NO140982B - Fremgangsmaate ved utvinning av et orgoteinrikt proteinkonsentrat fra roede blodlegemer ved en ett-trinnsfremgangsmaate, hvilket konsentrat i det vesentlige er fri for hemoglobin og karbonsyreanhydrase - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den art som er angitt i krav l's ingress.

Orgotein utgjor en familie av proteinkongener med en karakteristisk kombinasjon av fysikalske, kjemiske og farmakologiske egenskaper. Hver og en av disse kongener karakteriseres fysi-kalskt av at de er den isolerte og i hovedsak rene formen av et kuleformet, buffervirkende og vannloselig protein med en meget kompakt naturlig form, som selv om den er ubestandig i varme,

er stabil ved oppvarming til f.eks. ca. 65°c i vann eller i en bufferlosning, som inneholder et salt av et toverdig metall med en ioneradius på 0,60 - 1,00 Å, og som ved gelelektroforese med pH 8,45 i 0,1 M tris-glycin-buffer . gir et karakteristisk

multipelbåndmonster. Kjemisk karakteriseres hver og en av disse kongener av at de inneholder samtlige, eller samtlige med unntagelse av 1 å 2, av de uunnværlige aminosyrene, videre en liten andel karbohydrat, ingen lipider, 0,1 - 1,0% metall, som utgjores av ca. 3-5 gramatomer pr. mol av ett eller flere chelaterte toverdige metaller med en ion-radius på 0,60 - 1,00 Å og i hovedsak ingen chelaterte enverdige metaller eller cellegifter i mole-kylet. Farmakodynamisk karakteriseres hver og en av kongenene ved at de er ikke-toksiske, immunologisk sett godt tolererbare, injiserbare proteiner hvis farmakologiske virkning omfatter anti-inflammatorisk virkning, som i likhet med den kompakte formen har samband med innholdet av det chelaterte to-verdige metallet. Immunologisk slektskap hos orgoteinkombener er tilstrekkelig

for at deres antistoffer, som fremstilles i en kanin eller noe annet egnet dyr, skal kunne igjenkjenne en eller flere andre orgoteinkongener, såsom et antigen og/eller for ett eller flere av antistoffene til andre orgoteinkongener å igjenkjenne det som et antigen og som bekreftes ved hjelp av gelimmuno-elektroforese og/eller gelimmunodiffusjon. Selv om visse fysikalske og kjemiske egenskaper og typen og graden av farma-kodynamisk virkning hos orgotein varierer fra kongener til kongener, så har alle orgoteinkongener den oven angitte kombinas-jonen av egenskaper.

Det fremgår av ferske litteraturdata at orgoteinfamilien av metallproteiner inkluderer de proteiner som tidligere ble isolert med forskjellige grader av renhet og som har fått navnene hepatokuprein, Mann & Keilin, Proe. Royal. Soc. for Biol.Sei., 126 303 (1939)5 cerebrokuprein, Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 1, 260 (1957); erytrokuprein, Markowitz et al., J. Biol. Chem., 234, 40 (1959); og cytokuprein; Carrico & Deutsch, J. Biol.

Chem. 244, 6087 (1969). Når det gjelder andre referanser se Mohamed & Greenberg, J. Gen. Physiol. 37, 433) (1954); Porter & Folch, Arch. Neurol. Psychiat. 77, 8 (1957); Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 5, 91 (1959); Krimmel et al., J. Biol. Chem.^ 234, 46 (1959); Wyman, Biochem. Biophys. Acta, 45, 387 (1960); Schields et al., J. Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowitz et al., Anal.Chem., 33, 1594 (1961); Porter et al., Arch. Biochem. Bioph., 105, 319 (1964), Stansell & Deutsch, J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965); ibid, 240, 4306 (1965); stansell & Deutsch, Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1966); McCord &Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 5753 (1969); Hartz & Deutsch, J. Biol. Chem., 244, 4565

(1969) McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6056 (1969); Carrico & Deutsch, ibid, 245, 723 (1970). Det har blitt rap-portert av disse metallproteiner innehar meget god superoksyd-dismutasevirkning, Se McCord &Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969); Keele, McCord og Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970); ibid, 246, 2875 (1971).

I det belgiske patent nr. 687.828 og det britiske patent nr. 1.160.151 beskrives en flertrinnsfremgangsmåte for isolering av orgotein fra animalsk vev, f.eks. okselever. I det amerikanske patentskriftet 3.687.927 beskrives en fremgangsmåte ifolge hvilken flere av prosess-trinnene kan utelates og hvorved utbyttet kan okes betydelig. I det amerikanske patentskriftet 3.579.495 beskrives en fremgangsmåte for isolering av orgotein fra rode blodlegemer ved hjelp av en flertrinnsfremgangsmåte, og hvorved man anvender en for-rensning i lbsningsmiddel for fjerning av hemoglobinet og et oppvarmningstrinn. Herved fås et totalt utbytte på ca. 0,01% beregnet på pakkede rode blod-legemer.

