KR20170118315A - 비만 동물모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비만 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 동물에 PHF20 유전자를 포함하는 벡터를 주입하는 단계를 포함하는 비만 동물모델의 제조방법, PHF20이 과발현된 비만 동물모델 및 이를 이용한 비만 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비만 동물모델은 체중, 체적, 지질 축적, 에너지 흡수 및 지방조직에서 미토콘드리아 생합성 등이 증가하므로 비만에 의해 유발되는 질환의 발병 기작 연구, 비만 치료제의 스크리닝 및 신약 개발 등에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 비만 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 동물에 PHF20 유전자를 주입하는 단계를 포함하는 비만 동물모델의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 비만 동물모델 및 이를 이용한 비만 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
비만이란 체내에 지방이 과다하게 축적된 상태를 말하는 것으로서, 세계보건기구(WHO)에서는 체질량 지수(BMI, body mass index)가 25∼29.9kg/㎡인 경우를 과체중, 30kg/㎡ 이상인 경우를 비만이라고 정하고 있다.
비만은 단순성 비만과 2차성 비만(증후성 비만)으로 분류된다. 단순성 비만의 원인으로는 과식, 운동부족, 및 기초대사의 저하 등을 들 수 있고, 임상적으로 비만으로 판정되는 경우의 대부분은 단순성 비만이다. 단순성 비만이 발현하여 그 상태가 지속되면, 각종 건강 장해를 일으키는 원인이 된다. 한편, 2차성 비만은 임의의 기초질환이 원인이 되어 발생하는 비만으로, 내분비성 비만, 시상하부성 비만, 유전성 비만 또는 약제에 기인한 비만 등을 들 수 있다.
이러한 비만은 의학적으로 질병이라고 하기 어려우나, 비만 자체 보다는 비만으로 인해 당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환, 가성 뇌종양(pseudotumor cerebri), 고지혈증, 수면 무호흡증(sleep apnea), 암, 폐 고혈압(pulmonary hypertension), 담낭염(cholecystitis), 및 골관절염(osteoarthritis) 등 다양한 만성 퇴행성 질환들이 유발될 수 있을 뿐만 아니라, 비만이 여러 가지 질환의 원인이 되어 합병증으로 나타나는 경우도 있으므로 비만을 하나의 질환으로 인식하고 치료할 필요가 있다.
한편, 질환 동물 모델(animal model for human diseases)이란 인간에게 나타나는 당뇨병·고혈압·암 등의 각종 질환을 지닌 동물로서 몇 세대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체질환 규명과 치료법 개발에 쓰이는 동물 모델을 지칭한다.
그 대표적인 예로서 고혈압쥐·당뇨병쥐·치매쥐 등이 있으며, 이들은 주로 유전자의 변형 또는 결손등의 돌연변이에 의해 제조되고, 이러한 유전자의 변형 또는 결손은 주로 화학물질의 주입에 의해 유도된다. 이렇게 제조된 돌연변이동물은 정상 개체에서 확인할 수 없는 생명현상을 연구하고, 정상 유전자에서 알 수 없는 유전자의 기능을 탐색할 수 있다는 점에서 사람을 직접 모델로 할 수 없는 질병 연구에 매우 유용하다.
이러한 동물들은 1980년대 이후 다양한 인체 질환과 거의 같은 수 또는 그 이상으로 개발되었으며 특수한 형질을 유지보존, 보급하여 응용함으로써 생명과학 분야의 발전에 크게 기여하여 왔다. 주로 계통발생학적으로 사람과 가까운 동물을 이용하며, 특히 번식능력·발육능력·환경 적응능력이 좋고 성질이 온순하며 사람의 유전자와 유사한 동물을 이용한다. 이 가운데 가장 대표적인 것이 누드 마우스와 SCID 마우스이다.
이러한 동물들은 무균 상태로 인위적으로 필요한 질병을 가지게 하여 연구에 이용할 수 있다. 한편 무병적 사육 환경인 특수사육환경(Barrier System)에서 유전적·미생물학적 오염에 대한 정기적인 품질 검정이 이루어지면서 그 동물이 가진 본래의 고유한 형질이 계속 유지 보존되고 체계적인 대량생산 시스템에 의해 고품질의 동물이 생산 공급되도록 해야 한다. 또한 다양하고 새롭게 개발되는 동물 자원에 대해서 체계적으로 유지 보존하고 응용체계를 갖추는 것도 필요하다.
