NO140982B

NO140982B - PROCEDURES FOR THE EXTRACTION OF AN ORGOTEIN - RICH PROTEIN CONCENTRATE FROM RED BLOOD BODIES BY A ONE-STEP PROCEDURE, WHICH IS ESSENTIALLY FREE OF HEMOGLOBIN AND CARBON

Info

Publication number: NO140982B
Application number: NO2935/73A
Authority: NO
Inventors: Wolfgang Huber; Mark Gary Saifer; Silver Heung Chow
Original assignee: Diagnostic Data Inc
Priority date: 1972-07-19
Filing date: 1973-07-18
Publication date: 1979-09-10
Also published as: RO63388A; DD104981A5; AT319472B; IN138517B; AU468022B2; DK134914B; CH602115A5; PH12009A; IT1043861B; IL40955A; JPS5331206B2; NO140982C; DE2306071A1; JPS4950112A; CS183633B2; AU4958272A; NL7300614A; FI48844B; FR2193027B1; SU578836A3

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den art som er angitt i krav l's ingress. The present invention relates to a method of the type specified in claim 1's preamble.

Orgotein utgjor en familie av proteinkongener med en karakteristisk kombinasjon av fysikalske, kjemiske og farmakologiske egenskaper. Hver og en av disse kongener karakteriseres fysi-kalskt av at de er den isolerte og i hovedsak rene formen av et kuleformet, buffervirkende og vannloselig protein med en meget kompakt naturlig form, som selv om den er ubestandig i varme, Orgotein forms a family of protein congeners with a characteristic combination of physical, chemical and pharmacological properties. Each and every one of these congeners is characterized physically by the fact that they are the isolated and essentially pure form of a globular, buffer-acting and water-soluble protein with a very compact natural form, which, although unstable in heat,

er stabil ved oppvarming til f.eks. ca. 65°c i vann eller i en bufferlosning, som inneholder et salt av et toverdig metall med en ioneradius på 0,60 - 1,00 Å, og som ved gelelektroforese med pH 8,45 i 0,1 M tris-glycin-buffer . gir et karakteristisk is stable when heated to e.g. about. 65°c in water or in a buffer solution, which contains a salt of a divalent metal with an ionic radius of 0.60 - 1.00 Å, and as by gel electrophoresis with pH 8.45 in 0.1 M tris-glycine buffer. gives a characteristic

multipelbåndmonster. Kjemisk karakteriseres hver og en av disse kongener av at de inneholder samtlige, eller samtlige med unntagelse av 1 å 2, av de uunnværlige aminosyrene, videre en liten andel karbohydrat, ingen lipider, 0,1 - 1,0% metall, som utgjores av ca. 3-5 gramatomer pr. mol av ett eller flere chelaterte toverdige metaller med en ion-radius på 0,60 - 1,00 Å og i hovedsak ingen chelaterte enverdige metaller eller cellegifter i mole-kylet. Farmakodynamisk karakteriseres hver og en av kongenene ved at de er ikke-toksiske, immunologisk sett godt tolererbare, injiserbare proteiner hvis farmakologiske virkning omfatter anti-inflammatorisk virkning, som i likhet med den kompakte formen har samband med innholdet av det chelaterte to-verdige metallet. Immunologisk slektskap hos orgoteinkombener er tilstrekkelig multiple band monster. Chemically, each of these congeners is characterized by the fact that they contain all, or all with the exception of 1 to 2, of the indispensable amino acids, further a small proportion of carbohydrate, no lipids, 0.1 - 1.0% metal, which is made up of about. 3-5 gram atoms per moles of one or more chelated divalent metals with an ionic radius of 0.60 - 1.00 Å and essentially no chelated monovalent metals or cytotoxic agents in the molecule. Pharmacodynamically, each of the congeners is characterized by the fact that they are non-toxic, immunologically well tolerated, injectable proteins whose pharmacological action includes anti-inflammatory action, which, like the compact form, is related to the content of the chelated divalent metal. Immunological relatedness in orgotein compounds is sufficient

for at deres antistoffer, som fremstilles i en kanin eller noe annet egnet dyr, skal kunne igjenkjenne en eller flere andre orgoteinkongener, såsom et antigen og/eller for ett eller flere av antistoffene til andre orgoteinkongener å igjenkjenne det som et antigen og som bekreftes ved hjelp av gelimmuno-elektroforese og/eller gelimmunodiffusjon. Selv om visse fysikalske og kjemiske egenskaper og typen og graden av farma-kodynamisk virkning hos orgotein varierer fra kongener til kongener, så har alle orgoteinkongener den oven angitte kombinas-jonen av egenskaper. for their antibodies, which are produced in a rabbit or any other suitable animal, to be able to recognize one or more other orgotein congeners, as an antigen and/or for one or more of the antibodies to other orgotein congeners to recognize it as an antigen and which is confirmed by using gel immunoelectrophoresis and/or gel immunodiffusion. Although certain physical and chemical properties and the type and degree of pharmacodynamic action of orgotein vary from congener to congener, all orgotein congeners have the combination of properties indicated above.

Det fremgår av ferske litteraturdata at orgoteinfamilien av metallproteiner inkluderer de proteiner som tidligere ble isolert med forskjellige grader av renhet og som har fått navnene hepatokuprein, Mann & Keilin, Proe. Royal. Soc. for Biol.Sei., 126 303 (1939)5 cerebrokuprein, Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 1, 260 (1957); erytrokuprein, Markowitz et al., J. Biol. Chem., 234, 40 (1959); og cytokuprein; Carrico & Deutsch, J. Biol. It appears from recent literature data that the orgotein family of metalloproteins includes those proteins that were previously isolated with varying degrees of purity and which have been given the names hepatocuprein, Mann & Keilin, Proe. Royal. Soc. for Biol.Sei., 126 303 (1939)5 cerebrocuprein, Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 1, 260 (1957); erythrocuprein, Markowitz et al., J. Biol. Chem., 234, 40 (1959); and cytocuprein; Carrico & Deutsch, J. Biol.

Chem. 244, 6087 (1969). Når det gjelder andre referanser se Mohamed & Greenberg, J. Gen. Physiol. 37, 433) (1954); Porter & Folch, Arch. Neurol. Psychiat. 77, 8 (1957); Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 5, 91 (1959); Krimmel et al., J. Biol. Chem.^ 234, 46 (1959); Wyman, Biochem. Biophys. Acta, 45, 387 (1960); Schields et al., J. Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowitz et al., Anal.Chem., 33, 1594 (1961); Porter et al., Arch. Biochem. Bioph., 105, 319 (1964), Stansell & Deutsch, J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965); ibid, 240, 4306 (1965); stansell & Deutsch, Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1966); McCord &Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 5753 (1969); Hartz & Deutsch, J. Biol. Chem., 244, 4565 Chem. 244, 6087 (1969). For other references see Mohamed & Greenberg, J. Gen. Physiol. 37, 433) (1954); Porter & Folch, Arch. Neurol. Psychiatrist. 77, 8 (1957); Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 5, 91 (1959); Krimmel et al., J. Biol. Chem.^ 234, 46 (1959); Wyman, Biochem. Biophys. Acta, 45, 387 (1960); Shields et al., J. Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowitz et al., Anal.Chem., 33, 1594 (1961); Porter et al., Arch. Biochem. Bioph., 105, 319 (1964), Stansell & Deutsch, J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965); ibid, 240, 4306 (1965); Stansell & Deutsch, Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1966); McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 5753 (1969); Hartz & Deutsch, J. Biol. Chem., 244, 4565

(1969) McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6056 (1969); Carrico & Deutsch, ibid, 245, 723 (1970). Det har blitt rap-portert av disse metallproteiner innehar meget god superoksyd-dismutasevirkning, Se McCord &Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969); Keele, McCord og Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970); ibid, 246, 2875 (1971). (1969) McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6056 (1969); Carrico & Deutsch, ibid, 245, 723 (1970). These metalloproteins have been reported to have very good superoxide dismutase activity, See McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969); Keele, McCord and Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970); ibid, 246, 2875 (1971).