Ifolge visse oven anforte litteratur-referanser anvendes et kromatografisk rensningstrinn med DEAE-cellulose, som en del av en flertrinnsprosess for isolering av orgotein fra rode blodlegemer. Ved den enkleste av disse prosesser ble de rode blodlegemene befridd fra hemoglobin ved utfelling i lbsningsmiddel, hvorefter de ble fraksjonert ved hjelp av K^HPO^ og aceton. En del av de fraksjonerte loselige proteinene fra lyserede røde blodlegemer fra okse ble kromatografert ved pH 7,4, Herved erholdt man av 3 1 pakkede blodlegemer 190 mg orgotein med en superoksyd-dismutasevirkning på 3.300 enheter/mg (totalt utbytte 0,006%, utbytte av orgotein 60%). Selv om denne fremgangsmåte er akseptabel i laboratorie-skala, så kan den ikke konkurrere okonomisk med senere utviklede prosesser. Fremstillingen av f.eks. 1 kg orgotein skulle kreve over 7.500 1 kloroform, 4.500 1 etanol, 7.000 kg K2HP04 og 5.000 1 aceton hvis prosessen kjores i full skala.

I norsk patent nr. 137.641 beskrives en frem-

gangsmåte ifolge hvilken i hovedsak rent orgotein fås direkte fra rode blod-legemer i ett trinn ved ion-bytterkromatografi. Selv om fremgangsmåten ifolge denne patentansokning ikke oppviser de ulemper som er forbundet med anvendelse av et blandet løs-ningsmiddel og ammoniumsulfat som utfellingsmiddel, så har fremgangsmåten likevel den ulempen at store væske-volumer må kromatograferes, og dette krever kromatograf-soyler av til-svarende stbrrelse. Videre er mer enn 99,8% av de proteiner som kromatograferes ikke onskelige proteiner, og dette begrenser soylens livslengde og kromatograf-hastigheten.

Fremgangsmåten krever dialyse av hele lysåtet for redusering av lysatets ion-styrke til det onskede lave nivå. Det dialyserte lysåtet er ikke stabilt, og ion-byttersoylen blir tettet igjen av utfelte proteiner, selv om lysatet klares under påfylling av proven. Stromningshastigheten gjennom soylen er relativt lav, og soylens adsorpsjonskapasitet av orgotein reduseres ved adsorpsjon av store mengder proteinholdige forurensninger. Dessuten er selektiviteten av adsorpsjonselueringen av visse orgoteinkongener, f.eks. fra hest, dårligere enn andre. Mens fremgangsmåten ifolge ovennevnte patent således ..utgjør en betydelig forbedring sammenlignet med eldre fremgangsmåter for isolering av orgotein, så har også den nevnte fremgangsmåten sine mangler.

Det har nå funnet at disse ulemper kan elimineres

uten vesentlig påvirkning av okonomi og fremgangsmåtens enkelthet ved forbehandling av de rode blodlegemene, og hvorved man avstedkommer en losning som holder orgoteinet tilbake, men som i hovedsak er fri for hemoglobin og karbonsyreanhydrase. En slik losning kan kromatograferes ved anvendelse av en meget mindre kromatograf-soyle enn den som kreves når lycinbehandlede rode blodkropper anvendes. Dette gjelder spesielt hvis utgangs-losningen blir konsentrert for kromatograferingen, og som.ikke kan gjores uten videre med lyserede røde blodlegemer.

Da langt mindre enn 1% av de proteiner, som passerer gjennom kromatograf-soylen ved fremgangsmåten ifolge ovennevnte patent nr. 137.641, behøver å kromatograferes ved fremgangsmåten ifolge nærværende oppfinnelse for isolering av samme mengde orgotein, så blir livslengden for den harpiks, som anvendes for kromatograferingen, meget lengre. Videre blir stromningshastigheten bedre og harpiksens selektivitet blir hoyere, og herved kreves en mindre noye regulert eluering. 'Fremgangsmåten har den åpenbare fordel sammenlignet med fremgangsmåten ifolge det amerikanske patentskriftet nr. 3.579.495

at karbonanhydrasen og hemoglobinet i de rode blodlegemene, som utgjor ca. 99% av deres proteiner, fjernes samtidig uten anvendelse av organisk losningsmiddel.