비만을 연구하기 위해서 전 세계적으로 질환 동물 모델을 이용한 연구가 진행되고 있는데, 비만 쥐가 가장 대표적인 예이다. 비만 쥐를 제작함에 있어, 종래에는 넉아웃(knockout) 기술을 이용하거나, 상기한 바와 같이 화학 물질을 주입하여 돌연변이를 유도하거나, 또는 비만 유도용 사료를 먹이는 방법을 이용하여 왔다. 이러한 종래의 방법을 이용하는 경우, 비용과 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라, 비만 쥐의 제작이 100% 담보되지 못하는 문제점이 있었다. 따라서 전세계적으로 대두되고 있는 문제인 비만을 연구하기 위한 비만 동물모델을 제작하기 위한 필요성이 존재한다.
이에 본 발명자들은 효율적인 비만 동물모델 제조방법에 대한 연구를 계속한 결과 PHF20을 과발현시키는 경우 동물모델에서 비만이 유도됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비만 동물모델의 제조방법 및 비만 동물모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 비만 동물모델을 이용하는 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PHF20(PHD finger protein 20) 유전자를 동물에 주입하는 단계;를 포함하는 비만 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된 비만 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된 비만 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질이 처리된 비만 동물모델에서 비만 정도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 측정 결과, 비만 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 비만 동물모델은 체중, 체적, 지질 축적, 에너지 흡수 및 지방조직에서 미토콘드리아 생합성 등이 증가하므로 비만에 의해 유발되는 질환의 발병 기작 연구, 비만 치료제의 스크리닝 및 신약 개발 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 비만 동물모델에서 PHF20 유전자의 발현 증가를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 비만 동물모델의 간에서 PHF20 mRNA의 발현 수준을 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 비만 동물모델의 뇌와 신장에서 PHF20의 발현 수준을 면역조직화학 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 체중을 나타낸 도이다.
도 5는 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 체적을 나타낸 도이다.
도 6은 고지방 식이에서 17주령 비만 동물모델의 체중을 나타낸 도이다.
도 7은 고지방 식이에서 17주령 비만 동물모델의 지방제외체중(lean body mass) 및 체지방량(fat mass)을 Lean and Fat mass 분석법을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 보통의 식이(Chow)에서 사육한 비만 동물모델의 에너지 흡수를 나타낸 도이다.
도 9는 고지방 식이(HFD)에서 사육한 비만 동물모델의 에너지 흡수를 나타낸 도이다.
도 10은 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 지방조직을 H&E 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 보통의 식이(NCD; Normal Chow Diet) 및 고지방 식이(HFD; High Fat Diet)에서 사육한 비만 동물모델의 간을 TEM으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 간을 Oil-red O 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 비만 동물모델의 간에서 PHF20 mRNA의 발현 수준을 PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 비만 동물모델의 뇌와 신장에서 PHF20의 발현 수준을 면역조직화학 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 체중을 나타낸 도이다.
도 5는 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 체적을 나타낸 도이다.
도 6은 고지방 식이에서 17주령 비만 동물모델의 체중을 나타낸 도이다.
도 7은 고지방 식이에서 17주령 비만 동물모델의 지방제외체중(lean body mass) 및 체지방량(fat mass)을 Lean and Fat mass 분석법을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 보통의 식이(Chow)에서 사육한 비만 동물모델의 에너지 흡수를 나타낸 도이다.
도 9는 고지방 식이(HFD)에서 사육한 비만 동물모델의 에너지 흡수를 나타낸 도이다.
도 10은 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 지방조직을 H&E 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 보통의 식이(NCD; Normal Chow Diet) 및 고지방 식이(HFD; High Fat Diet)에서 사육한 비만 동물모델의 간을 TEM으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 보통의 식이 및 고지방 식이에서 사육한 비만 동물모델의 간을 Oil-red O 염색한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 PHF20(PHD finger protein 20) 유전자를 동물에 주입하는 단계;를 포함하는 비만 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 PHF20(PHD finger protein 20) 유전자는 인간 유래로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열(NCBI number NM_016436)로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 PHF20 유전자는 벡터 예컨대, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 비바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 포함되며, 바람직하게는 pcDNA3 벡터에 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 프로모터를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예컨대 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "프로모터"는 이에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 허용하고 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 폴리머라제를 결합시키기 위한 인식 서열 및 전사용 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포내에서 목적한 단백질을 발현시키기 위해서는 적합한 기능성 프로모터를 선택해야 한다. 이들은 예를 들면, GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁되어 있으며, 시판되거나 개개의 공급원으로부터 폴리뉴클레오티드 서열내에 클로닝된 별개의 요소 또는 요소들로서 입수할 수 있다.
