CN106615888A - 一种影响嘌呤代谢的酵母果糖组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物配制技术领域,涉及一种能够影响嘌呤代谢的酵母果糖组合物;其有效成份包括酵母膏和D‑果糖;将有效成份按质量配比混合后采用常规工艺配制成颗粒或溶液;其中,高酵母饲料为大鼠用市售颗粒饲料粉碎后,再在其中均匀加入酵母膏,最后再重新制作成原来形状和尺寸的颗粒;果糖水溶液为将D‑果糖溶于纯净水中,配置成果糖水溶液;其中,大鼠用市售颗粒饲料中包含粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙和磷;将高酵母饲料与果糖水溶液作为套餐式组合物用于组合喂养动物;其操作易于掌握,避免长期灌胃或注射造成动物损伤;其组合物配方科学,配制工艺简单,有效成份均匀,成份搭配合理,使用效果好,喂养方便。
Description
技术领域:
本发明属于药物配制技术领域,涉及一种能够影响嘌呤代谢的酵母果糖组合物;其有效成份包括酵母膏和D-果糖,将有效成份按质量配比混合后采用常规工艺配制成颗粒或溶液。
背景技术:
血清尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物,其异常升高可引起高尿酸血症的发生。高尿酸血症是痛风的致病基础,据报道,18.8%的高尿酸血症患者在5年的随访期间内患上了痛风。近年来,有流行病学研究表明高尿酸血症与痛风的患病率有越来越高的趋势,两种疾病都成为了亟待解决的公共卫生问题。由于经济的快速发展,中国人的生活方式发生了很大的变化,以碳水化合物和蔬菜为基本的传统饮食方式也为之改变,肉类、乳类等其它富含嘌呤的食物的摄入量逐年升高,这与高尿酸血症和痛风的发生是密切相关的。一些研究还表明,高尿酸血症与多种疾病有关,包括糖尿病、高血压、中风、血脂异常、慢性肾脏病、心血管疾病和心力衰竭等,痛风也是目前非常严重的健康问题之一,是心脏衰竭和代谢综合征的一个独立危险因素。
有流行病学调查显示,人类的果糖的摄入量正逐年增长,果糖消费量的增长与人群血尿酸平均水平的升高存在一定的关联性。另外,高果糖饮食与高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、腹型肥胖等代谢性疾病的发生均存在一定关系。果糖经人体摄入后在果糖激酶的催化下快速磷酸化进入细胞,而此过程无负反馈机制,因此可导致细胞内三磷酸腺苷(ATP)耗竭产生大量腺嘌呤核苷酸(AMP),AMP进一步脱磷酸分解为次黄嘌呤核苷酸(IMP)或腺苷,经核苷酶催化下产生次黄嘌呤,可在黄嘌呤氧化酶(XOD)的催化下最后分解为尿酸。此外,果糖大量磷酸化导致磷酸匮乏,加速了AMP去磷酸分解的一系列步骤。有研究表明10%果糖水可使大鼠血尿酸水平升高,但是形成的高尿酸水平极不稳定。考虑到采用单一药物干预嘌呤代谢的方法因其作用机制单一,往往不能取得很好的效果,故本申请拟采用含嘌呤较高的酵母饲料与果糖饮水结合的方式影响机体嘌呤代谢,可采用此组合物建立高尿酸形成稳定的动物模型,为开展尿酸代谢、干预效果及其机制研究提供良好的技术支持。
发明内容:
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点,寻求制备一种影响嘌呤代谢的酵母果糖组合物,继而用其建立高尿酸形成稳定的动物模型,用于开展尿酸代谢、干预效果的机制探讨。
为了实现上述目的,本发明涉及的组合物包含质量百分比为20%的高酵母饲料和质量百分比浓度为10%的果糖水溶液;其中,高酵母饲料为大鼠用市售颗粒饲料粉碎后,再在其中均匀加入质量百分比为20%的酵母膏,最后再重新制作成原来形状和尺寸的颗粒;涉及的果糖水溶液为将D-果糖溶于纯净水中,配置成质量百分比浓度为10%的果糖水溶液;其中,所涉及的大鼠用市售颗粒饲料中包含:粗蛋白为20.50%,粗脂肪为4.62%,粗纤维为4.35%,粗灰分为6.2%,钙为1.23%,磷为0.91%,均为质量百分比,能量为345kcal/kg;所涉及的果糖、酵母膏均采用市售产品;将高酵母饲料与果糖水溶液作为套餐式组合物用于组合喂养动物。
本发明与现有技术相比,采用喂养与饮水结合的方法干预动物,操作易于掌握,避免长期灌胃或注射造成动物损伤;其组合物配方科学,配制工艺简单,有效成份均匀,成份搭配合理,使用效果好,喂养方便。
附图说明:
图1为本发明涉及的空白对照组C、酵母对照组Y、酵母氧嗪酸钾组YO和酵母果糖组YF的血清中XOD活性和ADA活性以及10%肝匀浆中XOD活性和ADA活性。
图2为本发明涉及的空白对照组a、酵母对照组b、酵母氧嗪酸钾组c和酵母果糖组d光镜下肾脏结构。
图3为本发明涉及的空白对照组C、酵母对照组Y、酵母氧嗪酸钾组YO和酵母果糖组YF的尿酸转运蛋白表达水平。
具体实施方式:
下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。
实施例1:
本实施例涉及的组合物为质量百分比为20%的高酵母饲料配合质量百分比浓度为10%果糖水溶液,搭配成套餐式组合物,用于动物模型的培养。
本实施例涉及的质量百分比为20%的高酵母饲料,其制作方法为:将购买的大鼠用市售的普通颗粒饲料粉碎成粒径为0.1~1mm的粉末,然后在其中均匀加入重量百分比为20%的酵母膏,再将饲料重新制作成直径为2~6mm的球状颗粒;涉及的质量百分比浓度为10%的果糖水溶液,为将D-果糖溶解于自来水中,配置成的果糖水溶液。
本实施例涉及的大鼠用普通颗粒饲料其配方为:粗蛋白为20.50%,粗脂肪为4.62%,粗纤维为4.35%,粗灰分为6.2%,钙为1.23%,磷为0.91%,能量为345kcal/kg;其中的果糖和酵母膏均采用市售产品。
本实施例涉及的酵母膏中含有蛋白质、核苷酸和B族维生素;在体内充分水解为含氮的有机碱,包括嘌呤碱、嘧啶碱类和磷酸,增加尿酸生成的前体物质,使尿酸生成增加,从而升高机体血尿酸水平。
实施例2:本实施例为具体构建高尿酸血症动物模型的步骤包括:
(1)动物试样选取:选取8周龄雄性清洁级Wistar大鼠,体质量(200±20)g,购自山东鲁抗医药股份有限公司,饲于青岛大学医学院SPF级动物饲养室,实验开始前用普通大鼠颗粒饲料适应性饲养1周,实验期间观察大鼠体表特征,行为活动是否有异常变化,对异常大鼠进行隔离,最终选出经过适应性喂养后体表特征和行为活动均无异常的Wistar大鼠40只;适应性喂养的环境为:温度:20~24℃,相对湿度:50%~70%,光照节律:12D:12L,工作照度:150~300lx,气流、风速0.1~0.2m/s,噪声≤60dB;所述适应性喂养的饲料为普通大鼠颗粒饲料,其配方中粗蛋白含量为20.50%,粗脂肪含量为4.62%,粗纤维含量为4.35%,粗灰分含量为6.2%,钙含量为1.23%,磷含量为0.91%,能量为345kcal/kg。
(2)高尿酸血症模型构建:采用随机数字表法将选出的40只雄性Wistar大鼠按体质量分组,分别是空白对照、酵母对照、酵母氧嗪酸钾和酵母果糖4组,每组10只,空白对照组给予普通大鼠颗粒饲料喂养,其他三组给予实施例1的酵母饲料喂养;酵母果糖组大鼠给予质量浓度10%果糖饮水,其他三组给予自来水饮水;高酵母氧嗪酸钾组予以0.5g/(kg·d)氧嗪酸钾灌胃,其他三组予以蒸馏水灌胃,灌胃体积均为10ml/(kg·d);所有大鼠均自由饮水和进食。
(3)材料与设备:
氧嗪酸钾(CAS:2207-75-2)购于上海麦克林生化科技有限公司;酵母膏的嘌呤含量为1.2%,货号:01-014,购于北京奥博星生物技术有限责任公司;D-果糖(CAS:57-48-7),购于北京华迈科生物技术有限责任公司;尿酸、肌酐、尿素氮测定试剂盒,购于中生北控生物科技有限公司;黄嘌呤氧化酶、腺苷脱氨酶测定试剂盒,购于南京建成试剂公司;一抗(兔抗):RST、GLUT9、OATl、GAPDH、二抗抗体(羊抗兔),购于北京博奥森生物技术有限公司;CX4全自动生化分析仪购于贝克曼库尔特公司;这些大鼠试样和材料设备为模型建立所需。
实施例3:
本实施例采用实施例2的动物干预进行实验:在实验分别进行2、4、6和8W后的早晨8点,大鼠禁食12h后剪尾取血1.0~1.5ml,室温静置凝血,3000r/min离心5min,取300μl血清,用全自动生化分析仪测定血清尿酸(SUA)、血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr);结果如表1显示,在实验2w后,酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组血SUA水平分别达到262.66、267.44和345.91μmol/L;与空白对照组相比均显著性上升(P<0.05),分别升高26.49%、28.