CN106900652A - 一种高尿酸血症模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于实验模型构建技术领域，涉及一种能够快速构建长期稳定的高尿酸血症模型的方法；其工艺过程包括试样选取、适应性喂养、模型构建、模型应用四个步骤；具体为将选取的大鼠于SPF的动物饲养室进行适应性喂养3～7天，观察大鼠的体表特征和行为活动，并保留合格试样大鼠；针对合格试样大鼠喂养质量百分比为20％的酵母饲料和质量百分比为10％的果糖水或对应比例的鲜水果汁，进食与饮水自由进行，得到试样大鼠高尿酸血症模型；再将构建的大鼠高尿酸血症模型进行应用，得到具有典型疾病表征的模型；采用饲料与饮水结合的方法造模，其操作简单，易于掌握，避免长期灌胃或注射造成动物损伤，方法安全可靠，具有良好的应用前景。

Description

一种高尿酸血症模型的构建方法

技术领域：

本发明属于实验模型构建技术领域，涉及一种能够快速构建长期稳定的高尿酸血症模型的方法，特别是一种以大鼠为试样的高尿酸血症模型的构建方法。

背景技术：

近年来，随着人们生活水平的提高和饮食方式的改变，高尿酸血症的发生率逐年升高；多项流行病学调查结果显示，高尿酸血症是心血管疾病、肾脏疾病和糖尿病等代谢综合征的独立危险因素，已经成为全世界威胁人类生存质量的健康问题。高尿酸血症在临床上通常作为痛风的标志，在高尿酸血症的患病人群中，有5％～12％的人最终发展为痛风；目前对于痛风的治疗，临床常用药有别嘌呤醇和苯溴马隆等，但这些药物均有一定的毒副作用，如导致体内脂质过氧化损伤，对皮肤黏膜、造血系统、肾脏和肝脏等都有较大的损害；因此，治疗痛风新药物的研究得到了很高的关注，而建立稳定持续的高尿酸血症模型是对高尿酸血症与痛风研究的重要前提。

目前，常用的高尿酸血症模型构建方法的机制一般涉及补充外源性尿酸、补充尿酸前体物质、抑制尿酸酶活性以及抑制肾脏尿酸排泄等，如利用酵母以及腺嘌呤和次黄嘌呤等嘌呤类物质，或直接给予外源性尿酸构建模型；但由于大鼠、小鼠等常用作实验对象的哺乳动物体内存在人类缺乏的尿酸酶，在中长期试验中，尿酸酶活性被激活，使血尿酸水平不能维持在较高的水平上；近年来，国内外最常用的高尿酸血症模型构建药物氧嗪酸钾可竞争性地与尿酸酶结合，抑制尿酸酶的活性，使体内血尿酸水平在短时间内增高，并可维持较长时间；但由于其竞争性抑制的机制需长期给药，可对实验动物肾脏造成较强炎症反应等不良效果；目前较常用的抑制尿酸排泄的药物主要为抗结核药物乙胺丁醇和烟酸，该模型构建方法的缺点是乙胺丁醇和烟酸等物质可造成肝功损害。

有流行病学调查显示，果糖的摄入量正逐年增长，果糖消费量的增长与人群血尿酸平均水平的升高存在一定的关联性，另外，高果糖饮食与高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、腹型肥胖等代谢性疾病的发生均存在一定关系；有研究表明10％果糖水可使大鼠血尿酸水平升高，但是形成的高尿酸水平极不稳定，因此，很难作为理想的高尿酸血症动物模型被广泛应用；而且采用单一药物构建模型的方法因其作用机制单一，往往不能取得很好的效果，故目前大多数研究采用联合构建模型的方式，联合构建模型不仅能使高尿酸血症模型维持时间更长，血尿酸升高更明显，而且也更接近人类高尿酸血症的发生机制和实际情况；故采用含嘌呤较高的酵母联合高果糖饮食的方法诱导高尿酸血症，形成稳定的动物模型，为开展尿酸代谢、干预效果及其机制研究能够提供良好的技术支持，也是当前学术界探讨的主题任务。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种以动物为试样的利用酵母联合果糖饮食诱导高尿酸血症，再建立稳定的高尿酸血症模型的方法。