상기 프로모터는 CMV 프로모터인 것이 바람직하나 단백질의 과발현을 위한 프로모터라면 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 용어, "CMV 프로모터(이하, pCMV)"란 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus; CMV) 초기(early) 프로모터를 말한다. pCMV는 강력한 조절 요소로 알려져 왔고, 다양한 세포에서 활성을 지닌다. 본 발명에서 PHF20 유전자를 과발현하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 PHF20 유전자를 증폭한 후 벡터에 연결하여 재조합 벡터를 제조할 수 있고, 이때 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드에 포함된 프로모터 이외의 전사 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열은 폴리아데닐화 서열과 같은 전사종결 서열; f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, BBV 복제원점 등의 복제 원점 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 재조합 벡터가 숙주 세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제와 같은 약물 저항 유전자, 대사 관련 유전자, 유전자 증폭 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항 유전자 및/또는 대사 관련 효소 유전자 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 선별 마커는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신 (streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자, 퓨로마이신 (Puromycin) 저항 유전자, 티미딘 키나아제 (TK) 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자, 글루타민 합성효소 (Glutamine synthetase, GS) 유전자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 PHF20 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하여 동물에 주입하였다.
상기 동물은 인간을 제외한 어떠한 동물도 가능하며, 바람직하게는 포유동물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 랫트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 개, 원숭이 등일 수 있다.
상기 주입은 PHF20 유전자를 동물에 과발현시키기 위한 목적을 달성할 수 있는 당 분야에 알려진 유전자 주입 방법에 의해서 제한 없이 수행할 수 있으며, 바람직하게는 난모세포 주입(oocyte injection) 방법에 의해 수행된다.
본 발명에 따른 제조방법은 PHF20 유전자를 포함하는 벡터가 주입된 상기 동물에서 산자를 얻는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 산자는 4세대에 걸쳐 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 상기 산자로부터 주입 유전자가 삽입되었는지 확인하여 파운더(founder) 동물을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기서 주입 유전자가 삽입되었는지 여부는 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 할 수 있고, 바람직하게는 서던 블롯팅(Southern blotting)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기서 상기 주입 유전자는 PHF20 유전자를 지칭한다.
또한, 본 발명은 PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된 비만 동물모델을 제공한다.
상기 동물모델은 정상동물인 야생형과 비교하여, PHF20 유전자의 발현이 증가; 간, 뇌를 포함하는 조직에서 지질 축적의 증가; 지방조직에서 미토콘드리아의 생합성 증가; 체적 증가; 체중 증가;를 포함하는 특성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, “정상동물”은 PHF20이 과발현되지 않은 야생형 동물을 의미한다. 예컨대 PHF20이 과발현되지 않은, 상기 비만 동물모델과 한배 새끼인 동물일 수 있다.
또한, 본 발명은 a) PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된 비만 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; b) 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 비만 정도를 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 측정 결과, 비만 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 방법 중 각 단계에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명의 a) 단계는, PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된 비만 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계이다.
본 발명에서 용어, “후보물질”은 비만을 치료, 예방 또는 개선할 수 있는 물질로서 화학물질, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 유전자, 단백질, 식품, 제형, 화합물, 조성물, 의약, 영양보조제, 건강관리제품 또는 음료 등의 물질을 제한 없이 포함한다.
본 발명에서 PHF20 유전자의 과발현은 당 업계에 공지된 과발현 유전자 조작 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 예컨대 PHF20 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 방법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 처리는 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 복강내 투여 등 종래 시료의 처리 또는 투여 방법 중 적절한 방법을 선택할 수 있으며, 후보물질의 처리양은 처리 방법이나 사전 실험 결과 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 b) 단계는, 상기 후보물질이 처리된 비만 동물모델에서 비만 정도를 측정하는 단계이다.
