ cznych o odpowiednio duzych rozmiarach. Ponadto, ponad 99,8% bialek, rozdzielanych chromatograficznie, to bialka obce, co zmniejsza trwalosc kolumny i ogranicza szybkosc rozdzielania.Sposób wymaga stosowania dializy pelnego lizatu w celu zmniejszenia sily jonowej do niezbednego niskiego poziomu. Poddany dializie lizat nie jest trwaly, i jezeli nie klaruje sie go podczas wkraplania próbki, wówczas nastepuje zatkanie kolumny przez wytracajace sie bialka. Szybkosc przeplywu przez kolumne jest stosunkowo mala, poniewaz zdolnosc adsorpcyjna kolumny w stosunku do orgoteiny jest zmniejszona w wyniku adsorbowania duzych ilosci zanieczyszczen bialkowych. Równiez selektywnosc adsorpcji podczas elucji pewnych grup orgotein, na przyklad wystepujacych u konia, jest gorsza, niz dla innych orgotein. A wiec chociaz opisany sposób jest znacznie lepszy od uprzednio stosowanych sposobów wyodrebniania orgoteiny, to ma on równiez szereg wad.Obecnie stwierdzono, ze mozna uniknac wad sposobu opisanego wyzej nie komplikujac go i nie pogarszajac jego rentownosci, dzieki zastosowaniu wstepnej obróbki czerwonych krwinek w celu otrzymania roztworu, zawierajacego orgoteine, a zasadniczo nie zawierajacego hemoglobiny i anhydrazy weglanowej. Roztwór taki mozna rozdzielic chromatograficznie, stosujac duzo mniejsza kolumne od kolumny, uzywanej do chromatografii krwinek czerwonych, poddanych lizie. Wyplywa to z mozliwosci zatezenia roztworu przed rozdzieleniem chromatograficznym, co jest niemozliwe przy wykorzystaniu krwinek czerwonych, poddanych lizie. Ponadto, poniewaz w sposobie wedlug wynalazku przez kolumne chromatograficzna przepuszcza sie mniej niz 1% bialek, przepuszczanych przez kolumne w sposobie, opisanym w serii nr 205 610, w celu otrzymania tej samej ilosci orgoteiny, przeto trwalosc kolumny jest duzo wieksza, wieksza jest szybkosc przeplywu i wyzsza selektywnosc zywicy, co z kolei wymaga mniej dokladnej regulacji przy eluowaniu.89 367 3 Sposób ten jest korzystniejszy w porównaniu ze sposobem opisanym w opisie patentowym St. Zjedn.Amer. nr 3 579 495, poniewaz anhydraza weglanowa i hemoglobina krwinek czerwonych, stanowiace okolo 99% bial«k, sa usuwane równoczesnie bez uzycia rozpuszczalników organicznych. istota wynalazku jest wiec sposób wyodrebnienia orgoteiny z krwinek czerwonych, prosty i mozliwy do zastosowania w skali przemyslowej. Sposobem tym otrzymuje sie koncentrat orgoteiny, nie zawierajacy hemoglobiny i anhydrazy weglanowej, z którego mozna latwo i ekonomicznie otrzymac czysta orgoteine w skali przemyslowej.Sposób wedlug wynalazku polega na otrzymywaniu koncentratu orgoteiny, nie zawierajacego hemoglobiny i anhydrazy weglanowej, z czerwonych krwinek na drodze ogrzewania przynajmniej krwinek czerwonych z pelnej krwi przy pH o wartosci od 5 do 8 i w temperaturze okolo 60»80°C, podczas którego wytraca sie hemoglobina, a nastepnie oziebienia mieszaniny, oddzielenia wytraconych bialek z roztworu wodnego tej mieszaniny i wyodrebnienia orgoteiny z cieczy znad osadu.