Formålet med nærværende oppfinnelse er å avstedkomme en fremgangsmåte for isolering av orgotein fra rode blodlegemer, hvilken fremgangsmåte oppviser fordeler, enkelhet og anvendbarhet i kommersiell skala, og at man samtidig får et orgoteinkonsen-trat som er fritt for hemoglobin og karbonanhydrase, og fra hvilket konsentrat rent orgotein lettere kan fremstilles okonomisk i kommersiell skala.

Fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i krav 1's karakteriserende del.

Det er overraskanc.e at såvel hemoglobinet som karbonsyreanhydrasen kan utfelles selektivt i hovedsak fullstendig, mens orgoteinet bibeholdes i løsning, og da på grunn av den store andelen, dvs. i det minste 95%, av utgangsproteiner som utfelles. Hemoglobin er også et relativt varmestabilt protein. Oppvarmingen bevirker ingen større uløselighet av hemoglobinet utenfor det pH-område som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Fra svensk patent nr. 375.693 er det kjent å inaktivere karbonsyreanhydrase i et hemoglobinfritt hemolycat ved oppvarmning til over 60° i nærvær av en pufferoppløsning inneholdende to-verdige metallioner med en atomradius i området 0,69-0,80 Å, for så å frem-stille orgotein fra lycatet, etter at utfelte proteiner er fil-trert ved hjelp av filtrering eller sentrifugering.

I norsk patent nr. 131,839 er angitt en fremgangsmåte for en ytterligere rensning av i det vesentlige rent orgotein, ved at dette oppvarmes i en bufferoppløsning til minst 65°C i nærvær

av to-verdige metallioner med en radius 0,60-1,0 Å, hvilket fø-rer til at forurensende proteiner felles ut og kan fjernes på en passende måte. I patentet er gitt en kort omtale av fremstilling av orgotein fra okselever hvor en suspensjon av leveren omrøres i en iskald bufferoppløsning inneholdende Mn<++> ioner inntil i det vesentlige alt av de oppløselige proteiner er ekstrahert, hvoretter det utføres en fraksjonert felling ved hjelp av aceton, hvoretter den utfelte del oppløses i en kald maleat-buffer-oppløsning inneholdende Mn<++> ioner, hvoretter den erholdte opp-løsning holdes ved 60°C i ca. 20 min., hvoretter denaturerte

proteiner fjernes og gjenværende oppløste proteiner i bufferopp-løsningen felles ved tilsetning av etanol, hvoretter de utfelte proteiner igjen løses i en maleatbufferoppløsning inneholdende de tidligere nevnte ioner, hvoretter oppløsningen lyofiliseres og det erholdte faststoff løses i en kold tris-buffer inneholdende magnesiumioner, hvoretter en fraksjonert utfelling fra den kolde bufferoppløsning skjer ved hjelp av ammoniumsulfat. Fraksjonene som felles ved en metningsgrad på 45-75 % fraskil-les, oppløses i en kold tris-buffer inneholdende magnesiumioner og kromatograferes gjennom en egnet kolonne, hvoretter eluatet dialyseres i flere trinn. Ved denne relativt kompliserte fremgangsmåte kan det oppnåes orgotein med en renhet på over 90 %.

Det er meget overraskende at man ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fjerne i det vesentlige alt av tilstedeværende proteiner i blod, samt karbonsyreanhydrase kan fjernes i ett trinn uten at orgoteinet som utgjør mindre enn 0,1 % absorberes eller okuleres i de utfelte proteinbestanddeler.

Ifølge en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen følgende trinn: (1) Hele blodmengden blir utspedd med opptil 3, f.eks. 0,5 - 1,5 volumandeler vann;

(2) Hele blodmengden oppvarmes ved 65 - 76°C i 1 - 8

timer;

(3) Den oppvarmede blandingen kjoles, fortrinnsvis til minst 40°C og helst til romtemperatur eller lavere; (4) De utfelte proteinene separeres, fortrinnsvis ved sentrifugering; og (5) Det rå orgoteinet separeres fra den overliggende rest, fortrinnsvis ved hjelp av ion-bytterharpikskromatografi.

Ved andre utforelsesformer anvendes ett eller flere av folgende varianter av denne foretrukkede utforelsesform:

(a) I trinnet (1) anvendes serumfrie blodlegemer-,

suspendert i 1 - 3 volumdeler vann som utgangsmateriale for oppvarmingstrinnet;

(b) Oppvarmningen blir utfort ved en lavere temperatur i en lengre tidsperiode, f.eks. 60°C i 3 eller flere timer, eller ved en hoyere temperatur i en kortere tidsperiode, f.eks. 80°C

i 30 minutter til 1 time;

(c) Oppvarmningen utfores ved en pH-verdi på ca. 7; (d) Trinn (3) blir utfort etter eller i lopet av trinn (4); (e) Orgotein blir isolert fra den overliggende resten i trinn (5) ved utfelling med aceton eller ved hjelp av noe annet med vann blandbart organisk losningsmiddel; (f) Orgotein blir isolert fra den overliggende resten i trinn (5) ved ultrafiltrering eller ved frysetorking; og (g) En del av vannet blir fjernet fra den overliggende resten for isoleringen av orgoteinet ved destillering i vakuum, f.eks. ved 20— 60°C.