为了实现上述目的，本发明所述的高尿酸血症模型的构建方法，其工艺过程包括以下步骤：

(1)试样选取：选取体重为180～220g，年龄为6～8周龄雄性清洁级Wistar大鼠，饲养于无特定病原体级(Specific Pathogen Free,SPF)的动物饲养室；

(2)适应性喂养：将步骤(1)中选取的Wistar大鼠于SPF级动物饲养室中进行适应性喂养3～7天，适应性喂养期间观察大鼠的体表特征和行为活动，将体表特征或行为活动异常的大鼠挑选出并隔离，保留合格试样大鼠；适应性喂养的环境为：温度为20～24摄氏度，相对湿度为50％～70％，光照节律为12D：12L，工作照度为150～300lx，气流或风速0.1～0.2m/s，噪声≤60dB；所述适应性喂养的饲料中粗蛋白重量百分比含量为20.50％，粗脂肪含量为4.62％，粗纤维含量为4.35％，粗灰分含量为6.2％，钙含量为1.23％，磷含量为0.91％，能量为345kcal/kg；

(3)模型构建：对步骤(2)中经过适应性喂养后体表特征和行为活动均无异常的合格试样大鼠，于SPF级动物饲养室中喂养质量百分比为20％的酵母饲料和质量百分比为10％的果糖水溶液或对应比例的鲜水果汁，合格试样大鼠进食与饮水自由进行5～10天后，得到试样大鼠高尿酸血症模型；质量百分比为20％的酵母饲料制作方法是：先将步骤(2)中所述对大鼠进行适应性喂养的普通大鼠颗粒饲料粉碎成粒径为0.1～1mm的粉末，然后在其中均匀加入重量百分比为20％的酵母膏，再将饲料重新制作成直径为2～6mm的颗粒；

(4)模型应用：对步骤(3)中构建的大鼠高尿酸血症模型进行隔周断尾取血，经3000r/min离心5min，取300μl血清，用全自动生化分析仪测定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)；处死大鼠后，摘取各组大鼠右侧肾脏，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后制成3μl厚切片，HE染色，光镜(×400)下观察肾脏组织学变化，利用酵母联合果糖诱导大鼠高尿酸血症，得到的模型具有典型的疾病表征，血清尿酸指标长期维持较高水平，不造成肾脏严重器质性损伤，符合高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤机制，为高尿酸血症的研究提供稳定模型。

本发明与现有技术相比，采用饲料与饮水结合的方法造模，其操作简单，易于掌握，避免长期灌胃或注射造成动物损伤，方法安全可靠，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1为本发明实施例2中空白对照组C、酵母对照组Y、酵母氧嗪酸钾组YO和酵母果糖组YF的血清中XOD活性和ADA活性以及10％肝匀浆中XOD活性和ADA活性。

图2为本发明实施例3中空白对照组a、酵母对照组b、酵母氧嗪酸钾组c和酵母果糖组d光镜下肾脏结构。

图3为本发明实施例4中空白对照组C、酵母对照组Y、酵母氧嗪酸钾组YO和酵母果糖组YF的尿酸转运蛋白表达水平。

具体实施方式：

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，实施例中所使用的实验方法，如无说明，均为常规方法；实施例中所使用的材料试剂，如无说明，均为商业途径得到。