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze hemoglobine i anhydroze weglanowa mozna selektywnie wytracic zasadni¬ czo calkowicie z roztworu, w którym pozostaje orgoteina, poniewaz wytraca sie duza ilosc, prawie 95%, bialka wyjsciowego. Stwierdzono równiez, ze hemoglobina jest bialkiem, stosunkowo odpornym na ogrzewanie.Ponadto stwierdzono, ze ogrzewanie nie czyni jej nierozpuszczalna, ewentualnie czyni ja tylko czesciowa nierozpuszczalna w zakresie pH, nie stosowanym w sposobie wedlug wynalazku.W najkorzystniejszej odmianie sposobu wedlug wynalazku w pierwszym etapie rozciencza sie pelna krew nie wiecej niz 3, na przyklad 0,5«1,5, objetosciami wody. W drugim etapie ogrzewa sie pelna krew w temperatu¬ rze okolo 65-75° C wciagu okolo 1-8 godzin. W trzecim etapie oziebia sie mieszanine, korzystnie do temperatury przynajmniej 40°C, a korzystniej do temperatury pokojowej lub nizszej, zas w czwartym etapie wytraca sie bialka, korzystnie za pomoca wirowania. W piatym etapie wyodrebnia sie surowa orgoteine z cieczy znad osadu, korzystnie za pomoca chromatografii jonowymiennej.W innych odmianach sposobu wedlug wynalazku stosuje sie rózne modyfikacje najkorzystniejszej odmiany tego sposobu. Itak, w pierwszym etapie, jako surowiec do drugiego etapu stosuje sie krwinki, pozbawione surowicy, zawieszone korzystnie w 1°3 objetosciach wody. Ogrzewanie prowadzi se w temperaturze nizszej przez dluzszy okres czasu, na przyklad w temperaturze 60°C wciagu 3 lub wiecej godzin, lub tez w temperaturze wyzszej przez krótszy okres, na przyklad w temperaturze 80°C wciagu od 30 minut do 1 godziny. Ogrzewanie prowadzi sie przy pH o wartosci okolo 7. Etap trzeci prowadzi sie po lub w trakcie etapu czwartego; orgoteine oddziela sie z cieczy znad osadu w etapie piatym na drodze wytracenia acetonem lub innym, mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem, po czym orgoteine wyodrebnia sie w cieczy znad osadu w etapie piatym na drodze ultrasaczenia lub przez liofilizacje. Przed oddzieleniem orgoteiny usuwa sie czesc wody z cieczy znad osadu na drodze destylacji pod zmniejszonym cisnieniem, na przyklad w temperaturze 20 60°C.Ogrzewanie pelnej krwi jest korzystniejsze, poniewaz odpada etap mechanicznego usuwania surowicy i przemywania upakowanych krwinek czerwonych. Mozna równiez ogrzewac krwinki czerwone, pozbawione surowicy. W tym przypadku otrzymuje sie nieco czysciejsza orgoteine, ale te korzysc niweluje koszt oddzielania i przemywania krwinek czerwonych przed ogrzewaniem. Ponadto dodatkowe zanieczyszczenia bialkowe mozna oddzielic minimalnym nakladem za pomoca enzymu proteolitycznego, co bedzie opisane ponizej. Z wyzej opisanych wzgledów pelna krew jest surowcem preferowanym.Etap ogrzewania mozna prowadzic z nierozcienczona pelna krwia lub tez z upakowanymi, wolnymi od surowicy krwinkami czerwonymi, ale w tym przypadku wystepuje problem mieszania i wymiany ciepla. Dlatego tez krew w calosci, a szczególnie oddzielone od surowicy krwinki czerwone korzystnie jest przed ogrzewaniem rozcienczyc, na przyklad okolo trzykrotnie, korzystnie 1-2 objetosciami wody. W razie potrzeby woda moze zawierac srodek buforujacy i/lub zródlo dwuwartosciowego jonu metalu, na przyklad Cu ilub Zn, korzystnie w stosunkowo