CN109010330B - 染料木黄酮在降低后口动物体内n-羟乙酰神经氨酸方面的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种染料木黄酮在降低后口动物体内N‑羟乙酰神经氨酸方面的用途，属于生物化学技术领域。本发明提供的实验证明，染料木黄酮能够抑制动物体Neu5Gc的生物合成，安全无毒副作用，对肉的食用品质及营养价值无影响。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体来说涉及一种染料木黄酮在降低后口动物体内N-羟乙酰神经氨酸方面的用途。
背景技术
大量流行病学资料显示，红肉及其加工肉类的过多摄入与癌症的发生密切相关。红肉可能是导致某些肿瘤的原因之一。充分的流行病学证据表明红肉和加工肉类是导致结肠/直肠癌的因素之一；红肉是导致食管癌、肺癌、胰腺癌及子宫内膜癌的原因之一；加工肉类是导致食管癌、肺癌、胃癌及前列腺癌的原因之一。过多食用红肉和加工肉类会使患肺癌和直肠癌的风险增加20％，会使患肠癌的风险增加30％。而红肉中致癌的高风险物质是免疫原性的N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)，人体中的Neu5Gc主要是通过摄人红肉而在人体内积累。Neu5Gc的摄人使机体内产生识别Neu5Gc的抗体，会促进慢性炎症的发生，从而刺激肿瘤的生长，因此，Neu5Gc附在肿瘤细胞表面，实际上是间接地促进了癌症的生长。
红肉属于营养丰富、味道鲜美的优质食材，是优质蛋白和许多重要微量元素如铁、硒、维生素A、维生素B6维生素D和维生素B12、叶酸、ω-3多不饱和脂肪酸和共轭亚油酸的来源，但是由于其存在Neu5Gc等致癌风险物质，消费者在摄人红肉获取营养物质的同时，也伴随Neu5Gc在人体内的堆积，这使得消费者对红肉的食用开始抗拒。因此，在食品领域对红肉Neu5Gc的解离方法的探索显得尤为重要和迫在眉睫。
目前，关于Neu5Gc解离的研究大多集中在宰后环节，如蒋芸等分别采用水煮、微波炉加热、有机酸腌制和半乳糖苷酶水解等方法处理猪肉和牛肉，发现他们对降低产品中Neu5Gc含量有着不同程度的效果；A.瓦基等研究证实通过有效量或递增量的游离或糖苷结合的N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、或其类似物或衍生物培养包含Neu5Gc的细胞系，能够降低细胞系及由细胞系所产生的产品中Neu5Gc的含量；Elaine A等研究了Neu5Gc的生物合成路径，发现单核苷酸能抑制关键酶胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)的活性，其中胞苷-5`磷酸抑制效果最好。这些降低或解离Neu5Gc的方法还停留在细胞实验或是烹饪前处理，该类方法在某种层面上对肉的食用品质和营养价值有影响；且不能降低宰前活体内Neu5Gc的含量，至今为止，在动物活体内还没有相关文献报道降低Neu5Gc的含量方法。
染料木黄酮(genistein，Gen，结构式I)是从大豆中提取的异黄酮类化合物，化学名为4’,5,7-三羟基异黄酮，是大豆异黄酮的主要活性成分。在畜牧生产中，大豆异黄酮具有抗氧化、抗应激、提高机体免疫力和抗菌等生理作用，能够改善肉的品质，且因其具有安全、绿色、无污染、可天然提取等优点，目前已被广泛应用于人类健康及饲料添加剂中发挥其营养作用。染料木黄酮还是表皮生长因子受体(EGFR)特异性的抑制剂，抑制了配体与EGFR的结合，使EGFR的酪氨酸残基不能磷酸化，细胞活化受阻，因此抑制了T细胞的活化、增殖，具有强大的免疫抑制作用，高剂量(>10μmol)时具有抑制酪氨酸蛋白激酶及DNA拓扑异构酶II活性的作用；低剂量(<10μmol)时表现为植物雌激素样作用，有助于保护血管、调节血清胆固醇水平、抗氧化剂防止动脉粥样硬化。Subbayamma Atluru等在体外实验中已证实染料木黄酮能抑制IL-2的产生和IL-2R的表达。且具有抗肿瘤作用。