CN105228640B - Phf20和jmjd3组合物及其在肿瘤免疫治疗中的使用方法 - Google Patents
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Abstract
调节哺乳动物体细胞重编程的药物组合物和治疗方法，特别是能对人细胞重编程进行体内体外的正向和负向调节的药物组合物和治疗方法。这一发明提供了PHF20来源的复合物和有用的方法用于癌症免疫治疗，特别是乳腺癌的治疗。
Description
优先权信息
本申请要求申请日为2013年2月26日、专利申请序列号为61/769,545的审查中的美国专利申请的优先权，该专利申请内容通过参考并入本申请中。
相关技术描述
人及小鼠的体细胞均可通过四个关键转录因子：Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc(Okitaet al.,2007；Takahashi et al.,2007b；Takahashi and Yamanaka,2006；Yu et al.,2007)被重编程为类似于多能胚胎干细胞(ESC)的状态，从而产生诱导多能干细胞(iPSCs)。基于iPSCs与ESCs在基因表达谱、表观遗传/基因标记以及自我更新和分化成多种细胞的能力方面的相似性，它在人类疾病模型的建立，药物筛选，甚至治疗应用方面拥有巨大的潜能(Plath and Lowry,2011；Robinton and Daley,2012)。
尽管采用以下几种方法均可以实现体细胞的重编程，包括诱导四个转录因子的表达，蛋白转导以及小RNA(miRNA)表达(Robinton andDaley,2012；Stadtfeld andHochedlinger,2010)，不管是依赖或不依赖小分子化合物，其效率及iPSC产生的动力仍不理想。这表明，在重编程过程有大量的遗传和表观遗传的的障碍存在(Hanna et al.,2009；Smith et al.,2010)。
许多因素，包括细胞增殖和细胞周期，间充质细胞到上皮细胞的转化以及表观遗传对组蛋白修饰和DNA甲基化的调节均可影响重编程效率(Papp and Plath,2011；Stadtfeld and Hochedlinger,2010)。瞬时强迫细胞表达重编程因子会产生可分离的事件，开始是间质细胞到上皮细胞的转化引起的体细胞标记物YHY I的丢失，接着激活胚胎标记物，例如碱性磷酸酶(AP)以及胚胎抗原1(SSEA1)(Li et al.,2010；Plath and Lowry,2011)。诱导和维持内源性多能基因，例如Nanog和Oct4，需要在DNA甲基化和组蛋白修饰方面进一步进行表观遗传修饰(Stadtfeld and Hochedlinger,2010)。如果不能及时达到这些表观遗传的变化，可能会导致部分重编程诱导多能干细胞。
在重编程过程中，全面分析常染色质的动态变化可以揭示在组蛋白修饰水平精细的表观遗传的改变(Gaspar-Maia et al.,011；Hemberger et al.,2009；Hochedlingerand Plath,2009；Koche et al.,2011)。异位表达染色质重塑蛋白，例如Brg-1和Brf155可以增强四个因子介导的重编程效率(Gaspar-Maia et al.,2009；Singhal et al.,2010)。ESCs和iPSCs都含有“二价结合域”，在这一区域核体标记为组氨酸3-赖氨酸27和组氨酸3-赖氨酸4三甲基化(H3K27me3和H3K4me3)(Gaspar-Mafia et al.,2011；Hochedlinger andPlath,2009)。而PcG复合体介导H3K27甲基化并且抑制基因阻遏(Cao et al.,2002；Margueron and Rinberg,2011),Jmjd3和Utx介导H3K27去甲基化(Agger et al.,2007；Hong et al.,2007；Jepsen et al.,2007；Kouzarides,2007；Lan et al.,2007)。因此，根据表观遗传因素在决定细胞谱系方面的重要性，可以合理推测在体细胞重编程过程中，一些因子是体细胞重编程高效进行所必须的，而另外一些因子可能起负调控作用。如果要除去这些重编程过程中路障，需要增加了解这些表观遗传分子的作用机制，即哪一种表观遗传因子控制细胞系从而影响重编程的动态过程。
发明概要
Jmjd3被鉴定为是重编程过程中的重要负调控分子。Jmjd3缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)与野生型相比明显会产生更多的iPSC克隆，而Jmjd3异位表达可以显著抑制重编程。Jmjd3的抑制作用通过组氨酸脱甲基酶依赖性及非依赖性两种途径实现，而后者是完全新颖的并包括Jmjd3靶向PHF20并通过招募E3连接酶Trim26而进行泛素化和降解。PHF20缺陷的MEFs即便在Jmjd3,Ink4a或p21敲低的条件下也不能转换为完全重编程的iPSCs，说明PHF20这一蛋白在重编程过程中起主导作用。因此，本发明提供了诱导多能干细胞形成的方法，包括在细胞中抑制或阻止Jmjd3基因的表达及抑制JMJD3蛋白的活性，例如通过在细胞培养中添加JMJD3的拮抗剂。
还发现PHF20在超过90％的乳腺癌组织中过表达，可作为一个新的乳腺癌抗原，在介导强的抗肿瘤免疫反应中起重要作用。因此提供了靶向PHF20的乳腺癌免疫疗法。一个实施方案中，提供了联合免疫疗法，该联合免疫疗法产生PHF20抗原特异性免疫反应，同时抑制乳腺癌肿瘤生长。另一个实施方案中，给予有需求的患者负载有纳米脂质体的树突状细胞(DC)与具有抗-PD-1(程序性死亡-1)闭锁的siRNAs或抗人PD1(抗-PD1)抗体联合应用，所述纳米脂质体含有PHF20肽，其中PHF20/DC免疫接种增强抗原特异性T细胞的前体，而抗-PD-1闭锁增加抗原特异性T细胞反应，(从而)抑制肿瘤生长并降低非特异性免疫反应或副作用。
另一个实施方案中，可以用包含抗PHF20抗体的合适制备物靶向肿瘤特异的PHF20，所述抗PHF20抗体优选人源化、或人、单克隆抗体。
本发明还提供了药物组合物，包括PHF20肽及药学上可接受的赋形剂，PHF20肽来源于PHF20蛋白，是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的表位。PHF20肽，优选人的PHF20肽，可以激活T细胞，从而使T细胞能够识别负载有PHF20肽的T2细胞或PHF20阳性的乳腺癌细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗或药物组合物，所述疫苗或药物组合物包含PHF20肽、编码PHF20肽的核酸分子、或包含编码PHF20肽的核酸分子的表达载体。
在本发明的一个实施方案中，提供了PHF20肽特异性的分离的T细胞，优选CTL，或者用PHF20肽刺激外周血单核细胞(PBMCs)产生的分离的T细胞。
本发明还提供了治疗乳腺癌的方法，包括以下步骤(a)从对象分离细胞群，该细胞群包含或能够产生CTLs和/或TH细胞；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂联用；(c)筛选所述细胞群中对PHF20肽特异的CTLs或TH细胞或它们的混合；以及(d)给予癌症患者所述细胞群。
或者，上述方法可包括：(a)从对象分离细胞群，这个群体包含或能够产生CTLs、TH细胞或它们的混合；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂联用；(c)筛选所述细胞群中对PHF20特异的CTLs、TH细胞或它们的混合；(d)从筛选的CTLs、TH细胞或它们的混合中克隆对本文描述的PHF20肽特异的T细胞受体(TCR)基因；(e)将在(c)克隆出的TCR基因转导入：i.患者细胞；或ii.供体细胞；或iii真核或原核细胞以产生mTCRs用于乳腺癌患者治疗。
附图简要说明
图1显示的是Jmjd3以及其它几个主要调节重编程的表观遗传因子的鉴定。异位表达Jmjd3可以抑制重编程。图1H和图1I中的数据显示的是三次独立实验的平均值+标准偏差。星号代表与对照有显著性差异(*p<0.05,**p<0.01***p<0.001by Student's t test)。
图2显示Jmjd3切除增加了重编程的效率和动力学。图2B和2C中的数据显示的是三次独立实验的平均值+标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异(*p<0.05,**p<0.01byStudent's t test)。
图3显示的是鉴定参与增强重编程的Jmjd3的靶基因。图3B、3D、3E、3F中的数据是三次独立实验的平均值±标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异(*p<0.05,**p<0.01***p<0.001by Student's t test)。
图4显示的是PHF20对iPSCs的维持和重编程有关键作用。图4D、4F、4H、4I、4J、4K和4L中使用的数据是三次独立实验的平均值±标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异(*p<0.05,**p<0.01by Student's t test)。
图5显示的是Jmjd3与PHF20相互作用并引起PHF20的降解。
图6显示的是Jmjd3靶向PHF20，通过招募E3泛素连接酶Trim26泛素化PHF20。
图7显示的是PHF20在重编程过程中通过与Wdr5相互作用是Oct4表达所必要的。图7A、7C-7E、7I和7J中使用的数据是三次独立实验的平均值±标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异(*p<0.05,**p<0.01by Student's t test)。
图8显示的是PHF20在乳腺癌中高表达。图8A显示PHF20mRNA在乳腺癌中的表达通过实时定量PCR测定。图8B用蛋白免疫印迹的方法分析PHF20在乳腺癌细胞和正常细胞系的表达情况。MCF-10A是一个正常乳腺细胞系。
图9显示的是PHF20特异的T细胞的产生及表征。(图9A)PHF20938-946特异的CD8+T细胞是通过对正常志愿者的PBMCs用PHF20肽体外刺激获得，并用于确定装载有不同浓度的PHF20938-946肽及对照肽(阴性对照)的T2细胞的识别。(图9B)PHF20938-946特异的T细胞在培养基中单独或与HLA-A2+PHF20+(MCF-7)或HLA-A2-PHF20+(DU4475,MDA-MB-361)乳腺癌细胞系共培养。一个正常的乳腺上皮细胞系MCF-10A作为对照。通过检测IFN-γ的释放来检测T细胞的活性。(图9C)PHF20938-946特异的CD8+T细胞通过LDH测试检测对MCF-7的细胞毒性。HLA-A2阴性的PHF20+PC3作为LDH测试的阴性对照。所用数据为平均值±标准偏差。结果代表三次独立实验。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与对照相比。