Oppvarmningstrinnet kan utfores på hele blodmengden, og dette foretrekkes da de mekaniske trinnene for fjerning av serumet og vasking av de pakkede rode blodlegemene elimineres. Oppvarmningstrinnet kan også utfores på serumfrie rode blod-legemer. Det sistnevnte oppvarmningstrinnet gir noe renere orgotein, men denne fordel oppveies av omkostningen for separering og vasking av de rode blodlegemene for oppvarmningen. Videre kan ytterligere proteinforbindelser separeres med minimal ekstra anstrengelse med et proteolytisk enzym som skal beskrives i det folgende. således er hele blodmengden det foretrukkede utgangsmaterialet.

Selv om oppvarmningen kan foretas på ikke utspedd helt blod eller serumfrie pakkede rode blodlegemer, så medforer dette mekaniske problemer med blanding og varmeoverforing. Derfor blandes hele blodet og spesielt de serumfrie rode blodlegemene fortrinnsvis med vann, f.eks. opp til ca. 3 volumdeler, fortrinnsvis 1-2 volumdeler, for oppvarmningen. Vannet kan,

hvis onsket, inneholde et buffermiddel og/eller en kilde for toverdige metallioner, f.eks. kobber og/eller sink, som fore-ligger i relativt lave konsentrasjoner, f.eks. under 0,05 M.

Når helt blod anvendes kan fritt natriumcitrat eller noen

annen koaguleringsinhibitor tilsettes for å forhindre koagulering for lyseringen av hemoglobinet.

Oppvarmningen skjer fortrinnsvis ved ca. det isoelektriske punktet for de rode blodlegemenes hemoglobin, nemlig ved ca. pH 7. Den isoelektriske pH-verdien for forskjellige hemoglobiner ligger innenfor området 6,5 - 7,5, vanligvis 6,7 - 7,4. Ved en lav pH-verdi, f.eks. under 5, denatureres hemoglobinet, men det utfelles bare partielt. Hemoglobin fra visse forsoksdyr, f.eks. okse og hest, utfelles ved samtlige pH-verdier innen området 5-8. Ovrig hemoglobin utfelles bare i nærheten av det aktuelle isoelektriske punkt.

pH-verdien hos rode blodlegemer kan innstilles med vilkårlig syre eller base.

Oppvarmningstrinnet foretas ved 60 - 80°C, fortrinnsvis

70 - 75°C, inntil alt eller hovedsakelig alt hemoglobin er utfelt. Den eksakte temperaturen og tiden er ikke kritisk så lenge hemoglobinet blir utfelt i hovedsak fullstendig Hoyere temperaturer og lengre oppvarmningstider fremmer totalt orgoteinutbyttet. Lavere temperaturer og kortere oppvarmningstider gir et mindre rent orgotein. 1-2 timer er til-strekkelig- ved ca. 75°C Oppvarmning i 1 time eller til og med lengre ved 60 - 75°C påvirker ikke merkbart det endelige utbyttet av rent orgotein. Oppvarmning ved 80°C i en time odelegger 1/4 til 3/4 av orgoteinet. Oppvarmningstrinnet kan utfores trinnvis eller kontinuerlig ved anvendelse av avlange oppvarmnings- og kjole-soner.

Varmelabile proteiner, inkludert enzymer, fjernes fra de røde blodlegemene ved varmedenaturering sammen med hemoglobinet.Karbonsyreanhydrasen er en dominerende komponent blant slike varmelabile proteiner. De rode blodlegemene oppvarmes inntil karbonsyreanhydrasen er inaktivert. Når det gjelder karbonsyreanhydrasens omfindtlighet overfor varme så henvises det til R.P. Davis,

The Enzymes, Volym 5, 545 (1961) Academic Press, New York

City.

Når hemoglobinet er utfelt har også karbonsyreanhydrasen og alle eller nesten alle andre varmelabile enzymer og ikke-enzymatiske proteiner i den overliggende resten blitt utfelt da hemoglobinet er mer stabilt. Ved f.eks. 60°C kreves vanligvis en oppvarmning i lengre tid enn 20 minutter for å inaktivere karbonsyreanhydrasen og de andre varmelabile proteinene, mens det ved en temperatur på 65° er til-strekkelig med 10 - 15 minutter .