niskim stezeniu, na przyklad, ponizej 0,05 mola/litr roztworu. W przypadku stosowania krwi pelnej mozna dodac cytrynian trójsodowy lub inny inhibitor koagulacji w celu zapobiezenia koagulacji przed liza hemoglobiny.Ogrzewanie korzystnie jest prowadzic w poblizu punktu izoelektrycznego hemoglobiny z krwinek czerwo¬ nych, a mianowicie przy pH o wartosci okolo 7. Punkty izoelektryczne róznych hemoglobin mieszcza sie . w zakresie pH = 6,5-7,5, zwykle 6,7-7,4. Przy pH o wartosci nizszej, na przyklad ponizej 5, hemoglobina ulega denaturacji, ale tylko czesciowo sie wytraca. Hemoglobina pewnych gatunków, na przyklad bydleca lub konska, wytraca sie przy kazdej wartosci pH w zakresie 5»8. Inna hemoglobina wytraca sie jedynie przy wartosci pH w poblizu punktu izoelektrycznego. pH krwinek czerwonych mozna doprowadzic do odpowiedniej wartosci za pomoca kazdego odpowiedniego kwasu lub zasady.89 367 Ogrzewanie prowadzi sie w temperaturze 60-80°C, kor^ /stnie w temperaturze okolo 70-75° C do momentu calkowitego lub zasadniczo calkowitego wytracenia sie hemoglobiny. Temperatura i czas ogrzewania nie sa parametrami krytycznymi tak dlugo, dopóki hemoglobina jest zasadniczo calkowicie wytracona. Wyzsza temperatura i dluzszy czas ogrzewania zmniejszaja calkowita wydajnosc orgoteiny, a nizsza temperatura i krótszy czas ogrzewania powoduja otrzymywanie mniej czystej orgoteiny. Wystarczajace jest ogrzewanie w temperaturze okolo 75°C wciagu 1~2 godzin. Ogrzewanie wciagu 1 godziny lub nawet dluzej w temperaturze 60-75° C nie wplywa znacznie na koncowa wydajnosc czystej orgoteiny, natomiast ogrzewanie w temperaturze 80°C wciagu 1 godziny niszczy okolo 1/4-3/4 orgoteiny. Ogrzewanie mozna prowadzic periodycznie, lub tez stosowac wydluzone strefy ogrzewania i oziebiania ciaglego.Nieodporne na ogrzewanie bialka, obejmujace równiez enzymy, usuwa sie z krwinek czerwonych na drodze termicznej denaturacji równoczesnie z hemoglobina. Anhydraza weglanowa jest glównym skladnikiem takich nieodpornych na ogrzewanie bialek. Krwinki czerwone ogrzewa sie do momentu dezaktywacji anhydrazy weglanowej- Wrazliwosc anhydrazy weglanowej na ogrzewanie podano w pracy R.P.Davisa, The Enzymes, t. 5, Academic Press, New York City, 1961, str. 545.Podczas wytracania hemoglobiny wytraca sie równiez anhydraza weglanowa i wszystkie lub prawie wszystkie inne, nie odporne na ogrzewanie enzymy i nieenzymatyczne bialka, znajdujace sie w cieczy znad osadu, poniewaz sa one mniej trwale od hemoglobiny. Dla przykladu, w celu dezaktywacji anhydrazy weglanowej i innych nieodpornych na ogrzewanie bialek wystarczy dwudziestominutowe ogrzewanie w tempera- turze 60°C i dziesiecio — pietnastominutowe w temperaturze 65°C.Stopien wytracenia hemoglobiny mozna latwo ocenic po kolorze cieczy znad osadu; powinna byc ona najwyzej bladorózowa przy calkowitym straceniu.Czasami, w przypadku starej krwi, moze sie nie wytracic caly czerwony skladnik hemoglobiny, jezeli etap ogrzewania prowadzi sie w srodowisku kwasnym. W takim przypadku, przed lub po usunieciu hemoglobiny, wytraconej w etapie ogrzewania, pozostale berwne skladniki mozna wytracic, doprowadzajac