图10显示的是在DCs中降低负调控因子的表达可增强抗原特异性免疫反应。抗肿瘤免疫反应在基于纳米技术的传递系统下会有进一步提高。
图11显示的是一个MSV传递系统以及利用它在肿瘤治疗模型中产生有效抗肿瘤免疫。(A)脂质体存在及不存在两种条件下MSV示意图展示。(B)通过负载有MSV/脂质体的DCs产生抗肿瘤免疫，MSV/脂质体包含TRP-2，CpG(TLR9的一个配体)以及MPLA(单脂酰脂质A，TLR4的一个配体)。小鼠静脉注射B16肿瘤细胞(每只鼠注射0.3*106个细胞，重悬于200μLPBS中)。4天后这些荷瘤小鼠用负载有所指肽或纳米颗粒的DCs免疫(0.3*106个细胞)。接种疫苗14天后检查肺转移。(C)不同处理组中B16的肺转移灶数目。四个组中的数据250代表数目太多无法统计。
图12展示的是DC/PHF20疫苗与抗PD-1联合治疗。
图13展示的是DC/肽抗原与抗PD-1联合治疗的两个时间表。
图14HLA-A2转基因小鼠中PHF20特异的T细胞免疫应答。用DC/PHF20肽免疫HLA-A2转基因小鼠。8天后，从脾脏中分离T细胞，检测它们识别PHF20或无关肽的能力。用CD8-FITC抗体染色，接着用IFN-g-PE抗体胞内染色。选通CD8+T细胞群后进行FACS分析。
发明描述
Jmjd3负调控体细胞重编程
在Tet-O-4F MEFs中用shRNA敲低技术鉴定出许多组蛋白修饰相关的蛋白是体细胞向iPSCs重编程过程中所需要。只有Jmjd3一个蛋白在这一过程中起到负调控作用。
Jmjd3可以通过上调启动子H3K27中三甲基化水平，从而在上调In4a/Arf中起重要作用(Agger et al.,2009；Barradas et al.,2009)。它通过H3K27的去三甲基化与其他靶基因相互作用以及通过与KIAA1718相互作用促进转录延长(Chen et al.,2012)。对In4a/Arf表达造成的这些影响可以导致衰老和抑制重编程(Hong etal.,2009；Kawamura etal.,2009；Li et al.,2009；Marion et al.,2009；Utikal et al.,2009)。如上文所述，切除Jmjd3可以降低细胞的衰老并且通过降低In4a和p21表达促进Jmjd3缺陷的MEFs重编程。然而，一些证据表明Jmjd3负调控重编程过程是通过一个新途径实现的，即不依赖于组蛋白甲基化酶的途径。首先，同时降低Jmjd3、Ink4a或p20的表达与单独降低它们中任意一个的表达相比明显会产生更多的iPSC克隆，这表明，Jmjd3抑制重编程的功能不仅仅是通过我们之前预测的上调Ink4a或p20实现的；其次，尽管在Jmjd3缺失的MEFs中异位表达全长的Jmjd3可以恢复Ink4a/Arf的表达并明显抑制重编程，但是我们用Jmjd3的突变体Jmjd3-AlmjC和Jmjd3-111390A也可以达到相同效果，而两个突变体都存在H3K27me3去甲基化酶活性，并不能调控Ink4a/Arf表达。因此Jmjd3利用脱甲基化酶活性依赖性及非依赖性两种机制调控体细胞重编程，并且后一种方式起主导作用。我们搜寻可能参与Jmjd3介导的脱甲基化酶非依赖性介导的调控重编程过程的靶分子，经过广泛筛查我们找到了PHF20。降低PHF20的表达会显著引起ESCs和iPSCs的分化，然而，如果ESCs或iPSCs用RA处理或去除LIP会引起PHF20,Oct4和Nanog表达下调，证明PHF20的表达对维持多能性状态的重要作用。PHF20最初被认为是抗体反应性蛋白，在包括肝癌和髓母细胞瘤在内的几种肿瘤中高表达(Fischer et al.,2001；Wang et al.,2002)。PHF20已被鉴定为“组蛋白识别器”，因为它可以特异地识别H3K4，H3K9，H4K20和H4K79的二甲基化(Adams-Cioaba et al.,2012；Kim etal.,2006)。最近的研究表明PHF20可以识别p53的K370和K382而甲基化，并且在对抗DNA受伤时可以在转录水平及转录后水平调控p53(Li et al.,2012b；Park et al.,2012)。PHF20敲除的小鼠出生不久就会死亡(Badeaux et al.,2012)。此外PHF20缺失的小鼠不能产生ESC。与此相应，PHF20缺失的MEFs重编程过程会受到完全抑制，这说明PHF20是iPSC重编程及产生ESCs的一个绝对必要因子。
Jmjd3在决定T细胞谱系的过程中有重要的作用，它通过一个去甲基化酶活性非依赖性途径，与CD4+T辅助细胞(Th1)主要调控分子T-bet及染色体塑造BAP复合体的主要催化亚基Brg-1相互作用实现的(Miller et al.,2010)。在这个例子中，Jmjd3与PHF20相互作用，引起PHF20泛素化，并通过蛋白酶体途径降解。虽然Jmjd1蛋白的C-端和N-端均可以结合到PHF20的N-端，Jmjd3蛋白自身并不能引起PHF20的K48泛素化。相反，它会招募一个E3泛素连接酶Trim26到PHF20上引起PHF20的K48泛素化。在敲低Trim26时PHF20的泛素化和降解也随之消失，从而增强iPSC的重编程。进一步研究表明全长的Jmjd3，以及某些突变体(Jmjd3-AJmjC和Jmjd3-H1390A)，但不包括Jmjd3-N，Jmjd3-M，Jmjd3-C突变体，可以结合到PHF20介导PHF20的泛素化。这些结果强调了Jmjd3-Trim26介导的泛素化在负调控重编程过程中所起的重要作用。
iPSCs的完全重编程伴随着不同的DNA甲基化模式改变以及内源性的Oct4以及其他几种ESC标志基因的活性表达(Plath and Lowry,2011；Stadtfeld and Hochedlinger,2010)。然而，是否是因为PHF20缺失引起这些内源标志基因未能激活，因此不能成功地重编程？一项最新的研究表明外源的Oct4与其他主要的重编程因子首先在MEFs中引起Wdr5的表达，随后形成Wdr5-Oct4复合体结合到Oct4启动子，引起内源的Oct4活化(Ang et al.,2011)。PHF20与Oct4表达的直接联系是，PHF20不仅可以结合到Oct4的启动子区域，还会与Wdr5和MOF特异结合。最近的研究显示MOF参与ESC自我更新和功能以及调控Nanog表达(Liet al.,2012a)。PHF20的缺失会降低Wdr5及MOF结合到Oct4启动子的能力，暗示了这种蛋白在活化内源Oct4表达以及增强iPSCs完全重编程所起的关键作用。与此观念相一致的是，这一实例中所显示的结果进一步证明PHF20缺失会引起许多内源性的ESC标记基因在重编程过程中不能再活化。尽管内源性的Sox2和Nanog表达缺失可以通过外源Oct4的表达得到弥补(在Dox存在的条件下)。这表明PHF20直接或间接影响许多ESC的关键基因表达。ChIP-PCR和ChIP-seq分析表明PHF20和Wdr5结合到Oct4的启动子，但并不会与Sox2，Nanog，Dnmt3i，Esgl，Eras，Rexl或Crinto的启动子位置结合。此外，ChIP-seq分析显示PHF20和Wdr5均会结合重要的表观遗传因子基因，包括Baf155，Brg-1和Sal4。因此，这就可以解释为什么PHF20缺失的MEFs不能非完全重编程的表现不能靠Oct4或4F(OSKM)的过表达来弥补，并且可以以此推断出PHF20是一个上游调控分子，调控Oct4及其他许多重要的ESC标志基因，因此，本研究提供的一个机制联系是Jmjd3介导PHF20降解导致重编程的缺陷。
基于这些发现，我们提出一个Jmjd3-PHF20轴如何调节iPSC重编程的工作模型。在WT MEFs中由4F介导的重编程中Jmjd3的表达增加，至少会启动两个不通过的通路(FIG.7K)。
1)Jmjd具有H3K27me2/3脱甲基化酶活性，它可以通过修饰H3K4和H3K27的甲基化上调Ink4a/Arf及p21。增加Ink4a、Arf和p21的量会引起细胞的衰老或凋亡，并降低细胞的增值，因此降低重编程的动力和效率。
2)Jmjd3蛋白也可以靶向PHF20，通过113K27脱甲基化酶非依赖性的方式，招募一个E3泛素连接酶Tim26将其泛素化和降解。PHF20的降解引起内源Oct4不能或微量表达，以此很大程度上降低重编程的效率。综上可看到，Jmjd3通过脱甲基化酶活性依赖及非依赖性途径有力地抑制重编程的动力和效率。Jmjd3缺失时可以使细胞的衰老及凋亡降低，并增强细胞的增殖，这要归功于增加了PHF20的量，引起内源Oct4表达激活，为体细胞重编程创造条件。
PHF20作为癌症治疗的免疫靶点
经研究发现PHF20(植物指状同源结构域包含蛋白20)在超过90％的乳腺癌组织中过表达，可以作为一个新的肿瘤抗原，介导抗肿瘤免疫反应而发挥重要作用。因此，我们提出靶向PHF20进行免疫治疗乳腺癌。一个实施方案是用联合免疫疗法产生PHF20特异的免疫反应，同时抑制乳腺癌细胞的增殖。另一个方案：将含有PHF20的肽及抑制PD1(程序性死亡1)的siRNAs纳米脂质体负载到树突状细胞(DC)，给患者免疫，根据需要，也可给患者使用抗人PD1抗体。PHF20/DC免疫接种可以诱导增加抗原特异性T细胞，同时，通过阻断PD-1信号通路可增强抗原特异性T细胞免疫反应，抑制肿瘤细胞的增殖，降低非特异性免疫反应或副反应。另一个实施方案中，可以用合适的抗PHF20抗体，优选的是人源化或人单克隆抗体靶向肿瘤特异的PHF20。
本发明提供了一个药物组合物，由一个治疗或控制乳腺癌的疫苗构成。本发明提供的疫苗除其他组成成分外，包含一个PHF20肽，此肽可为PHF20蛋白来源的任意肽(细节见下文)，并作为细胞毒性T细胞(CTL)的表位。本发明的PHF20肽可用于体外刺激T细胞，经过刺激的T细胞可以识别负载不同PHF20肽浓度的T2细胞，或者PHF20阳性的乳腺癌细胞。
NetMHC 3.2版本(cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.2)利用Artificial NeuralNetworks预测及选择结合到等位基因HLA-A0201的9聚体肽。预测阈值小于或等于50nM的肽，我们认为有较强的结合性，而阈值大于500nM的则淘汰。我们选择了10个PHF20来源的9聚体肽，它们的序列如表1所示。
表1PHF20肽的氨基酸序列
在具体的实施方案中PHF20肽来源的PHF20蛋白为人PHF20蛋白。在另一个实施方案中PHF20肽包含氨基酸WQFNLLTHV(SEQ IDNO:2)。
本发明中的疫苗在一些实施法案中可以联合使用。
在一些实施方案中，本文提供的实施方案包含基于PHF20肽的乳腺癌疫苗。在其他实施方案中，本文提供的组合物包含疫苗以及辅助T细胞的抗原表位，佐剂和/或免疫应答调节剂。在其他实施方案中，本文提供的组合物包含免疫应答调节剂。本文提供的药物组合物适用于人及动物。
一方面，本文提供的基于PHF20肽的疫苗依据患者需要可用于预防、治疗和/或控制乳腺癌，可作为预防性疫苗或者治疗性疫苗给予患者。这些患者包括被诊断出乳腺癌或有乳腺癌患病风险的。那些经过其他方法治疗的乳腺癌患者，无论有效与否，均适用于这种治疗方案。