I det belgiske patent nr. 687.828 og det britiske patent nr. 1.160.151 beskrives en flertrinnsfremgangsmåte for isolering av orgotein fra animalsk vev, f.eks. okselever. I det amerikanske patentskriftet 3.687.927 beskrives en fremgangsmåte ifolge hvilken flere av prosess-trinnene kan utelates og hvorved utbyttet kan okes betydelig. I det amerikanske patentskriftet 3.579.495 beskrives en fremgangsmåte for isolering av orgotein fra rode blodlegemer ved hjelp av en flertrinnsfremgangsmåte, og hvorved man anvender en for-rensning i lbsningsmiddel for fjerning av hemoglobinet og et oppvarmningstrinn. Herved fås et totalt utbytte på ca. 0,01% beregnet på pakkede rode blod-legemer. Belgian Patent No. 687,828 and British Patent No. 1,160,151 describe a multi-step process for isolating orgotein from animal tissue, e.g. beef liver. In US patent document 3,687,927, a method is described according to which several of the process steps can be omitted and whereby the yield can be increased significantly. In the US patent document 3,579,495, a method for isolating orgotein from red blood cells is described using a multi-step procedure, and in which a pre-purification in a solvent is used to remove the hemoglobin and a heating step. This results in a total yield of approx. 0.01% calculated on packed red blood cells.

Ifolge visse oven anforte litteratur-referanser anvendes et kromatografisk rensningstrinn med DEAE-cellulose, som en del av en flertrinnsprosess for isolering av orgotein fra rode blodlegemer. Ved den enkleste av disse prosesser ble de rode blodlegemene befridd fra hemoglobin ved utfelling i lbsningsmiddel, hvorefter de ble fraksjonert ved hjelp av K^HPO^ og aceton. En del av de fraksjonerte loselige proteinene fra lyserede røde blodlegemer fra okse ble kromatografert ved pH 7,4, Herved erholdt man av 3 1 pakkede blodlegemer 190 mg orgotein med en superoksyd-dismutasevirkning på 3.300 enheter/mg (totalt utbytte 0,006%, utbytte av orgotein 60%). Selv om denne fremgangsmåte er akseptabel i laboratorie-skala, så kan den ikke konkurrere okonomisk med senere utviklede prosesser. Fremstillingen av f.eks. 1 kg orgotein skulle kreve over 7.500 1 kloroform, 4.500 1 etanol, 7.000 kg K2HP04 og 5.000 1 aceton hvis prosessen kjores i full skala. According to certain literature references cited above, a chromatographic purification step with DEAE-cellulose is used as part of a multi-step process for isolating orgotein from red blood cells. In the simplest of these processes, the red blood cells were freed from hemoglobin by precipitation in solvent, after which they were fractionated using K^HPO^ and acetone. A part of the fractionated soluble proteins from lysed red blood cells from ox was chromatographed at pH 7.4. In this way, 190 mg of orgotein with a superoxide dismutase activity of 3,300 units/mg (total yield 0.006%, yield of orgotein 60%). Although this method is acceptable on a laboratory scale, it cannot compete economically with later developed processes. The production of e.g. 1 kg of orgotein would require over 7,500 l of chloroform, 4,500 l of ethanol, 7,000 kg of K2HP04 and 5,000 l of acetone if the process were run at full scale.

I norsk patent nr. 137.641 beskrives en frem- Norwegian patent no. 137,641 describes a development

gangsmåte ifolge hvilken i hovedsak rent orgotein fås direkte fra rode blod-legemer i ett trinn ved ion-bytterkromatografi. Selv om fremgangsmåten ifolge denne patentansokning ikke oppviser de ulemper som er forbundet med anvendelse av et blandet løs-ningsmiddel og ammoniumsulfat som utfellingsmiddel, så har fremgangsmåten likevel den ulempen at store væske-volumer må kromatograferes, og dette krever kromatograf-soyler av til-svarende stbrrelse. Videre er mer enn 99,8% av de proteiner som kromatograferes ikke onskelige proteiner, og dette begrenser soylens livslengde og kromatograf-hastigheten. procedure according to which essentially pure orgotein is obtained directly from red blood cells in one step by ion-exchange chromatography. Although, according to this patent application, the method does not exhibit the disadvantages associated with the use of a mixed solvent and ammonium sulfate as precipitant, the method still has the disadvantage that large volumes of liquid must be chromatographed, and this requires chromatograph soils of corresponding steering wheel. Furthermore, more than 99.8% of the proteins that are chromatographed are not desirable proteins, and this limits the lifespan of the soil and the speed of the chromatograph.

Fremgangsmåten krever dialyse av hele lysåtet for redusering av lysatets ion-styrke til det onskede lave nivå. Det dialyserte lysåtet er ikke stabilt, og ion-byttersoylen blir tettet igjen av utfelte proteiner, selv om lysatet klares under påfylling av proven. Stromningshastigheten gjennom soylen er relativt lav, og soylens adsorpsjonskapasitet av orgotein reduseres ved adsorpsjon av store mengder proteinholdige forurensninger. Dessuten er selektiviteten av adsorpsjonselueringen av visse orgoteinkongener, f.eks. fra hest, dårligere enn andre. Mens fremgangsmåten ifolge ovennevnte patent således ..utgjør en betydelig forbedring sammenlignet med eldre fremgangsmåter for isolering av orgotein, så har også den nevnte fremgangsmåten sine mangler. The method requires dialysis of the entire lysate to reduce the ion strength of the lysate to the desired low level. The dialysed lysate is not stable, and the ion-exchange oil is clogged again by precipitated proteins, even if the lysate is clarified during refilling of the sample. The flow rate through the soil is relatively low, and the soil's adsorption capacity of orgotein is reduced by adsorption of large amounts of proteinaceous contaminants. Moreover, the selectivity of the adsorption elution of certain orgotein congeners, e.g. from horse, worse than others. While the method according to the above-mentioned patent thus ..constitutes a significant improvement compared to older methods for isolating orgotein, the said method also has its shortcomings.

Det har nå funnet at disse ulemper kan elimineres It has now been found that these disadvantages can be eliminated

uten vesentlig påvirkning av okonomi og fremgangsmåtens enkelthet ved forbehandling av de rode blodlegemene, og hvorved man avstedkommer en losning som holder orgoteinet tilbake, men som i hovedsak er fri for hemoglobin og karbonsyreanhydrase. En slik losning kan kromatograferes ved anvendelse av en meget mindre kromatograf-soyle enn den som kreves når lycinbehandlede rode blodkropper anvendes. Dette gjelder spesielt hvis utgangs-losningen blir konsentrert for kromatograferingen, og som.ikke kan gjores uten videre med lyserede røde blodlegemer. without significant impact on economy and the simplicity of the procedure when pre-treating the red blood cells, and whereby a solution is obtained which retains the orgotein, but which is essentially free of hemoglobin and carbonic anhydrase. Such a solution can be chromatographed using a much smaller chromatograph soil than that required when lysine-treated red blood cells are used. This applies in particular if the starting solution is concentrated for the chromatography, and which cannot be done without further ado with lysed red blood cells.

Da langt mindre enn 1% av de proteiner, som passerer gjennom kromatograf-soylen ved fremgangsmåten ifolge ovennevnte patent nr. 137.641, behøver å kromatograferes ved fremgangsmåten ifolge nærværende oppfinnelse for isolering av samme mengde orgotein, så blir livslengden for den harpiks, som anvendes for kromatograferingen, meget lengre. Videre blir stromningshastigheten bedre og harpiksens selektivitet blir hoyere, og herved kreves en mindre noye regulert eluering. 'Fremgangsmåten har den åpenbare fordel sammenlignet med fremgangsmåten ifolge det amerikanske patentskriftet nr. 3.579.495 Since far less than 1% of the proteins that pass through the chromatograph soil in the method according to the above-mentioned patent no. the chromatography, much longer. Furthermore, the flow rate improves and the selectivity of the resin becomes higher, and a less carefully regulated elution is therefore required. 'The method has the obvious advantage compared to the method according to US Patent No. 3,579,495

at karbonanhydrasen og hemoglobinet i de rode blodlegemene, som utgjor ca. 99% av deres proteiner, fjernes samtidig uten anvendelse av organisk losningsmiddel. that the carbonic anhydrase and hemoglobin in the red blood cells, which make up approx. 99% of their proteins are removed simultaneously without the use of organic solvents.