pH do wartosci 7 lub powyzej, korzystnie 7-7,5, przed wytraceniem orgoteiny, na przyklad przed lub po oddzieleniu wytraconej hemoglobiny, na przyklad jako czesc wstepnie wytraconych acetonem obcych bialek. Wytracone skladniki czerwone mozna usunac w taki sam sposób, jak hemoglobine, wytracona w etapie ogrzewania.Po ogrzaniu, cieple krwinki czerwone oziebia sie do temperatury ponizej okolo 50°C, korzystnie do temperatury pokojowej lub nizszej, na przyklad przepuszczajac przez wymiennik ciepla. Nastepnie usuwa sie hemoglobine i inne bialka, wytracone w etapie ogrzewania, korzystnie za pomoca wirowania i wyrzuca sie je.Mozna równiez stosowac sedymentacje lub saczenie, korzystnie saczenie pod zmniejszonym cisnieniem za pomoca filtracji, na przyklad ziemia okrzemkowa. Po usunieciu wytraconej hemoglobiny oddziela sie orgoteine z cieczy znad osadu, na przyklad przez dodanie acetonu do oziebionego roztworu, przez liofilizacje, ultrasacze- nie lub przez adsorpcje na zywicy jonowymiennej i jej przemywanie.Korzystnym sposobem oddzielenia orgoteiny z cieczy znad osadu jest chromatografia jonowymienna, na przyklad, opisana w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 579 495.Szczególnie korzystnym sposobem, latwym do zastosowania przy masowej produkcji orgoteiny, jest przepuszczenie cieczy znad osadu, otrzymanej w etapie ogrzewania przez kolumne, wypelniona dwuetyloamino- etyloceluluza. W tym etapie ciecz znad osadu o sile jonowej ponizej 0 01 m przepuszcza sie przez kolumne, wypelniona dwuetyloaminoetyloceluloza lub innym slabo zasadowym wymieniaczem jonowym, przy czym orgoteina adsorbuje sie na zywicy jonowymiennej. Kolumne przemywa sie woda lub roztworem buforowym o sile jonowej ponizej okolo 0,01 m i wymywa sie orgoteine przy sile jonowej wyzszej, na przyklad od okolo 0,02 do okolo 0,03 m. W zaleznosci od zastosowanych warunków z kolumny otrzymuje sie orgoteine od surowej, na przyklad 50 procentowej, do bardzo czystej.Mozna równiez ciecz znad osadu oczyszczac na drodze chromatografii na sitach molekularnych, na przyklad przepuszczajac je przez kolumne, wypelniona zywica dekstranowa, usieciowana epichlorohydryna, znana pod nazwa Sephadex G-75 Superfine, Pharmacia (Szwecja). W czasie procesu górna czesc kolumny mozna wymieniac; tak wiec, kiedy górna czesc kolumny zaadsorbuje orgoteine w ilosci, odpowiadajacej jej zdolnosci adsorpcyjnej, górna czesc usuwa sie i zastepuje swieza zywica, pozostawiajac reszte kolumny nienaruszona.Ciecz znad osadu moze byc wstepnie oczyszczona przed oddzieleniem orgoteiny, przez dodanie enzymu proteolitycznego.Nieoczkiwanie stwierdzono, ze we wszystkich w praktyce spotykanych przypadkach orgoteina zasadniczo nie ulega egradacji pod wplywem enzymu proteolitycznego. Tak wiec, surowa orgoteine w cieczy znad osadu mozna oczyszczac przez selektywne trawienie obcych bialek, korzystnie Strep. griseus proteinaza, pankreatyna, subtilizyna, papaina lub bromelaina, przy stosunku wagowym enzymu do bialek w cieczy znad osadu, równym89 367 5 okolo od 1 : 2 do 1 : 1 000, w zaleznosci od wybranego enzymu i stosunku obcych bialek do orgoteiny w