免疫系统对于肿瘤细胞的识别，控制和破坏起关键作用。利用免疫系统清除恶性肿瘤成为肿瘤治疗的一个有力方法，但是，直到现在才在临床上有了零星成功(Rosenberg,2011；Lesterhuis et al.,2011；Di Lorenzo et al.,2011)。最近美国FDA批准了以免疫治疗为基础的两个药物sipuleucel-T(Provenge)和ipilimumab(Yervoy,抗-CTLA-4)，分别用于治疗转移性的前列腺癌和黑色素瘤，这是肿瘤免疫治疗领域的里程碑(Kantoff et al.,2010；Hodi et al.,2010)。但是还缺少对乳腺癌的免疫治疗的方案。
尽管许多能作为免疫治疗靶标的乳腺肿瘤抗原已经被发现，他们却只在小部分乳腺癌中表达。例如，HER-2/neu只在20％的乳腺癌中表达。NY-ESO-1和MAGE-A家族抗原只在2-6％的乳腺癌中表达(Chenet al.,2011)，超过80％的乳腺癌患者无法应用。因此，在乳腺癌免疫治疗领域，其中一个主要的困难是鉴定能应用于大多数患者的新的乳腺癌抗原。为了解决这个关键问题，研究者们最近发现了PHF20(植物指状同源结构域包含蛋白20，planthomeodomain finger-containing protein 20)，它具有免疫原性并且在超过90％的乳腺癌患者中高表达。它的MHC-I及MHC-II限制性T细胞表位均已被鉴定。PHF20特异性T细胞能识别PHF20阳性的乳腺癌细胞。PHF20也称为胶质瘤表达抗原2(GLEA2)及肝细胞癌抗原58(HCA58)，能在癌症患者体内引起强烈的抗体反应(Fischer et al.,2001；Wang et al.,2002)。重要的是，针对PHF20的自身抗体反应与神经母细胞瘤患者的长生存期显著相关(Pallasch et al.,2005)。然而，在众多导致肽疫苗甚至FDA认证的疫苗(例如sipuleucel-T)(Buonerba et al.,2011)相对低下的临床有效性的因素中，T细胞共抑制分子CTLA-4、PD-1(programmed death1)信号及调节性T细胞(Tregs)等强大的多重抑制机制是改善癌症疫苗及药物疗效的主要障碍(Curiel et al.,2004；Wang et al.,2004；Zou,2006；Wangand Wang,2007)。PD-1在活化的T细胞中表达，是一个关键的免疫检查点分子(Dong etal.,1999)，它的配体为PD-L1(B7-h1)在肿瘤细胞及基质细胞中表达，他们通过相互作用发挥免疫抑制功能(Dong et al.,2002)。近来，抗PD-1抗体相关的临床试验在肺癌、黑色素瘤及肾细胞癌患者中显示了持久的肿瘤消退及18-28％的客观临床反应率(Topalian etal.,2012；Brahmer et al.,2012)。
因此，改善PHF20免疫治疗的关键在于(1)通过调节DC细胞的能力产生强大的免疫反应；(2)通过阻断PD-1介导的抑制信号进一步放大抗原特异性免疫反应。也就是说，通过敲低DC细胞的负性信号及阻断T细胞的共抑制信号，进一步增强PHF20疫苗产生的乳腺癌特异性免疫，从而产生强大而持久的针对乳腺癌的抗原特异性免疫反应。
我们最近实施了一个用NY-ESO-1肽疫苗治疗转移性前列腺癌患者的I期临床试验。虽然这些肽疫苗是安全的，也能引起肿瘤特异性免疫反应，但是像其他蛋白/肽疫苗相关研究一样，其临床反应率仍有待改善。因为NY-ESO-1只在小部分(2-6％)乳腺癌中表达，它并不适合用于乳腺癌的免疫治疗。为此，PHF20，一个新的免疫靶标，已经被发现在超过90％的乳腺癌样本及细胞系中表达。因此，基于PHF20的蛋白/肽疫苗可用来诱导肿瘤特异性T细胞反应，再通过敲低DC细胞的负性信号及抗PD-1抗体的阻断作用来进一步增强。为了促进临床转化研究，GMP等级的PHF20肽已经被制备好，且GMP等级的抗PD-1和抗PD-L1抗体也已经可以使用。
虽然免疫抑制及负性免疫调节对于维持宿主免疫反应和免疫耐受间的平衡至关重要，他们也同时造就了研发强效疫苗及药物的障碍(Sakaguchiet al.,2004)。对于肿瘤也是如此，因为PD-1信号有效地削弱了肿瘤肽/蛋白疫苗诱导的免疫反应(Zou,2006；Wangand Wang,2007)。这里所展示的研究，首次把PHF20作为免疫原性抗原靶标用于乳腺癌的免疫治疗，也显示了PHF20特异性抗肿瘤免疫能通过阻断DC细胞及T细胞的负性信号进一步增强，就像放开了抗原特异性T细胞产生及增值的刹车一样。最重要的是，DC细胞/肽疫苗与阻断PD-1负性信号的联合治疗能产生更优越的抗原特异性抗肿瘤免疫。这种联合治疗代表了治疗转移性乳腺癌的一个全新的方法。
这些研究也直接解决了肿瘤免疫治疗领域的一个主要问题——免疫检查点及免疫抑制。这一发明——阻断免疫抑制及负性调节因素，为转移性乳腺癌的治疗创造了新的机遇，也引领了新的抗原特异的治疗性抗肿瘤疫苗/药物的研发。
PHF-20：一个新的乳腺癌抗原：因为HER-2/neu只在20％的乳腺癌中表达，而NY-ESO-1和MAGE-A家族抗原只在2-6％的乳腺癌中表达，所以，鉴定能应用于大多数乳腺癌患者的免疫治疗的乳腺癌抗原至关重要。为此，PHF20，一个新的乳腺癌抗原已经被发现。PHF20在乳腺癌细胞中高表达，其在正常乳腺细胞系(MCF-10A)、PBMC或正常组织中(睾丸除外)低表达甚至不表达。如图8A and图8B所示，通过实时PCR及蛋白质印记分析，在乳腺癌细胞中，PHF20在mRNA水平及蛋白质水平上高表达。
PHF20特异性T细胞识别乳腺癌：为了测定PHF20的免疫原性，T细胞从HLA-A2+的健康供者的PBMC中分离出来，PHF20特异性的T细胞能够识别PHF20938-946(WQFNLLTHV)肽负载的T2细胞及PHF20阳性的乳腺癌细胞(图9A和图9B)。并且，PHF20特异性T细胞能裂解HLA-A2及PHF20双阳性的MCF-7乳腺癌细胞(图9C)。
干细胞重编程需要PHF20：研究显示PHF20是胚胎干细胞(ESC)及诱导性多能干细胞(iPSCs)的维持和再生所必须的。PHF20缺失会导致iPSCs/ESCs的分化和许多干细胞标记物的下调(图4G和图4C)。PHF20在MEF细胞中的缺失阻止了其重编程为iPSC细胞，此过程能被PHF20cDNA过表达所逆转(图4J)。这些结果显示了PHF20是ESC细胞及iPSC细胞的产生和维持所必须的，提示PHF20可能在肿瘤干细胞的再生和维持中有重要的作用。
抑制性分子或负性调节因子：T细胞活化的共抑制分子，例如CTLA-4和PD-1(程序细胞死亡1)被用来作为抗体药物的靶标，以阻断T细胞的负性信号。类似地，敲低固有免疫信号通路的负性调节因子，例如DC中的A20，能增强抵抗免疫抑制的能力，诱发强大的抗肿瘤免疫(Song et al.,2008)。最近一些重要的负性调节因子也被陆续发现，包括NLRC5,NLRX1和NLRP4这些NOD样受体蛋白家族的成员。NLRC5和NLRX1通过不同的机制与IκB激酶(IKK)复合物相互作用有效地阻止了NF-κB的活化(Cui et al.,2011；Xia et al.,2011)。重要的是，他们也通过标靶不同的受体或衔接分子抑制I型干扰素信号通路。NLRC5通过直接和RIG-I及MDA-5相互作用以抑制I型干扰素信号(Cui et al.,2011)，然而NLRX1通过与一个重要的衔接分子MAVS相互作用以抑制I型干扰素信号(Moore et al.,2008)。敲低或敲除这些负性调节因子加强了NF-κB以及I型干扰素信号并产生了更多的促炎因子(Cui etal.,2012；Tong et al.,2012)。
NY-ESO-1肽用于前列腺癌患者的I期临床试验：NY-ESO-1重组蛋白或合成肽用于黑色素瘤及卵巢癌的I期临床试验已经被执行(Davis et al.,2004；Khong et al.,2004；Odunsi et al.,2007；Valmori et al.,2007)。用于转移性前列腺癌患者的I期临床试验最近也完成了，此试验用于评估MHC-I类和/或MHC-II类分子限制性NY-ESO-1肽联合运用的安全性及可行性。试验共招募了9名患者。试验显示此肽疫苗具有良好的耐受性。在6名患者中，PSA翻倍时间(PSA-DT)的中位数相对于基线水平有所延长，其中包括两名PSA水平有所下降。9名患者中有6名被观察到有强烈的NY-ESO-1特异性T细胞反应。这些可喜的临床结果为测试PHF20能否在乳腺癌患者中能否诱发强免疫反应提供了动力，因为NY-ESO-1在乳腺癌中的低表达率阻碍了其在乳腺癌免疫治疗中的应用。
因为PHF20可以致敏健康捐助者PBMC中的T细胞，肿瘤患者的HLA-A2表型的PHF20特异的T细胞前体要比健康捐助者的多。如果是这样，抗原特异的T细胞在体外用PHF20肽刺激后会很容易检测，诱导和扩增。对于NY-ESO-1，研究发现，在已经产生NY-ESO-1特异性抗体的患者中，可以很容易地从PBMC中分离出NY-ESO-1特异的T细胞。
PHF20肽可诱导肿瘤患者外周血单个核细胞中的抗原特异性T细胞：虽然大多数自身抗原特异性T细胞通过中央免疫耐受机制被清除，但一些自身抗原特异性T细胞可逃避这种耐受机制，并且在外周血中循环。这些T细胞的T细胞受体(TCR)亲和力相对较低。当癌症相关的自身抗原如PHF20在癌细胞中过表达时，与健康人比较，他们可能会诱导和增加癌症患者外周血单个核细胞(PBMCs)中抗原特异性T细胞的亲和力和前体。
收集20例患者和健康供者的PBMCs(其中10例来自HLA-A2+健康供者，10例来自HLA-A2+乳腺癌患者)。将每个样品中约2.5×105个PBMCs铺于96孔平底板，10μg/ml肽处理。第7和14天时，将辐照过的1×105个PBMCs经过10μg/ml肽处理，洗两次，加到每个孔。第8、11、15和18天时，120IU/mL IL-2处理。每个刺激周期，收集细胞，与靶细胞共孵育过夜，检测上清中细胞因子的释放。HLA-A2匹配/HLA-A2不匹配肿瘤细胞株、EBV转化的B细胞都和T细胞过夜共培养。收集细胞上清，ELISA检测细胞因子(GM CSF，IFNγ、IL-4、IL-17和IL10)。固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)、细胞内细胞因子染色和Tetramer染色进一步鉴定抗原特异性T细胞。ELISPOT和胞内染色法是评估功能性抗原特异性T细胞的可靠方法，而Tetramer染色不依赖T细胞功能确定T细胞占总细胞的比例。实验结果表明，PHF20肽诱导和扩增抗原特异性T细胞的效应在乳腺癌患者的外周血单个核细胞中比健康人外周血单个核细胞更容易出现。
为了检测乳腺癌患者外周血单个核细胞中PHF20特异性T细胞的TCR亲和力是否高于健康供者，将不同浓度肽(例如10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001μM稀释于无血清培养基中)与HLA-A2匹配的T2细胞或EBV转化的B细胞共孵育90分钟后，洗三次。将健康捐赠者和乳腺癌患者T细胞加到不同浓度肽的孔中，与T细胞过夜共培养，ELISA测定上清液中细胞因子的释放。