Formålet med nærværende oppfinnelse er å avstedkomme en fremgangsmåte for isolering av orgotein fra rode blodlegemer, hvilken fremgangsmåte oppviser fordeler, enkelhet og anvendbarhet i kommersiell skala, og at man samtidig får et orgoteinkonsen-trat som er fritt for hemoglobin og karbonanhydrase, og fra hvilket konsentrat rent orgotein lettere kan fremstilles okonomisk i kommersiell skala. The purpose of the present invention is to create a method for isolating orgotein from red blood cells, which method shows advantages, simplicity and applicability on a commercial scale, and that at the same time you get an orgotein concentrate that is free of hemoglobin and carbonic anhydrase, and from which concentrate pure orgotein can more easily be produced economically on a commercial scale.

Fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i krav 1's karakteriserende del. The method is characterized by what is stated in claim 1's characterizing part.

Det er overraskanc.e at såvel hemoglobinet som karbonsyreanhydrasen kan utfelles selektivt i hovedsak fullstendig, mens orgoteinet bibeholdes i løsning, og da på grunn av den store andelen, dvs. i det minste 95%, av utgangsproteiner som utfelles. Hemoglobin er også et relativt varmestabilt protein. Oppvarmingen bevirker ingen større uløselighet av hemoglobinet utenfor det pH-område som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. It is surprising that both the hemoglobin and the carbonic anhydrase can be selectively precipitated essentially completely, while the orgotein is retained in solution, and then because of the large proportion, i.e. at least 95%, of starting proteins that are precipitated. Hemoglobin is also a relatively heat-stable protein. The heating causes no greater insolubility of the hemoglobin outside the pH range used in the method according to the invention.

Fra svensk patent nr. 375.693 er det kjent å inaktivere karbonsyreanhydrase i et hemoglobinfritt hemolycat ved oppvarmning til over 60° i nærvær av en pufferoppløsning inneholdende to-verdige metallioner med en atomradius i området 0,69-0,80 Å, for så å frem-stille orgotein fra lycatet, etter at utfelte proteiner er fil-trert ved hjelp av filtrering eller sentrifugering. From Swedish patent no. 375,693 it is known to inactivate carbonic anhydrase in a hemoglobin-free hemolycate by heating to above 60° in the presence of a buffer solution containing divalent metal ions with an atomic radius in the range 0.69-0.80 Å, and so on -still orgotein from the lycate, after precipitated proteins have been filtered by means of filtration or centrifugation.

I norsk patent nr. 131,839 er angitt en fremgangsmåte for en ytterligere rensning av i det vesentlige rent orgotein, ved at dette oppvarmes i en bufferoppløsning til minst 65°C i nærvær Norwegian patent no. 131,839 describes a method for further purification of essentially pure orgotein, by heating this in a buffer solution to at least 65°C in the presence of

av to-verdige metallioner med en radius 0,60-1,0 Å, hvilket fø-rer til at forurensende proteiner felles ut og kan fjernes på en passende måte. I patentet er gitt en kort omtale av fremstilling av orgotein fra okselever hvor en suspensjon av leveren omrøres i en iskald bufferoppløsning inneholdende Mn<++> ioner inntil i det vesentlige alt av de oppløselige proteiner er ekstrahert, hvoretter det utføres en fraksjonert felling ved hjelp av aceton, hvoretter den utfelte del oppløses i en kald maleat-buffer-oppløsning inneholdende Mn<++> ioner, hvoretter den erholdte opp-løsning holdes ved 60°C i ca. 20 min., hvoretter denaturerte of divalent metal ions with a radius of 0.60-1.0 Å, which causes contaminating proteins to precipitate out and can be removed in a suitable way. The patent gives a brief description of the production of orgotein from ox liver, where a suspension of the liver is stirred in an ice-cold buffer solution containing Mn<++> ions until essentially all of the soluble proteins have been extracted, after which a fractional precipitation is carried out using of acetone, after which the precipitated part is dissolved in a cold maleate buffer solution containing Mn<++> ions, after which the resulting solution is kept at 60°C for approx. 20 min., after which denatured

proteiner fjernes og gjenværende oppløste proteiner i bufferopp-løsningen felles ved tilsetning av etanol, hvoretter de utfelte proteiner igjen løses i en maleatbufferoppløsning inneholdende de tidligere nevnte ioner, hvoretter oppløsningen lyofiliseres og det erholdte faststoff løses i en kold tris-buffer inneholdende magnesiumioner, hvoretter en fraksjonert utfelling fra den kolde bufferoppløsning skjer ved hjelp av ammoniumsulfat. Fraksjonene som felles ved en metningsgrad på 45-75 % fraskil-les, oppløses i en kold tris-buffer inneholdende magnesiumioner og kromatograferes gjennom en egnet kolonne, hvoretter eluatet dialyseres i flere trinn. Ved denne relativt kompliserte fremgangsmåte kan det oppnåes orgotein med en renhet på over 90 %. proteins are removed and remaining dissolved proteins in the buffer solution are combined by adding ethanol, after which the precipitated proteins are again dissolved in a maleate buffer solution containing the previously mentioned ions, after which the solution is lyophilized and the solid obtained is dissolved in a cold tris buffer containing magnesium ions, after which a fractional precipitation from the cold buffer solution takes place with the aid of ammonium sulphate. The fractions that are common at a degree of saturation of 45-75% are separated, dissolved in a cold tris buffer containing magnesium ions and chromatographed through a suitable column, after which the eluate is dialysed in several steps. With this relatively complicated method, orgotein can be obtained with a purity of over 90%.

Det er meget overraskende at man ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fjerne i det vesentlige alt av tilstedeværende proteiner i blod, samt karbonsyreanhydrase kan fjernes i ett trinn uten at orgoteinet som utgjør mindre enn 0,1 % absorberes eller okuleres i de utfelte proteinbestanddeler. It is very surprising that with the method according to the invention, essentially all of the proteins present in blood can be removed, and carbonic anhydrase can be removed in one step without the orgotein, which makes up less than 0.1%, being absorbed or oculated in the precipitated protein components.

Ifølge en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen følgende trinn: (1) Hele blodmengden blir utspedd med opptil 3, f.eks. 0,5 - 1,5 volumandeler vann; According to a preferred embodiment, the method according to the invention comprises the following steps: (1) The entire amount of blood is diluted by up to 3, e.g. 0.5 - 1.5 parts by volume of water;

(2) Hele blodmengden oppvarmes ved 65 - 76°C i 1 - 8 (2) The entire blood volume is heated at 65 - 76°C for 1 - 8

timer; hours;

(3) Den oppvarmede blandingen kjoles, fortrinnsvis til minst 40°C og helst til romtemperatur eller lavere; (4) De utfelte proteinene separeres, fortrinnsvis ved sentrifugering; og (5) Det rå orgoteinet separeres fra den overliggende rest, fortrinnsvis ved hjelp av ion-bytterharpikskromatografi. (3) The heated mixture is cooled, preferably to at least 40°C and preferably to room temperature or lower; (4) The precipitated proteins are separated, preferably by centrifugation; and (5) The crude orgoteine is separated from the overlying residue, preferably by ion-exchange resin chromatography.