Man kan lett kontrollere at hemoglobinutfellingen er fullstendig ved å observere fargen på den overliggende resten, hvilken bor være lys-klar.

Når man anvender gammelt blod kan det av og til hende at hele

den rode fargen hos hemoglobinet ikke folger med i utfellingen hvis oppvarmningen skjer ved sur pH-verdi. Hvis dette skjer for eller etter fjerningen av hemoglobinet, som er utfelt ved oppvarmning, kan restfargen utfelles ved innstilling av pH-verdien på 7 eller noe over, fortrinnsvis 7 - 7,5, for orgoteinet utfelles, f.eks. for eller etter separeringen av utfelt hemoglobin, og som f.eks. som del av for-utfellingen av strom-mende proteiner med aceton. Den utfelte rode fargen kan fjernes på samme måte som hemoglobinet, og som er utfelt ved oppvarmning.

Etter oppvarmningen kjoles de oppvarmede rode blodlegemene

til en temperatur under 50°C, fortrinnsvis ved romtemperatur eller kaldere, f.eks. ved gjennomstrømning gjennom en varme-veksler.

Hemoglobinet og andre proteiner som er utfelt ved oppvarmningen fjernes derefter, fortrinnsvis ved sentrifugering, og

kastes. Avsetting eller filtrering, fortrinnsvis vakuumfil-trering med filter-hjelpemiddel, såsom diatomé-jord kan også anvendes.

Etter fjerning av det utfelte hemoglobinet kan orgoteinet separeres fra den overliggende resten, f.eks. ved tilsetning av aceton til den kjolte løsningen, ved lyofilisering, ved ultrafiltrering eller ved adsorpsjon på og eluering fra en ionbytterharpiks-soyle.

En foretrukket metode for separering av orgoteinet fra resten

er ionbytterkromatografi, f.eks. ved anvendelse av den teknikk som beskrives i det amerikanske patentskriftet 3.579.495.

En spesielt foretrukket metode, som er lett anvendbar for fremstilling av store mengder orgotein, er å la resten,.som fås fra oppvarmningstrinnet, stromme gjennom DEAE-cellulose.

Ved denne fremgangsmåte får den overliggende resten, som har

en ion-styrke under 0,01 M;stromme over DEAS-cellulose eller en annen svakt basisk ion-byttersoyle, hvorved orgoteinet adsorberes på ion-bytterhapriksen. Soylen vaskes siden med vann eller en bufferlosning, som har en ion-styrke som er mindre enn ca. 0,01 M, hvoretter orgoteinet elueress ved en høyere ion-styrke, f.eks. ved 0,02 - 0,03 M. Alt etter de anvendte betingelsene kan rått orgotein, f.eks. med en renhet på 50%, eller meget rent orgotein elueres fra soylen.

Alternativt kan den overliggende resten renses ved molekylsikt-kromatografi, f.eks. får den gjennomstrømme en soyle med epiklorhydrinkryssbundet dekstranharpiks (Sephadex G-75 Superfine, Pharmacia, Sverige). I en produksjonsmodell kan soylens hode utbyttes slik at når overdelen av soylen har absorbert orgotein i en grad som tilsvarer soylens kapasitet, så kan hoveddelen fjernes og erstattes med fersk harpiks. Herved forblir resten av soylen intakt.

Den overliggende resten kan forrenses for isolering av orgoteinet fra resten ved tilsetning av et proteolytisk enzym.

Overraskende nok er orgotein i hovedsak inert mot nedbrytning

av proteolytiske enzymer. Således kan det rå orgoteinet i den overliggende resten renses ved selektiv spaltning av de fremmede proteinene, og da fortrinnsvis med Strep. griseus proteinas, pankreatin, subtilisin, papain eller bromelain,

og i et vektsforhold mellom enzym og proteiner i den overliggende resten på 1:2 til 1:1000, alt etter det valgte enzym og forholdet mellom fremmede proteiner og orgotein i blandingen. Rent eller i hovedsak rent orgotein kan isoleres fra den spaltede blandingen på konvensjonell måte, f.eks. ved ultrafiltrering. Proteinfragmentene fra den enzymatiske spalt-ningen og overskuddsioner kan enkelt fjernes fra den spaltede blandingen ved hjelp av dialyse for isoleringen av orgoteinet fra blandingen.