PHF20特异性抗体反应与乳腺癌患者体内高的抗原特异性T细胞前体细胞反应有关。为了确定健康供者和乳腺癌患者体内PHF20特异性抗体反应的异同，我们与美国卫理公会医院研究所(TMHRI)的Dr.Jenny Chang合作，收集80名癌症患者血清和20份健康供者血清(作为对照组)。详细的实验过程类似于先前检测NY-ESO-1抗体的描述。将血清稀释25倍、250倍时，PHF20OD值大于平均OD值加上健康供者SDs值的三倍定义为阳性反应。一旦确定乳腺癌患者血清含高滴度的PHF20抗体，这些患者将被检测是否含有较高的PHF20特异性T细胞前体，与不含抗PHF20抗体的乳腺癌患者相比。同时，血清含抗PHF20抗体的乳腺癌患者表现出更好的生存状况。总的来说，这些研究表明使用PHF20蛋白质/肽对乳腺癌进行免疫治疗是有效的，并且PHF20抗体和抗原特异性T细胞反应在乳腺癌的控制中同样重要。
HLA-A2转基因(Tg)小鼠已被成功用于癌症疫苗研究的临床前模型。最近，杰克逊实验室(Jackson Laboratory)人源化NGS-A2小鼠已被选定为蛋白质/肽免疫接种后直接评价人T细胞反应的指标。由于人和小鼠识别PHF20的T细胞表位序列是相同的，所以这些小鼠和乳腺癌细胞系E0771-A2(表达HLA-A2分子)的使用非常适合临床前肿瘤模型的研究。用PHF20肽免疫接种HLA-A2和NSG-A2(NOD SCID il2rgama-：1)转基因小鼠可激活抗原特异性CD8+T细胞，引起强有力的T细胞介导的抗乳腺癌反应。下面进行的实验是为了确定DCs/PHF20肽免疫接种这些小鼠是否足以抑制肿瘤生长。HLA-A2和NSG-A2小鼠都可诱导T细胞应答，这里我们以HLA-A2转基因小鼠作为实例来说明本节的实验设计。
HLA-A2转基因小鼠的肿瘤治疗模型：由于癌症患者肿瘤进展迅速，所以确定PHF20肽疫苗是否可以产生抗肿瘤免疫疗效十分重要。在肿瘤治疗模型中进行以下研究。
(a)免疫用DCs/PHF20肽的制备：DCs从HLA-A2转基因小鼠中获取。第7天时，收集DCs，以10uM终浓度PHF20肽和其他对照肽与其共孵育90分钟，PBS洗三次后DCs/肽可用于免疫接种。三个疫苗接种组进行测试：(1)DC/PHF20肽，(2)DC/对照肽，和(3)DC/PBS。
(b)用乳腺癌E0771-A2细胞系免疫接种和攻击：第0天，HLA-A2转基因小鼠(每组6只)皮下注射E0771-A2乳腺癌细胞(5×105个/鼠)。第5天，给这些荷瘤小鼠尾静脉注射3×105个DCs/PHF20肽或DCs/对照肽。每2天使用卡尺监测肿瘤的生长。统计学分析组间肿瘤生长抑制差异。
(C)CD8+T细胞反应的分析：为了评估CD8+T细胞的功能，收集免疫小鼠和肿瘤消退小鼠的脾细胞。每组选取三只小鼠，取其淋巴结，尼龙网过滤，Ficoll密度梯度离心，制成单细胞悬液。CD4抗体、CD8抗体染色，流式细胞仪分析这些细胞的表型。再利用不同方法对抗原特异性T细胞的功能进行检测。
i)细胞因子谱分析：采用活化16小时的T细胞上清，ELISA检测CD8+T细胞分泌的GM-CSF，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10，TGF-β和IL-17。
ii)ELISPOT法：具体ELISPOT法操作步骤参见抗原特异性T细胞的研究(Fu etal.,2004)。使用显微镜计数彩色斑点。
iii)四聚体测定：HLA-A2/PHF20四聚体用来检测抗原特异性CD8+T细胞，方法同前所述检测TRP2特异性的CD8+T细胞(Fu et al.,2004)。
PHF20肽的免疫毒性研究。癌症患者的其他肽疫苗无毒性作用，但诱导自身免疫反应仍有可能。以C57BL/6小鼠作为对照评价PHF20肽对HLA-A2转基因小鼠的急性和慢性毒性。
剂量：选用两种肽传递的方法。一种是静脉注射不同浓度DCs/PHF20(0，3，30，100mg/mL)。第二种是皮下注射PHF20肽。基于对人类NY-ESO1肽Ⅰ期临床试验的经验，肽剂量为每注射液1mg，等于每只鼠0.28μg。因此，对于急性毒性研究，我们将使用10和100倍的高浓度肽(即，每只鼠3和30μg)。所有组(每组10只HLA-A2小鼠)静脉注射不同剂量的PHF20肽或对照肽(例如0，3，30和60μg/鼠标)。C57BL/6小鼠作为PHF20肽的一种特异性对照。检测急性毒性，小鼠连续6天接受注射；评估慢性毒性，小鼠每周一次注射，连续6个月。
动物行为及体重：每日评估各组小鼠的死亡、行为、疼痛或痛苦的迹象。每周监测其食物消耗和身体重量。
临床病理：急性毒性试验，第一次剂量(0天)前，抽血进行血液学(CBC)和血清化学评估，随后每周一次(0，7，14，21和28天)监测。为了确定慢性毒性，前2个月每2周(0天，14，28，42、56)收集一次血液，随后四个月，每30天收集一次，共计九份血液样本，进行血液学及血清化学实验。血清分析炎性细胞因子如IL-1和IL-6的产生，检测自身抗体、核仁抗原和抗体(ANA)的产生。大体和镜下病理剖检在美国卫理公会医院研究所(TMHRI)病理中心进行。
统计分析：所有数据按照以下标准方式进行分析。每个端点都有基线测量，且和对照组的相应值进行比较。每个组都有描述性统计，包括平均值、标准差，中位数和范围。成对比较用控制实验错误率的技术来实现。动物实验中，采用双侧双样t检验，每组6个样本就能达到81％的效力来检测组间差别，能达到0.01的显著性差异。最后，用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验对肿瘤体积差异进行评估。用重复测量方差分析(Repeated MeasureANOVA)来检测差异随时间的增长。样本大小计算用PASS 2002(NCSS和PASS，Kaysvi lle，UT)进行，所有分析用SPSS 12软件包(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行。
DCs在诱导免疫和耐受过程中扮演重要角色，除了肿瘤抗原肽和TLR7/9受体激动剂的刺激，增强DCs诱导抗原特异性免疫反应能力的一个关键是减少DCs中的负调控分子。因此，减少负调控分子，可实现DCs以最大能力来刺激T细胞反应(图10)。有研究人员(Ferrari,2005；Grattoni et al.,2011)使用多级纳米递送系统促使DCs有效地提呈肽与小分子(TLR配体和siRNA)。
已有一些负调控分子被鉴定，包括有效抑制NF-kB活化和I型干扰素信号的NLRC5、NLRX1和NLRP4。减少这些负调控分子可增强天然免疫反应和细胞因子的产生。沉默这些负调控分子的表达可增强DCs诱导抗原特异性免疫反应的独特能力。减少NLRX1的表达是实现上述效应的一种方法(图10)，其中减少DCs中A20分子的表达作为阳性对照。
a)NLRX1-KD DCs的制备：NLRX1-KD DCs直接从NLRX1-KD x HLA-A2或HLA-A2转基因小鼠体内分离。或者，如前所述(Fu et al.,2004)，从慢病毒包被NLRX1shRNA转染的HLA-A2小鼠体内获得DCs。
b)肿瘤治疗模型中，肿瘤内注射和DC/肽免疫：第0天，HLA-A2小鼠(每组6只)皮下注射E0771-A2乳腺肿瘤细胞。野生型DCs和NLRX1-KD DCs与PHF20肽或对照肽共孵育，PBS洗三次后，DCs/肽作免疫备用。肿瘤细胞注射后第5天开始接种DCs/肽，DCs/肽，包括以下四组：1)DCs/PHF20肽；2)DCs/对照肽；3)NLRX1-KD DCs/PHF20肽；和4)NLRX1-KD DCs/对照肽。每2天用数字卡尺监测肿瘤生长。如前所述(Fu et al.,2004)，用细胞内染色法、ELISA和四聚体分析检测抗原特异性T细胞功能。
Surface chemical modifications have been optimized such that theparticles can evade
表面化学修饰方法的优化，使得微粒可以逃避生物屏障，富集到肿瘤组织。利用光刻合成方法，我们基本可以生产出任何尺寸和形状的第一代微粒，在设计图中就可以实现整个空间。第二代纳米颗粒可以是结合小分子药物如肽、TLR激动剂、siRNA的脂质体和微胶粒。这里，我们打算将TRP2肽，TLR7/9受体激动剂，Poly-G3OND和(或)siRNA结合进纳米脂质体。然后将这些纳米脂质体加载到介孔硅中(MSV/liposomes)(图11A)。MSV/liposomes可直接体外转进DCs，再静脉注射到小鼠体内。另一种方法是直接将这些MSV/liposomes注射到小鼠体内。
为了验证MSV输送系统的效力，最近我们进行的实验采用B16肿瘤和TRP-2肽(在小鼠体内可被H-2Kb提呈，人体内被HLA-A2提呈)，我们发现DCs/MSV-TRP-2(MSV/liposomes含有TRP-2肽)免疫的小鼠肺部B16肿瘤不生长。相反，DC/MSV、DC/TRP-2、MSV-TRP-2免疫的小鼠肺部肿瘤继续生长(图11)。这些结果表明，为实现有效抗肿瘤免疫，DCs和MSV/脂质体传送系统都是需要的。通过基于纳米技术的MSV/脂质体输送系统，将肿瘤肽、TLR配体和(或)siRNA结合使用能够显著提高癌症免疫治疗的疗效，且副作用最小化。肿瘤抗原肽、TLR7/9激动剂和(或)siRNA可以装入相同或不同的纳米粒子。
c)DCs/纳米颗粒的制备：准备DCs，第7天时，收集DCs，负载含有PHF20肽、TLR7/9配体和(或)前述(Wang et al.,2002)负调控分子siRNA的MSV/脂质体，PBS洗三次后，DCs/纳米微粒作免疫备用。
免疫及肿瘤生长监测：为了探究DCs/MSV/liposome-PHF20、DCs/MSV/liposome-TLR7/9激动剂和(或)DCs/MSV/liposome-负调控分子siRNA如DCs/MSV/liposome-NLRX1的联合治疗效果，第0天，HLA-A2转基因小鼠(每组6只)皮下注射E0771-A2肿瘤细胞(5×105个/鼠标)。第5天，给这些小鼠静脉注射3×105个DCs/纳米颗粒，DCs/纳米颗粒包括以下四组：1)MSV/PHF20；2)MSV/对照肽；3)MSV/PHF20+TLR7/9受体激动剂；4)MSV/PHF20+TLR7/9受体激动剂+NLRX1shRNA。每2天监测肿瘤的生长。
B7-H1(也称为CD274，PD-L1)是T细胞活化中一个关键的负调控分子，在大多数新鲜分离的人类癌症样本中，B7-H1组成性表达。B7-H1是其受体PD-1的主要配体，对T细胞提供抑制信号，抑制免疫反应(Samstein et al.,2012；Woo et al.,2012)。B7-H1/PD-1介导的抑制机制包括诱导细胞凋亡、无能和耗竭激活的效应T细胞(Woo et al.,2012；Zou andChen,2008)。因此，肿瘤微环境中B7-H1/PD-1抑制作用的存在，抗肿瘤T细胞的免疫功能不能发挥。有研究发现(Darce et al.,2012；Samstein et al.,2012；Matsuzaki et al.,2010)，在病毒感染和癌症患者耗竭的CD8+T细胞中，PD-1上调。这部分解释了为什么外周T细胞反应和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)不会导致癌症的消退(Taube et al.,2012)。最近的临床试验表明,用抗PD-1抗体可使肿瘤持久消退，肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌的临床反应率为18-28％。