Ved andre utforelsesformer anvendes ett eller flere av folgende varianter av denne foretrukkede utforelsesform: In other embodiments, one or more of the following variants of this preferred embodiment are used:

(a) I trinnet (1) anvendes serumfrie blodlegemer-, (a) In step (1), serum-free blood cells are used,

suspendert i 1 - 3 volumdeler vann som utgangsmateriale for oppvarmingstrinnet; suspended in 1 - 3 parts by volume of water as starting material for the heating step;

(b) Oppvarmningen blir utfort ved en lavere temperatur i en lengre tidsperiode, f.eks. 60°C i 3 eller flere timer, eller ved en hoyere temperatur i en kortere tidsperiode, f.eks. 80°C (b) The heating is carried out at a lower temperature for a longer period of time, e.g. 60°C for 3 or more hours, or at a higher temperature for a shorter period of time, e.g. 80°C

i 30 minutter til 1 time; for 30 minutes to 1 hour;

(c) Oppvarmningen utfores ved en pH-verdi på ca. 7; (d) Trinn (3) blir utfort etter eller i lopet av trinn (4); (e) Orgotein blir isolert fra den overliggende resten i trinn (5) ved utfelling med aceton eller ved hjelp av noe annet med vann blandbart organisk losningsmiddel; (f) Orgotein blir isolert fra den overliggende resten i trinn (5) ved ultrafiltrering eller ved frysetorking; og (g) En del av vannet blir fjernet fra den overliggende resten for isoleringen av orgoteinet ved destillering i vakuum, f.eks. ved 20— 60°C. (c) The heating is carried out at a pH value of approx. 7; (d) Step (3) is carried out after or in the course of step (4); (e) Orgotein is isolated from the overlying residue in step (5) by precipitation with acetone or by means of some other water-miscible organic solvent; (f) Orgotein is isolated from the supernatant in step (5) by ultrafiltration or by freeze drying; and (g) Part of the water is removed from the supernatant for the isolation of the orgoteine by vacuum distillation, e.g. at 20-60°C.

Oppvarmningstrinnet kan utfores på hele blodmengden, og dette foretrekkes da de mekaniske trinnene for fjerning av serumet og vasking av de pakkede rode blodlegemene elimineres. Oppvarmningstrinnet kan også utfores på serumfrie rode blod-legemer. Det sistnevnte oppvarmningstrinnet gir noe renere orgotein, men denne fordel oppveies av omkostningen for separering og vasking av de rode blodlegemene for oppvarmningen. Videre kan ytterligere proteinforbindelser separeres med minimal ekstra anstrengelse med et proteolytisk enzym som skal beskrives i det folgende. således er hele blodmengden det foretrukkede utgangsmaterialet. The heating step can be performed on the entire blood volume, and this is preferred as the mechanical steps of removing the serum and washing the packed red blood cells are eliminated. The heating step can also be performed on serum-free red blood cells. The latter heating step gives somewhat purer orgotein, but this advantage is offset by the cost of separating and washing the red blood cells for heating. Furthermore, further protein compounds can be separated with minimal extra effort with a proteolytic enzyme to be described in the following. thus, whole blood is the preferred starting material.

Selv om oppvarmningen kan foretas på ikke utspedd helt blod eller serumfrie pakkede rode blodlegemer, så medforer dette mekaniske problemer med blanding og varmeoverforing. Derfor blandes hele blodet og spesielt de serumfrie rode blodlegemene fortrinnsvis med vann, f.eks. opp til ca. 3 volumdeler, fortrinnsvis 1-2 volumdeler, for oppvarmningen. Vannet kan, Although the heating can be carried out on undiluted whole blood or serum-free packed red blood cells, this entails mechanical problems with mixing and heat transfer. Therefore, the whole blood and especially the serum-free red blood cells are preferably mixed with water, e.g. up to approx. 3 parts by volume, preferably 1-2 parts by volume, for the heating. The water can,

hvis onsket, inneholde et buffermiddel og/eller en kilde for toverdige metallioner, f.eks. kobber og/eller sink, som fore-ligger i relativt lave konsentrasjoner, f.eks. under 0,05 M. if desired, contain a buffering agent and/or a source of divalent metal ions, e.g. copper and/or zinc, which are present in relatively low concentrations, e.g. below 0.05 M.

Når helt blod anvendes kan fritt natriumcitrat eller noen When whole blood is used, free sodium citrate or any

annen koaguleringsinhibitor tilsettes for å forhindre koagulering for lyseringen av hemoglobinet. other coagulation inhibitor is added to prevent coagulation for the lysis of the hemoglobin.

Oppvarmningen skjer fortrinnsvis ved ca. det isoelektriske punktet for de rode blodlegemenes hemoglobin, nemlig ved ca. pH 7. Den isoelektriske pH-verdien for forskjellige hemoglobiner ligger innenfor området 6,5 - 7,5, vanligvis 6,7 - 7,4. Ved en lav pH-verdi, f.eks. under 5, denatureres hemoglobinet, men det utfelles bare partielt. Hemoglobin fra visse forsoksdyr, f.eks. okse og hest, utfelles ved samtlige pH-verdier innen området 5-8. Ovrig hemoglobin utfelles bare i nærheten av det aktuelle isoelektriske punkt. The heating preferably takes place at approx. the isoelectric point for the hemoglobin of the red blood cells, namely at approx. pH 7. The isoelectric pH value of various hemoglobins lies within the range 6.5 - 7.5, usually 6.7 - 7.4. At a low pH value, e.g. below 5, the hemoglobin is denatured, but it is only partially precipitated. Hemoglobin from certain experimental animals, e.g. ox and horse, is precipitated at all pH values in the range 5-8. Other hemoglobin is only precipitated near the relevant isoelectric point.

pH-verdien hos rode blodlegemer kan innstilles med vilkårlig syre eller base. The pH value of red blood cells can be adjusted with any acid or base.

Oppvarmningstrinnet foretas ved 60 - 80°C, fortrinnsvis The heating step is carried out at 60 - 80°C, preferably

70 - 75°C, inntil alt eller hovedsakelig alt hemoglobin er utfelt. Den eksakte temperaturen og tiden er ikke kritisk så lenge hemoglobinet blir utfelt i hovedsak fullstendig Hoyere temperaturer og lengre oppvarmningstider fremmer totalt orgoteinutbyttet. Lavere temperaturer og kortere oppvarmningstider gir et mindre rent orgotein. 1-2 timer er til-strekkelig- ved ca. 75°C Oppvarmning i 1 time eller til og med lengre ved 60 - 75°C påvirker ikke merkbart det endelige utbyttet av rent orgotein. Oppvarmning ved 80°C i en time odelegger 1/4 til 3/4 av orgoteinet. Oppvarmningstrinnet kan utfores trinnvis eller kontinuerlig ved anvendelse av avlange oppvarmnings- og kjole-soner. 70 - 75°C, until all or mainly all hemoglobin is precipitated. The exact temperature and time are not critical as long as the hemoglobin is essentially completely precipitated. Higher temperatures and longer heating times promote total orgotein yield. Lower temperatures and shorter heating times produce a less pure orgotein. 1-2 hours is enough - at approx. 75°C Heating for 1 hour or even longer at 60 - 75°C does not appreciably affect the final yield of pure orgotein. Heating at 80°C for one hour decomposes 1/4 to 3/4 of the orgotein. The heating step can be carried out step by step or continuously by using elongated heating and dressing zones.

Varmelabile proteiner, inkludert enzymer, fjernes fra de røde blodlegemene ved varmedenaturering sammen med hemoglobinet.Karbonsyreanhydrasen er en dominerende komponent blant slike varmelabile proteiner. De rode blodlegemene oppvarmes inntil karbonsyreanhydrasen er inaktivert. Når det gjelder karbonsyreanhydrasens omfindtlighet overfor varme så henvises det til R.P. Davis, Heat-labile proteins, including enzymes, are removed from the red blood cells by heat denaturation together with the hemoglobin. Carbonic anhydrase is a dominant component among such heat-labile proteins. The red blood cells are heated until the carbonic anhydrase is inactivated. Regarding carbonic anhydrase's sensitivity to heat, reference is made to R.P. Davis,

The Enzymes, Volym 5, 545 (1961) Academic Press, New York The Enzymes, Volume 5, 545 (1961) Academic Press, New York

City. City.