Hvis man onsker å separere orgoteinet fra den overliggende

resten (supernatant) i ett trinn, så kan orgoteinet utfelles fra resten med aceton. 1-15, volumdeler aceton, bereg-

net på væskevolumet som inneholder orgotein, er tilstrekkelig for utfelling av alt orgotein. Orgotein av hoyere renhet,

f.eks. ca. 50% eller mer, kan iblant forekomme ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen ved forutfelling av en del av de opploste proteinene med aceton. Hvis man anvender en mindre mengde aceton enn det nevnte volum, f.eks. 1/2 til 3/4 volum,

så utfelles meget lite, hvis overhodet noe orgotein med de fremmede proteinene. Etter fjerningen av de utfelte fremmede proteinene, f.eks. på den måte som er beskrevet ovenfor for fjerning av det utfelte hemoglobinet, så utfelles orgoteinet med resten av acetonet, f.eks. 3/4 til 1,5 volumdeler, beregnet på den utspedde losningen. Dette forutfellingstrinn med løsnings-midlet utfeller imidlertid meget lite proteinholdige foruren-

sninger hvis oppvarmningen skjer ved 75 - 80°C i en til to timer ved pH 7,0, og da på grunn av den fullstendige utfellingen som fås ved oppvarmningen.

Forutfellingen av de fremmede proteinene og orgoteinet skjer fortrinnsvis i kald losning, f.eks. ved 0 - 5°C. Imidlertid kan vilkårlig temperatur, f.eks. romtemperatur, anvendes opp til acetonets kokepunkt.

Aceton anvendes ved fremgangsmåten av økonomiske grunner.

Det tør imidlertid være helt åpenbart for fagmannen

at andre og dyrere blandbare løsningsmidler også kan anvendes for utfelling av orgoteinet, f..eks. metyletyl-keton, tetrahydrofuran og de funksjonsmessig med aceton ekvi-valente midlene.

Det utfelte orgoteinet bor befries for re;sten av losningsmidlet samt fra fuktighet så snart som mulig, f.eks. ved hjelp av frysetorking og liofilisering eller gjenopplosning med vann-holdige bærere for ytterligere rensing for å unngå orgotein-tap.

Selv om en orgoteinrik utfelling som er fri for hemoglobin og karbonanhydrase kan erholdes ved utfelling med aceton, så er den hemoglobinfrie overliggende resten meget egnet for molekyl-sikting eller svakt basisk ion-bytterkromatogråfering, f.eks. på den måte som beskrives i norsk patent nr.

13 7.641 eller i det amerikanske patentskriftet 3.579.495.

I det tilfelle da det ikke passer å kromatografere store ne ngder væske, så kan denne hemoglobinfrie resten konsen-treres for kromatograferingen ved ultrafiLtrering eller fryse-torkning. Trinnvis adsorpsjon av orgotein ved svakt basisk ion-bytter kan også anvendes.

I det folgende beskrives foretrukkede eksempler av fremgangs-, måten ifolge oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Vaskede erytrocyter fra okse lyseres i det doble

volumet vann, som inneholder 1 ;ug Cu <++> og Zn <++> for hver 5 p. g anslått mengde orgotein i de rode blodlegemene, og oppvarmning til 70 - 75°C i 1 - 2 timer ved en pH-verdi på ca. 7, dvs. hemoglobinets isoelektriske punkt. Deretter utspedes 2-3 ganger, avkjoling av blandingen og sentrifugering av den erholdte oppslemmingen ved 4°C. Deretter dialyseres og lyofilisej den overliggende resten (supernatant) som inneholder i hovedsak rent orgotein.

EKSEMPEL 2

Suspendering av vaskede og serumfrie, frossede og pakkede rode blodlegemer fra hest i det doble volumet vann. pH-innstilles til 5,5 med eddiksyre. Suspensjonen oppvarmes ved 65°c i 15 minutter. Suspensjonen avkjoles til romtemperatur eller kaldere og de utfelte proteinene fjernes ved sentrifugering. pH-verdien innstilles til 7,5 for utfelling av det rodfargede stoffet, hvoretter man sentrifugerer. Resten blandes med 3/4 volumdeler is-kjolt aceton.. Man sentrifugerer og kaster bort utfellingen. Deretter tilsettes for andre gangen 3/4 volumdeler kald aceton, og man sentrifugerer for separering av den erholdte utfellingen som består av ca. 50% orgotein. Man foretar frysetorking og lyofilisering av utfellingen for lagring av det rå orgoteinet.

Hovedsakelig rent orgotein kan isoleres av det således frem-stilte rå orgoteinet ved molekylsilgelfiltrering ved anvendelse av kryssbundet dekstran (Sephadex G-75), og som er beskrevet i det amerikanske patentskrift 3.579.495, eller ved ionbytter-harpikskromatografi med DEAE-cellulose som er beskrevet i eksempel 3 i det amerikanske patentskriftet 3.637.640 eller som er beskrevet i norsk patent nr. 137.641.