mieszaninie.Czysta lub zasadniczo czysta orgoteine mozna wydzielic z trawionej mieszaniny znanymi sposobami, na przyklad na drodze ultrasaczenia. Fragmenty bialek z trawienia enzymatycznego i nadmiar jonów mozna latwo usunac z mieszaniny przed wydzieleniem orgoteiny, stosujac dialize.W razie potrzeby wyodrebnienia orgoteiny z cieczy znad osadu w jednym etapie, mozna ja wytracic acetonem. Do wytracenia calej orgoteiny wystarcza okolo 1-1,5 objetosci acetonu, liczonej w stosunku do objetosci cieczy, zawierajacej orgoteine. Orgoteine czysciejsza, na przyklad, okolo 50 procentowa lub wyzej procentowa, mozna czasami otrzymac sposobem wedlug wynalazku przez wstepne wytracenie czesci rozpuszczo¬ nych bialek acetonem. W przypadku uzycia mniejszej ilosci, niz równej objetosci acetonu, na przyklad 1/2 — 3/4 objetosci, wraz z obcymi bialkami wytraca sie bardzo malo orgoteiny lub tez nie wytraca sie ona wcale. Po usunieciu wytraconych obcych bialek, na przyklad sposobem opisanym powyzej, uzytym do usuwania wytraconej hemoglobiny, orgoteine wytraca sie pozostala iloscia acetonu, na przyklad 3/4 — 1,5 objetosci, obliczonej w stosunku do roztworu wodnego. W tym etapie wstepnego wytracania za pomoca rozpuszczalnika wytraca sie bardzo malo zanieczyszczen bialkowych, o ile etap ogrzewania prowadzono w temperaturze 75-80° C wciagu 1—2 godzin przy pH o wartosci 7, tzn. w warunkach niezbednych do calkowitego wytracenia w etapie ogrzewania.Etap wstepnego wytracania obcych bialek i orgoteiny korzystnie jest prowadzic w temperaturze niskiej, na przyklad 0*5°C, ale mozna go prowadzic w kazdej temperaturze od temperatury otoczenia do temperatury wrzenia acetonu.W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie aceton ze wzgledów ekonomicznych. Dalej wykazano jednak, ze do wytracania orgoteiny mozna równiez stosowac inne drozsze, mieszajace sie z woda rozpuszczalniki takie jak mety Ioetyloketon i czterowodorofuran i zawierajace takie grupy funkcyjne, jak aceton.Wytracona orgoteina powinna byc, w celu unikniecia strat, jak najszybciej uwolniona od resztek rozpuszczalnika i wilgoci, na przyklad przez liofilizacje lub ponowne rozpuszczenie w wodnym vehiculum w celu dalszego oczyszczania.Chociaz osad bogaty w orgoteine, uwolniony od hemoglobiny i anhydrazy weglanowej, mozna otrzymac na drodze wytracania acetonem, to ciecz znad osadu, uwolniona od hemoglobiny, nadaje sie wybitnie do oczyszczania na sitach molekularnych lub na drodze chromatograficznej na slabo zasadowych zywicach jonowymiennych, na przyklad sposobem opisanym w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 579 495.W przypadku, gdy niewygodne jest rozdzielac chromatograficznie ze wzgledu na duza objetosc cieczy, ciecz znad osadu, pozbawiona hemoglobiny, mozna zatezyc przed chromatografia przez ultrasaczenie lub liofilizacje. Mozna równiez stosowac periodyczna adsorpcje orgoteiny na slabo zasadowych wymieniaczach jonowych.Ponizej podane przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Poddane lizie, przemyte erytrocyty z krwi bydlecej rozciencza sie dwukrotna objetoscio¬ wo iloscia wody, zawierajacej 1 jug Cu++ i