본 발명에서 비만 정도를 측정은 체중, 체적, PHF20의 발현 또는 활성, 지질 축적, 에너지 흡수(energy intake) 및 지방조직에서 미토콘드리아 생합성(biogenesis)으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 변화를 측정함으로써 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PHF20의 발현 또는 활성 감소 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학염색, 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 단백질 칩(Chip)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 c) 단계는, 상기 b) 단계의 측정 결과, 비만 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계이다.
상기 선별은, 후보물질의 처리 전 비만 동물모델의 비만 정도를 측정한 결과와 b) 단계의 측정 결과를 비교한 결과, 후보물질의 처리 전의 비만 정도보다 비만 정도를 감소시킨 후보물질을 선택함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 비만 동물모델의 확립
PHF20 유전자를 이용하여 비만 모델 마우스를 확립하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다. 인간 PHF20을 암호화하는 cDNA를 pcDNA3 벡터 내 CMV 프로모터의 하류에 서브클로닝 하였고, 형질전환 마우스를 제작하기 위해 난모세포 주입(oocyte injection)하였다. 양성인 마우스를 서던 블롯팅에 의해 확인하였고 야생형 C57BL/6N 마우스에 4세대 동안 사육하는 방식으로 3개의 형질전환(TG) 동물 주를 선별하였다.
비만 동물모델을 확인하기 위하여 야생형 마우스와 PHF20이 과발현된 형질전환 마우스를 Research Diets Inc.에서 구입한 60% 고지방 사료 (D12492)를 12주 동안 식이하게 하였다. 마우스를 12시간 명/12시간 암 주기; 50-60% 습도; 대기 온도 23uC61uC; 먹이를 임의로 제공;하는 제어되는 환경에서 유지하였다. 모든 마우스 실험은 기관의 지침에 따라 동물 시설 내에서 수행하였으며, 실험 프로토콜은 Korean Research Institute of Biotechnology and Bioscience 및 충남대학교의 기관감사위원회에 의해 승인되었다.
상기 방법에 의해 제작된 비만 동물모델로 TG-양성 F3 마우스를 하기 실시예에 사용하였고, TG-음성 한배 새끼를 대조군(야생형 마우스)으로 사용하였다.
실시예 1: 비만 동물모델의 특성 확인
상기 확립한 비만 동물모델의 특성을 확인하기 위해서, PCR에 의해 유전형질 분석(genotyping)을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 꼬리에서 gDNA를 분리한 후 PHF20 유전자 증폭용 프라이머 세트(정방향: TAGCGGTTTGACTCACGGGG, 역방향: ACAGCAGTGACTTTGGCCGGG) 및 내적 대조군인 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머 세트(정방향: AAGGTCGGAGTCAACGGATT, 역방향: CTCCTGGAAGATGGTGATGG)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분 동안 30 사이클 후 95℃ 30초, 72℃ 1분 20초, 72℃ 10분으로 설정하였다. PCR 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 상기 제조예에서 제작한 비만 동물모델에서 대조군인 야생형에 비해 PHF20 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다.
또한, 간에서 대조군인 야생형과 비만 동물모델의 PHF20 mRNA의 수준을 PCR을 통해 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기에서 제조한 비만 동물모델의 간에서 PHF20 유전자의 mRNA 수준이 대조군에 비해 유의도 있게 증가함을 확인하였다.
또한, 야생형 마우스와 비만 동물모델 마우스의 뇌와 신장에서 면역조직화학 기법에 의해 PHF20의 발현 수준을 측정하였다. 구체적으로 뇌와 신장을 10% 중화된 포르말린에 16시간 동안 고정하고, 세척한 후 파라핀에 임베딩하였다. 5mm 두께의 조직 단면의 파라핀을 제거하고 재수화(rehydrate) 한 후 시트르산 완충액 내에 전자레인지에서 10분 동안 가열하였다. 이후 상기 조직 단면을 1차 항체(항-PHF20 (1:100 희석; Cell Signaling))와 함께 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. Polink-1 HRP Rat-NM DAB Detection System (GBI Inc)을 사용해서 면역조직화학 염색을 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에 비해 비만 동물모델의 뇌와 신장에서 PHF20이 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 2: 비만 동물모델의 체중, 체적 및 지방 축적 확인
비만 동물모델에서 PHF20의 과발현이 미치는 영향을 확인하기 위해서 체중 및 지방 축적을 측정하였다.