Når hemoglobinet er utfelt har også karbonsyreanhydrasen og alle eller nesten alle andre varmelabile enzymer og ikke-enzymatiske proteiner i den overliggende resten blitt utfelt da hemoglobinet er mer stabilt. Ved f.eks. 60°C kreves vanligvis en oppvarmning i lengre tid enn 20 minutter for å inaktivere karbonsyreanhydrasen og de andre varmelabile proteinene, mens det ved en temperatur på 65° er til-strekkelig med 10 - 15 minutter . When the hemoglobin is precipitated, the carbonic anhydrase and all or almost all other heat-labile enzymes and non-enzymatic proteins in the overlying residue have also been precipitated as the hemoglobin is more stable. By e.g. At 60°C, heating for longer than 20 minutes is usually required to inactivate the carbonic anhydrase and the other heat-labile proteins, while at a temperature of 65°, 10 - 15 minutes is sufficient.

Man kan lett kontrollere at hemoglobinutfellingen er fullstendig ved å observere fargen på den overliggende resten, hvilken bor være lys-klar. One can easily check that hemoglobin precipitation is complete by observing the color of the overlying residue, which should be light-clear.

Når man anvender gammelt blod kan det av og til hende at hele When old blood is used, it can sometimes happen that it heals

den rode fargen hos hemoglobinet ikke folger med i utfellingen hvis oppvarmningen skjer ved sur pH-verdi. Hvis dette skjer for eller etter fjerningen av hemoglobinet, som er utfelt ved oppvarmning, kan restfargen utfelles ved innstilling av pH-verdien på 7 eller noe over, fortrinnsvis 7 - 7,5, for orgoteinet utfelles, f.eks. for eller etter separeringen av utfelt hemoglobin, og som f.eks. som del av for-utfellingen av strom-mende proteiner med aceton. Den utfelte rode fargen kan fjernes på samme måte som hemoglobinet, og som er utfelt ved oppvarmning. the red color of the hemoglobin is not included in the precipitation if the heating takes place at an acidic pH value. If this happens before or after the removal of the hemoglobin, which is precipitated by heating, the residual color can be precipitated by setting the pH value to 7 or something above, preferably 7 - 7.5, for the orgotein to precipitate, e.g. before or after the separation of precipitated hemoglobin, and which e.g. as part of the pre-precipitation of streaming proteins with acetone. The precipitated red color can be removed in the same way as the hemoglobin, which is precipitated by heating.

Etter oppvarmningen kjoles de oppvarmede rode blodlegemene After the heating, the heated red blood cells are dressed

til en temperatur under 50°C, fortrinnsvis ved romtemperatur eller kaldere, f.eks. ved gjennomstrømning gjennom en varme-veksler. to a temperature below 50°C, preferably at room temperature or colder, e.g. by flow through a heat exchanger.

Hemoglobinet og andre proteiner som er utfelt ved oppvarmningen fjernes derefter, fortrinnsvis ved sentrifugering, og The hemoglobin and other proteins precipitated by the heating are then removed, preferably by centrifugation, and

kastes. Avsetting eller filtrering, fortrinnsvis vakuumfil-trering med filter-hjelpemiddel, såsom diatomé-jord kan også anvendes. thrown away. Deposition or filtration, preferably vacuum filtration with a filter aid such as diatomaceous earth can also be used.

Etter fjerning av det utfelte hemoglobinet kan orgoteinet separeres fra den overliggende resten, f.eks. ved tilsetning av aceton til den kjolte løsningen, ved lyofilisering, ved ultrafiltrering eller ved adsorpsjon på og eluering fra en ionbytterharpiks-soyle. After removal of the precipitated hemoglobin, the orgotein can be separated from the overlying residue, e.g. by addition of acetone to the cooled solution, by lyophilization, by ultrafiltration or by adsorption on and elution from an ion exchange resin soyle.

En foretrukket metode for separering av orgoteinet fra resten A preferred method for separating the orgotein from the rest

er ionbytterkromatografi, f.eks. ved anvendelse av den teknikk som beskrives i det amerikanske patentskriftet 3.579.495. is ion exchange chromatography, e.g. using the technique described in US patent 3,579,495.

En spesielt foretrukket metode, som er lett anvendbar for fremstilling av store mengder orgotein, er å la resten,.som fås fra oppvarmningstrinnet, stromme gjennom DEAE-cellulose. A particularly preferred method, which is readily applicable to the production of large amounts of orgotein, is to pass the residue obtained from the heating step through DEAE cellulose.

Ved denne fremgangsmåte får den overliggende resten, som har By this procedure, the overlying remainder, which has

en ion-styrke under 0,01 M;stromme over DEAS-cellulose eller en annen svakt basisk ion-byttersoyle, hvorved orgoteinet adsorberes på ion-bytterhapriksen. Soylen vaskes siden med vann eller en bufferlosning, som har en ion-styrke som er mindre enn ca. 0,01 M, hvoretter orgoteinet elueress ved en høyere ion-styrke, f.eks. ved 0,02 - 0,03 M. Alt etter de anvendte betingelsene kan rått orgotein, f.eks. med en renhet på 50%, eller meget rent orgotein elueres fra soylen. an ionic strength below 0.01 M; current over DEAS cellulose or another weakly basic ion exchange soil, whereby the orgotein is adsorbed on the ion exchange matrix. The soil is then washed with water or a buffer solution, which has an ionic strength less than approx. 0.01 M, after which the orgoteine is eluted at a higher ionic strength, e.g. at 0.02 - 0.03 M. Depending on the conditions used, raw orgotein, e.g. with a purity of 50%, or very pure orgotein is eluted from the soil.

Alternativt kan den overliggende resten renses ved molekylsikt-kromatografi, f.eks. får den gjennomstrømme en soyle med epiklorhydrinkryssbundet dekstranharpiks (Sephadex G-75 Superfine, Pharmacia, Sverige). I en produksjonsmodell kan soylens hode utbyttes slik at når overdelen av soylen har absorbert orgotein i en grad som tilsvarer soylens kapasitet, så kan hoveddelen fjernes og erstattes med fersk harpiks. Herved forblir resten av soylen intakt. Alternatively, the overlying residue can be purified by molecular sieve chromatography, e.g. it is passed through a soyle of epichlorohydrin cross-linked dextran resin (Sephadex G-75 Superfine, Pharmacia, Sweden). In a production model, the head of the soylen can be replaced so that when the upper part of the soylen has absorbed orgotein to a degree corresponding to the soylen's capacity, the main part can be removed and replaced with fresh resin. In this way, the rest of the soil remains intact.

Den overliggende resten kan forrenses for isolering av orgoteinet fra resten ved tilsetning av et proteolytisk enzym. The overlying residue can be prepurified to isolate the orgotein from the residue by adding a proteolytic enzyme.

Overraskende nok er orgotein i hovedsak inert mot nedbrytning Surprisingly, orgotein is essentially inert to degradation

av proteolytiske enzymer. Således kan det rå orgoteinet i den overliggende resten renses ved selektiv spaltning av de fremmede proteinene, og da fortrinnsvis med Strep. griseus proteinas, pankreatin, subtilisin, papain eller bromelain, of proteolytic enzymes. Thus, the crude orgotein in the overlying residue can be purified by selective cleavage of the foreign proteins, preferably with Strep. griseus proteinase, pancreatin, subtilisin, papain or bromelain,

og i et vektsforhold mellom enzym og proteiner i den overliggende resten på 1:2 til 1:1000, alt etter det valgte enzym og forholdet mellom fremmede proteiner og orgotein i blandingen. Rent eller i hovedsak rent orgotein kan isoleres fra den spaltede blandingen på konvensjonell måte, f.eks. ved ultrafiltrering. Proteinfragmentene fra den enzymatiske spalt-ningen og overskuddsioner kan enkelt fjernes fra den spaltede blandingen ved hjelp av dialyse for isoleringen av orgoteinet fra blandingen. and in a weight ratio between enzyme and proteins in the overlying residue of 1:2 to 1:1000, depending on the enzyme chosen and the ratio between foreign proteins and orgotein in the mixture. Pure or substantially pure orgotein can be isolated from the cleaved mixture by conventional means, e.g. by ultrafiltration. The protein fragments from the enzymatic cleavage and excess ions can be easily removed from the cleaved mixture by means of dialysis for the isolation of the orgotein from the mixture.