但此抗肿瘤作用主要是基于肿瘤已经发生，通过诱导T淋巴瘤细胞、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌细胞的凋亡来发挥抗肿瘤作用；除此之外，有文献报道，染料木黄酮作为酪氨酸蛋白激酶抑制剂抑制酪氨酸磷酸化依赖的小G蛋白Rac膜转位，进一步抑制胞内还原型辅酶II(NADPH)氧化酶的活性，使细胞内超氧化物的产生减少，从而达到抗氧化的作用，但是对于Neu5Gc的生物合成的影响还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种能抑制动物体Neu5Gc的生物合成，安全无毒副作用，对肉的食用品质及营养价值无影响的染料木黄酮在降低后口动物体内N-羟乙酰神经氨酸方面的用途。
本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明的染料木黄酮在降低后口动物体内N-羟乙酰神经氨酸方面的用途，具体方法如下：用1～500mg/kg.d染料木黄酮每天经口漫灌胃非人源哺乳动物(自身能合成Neu5Gc的动物)，空白组灌胃相应的溶剂，基础饲料喂养，灌胃15～60天后取肌肉组织及内脏保存于-80℃冰箱中待测，进行高效液相色谱荧光检测Neu5Gc的含量，以肌肉组织或者是内脏中Neu5Gc峰面积的降低或者去除为指标，进一步验证此方法的可行性，动物房温度控制在23±2℃，湿度60％；自由进食、自由饮水。
本发明同现有技术相比，具有明显的优点和有益效果，由以上技术方案可知，本发明是从肿瘤预防的角度出发，在肿瘤还未发生之前，从红肉源头上降低致癌物质Neu5Gc的含量达到预防慢性疾病的目的。本发明基于Neu5Gc的生物合成需要还原型辅酶II(NADPH)氧化酶，所以从Neu5Gc的生物合成路径考虑，采用安全的天然提取物染料木黄酮作为抑制剂，抑制大鼠体内Neu5Gc的生物合成，通过漫灌胃和饲喂的方法添加染料木黄酮抑制动物体Neu5Gc的生物合成，安全无毒副作用，对肉的食用品质及营养价值无影响，从饲养环节降低红肉中Neu5Gc的含量。
附图说明
图1为染料木黄酮对大鼠肌肉中Neu5Gc的影响图；
图2为染料木黄酮对大鼠肝脏组织中Neu5Gc的影响图；
图3为染料木黄酮对大鼠肾脏组织中Neu5Gc的影响图。
具体实施方式
动物饲养：
选取30日龄的SPF级SD雄性大鼠80只，适应性饲养一周后，随机分为两组：溶剂对照组(空白对照组)、染料木黄酮组(实验组)，每组40只；动物房温度控制在23±2℃，湿度60％以及12h昼夜交替；自由进食、自由饮水。空白组和实验组分别利用5％的乙醇溶液和300mg/kg.d染料木黄酮溶液经口腔灌胃。
样品采集：
连续灌灌胃15天、30天、45天、60天后，各组大鼠不禁水不禁食后，在空白对照组和实验组中分别取10只大鼠的后腿肉、肾脏、肝脏样品与-80℃保存待用。
样品检测具体方法：
高效液相色谱条件色谱柱为德国默克Li Chrosorb RP-18柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，荧光检测器激发波长373nm、发射波长448nm，流动相为乙腈-甲-超纯水(8∶7∶85，V/V)，流速为0.9mL/min，体积10μL。
衍生液的配制及衍生条件：
DMB衍生液配制：8mmol/L DMB、1.5mol/L冰醋酸、0.25mol/L硫代硫酸钠、0.25mol/L亚硫酸钠、0.8mmol/L2-巯基乙醇。
衍生条件:
900μL标准品中加入100μL DMB衍生液，50℃避光衍150min，冷却至室温后分析。
肌肉组织及内脏中Neu5Gc含量的检测：
分别称取1.000g后腿肉及左肾、肝脏于匀浆瓶中，加入10mL的30％的硫酸铵磨成匀浆液，-80℃冷冻12h沉淀蛋白质，之后进行冷冻干燥成粉末，将干燥后的粉末溶于10mL2mol/L醋酸的中进行酸解，使结合态的Neu5Gc解离，水解后-80℃冷冻12h,在进行冷冻干燥成粉末，将冻干粉溶于1.0mL的蒸馏水和0.2mL0.1mol/L NaOH中。在37℃的条件下水浴30min去乙酰化处理。取去乙酰化的样品900μL，加入100μL的衍生剂，在避光的条件下衍生150min后进行高效液相色谱检测。