鉴于存在多种抑制机制抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞反应，我们推测阻断T细胞激活中PD-1的负调控信号会增强抗肿瘤免疫。用PHF20肽免疫小鼠会诱导抗原特异性免疫，但可能不足以消灭肿瘤细胞。越来越多的证据表明，增强抗肿瘤T细胞反应需要阻断负调控信号或卡控点(CTLA-4和PD-1)。因此，最佳的抗肿瘤免疫是通过PHF20肽疫苗诱导产生抗原特异性T细胞，同时结合抗PD-1或抗PD-L1抗体，进而获得抗肿瘤免疫的有效治疗(图12)。
通过阻断PD-1可增强PHF20肽诱导的抗肿瘤免疫。使用或不使用抗人PD-1抗体，用DC/PHF20肽免疫人源化NSG-A2小鼠，实验程序概述如下。
i)人源化NSG-A2小鼠的制备：用人性化NSG-A2小鼠来表明PHF20肽疫苗在诱导有效抗肿瘤免疫中的可行性和有效性。NSG-A2(NOD SCID IL2rgama-/-：HLA-A2.1)小鼠已是病毒感染和癌症研究中一个有效的临床前模型。人源化NSG-A2小鼠使用先前描述的方法获得。简而言之，2到5天大的NSG小鼠用100cGy照射后6小时，肝内注入1～3×105个CD34+造血干细胞。移植后10-12周，采血，流式细胞仪分析外周淋巴细胞。
ii)DCs/PHF20肽的制备：从HLA-A2+的外周血单个核细胞中准备DCs，第7天，收集DCs，负载PHF20肽或对照肽，方法如前所述，PBS洗三次后，DCs/PHF20肽作免疫接种备用。或者可用负载含有PHF20肽、TLR7/9配体和(或)siRNA的MAV/脂质体的DCs作免疫备用。
iii)免疫和肿瘤生长监测：第0天，人源化NSG-A2转基因小鼠(每组6只)皮下注射HLA-A2+人乳腺癌细胞MCF-7(5×105/鼠)。第5天，给这些荷瘤小鼠尾静脉注射3×105DCs/PHF20或对照肽。由于抗PD-1阻断可以和DCs/PHF20同时免疫，或者在DCs/肽免疫之后，所以我们进行实验以确定最佳组合方案。如图13所示，治疗组包括以下：
A.疫苗接种+抗PD-1阻断时间表
1)第5天，仅用DCs/PHF20肽免疫，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫
2)第5天，DC/PHF20肽免疫+对照抗体，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫+对照抗体
3)第5天，DC/PHF20肽免疫+抗PD-1抗体，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫+抗PD-1抗体
B.初始和加强免疫+抗PD-1阻断时间表
1)第5天，DCs/PHF20肽免疫，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫
2)第5天，DCs/PHF20肽免疫，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫+对照抗体
3)第5天，DCs/PHF20肽免疫，第20天，再次用DCs/PHF20肽免疫+抗PD-1抗体
每2天监测肿瘤的生长。统计分析组间肿瘤生长抑制的差异。
检测抗原特异性T细胞：为了监测T细胞反应和抗肿瘤免疫的关系，我们使用PHF20肽四聚体和ELISPOT法检测CD8+T细胞反应。同时，用酶联免疫吸附法检测T细胞产生的不同细胞因子。
本实验表明了DCs/PHF20肽刺激剂或疫苗在诱导抗原特异性T细胞反应和抗肿瘤免疫中的生物效价和毒性，并确定了最有前途的策略，即通过减少DCs中负调控分子的表达以产生强大的免疫反应。强大的抗肿瘤免疫功能可通过结合PHF20肽疫苗和抗PD-1阻断来实现。本研究提供了一种用于治疗癌症，特别是转移性乳腺癌，结合PHF20和抗PD-1免疫治疗疫苗或药物的发展方向。
HLA-A2转基因小鼠体内PHF20特异性T细胞的产生：为了表明用DCs/PHF20肽免疫HLA-A2转基因小鼠能够诱导抗原特异性T细胞反应，通过实验，我们发现DCs/PHF20免疫HLA-A2小鼠产生很强的特异性识别PHF20肽(WQFNLLTHV)的抗原特异性T细胞反应，而不是针对其他不相关的肽(图14)
用DCs/PHF20免疫HLA-A2转基因小鼠，八天后，从脾细胞中分离T细胞，检测它们识别PHF20和其他不相关肽的能力。T细胞进行抗-CD8-FITC染色，胞内染抗-IFN-γ-PE。流式细胞仪分析CD8+T细胞群。
实施例
以下实施例为了说明本发明的说明性实施方案。本领域一般技术人员应理解，这些实施例中公开的技术代表着发现其在实施本发明中作用良好的技术，因此可认为这些技术构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员，在根据本公开内容理解及不脱离本发明精神的基础上，在具体实施过程中更改许多操作仍可以得到类似的结果，具体化的实例从发明的精神和范围出发可以获得类似的结果。
JMJD3通过依赖或不依赖组蛋白去甲基化酶活性信号通路负调控重编程
本例中，通过一系列组蛋白修饰蛋白的筛选，已确定Jmjd3是体细胞重编程中一个有效的负调控分子。减少或消除Jmjd3的表达可增强重编程效力，该过程由以下双机制介导：1)Jmjd3通过上调p21、Jnk4a促进细胞衰老，进而部分抑制诱导多能干细胞的重编程，2)Jmjd3依赖去甲基化酶活性，通过Trim26靶向调控PHF20的泛素化和蛋白酶体降解。减少或清除PHF20可阻断内源性Oct的表达活性，从而激活部分程序性细胞。这些结果表明，Jmjd3-PHF20轴是体细胞重编程中的关键途径，也为Jmjd3调控重编程的分子机制提供了新的视野。
实验程序
小鼠
Rosa-rtTA Tet-O-Oct4转基因小鼠购于杰克逊实验室(strain 006911)。Tet-O-Myc转基因小鼠来自贝勒医学院。Ezh2ff小鼠来自北卡罗来那大学(UNC)突变小鼠区域资源中心(MMRRC)(Su et al.,2003)。ERT Cre转基因小鼠购于杰克逊实验室(strain 004847)。PHF20基因敲除小鼠来自安德森癌症中心(Badeaux et al.,2012)。使用Cre-LoxP系统敲除Jmjd3外显子15-21位置。通过杂交Jmjdff鼠和Hprt-Cre鼠(Jackson Laboratories,strain004302)实现Jmjd3全基因敲除。Tet-O-Sox2，Tet-O-Klf4和Tet-O-PHF20基因小鼠来自贝勒医学院。通过与C57BL/6小鼠杂交，每一个基因建立和维持两个独立的转基因系。这些小鼠与rtTA Tet-O-Oct4、rtTA-O-Myc转基因小鼠杂交产生五部分转基因小鼠。rtTA Tet-O-Oct4、Sox2、Klf4、Myc的MEFs从转基因小鼠中获取。所有小鼠均养于无病原体的动物房。所有动物研究均采用已经核准的实验程序。
细胞培养
mESCs和miPSCs用mESC培养基【含15％FBS，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1％非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)和1000U ml-1LIF(Santa cruz)d的DMEM培养基】与辐照过的饲养层细胞共培养。
MEFs通过妊娠中期的胚胎(胚胎发育第13.5天)用胰蛋白酶消化分离，再用成纤维细胞培养基(含10％FBS，1mM L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，0.1mMβ-巯基乙醇的DMEM培养基)培养得到。hiPSC培养基包含20％血清替代物的DMEM/F12培养基(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM巯基乙醇，1％非必需氨基酸和10ng/mL的FGF2(Invitrogen)组成。
慢病毒转导
所有慢病毒质粒由先前描述的方法制备(Peng et al.,2005)：将293T细胞放在T175培养瓶中培养，用表达shRNA/cDNA(22.5μg)的慢病毒载体与包装质粒VSV-G(10μg)和△8.9(15μg)一起通过脂质体2000(Invitrogen)转导试剂转导。在转导后48h收集病毒上清液，每种病毒总共可收集大约35ml的病毒上清液。病毒上清液进一步用超速离心机于25000rpm，4℃离心2h，浓缩约200倍，用175μl PBS重悬。MEFs用浓缩的病毒和聚凝胺(8g/mL；Sigma)。通常情况下，超过90％的细胞用这种方法可被转导成功，通过GFP cDNA转导进行判断。慢病毒shRNAs信息如表2所示。
克隆全长Jmjd3，PHF20 cDNAs和各种突变体
为了克隆全长Jmjd3cDNA，分离全部RNA，Jmjd3 cDNA片段通过PCR扩增。含有Jmjd3的5-kb PCR产品克隆到HA-或Flag标记的pcDNA3.1载体。截断缺失突变体用不同引物进行PCR得到。用类似的方法克隆得到全长PHF20和缩短的PHF20。Jmjd3H1390A突变用QuikChange II XL定点突变试剂盒(Agilent technologies)制备。所有的cDNAs测序证实与数据库发表的序列相同。
分离ICM和建立ESC细胞系
在胚胎发育第3.5天，囊胚从PHF20+/-交叉怀孕的雌鼠中分离得到，并在明胶包被的24孔板上用ESC培养基培养。每天监测和记录ICM的生长状况。在第4天，ICM用AP-kit染色。为了建立ESC细胞株，囊胚在胚胎发育第3.5天在24孔细胞培养板上用ESC培养基与饲养层细胞共培养。这些ESCs不断传代至P3。
生产制备嵌合体小鼠
完全重编程的iPSCs细胞显微注入Balb/c囊胚来产生嵌合体小鼠；嵌合体小鼠可以通过毛色来识别。
亚硫酸氢盐测序分析
亚硫酸氢盐转化用Epitect Bisulfite Kit(QIAGEN)进行。分子克隆根据产品说明书采用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen)。
Jmjd3脱甲基酶活性测定
293T细胞转导HA-Jmjd3或各种HA-Jmjd3突变体。转导48h后收集核裂解物。Utx/Jmjd3 H3K27me3去甲基化酶活性检测试剂盒(Epigentek)被用来确定Jmjd3H3K27me3去甲基化酶活性。
免疫荧光染色
细胞在预先处理的盖玻片上培养，用4％PFA固定和用0.5％Triton X-100透明。细胞用一抗染色Oct4(Santa Cruz),SSEA-1(Abcam)or HA，然后分别用共轭Texas Red的二抗染色。细胞核用DAPI(Invitrogen)复染。细胞用配备C350FX摄像头的Leica DMI4000B倒置荧光显微镜拍照。
碱性磷酸酶染色(AP染色)
按照碱性磷酸酶检测试剂盒(Vector lab)的说明书来确定碱性磷酸酶活性。
免疫沉淀(IP)，免疫印迹和泛素化分析