Hvis man onsker å separere orgoteinet fra den overliggende If one wishes to separate the orgotein from the overlying one

resten (supernatant) i ett trinn, så kan orgoteinet utfelles fra resten med aceton. 1-15, volumdeler aceton, bereg- the residue (supernatant) in one step, then the orgotein can be precipitated from the residue with acetone. 1-15, parts by volume acetone, calculated

net på væskevolumet som inneholder orgotein, er tilstrekkelig for utfelling av alt orgotein. Orgotein av hoyere renhet, net on the liquid volume containing orgotein is sufficient for precipitation of all orgotein. Orgotein of higher purity,

f.eks. ca. 50% eller mer, kan iblant forekomme ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen ved forutfelling av en del av de opploste proteinene med aceton. Hvis man anvender en mindre mengde aceton enn det nevnte volum, f.eks. 1/2 til 3/4 volum, e.g. about. 50% or more can sometimes occur in the method according to the invention by pre-precipitating part of the dissolved proteins with acetone. If you use a smaller amount of acetone than the mentioned volume, e.g. 1/2 to 3/4 volume,

så utfelles meget lite, hvis overhodet noe orgotein med de fremmede proteinene. Etter fjerningen av de utfelte fremmede proteinene, f.eks. på den måte som er beskrevet ovenfor for fjerning av det utfelte hemoglobinet, så utfelles orgoteinet med resten av acetonet, f.eks. 3/4 til 1,5 volumdeler, beregnet på den utspedde losningen. Dette forutfellingstrinn med løsnings-midlet utfeller imidlertid meget lite proteinholdige foruren- then very little, if any, orgotein is precipitated with the foreign proteins. After the removal of the precipitated foreign proteins, e.g. in the manner described above for removing the precipitated hemoglobin, the orgotein is precipitated with the rest of the acetone, e.g. 3/4 to 1.5 parts by volume, calculated for the diluted solution. However, this pre-precipitation step with the solvent precipitates very little proteinaceous contaminants.

sninger hvis oppvarmningen skjer ved 75 - 80°C i en til to timer ved pH 7,0, og da på grunn av den fullstendige utfellingen som fås ved oppvarmningen. changes if the heating takes place at 75 - 80°C for one to two hours at pH 7.0, and then because of the complete precipitation obtained by heating.

Forutfellingen av de fremmede proteinene og orgoteinet skjer fortrinnsvis i kald losning, f.eks. ved 0 - 5°C. Imidlertid kan vilkårlig temperatur, f.eks. romtemperatur, anvendes opp til acetonets kokepunkt. The pre-precipitation of the foreign proteins and orgotein preferably takes place in a cold solution, e.g. at 0 - 5°C. However, arbitrary temperature, e.g. room temperature, is used up to the acetone's boiling point.

Aceton anvendes ved fremgangsmåten av økonomiske grunner. Acetone is used in the process for economic reasons.

Det tør imidlertid være helt åpenbart for fagmannen However, it dares to be completely obvious to the person skilled in the art

at andre og dyrere blandbare løsningsmidler også kan anvendes for utfelling av orgoteinet, f..eks. metyletyl-keton, tetrahydrofuran og de funksjonsmessig med aceton ekvi-valente midlene. that other and more expensive miscible solvents can also be used for precipitation of the orgotein, e.g. methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran and the agents functionally equivalent to acetone.

Det utfelte orgoteinet bor befries for re;sten av losningsmidlet samt fra fuktighet så snart som mulig, f.eks. ved hjelp av frysetorking og liofilisering eller gjenopplosning med vann-holdige bærere for ytterligere rensing for å unngå orgotein-tap. The precipitated orgotein should be freed from the rest of the solvent and from moisture as soon as possible, e.g. by freeze-drying and lyophilization or redissolving with aqueous carriers for further purification to avoid orgotein loss.

Selv om en orgoteinrik utfelling som er fri for hemoglobin og karbonanhydrase kan erholdes ved utfelling med aceton, så er den hemoglobinfrie overliggende resten meget egnet for molekyl-sikting eller svakt basisk ion-bytterkromatogråfering, f.eks. på den måte som beskrives i norsk patent nr. Although an orgotein-rich precipitate free of hemoglobin and carbonic anhydrase can be obtained by precipitation with acetone, the hemoglobin-free supernatant is very suitable for molecular sieving or weakly basic ion-exchange chromatography, e.g. in the manner described in Norwegian patent no.

13 7.641 eller i det amerikanske patentskriftet 3.579.495. 13 7,641 or in the US patent document 3,579,495.

I det tilfelle da det ikke passer å kromatografere store ne ngder væske, så kan denne hemoglobinfrie resten konsen-treres for kromatograferingen ved ultrafiLtrering eller fryse-torkning. Trinnvis adsorpsjon av orgotein ved svakt basisk ion-bytter kan også anvendes. In the event that it is not suitable to chromatograph large amounts of liquid, this hemoglobin-free residue can be concentrated for the chromatography by ultrafiltration or freeze-drying. Stepwise adsorption of orgotein by weakly basic ion exchange can also be used.

I det folgende beskrives foretrukkede eksempler av fremgangs-, måten ifolge oppfinnelsen. In the following, preferred examples of the method according to the invention are described.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Vaskede erytrocyter fra okse lyseres i det doble Washed erythrocytes from ox are lysed in duplicate

volumet vann, som inneholder 1 ;ug Cu <++> og Zn <++> for hver 5 p. g anslått mengde orgotein i de rode blodlegemene, og oppvarmning til 70 - 75°C i 1 - 2 timer ved en pH-verdi på ca. 7, dvs. hemoglobinets isoelektriske punkt. Deretter utspedes 2-3 ganger, avkjoling av blandingen og sentrifugering av den erholdte oppslemmingen ved 4°C. Deretter dialyseres og lyofilisej den overliggende resten (supernatant) som inneholder i hovedsak rent orgotein. volume of water, containing 1 µg of Cu <++> and Zn <++> for every 5 µg of estimated amount of orgotein in the red blood cells, and heating to 70 - 75°C for 1 - 2 hours at a pH value of approx. 7, i.e. the isoelectric point of hemoglobin. Then dilute 2-3 times, cool the mixture and centrifuge the obtained slurry at 4°C. The overlying residue (supernatant), which contains essentially pure orgotein, is then dialysed and lyophilized.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Suspendering av vaskede og serumfrie, frossede og pakkede rode blodlegemer fra hest i det doble volumet vann. pH-innstilles til 5,5 med eddiksyre. Suspensjonen oppvarmes ved 65°c i 15 minutter. Suspensjonen avkjoles til romtemperatur eller kaldere og de utfelte proteinene fjernes ved sentrifugering. pH-verdien innstilles til 7,5 for utfelling av det rodfargede stoffet, hvoretter man sentrifugerer. Resten blandes med 3/4 volumdeler is-kjolt aceton.. Man sentrifugerer og kaster bort utfellingen. Deretter tilsettes for andre gangen 3/4 volumdeler kald aceton, og man sentrifugerer for separering av den erholdte utfellingen som består av ca. 50% orgotein. Man foretar frysetorking og lyofilisering av utfellingen for lagring av det rå orgoteinet. Suspension of washed and serum-free, frozen and packed horse red blood cells in the double volume of water. The pH is adjusted to 5.5 with acetic acid. The suspension is heated at 65°c for 15 minutes. The suspension is cooled to room temperature or colder and the precipitated proteins are removed by centrifugation. The pH value is set to 7.5 to precipitate the red-coloured substance, after which centrifugation is carried out. The remainder is mixed with 3/4 parts by volume of ice-cold acetone. The precipitate is centrifuged and thrown away. Then, 3/4 parts by volume of cold acetone is added for the second time, and centrifuged to separate the precipitate obtained, which consists of approx. 50% orgotein. The precipitate is freeze-dried and lyophilized for storage of the raw orgotein.