Zn4* na kazde 5 jug z szacowanej ilosci orgoteiny, znajdujacej sie w krwinkach czerwonych i utrzymuje w temperaturze 70-75° C w ciagu 1-2 godzin przy pH o wartosci okolo 7, to znaczy w punkcie izoelektrycznym hemoglobiny.Nastepnie calosc rozciencza sie dwu-trzykrotnie, oziebia i odwirowuje otrzymana zawiesine w temperaturze 4°C. Po dializie i liofilizacji cieczy znad osadu otrzymuje sie zasadniczo czysta orgoteine.Przyklad II. Przygotowuje sie zawiesine przemytych i pozbawionych surowicy zamrozonych upako¬ wanych krwinek czerwonych z krwi konskiej w dwukrotnej objetosciowo ilosci wody i doprowadza pH do wartosci 5,5 za pomoca kwasu octowego. Nastepnie zawiesine utrzymuje sie w temperaturze 65°C wciagu 15 minut. Po oziebieniu do temperatury otoczenia lub nizszej odwirowuje sie wytracone bialka. pH cieczy doprowadza sie do wartosci 7,5 w celu wytracenia czerwonego barwnika i odwirowuje sie. Uzyskana ciecz znad osadu miesza sie z 3/4 objetosci acetonu, oziebionego lodem. Wytracony osad odwirowuje sie i odrzuca.Ponownie dodaje sie 3/4 objetosci zimnego acetonu i znów odwirowuje osad, zawierajacy okolo 50% orgoteiny.Po liofilizacji tego osadu uzyskuje sie surowa orgoteine, nadajaca sie do przechowywania.Zasadniczo czysta orgoteine mozna otrzymac z tak uzyskanej orgoteiny surowej na drodze saczenia przez sita molekularne, stosujac usieciowany dekstran o nazwie handlowej Sephadex G-75 w sposób, opisany w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 579 495 lub tez na drodze chromatografii jonowymiennej, stosujac dwuetyloaminoetyloceluloze w sposób opisany w przykladzie III opisu patentowego St. Zjedn. Amer. nr 3 637 640.Przyklad III. Postepuje sie zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie I lub II, lecz stosuje sie krwinki czerwone z krwi bydlecej, ludzkiej, kurzej, owczej lub swinskiej i ogrzewa sie przy pH, odpowiadajacemu punktom izoelektrycznym ich hemoglobiny, na przyklad, przy pH o wartosci 6,8-7,4, korzystnie okolo 7.6 89 367 Przyklad IV. Postepuje sie zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie I, II lub III, lecz ogrzewa sie krwinki czerwone bez wody lub tez w objetosci ró\-nej objetosci wody.Przyklad V. Postepuje sie w sposób, zasadniczo opisany w przykladzie II, lecz dodaje sie cala ilosc acetonu, to znaczy 1,5 objetosci, jednorazowo. Otrzymuje sie orgoteine mniej czysta. Rozcieranie osadu z minimalna iloscia wody pozwala na wyekstrahowanie orgoteiny z osadu. Po odwirowaniu uzyskuje sie roztwór orgoteiny o prawie tej samej czystosci, co orgoteina, otrzymana w przykladzie II.Przyklad VI. Postepuje sie zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie II lub III, lecz pomija sie pierwsze wirowanie.Przyklad VII. Postepuje sie zasadniczo wsposób, opisany wprzykladzie II, III, IV, lecz osad oddziela sie dopiero po dodaniu pierwszej porcji acetonu (3/4 objetosci).Przyklad VIII. Postepuje sie zasadniczo wsposób, opisany wprzykladzie I—VII, lecz utrzymuje sie calosc w temperaturze 80°C w ciagu okolo 30 minut.Przyklad IX. Postepuje sie zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie II, lecz wytracanie acetonem zastepuje sie