细胞在低盐裂解缓冲液或含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。按照先前描述的(Cui et al.,2010)，样品于10000g离心10min，上清液加入40-μL抗HA凝胶或抗Flag M2亲和力凝胶。样品用特异性抗体在4℃免疫沉淀过夜。珠子清洗5遍，用3×SDS/PAGE加样缓冲液洗脱。用3×SDS/PAGE样缓冲液，并煮沸用于免疫印迹。按照描述使用抗PHF20的特异性抗体(Cell Signaling Technology)，然后用固定化蛋白A/G(Sigma)孵育进行内源性免疫共沉淀试验。化学发光的HRP底物(Millipore)用于蛋白质检测。为了分析PHF20泛素化，HEK293T细胞转导PHF20，JMJD3，Trim26有或没有WT泛素或仅含一个在48位点(K48)或63位点(K63)赖氨酸的泛素突变体。转导后36h，细胞裂解物用指示抗体进行免疫沉淀，包括抗PHF20和抗Flag抗体(Sigma)中，然后用抗泛素或抗K48泛素抗体做免疫印迹分析来检测PHF20的泛素化。
染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR和ChIP-序列分析
根据印超染色质免疫沉淀反应手册(Sigma)进行ChIP的测定。简言之，ESCs和iPSCs最终生长至大约1-5×107个细胞用于每个反应。细胞用1％甲醛溶液在室温下交联10min，并用0.125M甘氨酸淬灭。细胞用1×PBS清洗两次。细胞重悬，裂解并超声溶解，和剪切交联的DNA。将所得的染色质提取物与10g抗体在4℃孵育过夜。第二天，每个样品加入15L封闭的珠子，然后在4℃孵育1h。珠子用RIPA缓冲液洗涤5次。复合物通过在洗脱液中加热至65℃，从珠子上洗脱下来。输入DNA(从超声保留)同时交联逆转处理。DNA用RNaseA、蛋白酶K处理并纯化。用于IP的一抗：PHF20(Cell Signaling Technology)，Wdr5(Bethyl)，鼠/兔IgG和RNA核糖核酸聚合酶Ⅱ(Sigma)。相对倍富集通过测定免疫沉淀效率(免疫沉淀的DNA量/输入样本量)进行计算。对于ChIP-Seq分析，总共30ng的免疫沉淀DNA片段用于ChIP-Seq文库构建。应用Illumina测序。序列从PHF20，Wdr5和聚合酶Ⅱ拉升下来的ChIP-Seq文库读取与使用ELAND软件读取的鼠mm8基因组一致。统计数据的倍数变化用基于MA图的方法进行评估(Wang et al.,2010)。
ChIP-Seq文库用标准方法建立(详阅：www.illumina.com)。生成的文库在Illumina Miseq设备上连续测序两次，对每个样品获得数据放在一起进行分析。生成的序列结果(碱基2-42个)用bowtie 0.12.7软件与鼠基因组mm9比对。(Langmead et al.,2009)。结合峰使用QuEST2.4软件(Valouev et al.,2008)结合标准参数和n倍的特定富集进行分析。由此产生的全基因组结合数据在Cistrome网站用实用工具进行分析(Liu et al.,2011)。全基因组结合模式用CEAS分析(Shin et al.,2009)。过表达的转录因子结合基序用序列位点注释，在转录因子数据库中查询鼠或人的基序(Matys et al.,2006)。转录起始位点(TSS)邻近结合位点采用Genomatix软件集分析(http://www.genomatix.com)。结合和未结合基因意义丰富。基因本体论分析临近结合位点采用基于网络的生物信息学数据库进行分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。
实时定量PCR(real-time PCR)
互补DNA由293T、MEF和iPS细胞的总RNA和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)，用寡核苷酸(dT)作为引物合成得到。基因转录通过实时PCR技术用专门用于ABI PRISM荧光定量PCR仪(Invitrogen)的SYBR绿色荧光实时定量PCR SuperMix在ABIPRISM 7000荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上检测。所有目标基因表达水平数值用肌动蛋白标定。用于实时定量PCR的引物列在表1中。
在重编程过程中敲除PHF20基因
为了确定PHF20在不同重编程阶段的作用，PHF20在不同时间点敲除。在前一天，将Tet-O-4F M2-11MEFs接种于饲养层细胞上，然后在第0天用基于组成型表达shRNA的PHF20特异性慢病毒转导这些细胞。培养基(包含这些病毒)用含强力霉素的新鲜ES培养基换液。为了在其他时间段敲除，细胞在第4、8或12天如文所述用PHF20特异性的或对照慢病毒的shRNA在含强力霉素的ES培养基中感染。感染的细胞在含强力霉素的ES培养基培养，并在第14天计数AP+克隆。
从MEFs和Tet-O-4F MEFs生产iPSCs
鼠源iPSCs按先前描述的方法做一些小的改动后进行生产(Takahashi et al.,2007a)。简单的说，MEFs(1-8×104/孔)接种在6孔细胞培养板里辐照过的MEFs上。第二天，细胞用等量的表达4种逆转录酶的慢病毒和逆转录酶进行转导。第三天，转导的MEFs用含2μg/mL强力霉素的mESC培养基培养14天。通过用含强力霉素的mESC培养基处理MEFs，Tet-O-4F转基因MEFs用于生产iPSCs。iPSCs形成效率基于AP阳性的iPSC克隆和播种的MEFs起始细胞数量进行计算。如前描述生产人的iPSC(Park et al.,2008)。
用Tet-O-4F MEFs和shRNA敲除筛查鉴定调制重编程的表观遗传因子
Tet-O-4F转基因MEF细胞用15个表观遗传因子特异性的慢病毒shRNA转导，然后重新播种于所需密度的辐照过的饲养层细胞上。第二天，加入包含2μg/mL强力霉素的mESC培养基并且每天补液。克隆在第12-14天染色检测AP活性，如前描述生产慢病毒质粒并浓缩(Peng et al.,2005)。
实时定量PCR和免疫印迹
如前所述，总RNA用Trizol(Invitrogen)提取，层析纯化和用SuperScript0II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)逆转录(Cui et al.,2010)。对于ChIP-qPCR分析，1ng ChIP-DNA用于每个PCR。所有qPCR用SYBR Green(Applied Biosystems)进行分析。为了获得全细胞蛋白提取物用于免疫印迹分析，细胞用低盐裂解缓冲液或RIPA缓冲液裂解。引物序列和抗体如表1所示。
Co-IP和ChIP分析
如前所述，细胞用低盐裂解缓冲液裂解，与抗体孵育过夜，蛋白A/G磁珠捕获(Cuiet al.,2010)。煮沸加样缓冲液洗脱免疫沉淀物。取10μL和2％全细胞裂解物用于每个免疫印迹。293T细胞附加表位免疫共沉淀用Flag、HA或Myc抗体在低盐裂解缓冲液中进行。ChIP用印超染色质免疫沉淀试剂盒(Sigma)检测。引物序列和抗体如表1所示。
结果
鉴定Jmjd3为重编程抑制剂
体细胞中转录因子(4个转录因子)的异位表达可以诱导iPSCs产生(Okita etal.,2007；Takahashi et al.,2007b；Takahashi and Yamanaka,2006)，但是重编程方案需要病毒转导必需因子，导致不同的结果。为了建立一个更简单的基于诱导4个转录因子的方法来生产iPSCs，我们建立了表达四环素(Tet)-O-诱导的Sox2和Klf4的转基因小鼠，然后用这些小鼠与携带rtTA-M2反向四环素反式激活因子的Tet-O-诱导的Oct4和Myc转基因小鼠杂交(图1A)。鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)由表达Tet-O-Oct4,-Sox2,-Klf4和-Myc基因和携带rtTA-M2的转基因小鼠产生，一旦他们用多西环素(Dox)处理就检测它们表达4种转录因子的能力。正如图1B所示，当用2μg/mL的Dox处理24h时，Oct4,Sox2,Klf4,和Myc蛋白易于通过免疫印迹分析检测。结果表明这些表达MEFs(Tet-O-4F MEFs)的4种转录因子在Dox存在时可有效产生iPSCs(图1C)。除去Dox在第8天之前或当天可显著减少AP+克隆产生，但在第10天除去Dox或在在第10天以后采用3个不同(WT,Tet-O-4F and Oct4-GFP)的类型的MEFs，AP+iPSC克隆数量没有明显不同。这些完全编程的iPSCs的AP,SSEA-1和Nanog染色为阳性(图1D-图1G)。这些结果与其他研究团队(Carey et al.,2010；Stadtfeld et al.,2010；Wernig et al.,2008)的报道一致，表明基于Tet-O-4F MEF重编程可以提供一个可靠的系统来筛查增强或减弱重编程效率的表观遗传因子。
发明人预测当敲除细胞系特异性分化基因的表达时，涉及组蛋白修饰的表观遗传因子在复活包括Oct4,Sox2和Nanog的富含干细胞的基因表达起关键作用，从而显著增加4种转录因子介导的重编程效率。为了检验这个假设，一组高敲除效率的shRNAs(>70％)用于筛选编码组蛋白甲基转移酶或脱甲基酶的基因，然后转导入Tet-0-4F MEFs。经过3轮筛选，结果表明敲除H3K27甲基转移酶Ezh2和许多包括Fbx110,Taridlb,Jaridld,Jarid2,Jmjdla,Jmjd2c和Utx的组蛋白去甲基转移酶基因，可显著降低重编程效率(图1H)。这与先前的结果一致，表明Fbx110,Ezh2,Jmjdla,Jmjd2c和Utx在ESC恢复和iPSC重编程起至关重要的作用(Ezhkova et al.,2009；Loh et al.,2007；Mansour et al.,2012；Onder etal.,2012；Wang et al.,2011)。相比之下，敲除Jmjd3显著增加4个转录因子介导的重编程效率，当它的异位表达导致重编程效率降低(图10)。虽然此过程无疑需要许多组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶，这些发现表明Jmjd3是体细胞产生iPSC的一个障碍。Jmjd3的这个独特特征导致将其选择作进一步研究。
Jmjd3敲除提高重编程效率和动力学
为了进一步明确Jmjd3在重编程中的作用，用Cre-LoxP系统有针对性的敲除外显子15-21来构建Jmjd3敲除的小鼠(图2A)。来自通过用Jenjd31小鼠和由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶启动子(Hpri-Cre)驱动表达Cre重编程基因的小鼠杂交来完全敲除Jmjd3的小鼠出生后存在肺部和骨骼形成的缺陷，很快死亡。RT-PCR和蛋白质印迹分析Jmjd3缺陷MEFs显示，对比WT对照组，在Jmjd3缺陷型MEFs中没有Jmjd3表达(图2A)。与Jmjd3敲除获得的结果一致，结果表明4个转录因子重编程的Jmjd3缺陷型MEFs比起WT MEFs产生更多的iPSC克隆(图2B)。对比WT MEFs的结果，通过Jmjd3缺陷型3个转录因子诱导的MEFs(Oct4,Sox2and Klf4)也获得了强大的重编程(图2B)。相比之下，Ezh2缺陷型MEFs通过用三苯氧胺处理Ezh211'407:Cre-ESR MEFs产生，显著抑制4个转录因子介导的MEFs重编程效率(图2C)，进一步证实Ezh2是重编程所必需的。更重要的是，结果表明重编程是由3个转录因子或4个转录因子介导，AP4-iPSC克隆在Jmjd3缺陷型MEFs比在WT MEFs中出现的更早，表明Jmjd3敲除显著增加重编程的动力学和重编程效率。