보통의 식이(NCD; Normal Chow Diet) 및 고지방 식이(HFD; High Fat Diet)에서 야생형과 비만 동물모델을 사육한 뒤 체중을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었고, 28주령의 야생형 및 비만 동물모델 마우스의 체적(body size)을 비교하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이를 유지한 경우 비만 동물모델은 야생형에 비해서 유의적으로 체중 및 체적이 증가함을 확인하였다.
또한, 고지방 식이를 유지하는 경우 17주령의 야생형 마우스와 비만 동물모델의 체중을 비교한 결과를 도 6에 나타내었으며, 도 6과 같이 비만 동물모델 마우스의 체중이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.
또한, 고지방 식이를 유지하는 경우 17주령의 야생형 및 비만 동물모델에서 Lean and Fat mass 분석법을 수행한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 지방제외체중(lean body mass)은 야생형 및 비만 동물모델에서 유의적 차이가 없었으나, 체지방량(fat mass)가 비만 동물모델에서 유의적으로 증가함을 확인하였다.
따라서, 야생형에 비해 비만 동물모델의 경우 고지방식이에서 지방의 축적으로 인한 체지방의 증가로 인해 체중 및 체적이 증가하므로 비만 동물모델로서 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 비만 동물모델에서 에너지 흡수 측정
비만 동물모델에서 음식 및 에너지 흡수를 확인하기 위해서, 야생형과 비만 동물모델 마우스를 각각 보통의 식이와 고지방 식이로 유지한 후 음식의 섭취 및 에너지 흡수를 측정하고 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 보통의 식이와 고지방 식이로 유지한 경우 모두에서 비만 동물모델의 에너지 흡수가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실시예 4: 비만 동물모델에서 지질 축적 및 지방조직에서 미토콘드리아의 생합성 측정
비만 동물모델에서 지질 축적 및 지방조직에서 미토콘드리아의 생합성을 측정하기 위해서, 보통의 식이와 고지방식이를 유지한 비만 동물모델 및 야생형 마우스의 지방조직(adipose tissue)을 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색하고 염색 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 보통의 식이를 유지한 경우 야생형과 비만 동물모델의 지방조직 사이에 큰 차이점을 발견할 수 없었던 반면, 고지방 식이를 유지한 경우 야생형에 비해 비만 동물모델의 지방조직에 지질이 많이 축적되었음을 확인하였다.
또한, 보통의 식이와 고지방 식이를 유지한 비만 동물모델 및 야생형 마우스의 간을 TEM으로 관찰하였다. 구체적으로, 각 동물 군의 간을 1% 글루타르알데히드 내 4℃에서 고정한 후 0.1M 카코딜산염(cacodylate) 완충액으로 4℃에서 세척하였다. 이와 같이 5회 세척한 후 상기 조직을 0.1% CaCl2를 포함하는 0.1m 카코딜산염 완충액(pH7.2)에서 1% OsO4로 4℃에서 1시간 동안 후고정 하였다. 시료를 순차적(serial) 에탄올에 의해 탈수시키고 프로필렌 옥사이드를 처리하고 Embed-812(EMS) 내에 임베딩하였다. 이후 레진을 60℃에서 36시간 동안 중합하였다. 조직을 EM UC6 ultramicrotome (LEICA)을 사용하여 섹션하였고 4% 우라닐 아세테이트 및 시트레이트로 염색하였다. Tecani G2 Spirit Tween 투과전자현미경(FEI Company, USA) 및 JEM ARM 1300S high-voltage electron microscope (JEOL, Japan)를 사용하여 관찰하고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 두 종류의 식이 모두에서 야생형에 비해 비만 동물모델(PHF20-TG)에서 미토콘드리아가 높은 수준으로 발견되었으며, 고지방 식이를 유지한 경우 보통의 식이를 유지한 경우에 비해 지질이 높은 수준으로 발견됨을 확인하였고, 고지방 식이 유지시 야생형에 비해 비만동물모델(PHF-TG)에서 지방 소립(lipid droplet)의 크기가 커져있음을 확인하였다.
실시예
5: 비만 동물모델의 간에서 지질 축적 확인
간에서의 지질 축적을 확인하기 위해서, 보통의 식이와 고지방식이를 유지한 야생형 및 비만 동물모델의 간을 Oil-red O 염색하여 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 지방세포를 염색하는 Oil-red O 염색 결과 야생형 및 비만 동물모델 모두 보통의 식이보다 고지방 식이를 유지한 경우 지질 축적이 뚜렷하게 증가함을 확인하였고, 고지방 식이를 유지한 경우에도 야생형보다 비만 동물모델의 간에서 지질 축적이 많이 발생했음을 알 수 있다.