EKSEMPEL 3

Folg fremgangsmåten i eksempel 1 eller 2 ved anvendelse av rode blodlegemer fra okse, menneske, kylling, får eller svin, og oppvarm ved ca. deres respektive isoelektriske punkter for hemoglobin, f.eks. 6,8 - 7,4, fortrinnsvis pH 7,0.

EKSEMPEL 4

Folg fremgangsmåten i eksemplene 1, 3 eller 3, men med den forskjell at de rode blodlegemene oppvarmes ved nærvær av den samme volumdel vann.

EKSEMPEL 5

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men med den forskjell at

1 1/2 volumdeler aceton tilsettes på en gang. Orgotein med lavere renhet erholdes. Ved triturering av utfellingen med et minimalt volum vann ekstraheres orgoteinet selektivt fra utfellingen. Sentrifugeringen gir en losning av orgotein med ca. samme renhet som den som blir oppnådd ifolge eksempel 2.

EKSEMPEL 6

Folg fremgangsmåten i eksempel 2 eller 3, men med den forskjell at den forste sentrifugeringen slbyfes.

EKSEMPEL 7

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, 3, 4 eller 6, men med den forskjellen at ingen av utfellingene separeres for etter til-setningen av den forste 3/4 volumdelen aceton.

EKSEMPEL 8

Folg fremgangsmåten i noen av eksemplene 1 - 7, men med den forskjell at oppvarmningen skjer til 80°c i ca. 30 minutter i oppvarmningstrinnet.

EKSEMPEL 9

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men erstatt acetonutfellingen med ultrafiltrering for å redusere det volum som skal kromatograf eres .

EKSEMPEL 10

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men erstatt acetonutfellingen med lyofilisering.

EKSEMPEL 11

Folg fremgangsmåten i eksempel 1, men med den forskjell at

rode blodlegemer fra okse eller menneske som er utspedd med vann

i forholdet 1:2 oppvarmes ved pH 7,0 i 18 timer ved 65°c.

EKSEMPEL 12

Folg fremgangsmåten i eksempel 2 ved anvendelse av rode blod-legemer fra okse, hest, menneske, kylling, får eller svin,

men erstatt acetonutfellingen med en enzymatisk oppldsning av de proteinholdige forurensningene, f.eks. ved tilsetning til den overliggende resten fra oppvarmningstrinnet av 1 - 3 mg pankreatin pr. ml pakkede rode blodlegemer, hvorefter dette får stå ved ca. 37°C i 15 - 48 timer. I hovedsak alt protein med unntagelse for orgotein opploses til små dialyserbare fragmenter. I hovedsak rent orgotein kan isoleres fra den opploste blandingen ved hjelp av ultrafiltrering.

EKSEMPEL 13

Folg fremgangsmåten i eksempel 1 men anvend som utgangsmateriale helt blod som stabiliseres mot koagulering med natriumcitrat.

Man blander to volumdeler ferskt okseblod (85 mg/ml totalt protein, 20 p. q/ ml orgotein) med en volumdel 3,8%'ig standard-losning av fortynnet trinatriumcitrat og to volumdeler vann som inneholder 25 ug/ml M Cu<++>, og 25 ug/ml M Zn<++>, hvorved man erholder en blodlosning som inneholder 1000 ;ug Cu . Man oppvarmer til 75°C og holder denne temperatur i 2 timer. Man kjoler til ca. 10°C ved tilsetning av 150 ml isvann. Denne utspedde losning eliminerer også behovet for en separat vasking etter sentrifugering. Man sentrifugerer og separerer den overliggende rest (234 ml). Denne inneholder totalt 1,6 mg proteiner og 12 - 17 jug/ml orgotein, som tilsvarer i det minste en 40 gangers rensing og et 70%'ig utbytte av orgoteinet i ut-gangsblodet. Dette skal sammenlignes med et 90%'ig utbytte av orgotein og minst 50 gangers rensing når man går ut fra uvaskede rode blodlegemer (90 mg/ml totalt protein) i stedet for helt blod.

I hovedsak rent orgotein isoleres fra den overliggende resten ved lyofilisering, og da slik som beskrevet i eksempel 1,

eller ved molekylsilfiltrering eller DEAE-cellulosekromatografi som beskrevet i eksempel 2.

For ytterligere rensing av orgoteinet for isoleringen, og som

er beskrevet ovenfor blandes 59 ml av den overliggende resten fra varmerensingen, og som inneholder 12 - 17 p. q/ ml orgotein,

med 50 - 150 mg pankreatin og 0,1% natriumazid (for å forhindre bakterieformering), og dette holdes ved 37°C i 15 timer, hvoretter det hele kjoles. Losningen inneholder 1 mg/ml totalt protein og 12 ^ug/ml orgotein.