由Jmjd3缺陷型MEFs产生的iPSCs显示ESC特有的形态学和标记，如AP，磷酸酶，SSEA-1和Nanog免疫染色阳性(图2E-图2G)。他们还形成畸胎瘤包含所有3个胚胎胚芽层(外胚层、中胚层和内胚层)(图2H-图2I),注入BALB/C宿主囊胚后形成嵌合体(图2J)。因此，由Jmjd3缺陷型MEFs产生的iPSCs和衍生自WT MEFs的iPSCs一样拥有同样的全能性特征，表明缺失Jmjd3增强Jmjd3重编程的效率和动力学，支持了这种蛋白负调控的角色。
Jmjd3负调控Ink4a/Arf基因座的重编程
发明者接着研究了Jmjd3敲除如何增强重编程。尽管Jmjd3表达被认为通过C端Jumonji域脱甲基Jumonji域修饰启动子区域H3K27甲基化，增加MEFs中Ink4a/Arf基因座的表达(Agger et al.,2009；Barradas et al.,2009)。此外，包括Ink4a,Arf和p21在内几个关键分子的表达，在细胞生长停滞和老化起着关键作用，并且在显著增加重编程效率的同时，它们的缺陷可以延缓细胞老化(Hong et al.,2009；Kawamura et al.,2009；Li etal.,2009；Marion et al.,2009；Utikal et al.,2009)。为了评估这些分子在Jmjd3缺陷型MEFs中的表达水平，我们做了RT-PCR和蛋白质印迹分析。观察到对比WT细胞的结果，Jmjd3缺陷显著降低Inklalibilf mRNA和蛋白质的表达(图3A)。尽管WT MEFs和Jmjd3缺陷型MEFs的p21mRNA没有明显差异(图3A)，Jmjd3缺陷型MEFs细胞的p21蛋白表达也降低。因此，Jmjd3缺陷显著减低Ink4a和Arf蛋白的表达，降低p21蛋白的程度较小。这些作用反过来可以降低细胞衰老和增加细胞增殖。的确，结果表明Jmjd3缺陷型MEF细胞比WT细胞生长更快(图3B)。细胞衰老是根据Jmjd3缺陷型MEFs半乳糖苷酶03-gal染色也减少，对比WT MEFs的结果(图3C)。尽管Jmjd3缺陷型MEFs繁殖5-7代后会经历衰老危机，因Jmjd3缺陷造成的衰老短期内减少和细胞增殖增加可能形成一个短暂的提高这些MEFs重编程的效率和动力学的方法。
为了确定Ink4alArf和p21下调对Jmjd3缺陷型MEFs高效重编程的影响程度，通过特异性的shRNAs敲除这些基因的表达，并评估其在Tet-O-4F MEFs中的作用。虽然通过shRNAs单独敲除Jmjd3,Ink4a/Arf或p21增加重编程效率(对比对照组shRNA转导MEFs)，但是同时敲除Jmjd3和Ink4a/Arf或p21的重编程效率几乎翻了一倍(图3D)表明Jmjd3对重编程可能有附加效应，这些效应与Ink4a,Arf和p21介导的效应不重叠。构建Jmjd3-N(包含N端450个氨基酸)，Jmjd3-AJmjC(包含催化Jumonji域敲除)和Jink13-111390A(包含一个催化域的点突变)，所有这些缺少H3K27三甲基的脱甲基活性。实验测试Jmjd3介导的重编程抑制是否依赖Ink4a/Arf和p21的表达，全长Jmjd3的异位表达而不是Jmjd3-N,Jrnjd3-4JnajC或Jmjd3-H1390A，在Jmjd3缺陷型MEFs仍然保留Ink4a/Arf的表达(图3E)并几乎完全抑制重编程(图3F)。出人意料的，2个Jmjd3突变(Jmjd3-AlmjC和Jmjd3-H1390A)缺乏H3K27去甲基活性，不能上调Ink4a/Arf表达仍然能够抑制在Jmjd3缺陷型MEFs里的重编程。这些结果明确Jmjd3可以通过依赖脱甲基反应和不依赖脱甲基反应的方法调节重编程。
PHF20是Jmjd3蛋白质的一个关键靶标
为了寻找Jmjd3的靶标，我们在WT MEFs和Jmjd3缺陷型MEFs中对比分析miRNA和mRNA基因表达，但是该研究没有找到任何基因，导致Jmjd3缺陷型MEF细胞中重编程效率提高。因此，我们将注意力转移到组蛋白表观遗传因子的表达水平上，因为他们是重编程体细胞为ESC样状态的关键(Plath and Lowry,2011；Stadtfeld and Hochedlinger,2010)。比较59个基因的表达编码组蛋白修饰蛋白，对比MEFs在iPSCs/ESCs中的18个基因在RNA水平显著，并且在iPSCs/ESCs之间与人纤维母细胞的11个基因被上调。对比纤维母细胞和iPSCs/ESCs的表达模式确定7个基因在鼠和人的iPSCs/ESCs高表达。这些基因，只有PHF20(编码PHD指蛋白20，也叫GLEA2)在Jmjd3缺陷型MEFs,iPSCs和ESCs表达明显增加对比其在WT MEFs(图3G)；然而，WT MEFs和Jmjd3缺陷型MEFs在PHF20mRNA表达上没有明显差异。
H3K27三甲基在WT MEFs和Jmjd3缺陷型MEFs或iPSCs也没有明显差异。此外，PHF20在睾丸，卵巢和ES细胞中强表达；在胎盘，肺，肝和肌肉中弱表达；在其他组织中仅仅轻微或根本不表达。在时间进程实验中为了确定PHF20在重编程过程的表达模式，发现其在WTMEFs中的表达平缓增加，其在Jmjd3缺陷型MEFs中表达加快(图3H)。这些结果表明PHF20蛋白是Jmjd3的一个关键靶标，从而可能在更新和维持ESCs，iPSCs或两者的过程中起重要作用。
ESCs和iPSCs维持和重编程中需要PHF20的表达
由于PHF20蛋白子在ESCs和iPSCs中都大量表达，我们评估了其在维持这些细胞类型的重要性。在用表达GFP的特异性的shRNA敲除ESCs里的PHF20后，我们发现了分化的证据，当ESCs用对照shRNA转导时仍然未分化(图4A)。此外，RT-PCR和蛋白质印迹分析揭示了在ESCs中PHF20像Oct4和Nanog一样，在撤去白血病抑制因子(LIF)和增加培养基中的视黄酸(RA)后能显著减少表达(图4B和图4C)。类似结果也在iPSCs中获得。为了确定稳定的ESC细胞系是否能衍生自WT和PHF20敲除的小鼠，结果表明，ESC细胞系可以很容易从WT小鼠中获得但是不能从PHF20敲除的小鼠中获得。WT ESCs表达AP,Nanog和Oct4蛋白，然而来自PHF20敲除的囊胚细胞却没有，并且快速分化为滋养层细胞，基于下调Oct4和上调Cdx2。总之，这些数据表明ESCs和iPSCs的生成和维持都需要PHF20。
为了进一步确定PHF20在iPSC产生中的作用，在不同时间点敲除Tet-O-4F MEFs中的PHF20，检测其形成iPSCs克隆的能力。在重编程早期(如在第0天或第4天)敲除PHF20几乎完全阻断iPSCs产生，然而在间期或末期(第10天或第12天)其对iPSCs形成数量的抑制作用减弱(但仍然明显)(图4D)。这个发现通过从敲除PHF20的小鼠中分离得到的敲除PHF20的MEFs证实，表明在MEFs中在RNA和蛋白质水平同时缺少PHF20的表达(图4E)。用3个转录因子或4个转录因子重编程iPSCs在PHF20缺陷型MEFs中被明显抑制(图4F)，且由PHF20缺陷型MEFs产生的iPSCs克隆寥寥无几，且只有部分重编程的iPSC(图4G)，表明PHF20是有效形成iPSCs所必需的。
MEFs的结果表明Jmjd3缺失可增强重编程，而PHF20敲除抑制重编程。这个想法通过用4个转录因子介导的人纤维母细胞重编程研究进一步得到证实，在该研究中Jmjd3敲除可增强重编程，而PHF20敲除阻断此过程。为了阐明Jmjd3和PHF20是如何相反地调节重编程，我们构建了Jmjd3/PHF20单个或双个敲除的MEFs，并验证其调节重编程的能力。Jmjd3-缺失和Jmjd3/PHF20双敲除的MEF细胞比WT和PHF20-缺失的细胞生长更快，但是在WT细胞和PHF20-缺失的细胞中观察到没有明显差异。正如期望的，Jmjd3敲除增强重编程，但是PHF20缺失抑制此过程(图4H)。显著的地，Jmjd3缺失在Jmjd3和PHF20双敲除的MEFs中不能改善重编程(图4H),表明Jmjd3-缺失的MEFs的增长优势不能克服PHF20缺陷型MEFs造成重编程失败。在敲除了Ink4a或p21的PHF20缺陷型MEFs细胞中得到了类似的结果：那就是，缺少任何一个这种调节因子在WT MEFs细胞中增加重编程，但是不能在PHF20缺陷型MEFs中挽救有缺陷型重编程(图4I)。PHF20的异位表达，相比之下，在PHF20-缺陷型MEFs中恢复重编程(图4J)，表明WT和Jmjd3-缺陷型MEFs都需要该基因的表达。
为了进一步检测PHF20表达促进重编程的能力，Tet-O-PHF20MEFs来自rtTA:Tet-O-PHF20转基因小鼠并用强力霉素处理。对比强力霉素处理的表达rtTA的WT MEFs中的结果，用强力霉素处理导致了PHF20表达增加(图4K)。更重要的是，对比用强力霉素处理的表达rtTA的WT MEFs中的结果，观察到强力霉素诱导PHF20在这些细胞中的表达，导致4个转录因子介导的重编程效率显著增加(图4K)。此外，过表达PHF20可以逆转Jmjd3介导重编程抑制反应(图4L)。在Tet-O-PHF20MEFs中增加重编程效率不是细胞增殖活性造成的，因为在接受或未接受强力霉素的WT和Tet-O-PHF20MEFs的细胞生长没有明显不同。反而，强力霉素诱导PHF20表达显著阻断Oct4,Sox2和Nanog在iPSCs里下调，从而在撤去LIF后，阻止其分化。但是，PHF20过表达并不能代替4重转录因子。这些结果表明PHF20似乎是在体细胞重编程过程中的必要条件，尽管其提高表达不能替代4个既定因素中的任何一种。
JMJD3与PHF20相互作用并介导其蛋白酶体降解
为了剖析被Jmjd3和PHF20交互控制的重编程分子机制，我们首先通过免疫荧光染色法研究其亚细胞分布，同时观察其定位于细胞核中。ESCs和iPSCs的分离也证实了这一结果。免疫共沉淀(co-IP)和免疫印迹法分析用标记的PHF20和HA-Jmjd3转染的293T细胞，发现Jmjd3与PHF20相互作用(图5A)。WT MEFs也获得了类似的结果但是PHF20缺陷型MEFs没有获得这样的结果(图5B)，表明Jmjd3在生理条件下与PHF20相互作用。对Jmjd3-N(1-450aa)、Jmjd3-M(400-1200aa)和Jmjd3-C(1201-1683aa)进行的域映射实验显示Jmjd3-N和Jmjd3-C构建体而非Jmjd3-M与PHF20相互作用(图5C)。同样地，PHF20的N末端区域(1-332aa包含一个DNA结合域)而非其C末端区域与Jmjd3相互作用(图5D)。进一步研究表明，除了Jmjd3，Utx或Uty都不与PHF20相互作用。因此，Jmjd3与PHF20通过它们的功能域特异性的相互作用。