따라서 상기 실시예들에서 확인한 바와 같이 PHF20을 과발현시켜 제작한 비만 동물모델은 특히 고지방 식이에서 지질 축적, 에너지 섭취, 미토콘드리아의 생합성을 증가를 나타내므로 비만에 대한 연구를 위한 동물모델로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
통계적 분석
3개 이상의 별개의 시험으로부터 얻은 데이터를 평균 ± S.D.로 표현하였다. 그룹 간의 차이를 Student’t test에 의하여 분석하였다. 대조군 값과 비교하여 p<0.05(*)를 유의도 있는 것으로 보았고, p<0.01(**)은 유의도가 상당히 높은 것으로 보았다. 통계적 분석은 SPSS software ver. 13.0 (SPSS Inc.)을 사용하여 분석하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
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<130> 1_33P
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 5899
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
gggggtcacg tggtgcagag cacgcagagt ccttctgtcg gttggtcctg gagcggcgca 60
gccggagtgg ggccgtgagg agaataaagg cagccccgtt gatgactgaa aatgacaaag 120
catccaccta acagacgagg aatcagcttt gaagtgggag cccagttgga agcccgggac 180
cgtttaaaaa actggtatcc agctcacata gaagacattg actacgagga aggaaaagta 240
ctcatccatt tcaagcgttg gaaccatcgt tatgatgagt ggttctgctg ggacagtcct 300
tatttacgcc ctttagagaa aatacagctg aggaaagagg gcttgcatga agaggatgga 360
tcttctgaat ttcaaataaa tgagcaggtc cttgcttgct ggtctgattg tcgtttttac 420
ccggccaaag tcactgctgt taacaaggat ggtacttaca ctgtgaaatt ttatgatgga 480
gtagttcaga ctgtcaaaca tattcatgtc aaagcttttt ccaaagatca gaatattgtg 540
ggtaatgcta ggcctaaaga aacagatcac aaaagtcttt catcatctcc tgataaacga 600
gagaagttta aagaacagag aaaagcaaca gtgaatgtga agaaagacaa agaagataaa 660
cccttaaaga cagaaaagcg acccaagcag cctgataaag aaggaaagtt aatctgttct 720
gaaaagggga aagtgtcaga gaaaagtctt cccaagaacg agaaggaaga caaggaaaac 780
atttccgaaa atgacagaga gtattctgga gatgcccaag tggataagaa acctgaaaat 840
gacattgtga agagtccaca agaaaacttg agggaaccca aaagaaaacg aggcagaccc 900
ccttccatag ctcctactgc tgtggattca aactctcaaa ctttgcaacc aataacattg 960
gaactgagaa gaaggaaaat atcaaaagga tgtgaagtcc cattaaaacg tcctcggctt 1020
gacaaaaatt catcccagga aaagtcaaaa aactactcgg aaaacactga caaagactta 1080
tcgaggagac gttcctccag gctgtccact aatgggaccc atgagatcct agatcctgac 1140
ttggttgtat cagatttggt tgatacggat cctttgcaag acacgttgtc tagtaccaag 1200
gaatctgaag aaggtcagtt gaagtctgct ttggaagctg gccaggtctc atctgcactg 1260
acttgccact cctttgggga tggatccggg gctgcaggct tggagttgaa ctgcccatca 1320
atgggagaaa acacgatgaa aacagaaccg acttctcccc ttgtggaatt acaagagatt 1380
tcgactgtgg aagtaacaaa tacttttaag aaaacagatg attttgggtc atctaatgca 1440
ccagctgtcg acctagacca taagtttaga tgcaaagttg tggactgttt aaaatttttc 1500
cgcaaagcca aactgttgca ctatcacatg aagtatttcc atggaatgga gaagtcactg 1560
gagccagaag agagcccggg aaagaggcat gtccaaacca ggggcccttc agcttcagac 1620
aagcccagcc aggagaccct gaccaggaag cgggtctctg ccagttcccc aactacaaaa 1680
gacaaggaaa agaataaaga gaagaaattc aaggagtttg tgagagtgaa gccaaagaag 1740
aaaaagaaaa agaaaaagaa aaccaaacct gaatgcccct gcagtgagga gatcagtgac 1800
acctcccagg aaccttctcc acccaaggca tttgctgtta ccaggtgtgg gtcctcacac 1860
aagccagggg tccatatgag cccgcagctt catggcccag aatctggaca ccacaaaggg 1920
aaagtgaaag cattggagga ggataatttg agtgagtcct cttctgagag ctttctctgg 1980