ultrasaczeniem, w celu zmniejszenia objetosci cieczy, poddawanej nastepnie rozdzielaniu chromato¬ graficznemu.Przyklad X. Postepuje sie zasadniczo w sposób opisany w przykladzie II, lecz wytracanie acetonem zastepuje sie liofilizacja.Przyklad XI. Postepuje sie zasadniczo w sposób,opisany wprzykladzie I, lecz ogrzewa sie krwinki czerwone z krwi bydlecej lub ludzkiej po rozcienczeniu woda w stosunku 1 :2, przy pH o wartosci 7,0 w temperaturze 65°C w ciagu 18 godzin.Przyklad XII. Postepuje sie zasadniczo wsposób, opisany wprzykladzie II, stosujac czerwone krwinki z krwi bydlecej, konskiej, ludzkiej, kurzej, owczej lub swinskiej, lecz zastepuje sie etap wytracania acetonem trawieniem zanieczyszczen bialkowych za pomoca enzymów, na przyklad dodajac do cieczy znad osadu, otrzymanej w etapie ogrzewania, 1-3 mg pankreatyny na kazdy 1 ml wyjsciowych upakowanych krwinek czerwonych i poddajac inkubacji w temperaturze okolo 37°C w ciagu 15-48 godzin. Zasadniczo wszystkie bialka z wyjatkiem orgoteiny zostana rozlozone na male, ulegajac dializie fragmenty. Z tej trawionej mieszaniny mozna wyodrebnic zasadniczo czysta orgoteine na drodze ultrasaczenia.Przyklad XIII. Postepuje sie zasadniczo wsposób, opisany wprzykladzie I, lecz stosuje sie jako surowiec pelna krew, stabilizowana cytrynianem sodowym — srodkiem zapobiegawczym koagulacji.Miesza sie dwie objetosci swiezej krwi bydlecej, zawierajacej 85 mg/ml wszystkich bialek, a 20jtzg/ml orgoteiny, z 1 objetoscia 3,8% standardowego roztworu cytrynianu trójsodowego i 2 objetosciami wody, zawierajacej 25/ig/ml MCu" i 25jug/ml M Zn**, otrzymujac roztwór pelnej krwi zawierajacy 1 OOOjug jonów Cu1* i Zn41" na 100 ml. Calosc utrzymuje sie w temperaturze 75°C wciagu 2 godzin, a nastepnie oziebia sie do temperatury okolo 10°C, dodajac 150 ml wody z lodem. Takie rozcienczenie eliminuje koniecznosc oddzielnego przemywania. Po wirowaniu odwirowuje sie osad i oddziela 234 ml cieczy znad osadu. Ciecz ta zawiera 1,6 mg bialka, a w tym 12-17/ig/ml orgoteiny, co stanowi co najmniej 40-krotne oczyszczenie i 70% odzysk orgoteiny z krwi wyjsciowej. Stosujac zamiast krwi pelnej nieprzemyte krwinki czerwone, zawierajace 90 mg/ml wszystkich bialek, uzyskuje sie zwiekszenie odzysku orgoteiny do 90% i co najmniej 50- krotne oczyszczenie.Zasadniczo czysta orgoteine wyodrebnia sie z cieczy znad osadu na drodze liofilizacji sposobem, opisanym wprzykladzie I, lub tez na drodze saczenia przez sita molekularne, badz chromatograficznie na DEAE-celulozie, sposobami, opisanymi w przykladzie II.W celu dalszego oczyszczania orgoteiny przed wyodrebnieniem, opisanym powyzej, miesza sie 59 ml cieczy znad osadu, otrzymanej podczas oczyszczania termicznego, zawierajacej 12-17jug/ml orgoteiny z 50-150 mg pankreatyny i 0,1% azydku sodu — srodka, zapobiegajacego wzrostowi bakterii, i utrzymuje w temperaturze 37°C wciagu 15 godzin. Po oziebieniu otrzymuje sie roztwór, zawierajacy 1 mg/ml wszystkich bialek i 12/ig/ml orgoteiny.Prostote i wygode prowadzenia powyzej opisanych sposobów uzyskuje sie w pewnym stopniu kosztem czystosci orgoteiny, wyodrebnionej z cieczy znad osadu, otrzymanej