实施例1：本实施例的具体构建高尿酸血症模型的具体步骤为

(1)动物试样选取与模型构建：选取8周龄雄性清洁级Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购自山东鲁抗医药股份有限公司，饲于青岛大学医学院SPF级动物饲养室，实验开始前用普通大鼠颗粒饲料适应性饲养1周，实验期间观察大鼠体表特征，行为活动是否有异常变化，对异常大鼠进行隔离，最终选出经过适应性喂养后体表特征和行为活动均无异常的Wistar大鼠40只；适应性喂养的环境为：温度：20～24℃，相对湿度：50％～70％，光照节律：12D：12L，工作照度：150～300lx，气流、风速0.1～0.2m/s，噪声≤60dB；所述适应性喂养的饲料为普通大鼠颗粒饲料，其配方中粗蛋白含量为20.50％，粗脂肪含量为4.62％，粗纤维含量为4.35％，粗灰分含量为6.2％，钙含量为1.23％，磷含量为0.91％，能量为345kcal/kg；

(2)材料与设备：

氧嗪酸钾(CAS：2207-75-2)购于上海麦克林生化科技有限公司；酵母膏的嘌呤含量为1.2％，货号：01-014，购于北京奥博星生物技术有限责任公司；D-果糖(CAS：57-48-7)，购于北京华迈科生物技术有限责任公司；尿酸、肌酐、尿素氮测定试剂盒，购于中生北控生物科技有限公司；黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶测定试剂盒，购于南京建成试剂公司；一抗(兔抗)：RST、GLUT9、OATl、GAPDH、二抗抗体(羊抗兔)，购于北京博奥森生物技术有限公司；CX4全自动生化分析仪购于贝克曼库尔特公司；这些大鼠试样和材料设备为模型建立所需。

实施例2：

本实施例采用随机数字表法将40只雄性Wistar大鼠按体质量分组，分别是空白对照、酵母对照、酵母氧嗪酸钾和酵母果糖4组，每组10只，空白对照组给予普通大鼠颗粒饲料喂养，其他三组给予质量分数为0.2的酵母饲料喂养；酵母果糖组大鼠给予质量浓度10％果糖饮水，其他三组给予自来水饮水；高酵母氧嗪酸钾组予以0.5g/(kg·d)氧嗪酸钾灌胃，其他三组予以蒸馏水灌胃，灌胃体积均为10ml/(kg·d)；所有大鼠均自由饮水和进食；在喂养分别满2、4、6和8W的早晨8点，大鼠禁食12h后剪尾取血1.0～1.5ml，室温静置凝血，3000r/min离心5min，取300μl血清，用全自动生化分析仪测定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)；结果如表1显示，在实验2w后，酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组血SUA水平分别达到262.66、267.44和345.91μmol/L；与空白对照组相比均显著性上升(P<0.05)，分别升高26.49％、28.79％和66.58％；而且酵母果糖组SUA水平比酵母对照组和酵母氧嗪酸钾组大鼠血尿酸水平分别增加83.25和78.47μmol/L(P值均<0.05)；在实验4w后，酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组与空白对照组相比SUA水平显著升高(p<0.05)，分别升高88.38、164.02和101.88μmol/L；在实验6w后，酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组，与空白对照组相比，SUA水平显著升高(P<0.05)；酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组三组之间SUA水平无显著差异；在实验8w后，酵母对照组SUA水平下降至322.21μmol/L，与空白对照组(265.77μmol/L)相比已无显著性差异(P>0.05)，酵母氧嗪酸钾组(465.25μmol/L)和酵母果糖组(451.41μmol/L)与空白对照组相比，SUA水平仍然显著升高(P<0.05)。

表2结果显示，在实验分别满2、4、6和8W时，酵母果糖组BUN水平降至6.01、4.62、4.71、3.65mmol/L，与空白对照组相比BUN水平均显著降低(p<0.05)，分别下降27.32％、37.48％、35.12％、50.14％，因此在实验第2w末到第8w末，酵母果糖组的BUN表现为下降趋势，大鼠体内BUN浓度逐渐降低；在实验第4w末，酵母氧嗪酸钾组BUN水平与酵母对照组相比显著降低(p<0.05)；表3结果显示所示，除第6w末酵母对照组与空白对照组相比，SCr水平显著降低(p<0.05)，其他各时间段各组SCr水平无显著差异；BUN是机体蛋白质代谢的终产物，BUN水平的高低可反映肾脏功能，当BUN水平升高时可提示肾功能损坏、肾小球滤过率较低，但肾脏具有较强代偿能力，当肾脏损伤较轻时，BUN水平可不表现为升高；当肾小球滤过率下降至50％以下时，BUN水平才能升高，同时可伴随SCr水平升高，本实施例中各组大鼠均未出现BUN与SCr水平升高现象，说明并未出现肾脏功能的严重损害；