agtgatgatg agtatggcca agatgtggat gtgaccacca acccagatga ggaacttgat 2040
ggggatgacc gctatgactt cgaggtggtc cgctgcatct gtgaggtcca ggaggaaaat 2100
gacttcatga ttcagtgtga agagtgccag tgctggcagc atggggtctg catgggatta 2160
ctggaagaaa atgtgcccga gaaatacacc tgttatgttt gccaagaccc tccaggtcag 2220
aggcctggct tcaagtactg gtatgacaag gagtggctga gcaggggaca tatgcatggc 2280
ctggcatttc tagaagagaa ctactcccat cagaatgcca agaagatcgt ggccacccac 2340
cagcttcttg gtgatgtgca gagagtgatt gaggttctgc atggcctgca gctcaagatg 2400
agcatcttgc aaagccggga gcatcctgat ctgccgctgt ggtgccagcc ttggaaacag 2460
cactcagggg aggggagatc tcatttcaga aacatccctg tcactgacac caggagcaag 2520
gaggaagctc caagctatag aactttgaac ggggcagtgg agaagcccag gcccctggcc 2580
ctgcccctgc cgcgttctgt ggaggaatcc tatatcacca gtgagcattg ctaccagaag 2640
ccccgcgcct attaccctgc cgtggagcag aagctggtgg tggagacgag gggctctgcc 2700
ctcgacgatg cggtcaaccc cctccatgag aacggcgatg attccctttc cccgcgcctg 2760
ggctggcctc tagaccaaga caggagcaag ggggacagtg accccaaacc cggctcccca 2820
aaggtgaagg aatatgtctc caaaaaggcc ctaccagaag aagcccctgc tcggaagctg 2880
ctggacagag gtggagaggg gctgctgagc tcccagcacc agtggcagtt taacctgctg 2940
acccatgtgg aatctcttca ggatgaagtt acgcacagga tggactccat tgagaaggag 3000
ttggatgtgt tggagagctg gctggactac actggggaac tggagccccc tgagccgctg 3060
gccaggcttc cgcagctcaa gcattgtatc aagcagctgc tgatggacct gggcaaggtg 3120
cagcagatcg ccctctgctg ctcaacatga aactgggcac ccaaaactca tgggggcaca 3180
atcctggggc acctgcagga ggagcttcgc atatttaaat aaataaacct agcatgctga 3240
atgcacgtga caccgactga cttcagggat ctgggccagg agtgtggtgg acattggaca 3300
aagaggccat tttggctgcg ggaggacact ctgatctcga agcctgccat aaaggtagca 3360
aatagactct tgggattccc ctcttctgtg cacatcgttg aatgaagaga gtctttttgc 3420
acaaacttca cttgaaattg tgccactgat gataaacgga atgagagcca aaaaagttta 3480
gttggagaca gttgtaaatt caatttggag tttatttaat tgacttttct atcacgttgg 3540
ggcacatgcc aactccctgg tttcttcctg gcatggtgtt tgggcagcag gcatcatttt 3600
ccttttctag cttcatagga atattgtgag ctcaccatgc tgtggaggtt gggaaagagc 3660
agagtcttgg ctgccctgct ttctccttag gactcttcac ttttctcacc acatctcttg 3720
catgacttca tggtactggg gacaagtttg tatgccttca ccccagagct ggctgggtta 3780
tggcttttgt agcagagccc atacagccta tggaagaact agaatctcac tcacagtaat 3840
aagaatctag gaggaattcc aaaccgaagc aggcagggtc tggaacccaa aggacagcat 3900
tttctaccca cttcttaata ttgacagctt ccccgttcta tttaatgtcc aaaaatgttt 3960
cccaaaattt caaactcttt cactgtaaag atttgttaca aagaatgtgg tttggggaat 4020
taccttattt tatattgttg taaacaaact tcaaattcta catgtgcgac ttttctcctt 4080
cctgaagggt gtttagtagt cagcgttttc agaattgttt tgttactata ctttaacatt 4140
ttacatttcc tgtttgtatt attttgtgag agcaaggtga tcatgctgct taaggtccag 4200
gtacaaccta tttgtacctt ttgagacaat atttgtgtta cttttgcagg ttacggttcc 4260
acatgtaatt gctatatttt gttttgtttt tccttactag gcaaagttaa aatgttccat 4320
gctttgagga gtgacccatt tcactacttt gttttcttat cactaaaggc aaaaatcaaa 4380
gcacagttgt ccattaacac ttataagtta attatgggtt tatgagtctg taatgttata 4440
tgctgcaaac atttactatg taaacgtgaa gtagccaata atatctcaat agtagtaaca 4500