79%和66.58%;而且酵母果糖组SUA水平比酵母对照组和酵母氧嗪酸钾组大鼠血尿酸水平分别增加83.25和78.47μmol/L(P值均<0.05);在实验4w后,酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组与空白对照组相比SUA水平显著升高(p<0.05),分别升高88.38、164.02和101.88μmol/L;在实验6w后,酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组,与空白对照组相比,SUA水平显著升高(P<0.05);酵母对照组、酵母氧嗪酸钾组和酵母果糖组三组之间SUA水平无显著差异;在实验8w后,酵母对照组SUA水平下降至322.21μmol/L,与空白对照组(265.77μmol/L)相比已无显著性差异(P>0.05),酵母氧嗪酸钾组(465.25μmol/L)和酵母果糖组(451.41μmol/L)与空白对照组相比,SUA水平仍然显著升高(P<0.05);其中表2结果显示,在实验分别满2、4、6和8W时,酵母果糖组BUN水平降至6.01、4.62、4.71、3.65mmol/L,与空白对照组相比BUN水平均显著降低(p<0.05),分别下降27.32%、37.48%、35.12%、50.14%,因此在实验第2w末到第8w末,酵母果糖组的BUN表现为下降趋势,大鼠体内BUN浓度逐渐降低;在实验第4w末,酵母氧嗪酸钾组BUN水平与酵母对照组相比显著降低(p<0.05);表3结果显示所示,除第6w末酵母对照组与空白对照组相比,SCr水平显著降低(p<0.05),其他各时间段各组SCr水平无显著差异;BUN是机体蛋白质代谢的终产物,BUN水平的高低可反映肾脏功能,当BUN水平升高时可提示肾功能损坏、肾小球滤过率较低,但肾脏具有较强代偿能力,当肾脏损伤较轻时,BUN水平可不表现为升高;当肾小球滤过率下降至50%以下时,BUN水平才能升高,同时可伴随SCr水平升高,本实施例中各组大鼠均未出现BUN与SCr水平升高现象,说明并未出现肾脏功能的严重损害;
综合结论:酵母联合果糖干预能使大鼠SUA水平长期稳定维持在一个较高的水平上,在第2、4、6、8周末分别达到345.91、403.71、447.21、451.41μmol/L,与空白对照组相比分别升高了66.5%、33.8%、37.5%和69.8%;
表1:各组大鼠血清尿酸水平(x±S,μmol/L)
注:a:与空白对照组相比,p<0.05,b:与酵母对照组相比,p<0.05,c:与酵母氧嗪酸钾组相比,p<0.05;
表2:各组大鼠血清尿素氮水平(x±S,mmol/L)
注:a:与空白对照组相比,p<0.05,b:与酵母对照组相比,p<0.05,c:与酵母氧嗪酸钾组相比,p<0.05;
表3:各组大鼠血清肌酐水平(x±S,mmol/L)
注:a:与空白对照组相比,p<0.05。
实施例4:
本实施例采用实施例2的动物干预进行实验:在动物实验第8w末,大鼠禁食12h后,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,室温静置凝血,3000r/min离心10min,取100μl血清测定黄嘌呤氧化酶(XOD)活性,取50μL血清,测定腺苷脱氨酶(ADA)活性;然后摘取各组大鼠肝脏,取1g肝脏组织与9ml生理盐水用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%肝匀浆,取100μl 10%肝匀浆测定XOD活性,取50μl 10%肝均浆测定ADA活性;结果如附图1所示,酵母果糖组与空白对照组相比,血清中XOD活性和ADA活性(图1(a))均显著上升(P<0.05),达到了46.30和26.83U/L,分别升高21.33%和37.30%;10%肝匀浆中XOD活性和ADA活性(图1(b))均显著上升(P<0.05),达到了10.44和15.31U/L,分别升高36.11%和38.05%;酵母氧嗪酸钾组与空白对照组相比,血清中XOD活性升高21.75%,差异有统计学意义(P<0.05);10%肝匀浆中ADA活性和XOD活性均显著升高(P<0.05);综合结论:酵母联合果糖干预能使大鼠SUA水平升高,其机制可能与大鼠体内XOD与ADA被激活有关。
实施例5:
本实施例采用实施例2的动物干预进行实验:在动物实验第8w末,大鼠禁食12h后,处死大鼠,摘取各组大鼠右侧肾脏,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋后制成3μl厚切片,HE染色,光镜(×400)下观察肾脏组织学结构;结果如附图2所示,空白对照组与酵母对照组大鼠肾脏结构正常,肾皮质中肾小球分布均匀,大小正常,肾小管无肿胀变性;酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏偶见间质片灶状单核淋巴细胞浸润1,无明显纤维化;酵母果糖组大鼠肾小管管腔间质偶见结晶物沉积2,无明显纤维化;综合结论:酵母果糖组大鼠肾小管偶见结晶物沉积,病理损伤较轻,符合高尿酸血症大鼠肾脏病理损伤机制。
实施例6:
本实施例采用实施例2的动物干预进行实验:在实验第54日时,用代谢笼法收集各组大鼠24h尿液,并测量尿液体积,于离心机中3000r/min离心10min,取上清液测定尿液尿酸(UUA)、尿液肌酐(UCr),计算尿酸清除率(CUA)和肌酐清除率(CCR),CUA计算公式为:UUA/SUA×每分钟尿量(ml/min),CCR计算公式为:UCr/SCr×每分钟尿量(ml/min);在动物实验第8w末,大鼠禁食12h后,处死大鼠,摘取各组大鼠左侧肾脏,提取大鼠肾组织中肾脏皮质刷状缘膜(BBMV)蛋白及肾脏皮层蛋白,采用考马斯亮蓝法测定BBMV和肾皮质上清中的蛋白含量,以牛血清蛋白为标准品;将蛋白统一稀释后,沸水浴煮5min,经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,湿转移至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜,配置5%脱脂奶于室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育1~2h,化学发光剂X光片上曝光,底片经扫描仪透扫后转化为图片,用Quantity one软件定量分析,确定杂交条带的相对吸光度值;结果显示(表4),酵母果糖组大鼠24h尿量与空白对照组相比明显升高(P<0.05),酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠CUA与空白对照组相比明显降低(P均<0.05),各组大鼠CCR值无显著性变化;WesternBlotting的结果表明(图3):与空白对照组相比,酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏皮质有机阴离子转运子1(OAT1)蛋白表达显著降低(P均<0.05);酵母果糖组大鼠肾脏BBMV中肾脏尿酸盐转运体(RST)蛋白表达与空白对照组相比显著升高(P<0.05),同时,酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏RST蛋白表达与空白对照组相比有升高趋势,但无统计学意义;与空白对照组相比,酵母果糖组与酵母氧嗪酸钾组大鼠肾脏BBWV中葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)蛋白有升高趋势,但无统计学意义;综合结论:本实施例中酵母果糖组大鼠尿酸转运系统紊乱,这是酵母果糖组大鼠血尿酸升高的重要原因;
表4:各组大鼠尿酸清除率与肌酐清除率情况(x±S)
注:a:与空白对照组相比,p<0.05,b:与酵母对照组相比,p<0.05。
Claims (1)
1.一种影响嘌呤代谢的酵母果糖组合物,其特征在于包含质量百分比为20%的高酵母饲料和质量百分比浓度为10%的果糖水溶液;其中,高酵母饲料为大鼠用市售颗粒饲料粉碎后,再在其中均匀加入质量百分比为20%的酵母膏,最后再重新制作成原来形状和尺寸的颗粒;涉及的果糖水溶液为将D-果糖溶于纯净水中,配置成质量百分比浓度为10%的果糖水溶液;其中,所涉及的大鼠用市售颗粒饲料中包含:粗蛋白为20.50%,粗脂肪为4.62%,粗纤维为4.35%,粗灰分为6.2%,钙为1.23%,磷为0.91%,均为质量百分比,能量为345kcal/kg;所涉及的果糖、酵母膏均采用市售产品;将高酵母饲料与果糖水溶液作为套餐式组合物用于组合喂养动物。
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