综合结论：酵母联合果糖干预能使大鼠SUA水平长期稳定维持在一个较高的水平上，在第2、4、6、8周末分别达到345.91、403.71、447.21、451.41μmol/L，与空白对照组相比分别升高了66.5％、33.8％、37.5％和69.8％。

表1：各组大鼠血清尿酸水平(x±S,μmol/L)

注：a:与空白对照组相比，p<0.05,b:与酵母对照组相比，p<0.05,c:与酵母氧嗪酸钾组相比，p<0.05；

表2：各组大鼠血清尿素氮水平(x±S,mmol/L)

注：a:与空白对照组相比，p<0.05,b:与酵母对照组相比，p<0.05,c:与酵母氧嗪酸钾组相比，p<0.05；

表3：各组大鼠血清肌酐水平(x±S,mmol/L)

注：a:与空白对照组相比，p<0.05。

实施例2：

本实施例采用实施例1的动物干预进行实验：在动物实验第8w末，大鼠禁食12h后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，室温静置凝血，3000r/min离心10min，取100μl血清测定黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，取50μL血清，测定腺苷脱氨酶(ADA)活性；然后摘取各组大鼠肝脏，取1g肝脏组织与9ml生理盐水用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％肝匀浆，取100μl10％肝匀浆测定XOD活性，取50μl 10％肝均浆测定ADA活性；结果如附图1所示，酵母果糖组与空白对照组相比，血清中XOD活性和ADA活性(图1(a))均显著上升(P<0.05)，达到了46.30和26.83U/L，分别升高21.33％和37.30％；10％肝匀浆中XOD活性和ADA活性(图1(b))均显著上升(P<0.05)，达到了10.44和15.31U/L，分别升高36.11％和38.05％；酵母氧嗪酸钾组与空白对照组相比，血清中XOD活性升高21.75％，差异有统计学意义(P<0.05)；10％肝匀浆中ADA活性和XOD活性均显著升高(P<0.05)；综合结论：酵母联合果糖干预能使大鼠SUA水平升高，其机制可能与大鼠体内XOD与ADA被激活有关。

实施例3：

本实施例采用实施例1的动物干预进行实验：在动物实验第8w末，大鼠禁食12h后，处死大鼠，摘取各组大鼠右侧肾脏，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后制成3μl厚切片，HE染色，光镜(×400)下观察；结果如附图2所示，空白对照组与酵母对照组大鼠肾脏结构正常，肾皮质中肾小球分布均匀，大小正常，肾小管无肿胀变性；酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏偶见间质片灶状单核淋巴细胞浸润，无明显纤维化；酵母果糖组大鼠肾小管管腔间质偶见结晶物沉积，无明显纤维化；综合结论：酵母果糖组大鼠肾小管偶见结晶物沉积，病理损伤较轻，符合高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤机制。