Hovedsakelig rent orgotein kan isoleres av det således frem-stilte rå orgoteinet ved molekylsilgelfiltrering ved anvendelse av kryssbundet dekstran (Sephadex G-75), og som er beskrevet i det amerikanske patentskrift 3.579.495, eller ved ionbytter-harpikskromatografi med DEAE-cellulose som er beskrevet i eksempel 3 i det amerikanske patentskriftet 3.637.640 eller som er beskrevet i norsk patent nr. 137.641. Substantially pure orgotein can be isolated from the thus produced crude orgotein by molecular sieve gel filtration using cross-linked dextran (Sephadex G-75), and which is described in US Patent 3,579,495, or by ion exchange resin chromatography with DEAE cellulose which is described in example 3 in the US patent document 3,637,640 or which is described in Norwegian patent no. 137,641.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

Folg fremgangsmåten i eksempel 1 eller 2 ved anvendelse av rode blodlegemer fra okse, menneske, kylling, får eller svin, og oppvarm ved ca. deres respektive isoelektriske punkter for hemoglobin, f.eks. 6,8 - 7,4, fortrinnsvis pH 7,0. Follow the procedure in example 1 or 2 when using red blood cells from ox, human, chicken, sheep or pig, and heat at approx. their respective isoelectric points for hemoglobin, e.g. 6.8 - 7.4, preferably pH 7.0.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

Folg fremgangsmåten i eksemplene 1, 3 eller 3, men med den forskjell at de rode blodlegemene oppvarmes ved nærvær av den samme volumdel vann. Follow the procedure in examples 1, 3 or 3, but with the difference that the red blood cells are heated in the presence of the same volume of water.

EKSEMPEL 5 EXAMPLE 5

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men med den forskjell at Follow the procedure in example 2, but with the difference that

1 1/2 volumdeler aceton tilsettes på en gang. Orgotein med lavere renhet erholdes. Ved triturering av utfellingen med et minimalt volum vann ekstraheres orgoteinet selektivt fra utfellingen. Sentrifugeringen gir en losning av orgotein med ca. samme renhet som den som blir oppnådd ifolge eksempel 2. 1 1/2 volumes of acetone are added at once. Orgotein of lower purity is obtained. By trituring the precipitate with a minimal volume of water, the orgotein is selectively extracted from the precipitate. The centrifugation results in a release of orgotein with approx. the same purity as that obtained according to example 2.

EKSEMPEL 6 EXAMPLE 6

Folg fremgangsmåten i eksempel 2 eller 3, men med den forskjell at den forste sentrifugeringen slbyfes. Follow the procedure in example 2 or 3, but with the difference that the first centrifugation is delayed.

EKSEMPEL 7 EXAMPLE 7

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, 3, 4 eller 6, men med den forskjellen at ingen av utfellingene separeres for etter til-setningen av den forste 3/4 volumdelen aceton. Follow the procedure in example 2, 3, 4 or 6, but with the difference that none of the precipitates are separated after the addition of the first 3/4 volume of acetone.

EKSEMPEL 8 EXAMPLE 8

Folg fremgangsmåten i noen av eksemplene 1 - 7, men med den forskjell at oppvarmningen skjer til 80°c i ca. 30 minutter i oppvarmningstrinnet. Follow the procedure in some of the examples 1 - 7, but with the difference that the heating takes place to 80°c for approx. 30 minutes in the warm-up stage.

EKSEMPEL 9 EXAMPLE 9

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men erstatt acetonutfellingen med ultrafiltrering for å redusere det volum som skal kromatograf eres . Follow the procedure in Example 2, but replace the acetone precipitation with ultrafiltration to reduce the volume to be chromatographed.

EKSEMPEL 10 EXAMPLE 10

Folg fremgangsmåten i eksempel 2, men erstatt acetonutfellingen med lyofilisering. Follow the procedure in Example 2, but replace the acetone precipitation with lyophilization.

EKSEMPEL 11 EXAMPLE 11

Folg fremgangsmåten i eksempel 1, men med den forskjell at Follow the procedure in example 1, but with the difference that

rode blodlegemer fra okse eller menneske som er utspedd med vann ox or human red blood cells diluted with water

i forholdet 1:2 oppvarmes ved pH 7,0 i 18 timer ved 65°c. in the ratio 1:2 is heated at pH 7.0 for 18 hours at 65°c.

EKSEMPEL 12 EXAMPLE 12

Folg fremgangsmåten i eksempel 2 ved anvendelse av rode blod-legemer fra okse, hest, menneske, kylling, får eller svin, Follow the procedure in example 2 using red blood cells from ox, horse, human, chicken, sheep or pig,

men erstatt acetonutfellingen med en enzymatisk oppldsning av de proteinholdige forurensningene, f.eks. ved tilsetning til den overliggende resten fra oppvarmningstrinnet av 1 - 3 mg pankreatin pr. ml pakkede rode blodlegemer, hvorefter dette får stå ved ca. 37°C i 15 - 48 timer. I hovedsak alt protein med unntagelse for orgotein opploses til små dialyserbare fragmenter. I hovedsak rent orgotein kan isoleres fra den opploste blandingen ved hjelp av ultrafiltrering. but replace the acetone precipitation with an enzymatic dissolution of the proteinaceous contaminants, e.g. by adding to the overlying residue from the heating step 1 - 3 mg of pancreatin per ml of packed red blood cells, after which this is allowed to stand at approx. 37°C for 15 - 48 hours. Essentially all protein with the exception of orgotein dissolves into small dialyzable fragments. Essentially pure orgotein can be isolated from the dissolved mixture by ultrafiltration.

EKSEMPEL 13 EXAMPLE 13

Folg fremgangsmåten i eksempel 1 men anvend som utgangsmateriale helt blod som stabiliseres mot koagulering med natriumcitrat. Follow the procedure in example 1 but use as starting material whole blood which is stabilized against coagulation with sodium citrate.

Man blander to volumdeler ferskt okseblod (85 mg/ml totalt protein, 20 p. q/ ml orgotein) med en volumdel 3,8%'ig standard-losning av fortynnet trinatriumcitrat og to volumdeler vann som inneholder 25 ug/ml M Cu<++>, og 25 ug/ml M Zn<++>, hvorved man erholder en blodlosning som inneholder 1000 ;ug Cu . Man oppvarmer til 75°C og holder denne temperatur i 2 timer. Man kjoler til ca. 10°C ved tilsetning av 150 ml isvann. Denne utspedde losning eliminerer også behovet for en separat vasking etter sentrifugering. Man sentrifugerer og separerer den overliggende rest (234 ml). Denne inneholder totalt 1,6 mg proteiner og 12 - 17 jug/ml orgotein, som tilsvarer i det minste en 40 gangers rensing og et 70%'ig utbytte av orgoteinet i ut-gangsblodet. Dette skal sammenlignes med et 90%'ig utbytte av orgotein og minst 50 gangers rensing når man går ut fra uvaskede rode blodlegemer (90 mg/ml totalt protein) i stedet for helt blod. Two parts by volume of fresh ox blood (85 mg/ml total protein, 20 µg/ml orgotein) are mixed with one part by volume of a 3.8% standard solution of diluted trisodium citrate and two parts by volume of water containing 25 ug/ml M Cu< ++>, and 25 ug/ml M Zn<++>, whereby a blood discharge containing 1000 ;ug Cu is obtained. It is heated to 75°C and maintained at this temperature for 2 hours. One dresses for approx. 10°C by adding 150 ml of ice water. This diluted solution also eliminates the need for a separate wash after centrifugation. The supernatant (234 ml) is centrifuged and separated. This contains a total of 1.6 mg of proteins and 12 - 17 ug/ml orgotein, which corresponds to at least a 40-fold purification and a 70% yield of the orgotein in the starting blood. This should be compared with a 90% yield of orgotein and at least 50 times purification when starting from unwashed red blood cells (90 mg/ml total protein) instead of whole blood.

I hovedsak rent orgotein isoleres fra den overliggende resten ved lyofilisering, og da slik som beskrevet i eksempel 1, Essentially pure orgotein is isolated from the overlying residue by lyophilization, and then as described in example 1,

eller ved molekylsilfiltrering eller DEAE-cellulosekromatografi som beskrevet i eksempel 2. or by molecular sieve filtration or DEAE cellulose chromatography as described in example 2.