gtatctttag cgacctttgg aatagttaag cacaggtcat tgtggacatg aattcaggcc 4560
tctgtactaa aatctatttc agggaatgtt ctgtctagtg atttgctcac catttgatat 4620
ataatgaatt ataggacaag tataagctga tctgctatag ctgtccatca gagagaatac 4680
acgtggctat aacatctata acaaaacgac gattcctcta caagaggctg tttctcactg 4740
ctaacgttgg tgtttctggc gtgggaagaa atgcacaggc gtgcatggca tgcacgttca 4800
gacagctgca ttgtaagagt tctgtcatgc agtctgaaaa gggaagaaac aggatggctt 4860
tctgtagcca cacctgtgag gcgtgatgat tgttgtatta ttagattact gatttttctt 4920
ttctgaaaat acatttgagt tttaatcaca tctgtggaag ctgtaacttt taaggtagtc 4980
aatttcatgt cttgttcaac gatgtaagca gaaactgaat tgccctaatt ttgccaactg 5040
gccattattg ggattattgt ttaaattttt ggtaaaggaa gtaatctcct ttcattcatt 5100
gtgacttttg ttcttaggga agcagagaag actccccaag ttcttataac ctcattgtgc 5160
ttccctaatt taaagccatg ttgaggggct ccattcccaa ttcctgggtc aaggtgaatt 5220
aaccctatgt tggagcactg gaaaccgtta tttgcaaaca ttgctgttac catttagaaa 5280
tatgtgcact atcagctggg tgcagtggct cacgtctgta atcccagcac tttgggaggc 5340
cgaggcaggt ggatcacctg aggtcaggag ttcgagacca gcctggccaa cagggtgaaa 5400
ccccgtctct actaaaagta caaaaattag ctgggcgtgg tggcggacgc ctgtaatctc 5460
agctacttgg gaggctgaag caggagaggt gctggaacct gggaggcgga ggttgaagtg 5520
agccgagatt gcgctattgc actccagctc gggcgacaac tgcaagactc catctcaaaa 5580
aaataaaaat aaaagaaaag aaagaaatat gtgcactacc taagttttgt ctttagaaaa 5640
actatccacc tataaaaaat taccttgaca aaaatagttc cggtttgact aatcattttg 5700
tttctttaag tggtaagtgt atgcaaggtg gatccttgat gagccaacat tgcactgtgg 5760
atacatatct atgtttacgc gctattagaa cagaaggcgc tgtatataga aatgttgctt 5820
tgaagcaata tttgcaaaac acgcagactt ctgtatctgt atttggaaaa aataaaacag 5880
gttcttgtta aaaaaaaaa 5899
Claims (8)
- PHF20(PHD finger protein 20) 유전자를 동물에 주입하는 단계;를 포함하는 비만 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PHF20 유전자는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 바이러스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상에 포함되는 것인, 비만 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물인 것인, 비만 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PHF20 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 비만 동물모델의 제조방법.
- PHF20(PHD finger protein 20) 유전자가 과발현된, 비만 동물모델.
- a) 제5항의 비만 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
b) 상기 후보물질이 처리된 비만 동물모델에서 비만 정도를 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 측정 결과, 비만 정도를 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 b) 단계에서 비만 정도 측정은 체중, 체적, PHF20의 발현 또는 활성, 지질 축적, 에너지 흡수(energy intake) 및 지방조직에서 미토콘드리아 생합성(biogenesis)으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 변화를 측정함으로써 수행되는 것인, 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 PHF20의 발현 또는 활성 감소 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학염색, 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 및 단백질 칩(Chip)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 비만 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
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