实施例4：

本实施例采用实施例1的动物干预进行实验：在实验第54日时，用代谢笼法收集各组大鼠24h尿液，并测量尿液体积，于离心机中3000r/min离心10min，取上清液测定尿液尿酸(UUA)、尿液肌酐(UCr)，计算尿酸清除率(CUA)和肌酐清除率(CCR)，CUA计算公式为：UUA/SUA×每分钟尿量(ml/min)，CCR计算公式为：UCr/SCr×每分钟尿量(ml/min)；在动物实验第8w末，大鼠禁食12h后，处死大鼠，摘取各组大鼠左侧肾脏，提取大鼠肾组织中肾脏皮质刷状缘膜(BBMV)蛋白及肾脏皮层蛋白，采用考马斯亮蓝法测定BBMV和肾皮质上清中的蛋白含量，以牛血清蛋白为标准品；将蛋白统一稀释后，沸水浴煮5min，经10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，湿转移至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜，配置5％脱脂奶于室温封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1～2h，化学发光剂X光片上曝光，底片经扫描仪透扫后转化为图片，用Quantity one软件定量分析，确定杂交条带的相对吸光度值；结果显示(表4)，酵母果糖组大鼠24h尿量与空白对照组相比明显升高(P<0.05)，酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠CUA与空白对照组相比明显降低(P均<0.05)，各组大鼠CCR值无显著性变化；WesternBlotting的结果表明(图3):与空白对照组相比,酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏皮质有机阴离子转运子1(OAT1)蛋白表达显著降低(P均<0.05)；酵母果糖组大鼠肾脏BBMV中肾脏尿酸盐转运体(RST)蛋白表达与空白对照组相比显著升高(P<0.05)，同时，酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏RST蛋白表达与空白对照组相比有升高趋势，但无统计学意义；与空白对照组相比，酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏BBWV中葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)蛋白有升高趋势，但无统计学意义；综合结论：本实施例中酵母果糖组大鼠尿酸转运系统紊乱，这是酵母果糖组大鼠血尿酸升高的重要原因；

表4：各组大鼠尿酸清除率与肌酐清除率情况(x±S)

注：a:与空白对照组相比，p<0.05,b:与酵母对照组相比，p<0.05。

Claims (1)

1.一种高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于其工艺过程包括以下步骤：

(1)试样选取：选取体重为180～220g，年龄为6～8周龄雄性清洁级Wistar大鼠，饲养于无病原体级SPF的动物饲养室；

(2)适应性喂养：将步骤(1)中选取的Wistar大鼠于SPF级动物饲养室中进行适应性喂养3～7天，适应性喂养期间观察大鼠的体表特征和行为活动，将体表特征或行为活动异常的大鼠挑选出并隔离，保留合格试样大鼠；适应性喂养的环境为：温度为20～24摄氏度，相对湿度为50％～70％，光照节律为12D：12L，工作照度为150～300lx，气流或风速0.1～0.2m/s，噪声≤60dB；所述适应性喂养的饲料中粗蛋白重量百分比含量为20.50％，粗脂肪含量为4.62％，粗纤维含量为4.35％，粗灰分含量为6.2％，钙含量为1.23％，磷含量为0.91％，能量为345kcal/kg；

(3)模型构建：对步骤(2)中经过适应性喂养后体表特征和行为活动均无异常的合格试样大鼠，于SPF级动物饲养室中喂养质量百分比为20％的酵母饲料和质量百分比为10％的果糖水溶液或对应比例的鲜水果汁，合格试样大鼠进食与饮水自由进行5～10天后，得到试样大鼠高尿酸血症模型；质量百分比为20％的酵母饲料制作方法是：先将步骤(2)中所述对大鼠进行适应性喂养的普通大鼠颗粒饲料粉碎成粒径为0.1～1mm的粉末，然后在其中均匀加入重量百分比为20％的酵母膏，再将饲料重新制作成直径为2～6mm的颗粒；

(4)模型应用：对步骤(3)中构建的大鼠高尿酸血症模型进行隔周断尾取血，经3000r/min离心5min，取300μl血清，用全自动生化分析仪测定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)；处死大鼠后，摘取各组大鼠右侧肾脏，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后制成3μl厚切片，HE染色，光镜(×400)下观察肾脏组织学变化，利用酵母联合果糖诱导大鼠高尿酸血症，得到的模型具有典型的疾病表征，血清尿酸指标长期维持较高水平，不造成肾脏严重器质性损伤，符合高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤机制，为高尿酸血症的研究提供稳定模型。