For ytterligere rensing av orgoteinet for isoleringen, og som For further purification of the orgotein for the isolation, and as

er beskrevet ovenfor blandes 59 ml av den overliggende resten fra varmerensingen, og som inneholder 12 - 17 p. q/ ml orgotein, is described above, mix 59 ml of the overlying residue from the heat purification, and which contains 12 - 17 p.q/ml orgotein,

med 50 - 150 mg pankreatin og 0,1% natriumazid (for å forhindre bakterieformering), og dette holdes ved 37°C i 15 timer, hvoretter det hele kjoles. Losningen inneholder 1 mg/ml totalt protein og 12 ^ug/ml orgotein. with 50 - 150 mg of pancreatin and 0.1% sodium azide (to prevent bacterial growth), and this is kept at 37°C for 15 hours, after which the whole is dressed. The solution contains 1 mg/ml total protein and 12 µg/ml orgotein.

Ved utforelse av de oven angitte prosesstrinn balanseres When carrying out the process steps stated above, balancing is carried out

enkelhet og bekvemmelighet i en viss utstrekning mot den onskede renheten hos det orgotein som isoleres fra den overliggende rest, som fås etter fjerning av de utfelte proteinene fra de oppvarmede blodlegemene. Acetonutfellingen gir således et simplicity and convenience to some extent against the desired purity of the orgotein isolated from the overlying residue obtained after removal of the precipitated proteins from the heated corpuscles. The acetone precipitation thus gives a

renere orgotein, men har den ulempen at den krever anvendelse purer orgotein, but has the disadvantage that it requires application

av et organisk losningsmiddel. Ion-byttersoylekromatografi of an organic solvent. Ion-exchange soil chromatography

med DEAE-cellulose gir orgotein med god renhet, men har den ulempen at den krever et dialysetrinn for å bringe ion-styrken til egnet lavt nivå, og nodvendiggjor dessuten kromatografi with DEAE-cellulose gives orgotein of good purity, but has the disadvantage that it requires a dialysis step to bring the ionic strength to a suitable low level, and also requires chromatography

av store væskevolum. Den senere ulempen kan imidlertid elimineres ved forkonsentrering av den overliggende resten ved hjelp av frysetorking eller lav temperaturfordampning av bare en del av den overliggende resten. Trinnvis adsorpsjon ved oppslemming av nevnte rest med en iom-bytterharpiks er lettere å utføre enn soylekromatografi, men er mindre effektiv. Lyofilisering gir ingen rensing i og for seg når man ikke forst foretar dialyse, men er meget egnet som metode for isolering av orgoteinet fra det store volumet av overliggende rest. of large liquid volumes. However, the latter disadvantage can be eliminated by pre-concentration of the overlying residue by means of freeze-drying or low temperature evaporation of only part of the overlying residue. Stepwise adsorption by slurrying said residue with an ion-exchange resin is easier to perform than soil chromatography, but is less efficient. Lyophilization does not provide any purification in and of itself when dialysis is not first carried out, but is very suitable as a method for isolating the orgotein from the large volume of overlying residue.

Renset orgotein Purified orgotein

Det rå orgoteinet, som fås ifolge fremgangsmåten fra noen av The crude orgotein, which is obtained according to the procedure of some of

de forannevnte eksempler, kan isoleres i ren form ved hjelp av molekylsikt-gelkromatografi av opptil 2 - 5 g. av det rå orgoteinet i en soyle (3,2 cm x 88,5 cm, totalt sjiktvolum 711,5 ml, tom-volum 265,5 ml) av Sephadex G-75 Superfine (Pharmacia, Sverige) epiklorhydrin kryssbundet dekstranharpiks, hvoretter eluatet oppsamles i fraksjoner på 5,4 ml, og hvis absorp-sgonsverdier ved & 265 og A280 m^les> Me<a begynnelse ved fraksjon 50 går disse absorpsjonsverdier rett opp og når en topp ved fraksjonen 68. Fraksjonene 66 - 73 inneholder hoveddelen av det the aforementioned examples, can be isolated in pure form by means of molecular sieve gel chromatography of up to 2 - 5 g. of the crude orgotheine in a soil (3.2 cm x 88.5 cm, total bed volume 711.5 ml, void volume 265.5 ml) of Sephadex G-75 Superfine (Pharmacia, Sweden) epichlorohydrin cross-linked dextran resin, after which the eluate is collected in fractions of 5.4 ml, and whose absorbance values at fraction 50, these absorption values go straight up and reach a peak at fraction 68. Fractions 66 - 73 contain the bulk of the

totale orgoteinet i en ultrareh tilstand. Fra og med fraksjon 98 faller disse absorpsjonsverdier mot null frem til fraksjon 116. De eneste signifikante forurensningene opptrer i rorene 45 - 60 total orgotein in an ultrareh state. Starting with fraction 98, these absorption values fall towards zero until fraction 116. The only significant impurities appear in the rudders 45 - 60

og rorene 118 - 150. and the rudders 118 - 150.

Alternativt tilfores en utspedd losning av opptil ca. 10 g Alternatively, a diluted solution of up to approx. 10 g

av det rå orgoteinet, som fås i eksempel 1, til en soyle (2,5 x 30 cm, sjiktvolum 147 ml) av DEAE-cellulose (fiber DEAE-23, Reeve-Angel) og det hele bringes til likevekt med of the crude orgotein obtained in Example 1 to a bed (2.5 x 30 cm, bed volume 147 ml) of DEAE cellulose (fiber DEAE-23, Reeve-Angel) and the whole is brought to equilibrium with

0,005 M fosfatbuffer med pH 6,0. Soylen kjores med en strom-ningshastighet på 240 ml/time med 0,005 M fosfatbuffer. Elu- 0.005 M phosphate buffer with pH 6.0. The soil is run at a flow rate of 240 ml/hour with 0.005 M phosphate buffer. Elu-

ering med orgoteinet avstedkommes med 4 1 av samme buffer med en NaCl-konsentrasjon som oker fra 0 til 0,08 M. Innholdet av kobber og sink samt eluatets absorpsjonsverdi ved A„,c og A~0,. måles, eration with the orgotein is carried out with 4 1 of the same buffer with a NaCl concentration that increases from 0 to 0.08 M. The content of copper and zinc as well as the absorption value of the eluate at A„,c and A~0,. measured,

Zoo ZoO ' Zoo ZoO'

f.eks. på den måte som er beskrevet i :TTdirsk patent nr. e.g. in the manner described in :TTirsk patent no.

137641. Tre topper opptrer, hvorved hver og en har en fin struktur, og hvis topper begynner ved 5 75 ml, 750 ml og 1.425 ml av eluatet. Orgoteinet (andre toppen) finnes i den del av eluatet hvor absorpsjonsverdiforholdet A265</A>28o er 1,27, 137641. Three peaks appear, each having a fine structure, and whose peaks begin at 575 ml, 750 ml and 1425 ml of the eluate. The orgotein (second peak) is found in the part of the eluate where the absorption value ratio A265</A>28o is 1.27,

og hvor innholdet av kobber og sink er maksimalt. Andelen 750 ml - 1.030 ml (0,025 - 0,035 M) av eluatet inneholder i hovedsak alt orgotein i en hoy renhetsgrad. and where the content of copper and zinc is maximum. The portion 750 ml - 1,030 ml (0.025 - 0.035 M) of the eluate essentially contains all orgotein in a high degree of purity.

Claims

1. Process for extracting an orgotein-rich protein concentrate from red blood cells in a one-step process, which concentrate is essentially free of hemoglobin and carbonic anhydrase, characterized in that at least the component of whole blood which is made up of the red blood cells, is heated at a pH between 5 and 8 to a temperature between 60 and 80°C, after which the heated mixture is cooled and the overlying liquid is freed from the precipitated proteins.

2. Method according to claim 1, characterized in that the whole blood or components of the whole blood are diluted with 3 parts by volume of water before heating. 1 volume parts blood.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the heating is carried out at a pH of 6.8 - 7.4.

4. Method according to claims 1-3, characterized in that the solution containing the whole blood or components of the whole blood is heated to 65 - 7<5>°C.