Ved utforelse av de oven angitte prosesstrinn balanseres

enkelhet og bekvemmelighet i en viss utstrekning mot den onskede renheten hos det orgotein som isoleres fra den overliggende rest, som fås etter fjerning av de utfelte proteinene fra de oppvarmede blodlegemene. Acetonutfellingen gir således et

renere orgotein, men har den ulempen at den krever anvendelse

av et organisk losningsmiddel. Ion-byttersoylekromatografi

med DEAE-cellulose gir orgotein med god renhet, men har den ulempen at den krever et dialysetrinn for å bringe ion-styrken til egnet lavt nivå, og nodvendiggjor dessuten kromatografi

av store væskevolum. Den senere ulempen kan imidlertid elimineres ved forkonsentrering av den overliggende resten ved hjelp av frysetorking eller lav temperaturfordampning av bare en del av den overliggende resten. Trinnvis adsorpsjon ved oppslemming av nevnte rest med en iom-bytterharpiks er lettere å utføre enn soylekromatografi, men er mindre effektiv. Lyofilisering gir ingen rensing i og for seg når man ikke forst foretar dialyse, men er meget egnet som metode for isolering av orgoteinet fra det store volumet av overliggende rest.

Renset orgotein

Det rå orgoteinet, som fås ifolge fremgangsmåten fra noen av

de forannevnte eksempler, kan isoleres i ren form ved hjelp av molekylsikt-gelkromatografi av opptil 2 - 5 g. av det rå orgoteinet i en soyle (3,2 cm x 88,5 cm, totalt sjiktvolum 711,5 ml, tom-volum 265,5 ml) av Sephadex G-75 Superfine (Pharmacia, Sverige) epiklorhydrin kryssbundet dekstranharpiks, hvoretter eluatet oppsamles i fraksjoner på 5,4 ml, og hvis absorp-sgonsverdier ved & 265 og A280 m^les> Me<a begynnelse ved fraksjon 50 går disse absorpsjonsverdier rett opp og når en topp ved fraksjonen 68. Fraksjonene 66 - 73 inneholder hoveddelen av det

totale orgoteinet i en ultrareh tilstand. Fra og med fraksjon 98 faller disse absorpsjonsverdier mot null frem til fraksjon 116. De eneste signifikante forurensningene opptrer i rorene 45 - 60

og rorene 118 - 150.

Alternativt tilfores en utspedd losning av opptil ca. 10 g

av det rå orgoteinet, som fås i eksempel 1, til en soyle (2,5 x 30 cm, sjiktvolum 147 ml) av DEAE-cellulose (fiber DEAE-23, Reeve-Angel) og det hele bringes til likevekt med

0,005 M fosfatbuffer med pH 6,0. Soylen kjores med en strom-ningshastighet på 240 ml/time med 0,005 M fosfatbuffer. Elu-

ering med orgoteinet avstedkommes med 4 1 av samme buffer med en NaCl-konsentrasjon som oker fra 0 til 0,08 M. Innholdet av kobber og sink samt eluatets absorpsjonsverdi ved A„,c og A~0,. måles,

Zoo ZoO '

f.eks. på den måte som er beskrevet i :TTdirsk patent nr.

137641. Tre topper opptrer, hvorved hver og en har en fin struktur, og hvis topper begynner ved 5 75 ml, 750 ml og 1.425 ml av eluatet. Orgoteinet (andre toppen) finnes i den del av eluatet hvor absorpsjonsverdiforholdet A265</A>28o er 1,27,

og hvor innholdet av kobber og sink er maksimalt. Andelen 750 ml - 1.030 ml (0,025 - 0,035 M) av eluatet inneholder i hovedsak alt orgotein i en hoy renhetsgrad.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved utvinning av et orgoteinrikt protein konsentrat fra røde blodlegemer ved en ett-trinnfremgangsmåte, hvilket konsentrat i det vesentlige er fri for hemoglobin og karbon-syreanhydråse, karakterisert ved at i det minste den bestanddel av helt blod som utgjøres av de røde blodlegemer, oppvarmes ved en pH mellom 5 og 8 til en temperatur mellom 6 0 og 8 0°C hvoretter den oppvarmede blanding avkjøles og den overliggende væske befries fra de utfelte proteiner.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at helblodet eller bestanddeler av helblodet før oppvarmning fortynnes med 3 volumdeler vann pr. 1 volumdeler blod.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at oppvarmningen utføres ved en pH på 6,8 - 7,4.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at oppløsningen inneholdende helblodet eller bestanddeler av helblodet oppvarmes til 65 - 7 <5>°C.