染料木黄酮对大鼠肌肉组织中Neu5Gc的影响：
图1是染料木黄酮对大鼠肌肉中Neu5Gc的影响图，由图1可知，饲养15天、45天、60天实验组Neu5Gc含量均低于空白组，且差异显著(P<0.05)，灌胃15天时，染料木黄酮对大白鼠后腿肉中Gc的抑制率为13.68％。而灌胃30天时，用HPLC-FLD法检测时系统未对其进行积分，说明在此灌胃时间段内，大鼠后腿肉中Neu5Gc的含量很低，由此可以推测染料木黄酮在灌胃30天抑制Neu5Gc的合成效果最好；灌胃45天抑制率为6.20％；60天时，抑制率为11.45％。由此可以推断，在大白鼠体内抑制Gc合成的最佳时间段为30日龄到60日龄。空白对照组中，在灌胃15到45天时间阶段内，Neu5Gc的含量在逐渐增大，而40到60天时Neu5Gc含量在降低，造成这结果的可能的原因有两点，其一是大鼠本身的差异，在饲养过程中，这一组大鼠个体大小差异较大；其二是随着饲养时间的延长，大鼠个体增大，而排泄物的量也随着增加，另有文献报道游离态的Neu5Gc在体内快速随着体液排出。所以随着排泄物的增加而游离态的Neu5Gc排出量增加。实验组，Neu5Gc的含量与空白组有相似的变化趋势，造成这结果的除了上述空白组存在的外，还有一种可能的原因是随着饲养时间的延长，大鼠体蓄积染料木黄酮的量越多，而对Neu5Gc合成的抑制效果越好。
染料木黄酮对大鼠肝脏组织中Neu5Gc的影响：
图2是染料木黄酮对大鼠肝脏组织中Neu5Gc的影响，由图2可知，各时间段实验组肝脏中Neu5Gc的含量均低于空白组，且存在显著性差异(P<0.05)，灌胃15天时，抑制率为11.29％，30天时抑制率为12.20％。45天时抑制率为21.66％，60天时抑制率为9.5％。整个饲养阶段，空白组和实验组中Neu5Gc的含量先增加后下降再升高，在45天时，Neu5Gc的含量低，抑制效果最好。60天时，空白组和实验组中Neu5Gc的含量最高。
染料木黄酮对大鼠肾脏组织中Neu5Gc的影响：
图3是染料木黄酮对大鼠肾脏组织中Neu5Gc的影响，由图3可知，各时间段空白组肾脏中Neu5Gc的含量均低于实验组，但是30和60天时差异不显著(P>0.05),15和45天时差异显著。15天时抑制率为10.63％，45天时抑制率为31.04％，整个饲养阶段中，空白组中Neu5Gc的含量逐渐降低，实验组先降低再升高，45天时含量最低。实验组中Neu5Gc的含量降低最多，抑制率最好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.染料木黄酮在制备后口动物体内N-羟乙酰神经氨酸生物合成抑制剂方面的应用。
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| CN1856578A (zh) * | 2003-09-26 | 2006-11-01 | 雅玛山酱油株式会社 | Cmp－n－乙酰神经氨酸的制造方法 |
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- 2018-09-18 CN CN201811084699.9A patent/CN109010330B/zh active Active
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| "Identification and characterization of flavonoids as sialyltransferase inhibitors";Kazuya I.P.J. Hidari等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20090319;第382卷(第3期);第609-613页 * |
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