po usunieciu wytraconych bialek z ogrza¬ nych krwinek czerwonych. Tak na przyklad, wytracanie acetonem prowadzi do uzyskania czysciejszej orgoteiny, ale wada jego jest koniecznosc stosowania rozpuszczalnika organicznego. Oczyszczanie chromatograficzne na wymieniaczu jonowym takim, jak DEAE-celuloza prowadzi do otrzymania orgoteiny o wysokim stopniu czystosci, ale wymaga z kolei etapu dializy w celu zmniejszenia sily jonowej do odpowiednio niskiego poziomu, i operowania duzymi objetosciami cieczy. Te ostatnia wade mozna wyeliminowac na drodze wstepnego zatezania cieczy znad osadu, stosujac liofilizacje lub zatezanie w niskiej temperaturze jedynie czesci cieczy znad osadu. Prowadzona periodycznie adsorpcja, polegajaca na wymieszaniu cieczy znad osadu z zywica jonowymien¬ na jest wygodniejsza od adsorpcji na kolumnie chromatograficznej, ale mniej wydajna. Liofilizacja, jezeli bez uprzedniej dializy, sama nie prowadzi do dobrego oczyszczania, ale jest bardzo wygodna do wyodrebniania orgoteiny z duzej objetosci cieczy znad osadu.U9 367 7 Przyklad XIV. Surowa orgoteine, otrzymana sposobem, opisanym w jakimkolwiek przykladzie, mozna wyodrebnic w czystej postaci, stosujac rozdzial chromatograficzny na sitach molekularnych. 2-5 g surowej orgoteiny przepuszcza sie przez kolumne o wymiarach 3,2,A,88,5 cm, przy calkowitej objetosci wypelnienia ~ 711,5 ml i objetosci wolnych przestrzeni — 265,5 ml, wypelniona zywica dekstranowa, usieciowa- na epichlorohydryna, o nazwie Sephadex G*75 Superfine (Pharmacia, Szwecja). Zbiera sie eluat w porcjach po ,4 ml i mierzy absorpcje przy dlugosci fali 265 i 280. Poczawszy od okolo 50 frakcji absorpcja wzrasta wyraznie i osiaga maksimum przy okolo 68 frakcji. Frakcje 66-73 zawieraja wiekszosc orgoteiny wstanie ultrat /ystym. Od frakcji 98 absorpcja ta spada do 0, az do frakcji okolo 116. Jedyne znaczace ilosci zanieczyszczenia pojawiaja sie w probówkach 45-60 i 118-150.W innym przypadku stosuje sie wodny roztwór, zawierajacy do okolo 10 g surowej orgoteiny, otrzymany w przykladzie I, Stosuje sie kolumne o wymiarach 2,5 X 30 cm przy objetosci wypelnienia 147 ml, wypelniona DEAE»ceiuloza o nazwie handlowej Fibrous DEAE-23 (Reeve~Angel), doprowadzona do pH o wartosci 6,0.Rozdzial prowadzi sie za pomoca 0,005 m roztworu buforu fosforanowego przy szybkosci przeplywu 240 ml/godz. Orgoteine eluuje sie 4 litrami tego samego buforu o stezeniu NaCI, wzrastajacym od 0 do 0,08 m.Mierzy sre zawartosc Cu i Zn oraz gestosc optyczna przy dlugosci fali 265 i 280 tak, jak to opisano na przyklad w zgloszeniu serii nr 205 610: Otrzymuje sie trzy glówne piki, kazdy bardzo wyrazny, przy 575 ml, 750 ml i 1425 ml eluatu. Orgoteina (drugi pik) jest obecna we frakcji eluatu, w której stosunek gestosci optycznej A205/A2S0 wynosi 1,27 i zawartosc Cu i Zn jest maksymalna. Frakcje od 750 ml do 1030 ml elautu (0,025^0,35 m) zawieraja zasadniczo cala orgoteine o wysokiej czystosci.Opisane przyklady mozna powtarzac z podobnym wynikiem, stosujac zamiast uzytych w przykladach, ogólnie lub szczególowo opisane w niniejszym opisie reagenty i/lub warunki prowadzenia procesu. PL