Jmjd3-PHF2相互作用的功能性影响是什么？为了回答这个问题，我们用定量标记的PHF20和递增量的HA-Jmjd3一起转染293T细胞。在这些研究中，PHF20蛋白表达量随Jmjd3蛋白表达量的增长而下降。同样，在293T细胞中，内源性PHF20蛋白表达量也随着Jmjd3cDNA转染量增加而下降(图5E)。研究结果支持这一观察，在Jmjd3缺陷型MEFs中的内源性PHF20蛋白表达量大大高于其在WT MEFs中的蛋白表达量；而在Jmjd3缺陷型MEFs中Jmjd3cDNA的异位表达使PHF20蛋白表达量减少到与其在WT MEFs中的表达量相近水平(图5F)。因此，这表明Jmjd3通过靶向降解PHF20蛋白对其进行负调控。
Trim26是PHF20泛素化和降解过程所需的E3泛素连接酶
为了明确Jmjd3如何引发PHF20的降解，发明者们首先试验了在293T细胞中被泛素化的该蛋白，是否表达WT、K48或K63泛素。PHF20明显经历了K48关联的泛素化过程，而几乎没有K63关联的泛素化，并且这种泛素化只有在293T细胞同时表达Jmjd3和PHF20时，才可观测到(图6A)。这些结果表明，Jmjd3特异性靶向PHF20，使其发生K48关联的聚泛素化和蛋白酶体降解。
基于Jmjd3不是E3泛素连接酶，可以推断，Jmjd3可能作为适配器将E3泛素连接酶招募到PHF20处使其泛素化。为了证实这种假设,我们设计了一个筛选试验：用Jmjd3表达载体和来源于人E3泛素连接酶shRNAs子库的慢病毒shRNA载体转染293T细胞(Cui et al.,2012)。在最初的约600个shRNAs筛选中，我们发现一个E3泛素连接酶(Trim26)-特异性shRNA与PHF20的蛋白表达量增加有关。为了证实这一发现，我们选取了2个对人类Trim26有60％敲除效率的shRNAs，和3个对鼠Trim26有90％以上敲除效率的特异性shRNAs。通过shRNA敲除内源性Trim26基因在293T细胞中可显著抑制Jmjd3-介导的PHF20泛素化(图.6B)，在PHF2041+MEFs中敲除Trim26或Jmjd3也得到了类似的结果。与这些结果一致，我们发现在PHF20WT MEFs中，敲除Trim26提高了重编程效率，但在PHF20缺陷型MEF中没有该现象(图6C)。进一步研究表明，敲除Trim26逆转了Jmjd3介导的重编程抑制，而Trim26的过表达抑制由Jmjd3敲除引起的重组效率提高。
由于Trim26和Jmjd3可以协调一致通过靶向PHF20使其泛素化和降解来调节重编程，发明者们接着确定了它们在重编程过程中的表达模式，发现Trim26随着Jmjd3的增加而减少(图6D)。不出所料，PHF20在重编程过程中逐渐增加，但其在Jmjd3-1-MEFs中比在WTMEFs中的水平更高(图6C和图6D)。尽管使用了蛋白酶抑制剂MG132阻断蛋白质降解，增加了PHF20蛋白量，甚至让Trim26和Jmjd3都过表达时，它的作用是非特异性的并会引起细胞死亡。因此，用MG132处理后，没有观察到iPSC克隆形成。综上所述，这些数据表明，PHF20蛋白量和Jmjd3-Trim26与在Jmjd3-1-MEFs或用强力霉素处理的Tet-O-PHF20MEFs中观察到重编程效率提高有关。
研究还确定Trim26异位表达促进了PHF20的泛素化和降解。对比Trim26或Jmjd3单独表达，它们共同表达导致K48关联的PHF20泛素化和降解显著增强(图6E)。为了确定Trim26是否与Jmjd3或PHF20相互作用，我们分别对单独Jmjd3，单独Trim26，或PHF20和Trim26两者一起进行了免疫沉淀实验。尽管Trim26与Jmjd3而非PHF20相互作用(图6F)，Jmjd3和PHF20都在表达Jmjd3，PHF20和Trim26的细胞的抗标记Trim26免疫沉淀中被检测到(图6F)，表明Jmjd3是一个适配器蛋白将Trim26召集到PHF20。为了确定Jmjd3中哪些结构域起将Trim26召集到PHF20的作用，我们用Jmjd3-N、Jmjd3-M或Jmjd3-C与Trim26一起转染293T细胞。免疫沉淀和蛋白质印迹实验显示，Jmjd3的N末端(Jmjd3-N)，而非Jmjd3-M或Jmjd3-C，能够与Trim26结合(FIG.6G)。为了识别Jmjd3中的哪些结构域是Trim26介导PHF20泛素化所必需的，我们用标记的PHF20连同HA-tagged Jmjd3-N、Jmjd3-M、Jmjd3-C、Jmjd3-AlmjC、Jmjd3-H1390A或全长Jmjd3转染293T细胞。在进行抗-Flag免疫沉淀实验后，我们评估了K48关联的PHF20泛素化。在该项研究中，(我们)观察到任何Jmjd3-N、Jmjd3-M和Jmjd3-C的构建体都不足以引发PHF20的泛素化(图6H)。相比之下，像全长Jmjd3、Jmjd3-41mjC和Jmjd3-H1390A能调节PHF20泛素化一样(FIG.6H)；与之相一致的结果显示在Jmjd3缺陷型MEFs中，Jmjd3-41mjC和Jmjd3-H1390A仍可抑制iPSC的重编程(图3F)。综上所述，这些结果表明，Jmjd3的N末端(Jmjd3-N)可与Trim26相互作用，但不足以引发PHF20泛素化。Jmjd3含前1200个氨基酸或点突变(Jmjd3-6，3mjC或JMJD3-H1390A)，是靶向PHF20通过招募E3连接酶Trim26引发泛素化的充分必要条件。
PHF20是内源性Oct4表达所必需的，同时与Wdr5在重编程过程中相互作用
由于PHF20在WT和Jmjd3缺陷型MEFs中对重编程过程至关重要，我们预测可能需要活化内源性关键基因，如ESCs中的Oct4和其它标记。为了证实这一预测，我们使用加入了强力霉素和在第10天撤去强力霉素的WT和PHF20"MEFs检测在Tet-O-4F介导的重编程中，缺少PHF20对活化11个ESC标记的影响。第14天的实时PCR分析表明，在PHF20缺陷型MEFs中，Oct4、Sox2、Nanog、Dnmt31、Esgl、Eras、Rex1和Cripto的表达无法被激活显现或大幅减少；但在在WT MEFs中即便是第10天撤去强力霉素，它们的表达都被高度活化；而Stat3、Grb2和b-catenin在WT和PHF20缺陷型MEFs中正常活化(图7A)。值得注意的是，在重编程过程中，当保留强力霉素时Sox2和Nanog可被活化。PHF20缺陷型MEFs的不完全重编程表型通过Oct4或4个转录因子过表达也不能恢复。这些结果强有力地提示，PHF20是控制许多关键重编程和多能因子的上游因子。
由于内源性Oct4的活化对形成完全重编程的iPSCs至关重要(Ang等,2011)，我们接下来确认PHF20在体内能否直接结合到Oct4启动子。ChIP-PCR分析显示，PHF20在WT ESCs和iPSCs中而非在PHF20缺陷型(分化的)ESCs和(不完全重编程的)iPSCs中与该启动子紧密结合(图7B和图7C)。PHF20无法与Cripto、Dnmt3l、Esgl、Ems、Nonog、Rexl或Sox2的启动子区域结合。同样的，ESCs和iPSCs的ChIP-Seq分析报告进一步证实，PHF20与Oct4启动子结合，但不能与Sox2或Nonog结合。而且,与Oct4启动子结合的PHF20在重编程过程中逐渐增加(图7D)。为了进一步确定PHF20过表达是否能促进内源性Oct4的表达，在4种转录因子介导的重编程过程中，我们用强力霉素处理了表达rtTA的WT和Tet-O-PHF20 MEFs。对比强力霉素处理的表达rtTA的WT MEFs，在阿霉素处理的Tet-O-PHF20 MEFs中Oct4的表达水平显著提高(图7E)，表明在重编程过程中，PHF20是内源性Oct4基因表达活化所必需的。
由于Oct4启动子的DNA甲基化状态充当iPSCs完全重编程的重要标记(Stadtfeld和Hochedlinger,2010)，我们对来自WT MEFs的ESCs和iPSCs做了硫酸氢盐测序分析，发现DNA去甲基化在Oct4启动子区域尤为强烈。相比之下，来自PHF20缺陷型MEFs的不完全重编程iPSC克隆保持着DNA甲基化模式(图7F)。更重要的是，这表明PHF20的异位表达能够挽救PHF20缺陷型iPSCs的不完整重编程状态和Oct4启动子的去甲基化状态，在WT iPSCs中也获得了类似的结果(图7F)。
PHF20是混合细胞白血病(MLL)基因H3K34甲基转移酶复合物的组分之一，其核心部件包括MLL、ASH2L、WDR5和RBBP5，以及PHF20也是H4K16乙酰转移酶MOF(male-absent onthe first，也叫MYSTI,KAT8)复合物的其中一个组分(Cai等,2010；Dou等,2005；Mendjan等,2006；Wysocka等,2005)。重要的是，Wdr5同样也是一个关键成分被MLL H3K4甲基转移酶和H4K16乙酰转移酶MOP所共享(Cai等,2010；Dou等,2005；Mendan等,2006；W socka等,2005)。然而，我们还不知道PHF20是否会与Wdr5或这两个复合物的其它组分相互作用。因为重编程的过程中，PHF20被上调，同时与Oct4启动子相结合；我们预测，PHF20在重编程过程中可能与Wdr5相互作用促进内源性Oct4的表达。为了验证这一可能性，我们用PHF20和H3K4甲基转移酶复合物的所有核心成分，包括Wdr5、MLL3、Dpy-30、Ash2l或RhBP5，一起转染293T细胞(Trievel和Shilatifard，2009)。PHF20与Wdr5相互作用，但是其既不与MLL3、Dpy-30、Ash2l、RbBP5(图7G)，也不与Oct4、Sox2或Nanog这些重编程因子相互作用。在iPSCs中观察到PHF20与Wdr5或RbBP5(而不是Ash2L)发生内源性相互作用(图7H)。ESCs和iPSCs的ChIP-seq分析结果显示，PHF20和Wdr5与Oct4启动子相结合。在能够被PHF20结合的4830个基因以及能够被Wdr5结合的5320个基因中，大约1900个基因能够被PHF20和Wdr5同时结合。抗PHF20的免疫共沉淀实验显示PHF20在iPSCs中与内源性MOF相互作用(图7H)。与近期的报告结果显示一致，H3K4甲基化与H4K16乙酰化密切相关(Wang等，2009)。因此，PHF20与Wdr5和MOF相互作用，将H3K4甲基转移酶复合物与H4K16乙酰转移酶复合物带到一起。
为了弄清PHF20的缺失如何导致内源性Oct4表达活化失败，我们研究了PHF20是否可能影响Wdr5、RbBP5和MOF结合Oct4启动子区域的能力。在对WT和PHF20缺陷型细胞的ChIP-PCR实验中，在PHF20缺陷型细胞中Wdr5未能结合到Oct4启动子，但在WT细胞中两者结合紧密(FIG.7I)。相似的，在PHF20缺陷型细胞中RbBP5和MOF与Oct4启动子结合的能力大大减弱。与上述结果相一致的是：ChIP-qPCR实验显示Oct4启动子上H3K4三甲基化急剧下降，而对H4K16乙酰化下调影响程度较小(图.7J)。总的来说，这些结果表明，在重编程过程中，招募H3K4甲基转移酶复合物以及或许H4K16乙酰转移酶复合物通过与Wdr5和MOF相互作用与同一启动子结合，导致内源性Oct4表达活化需要PHF20与Oct4启动子结合(图7K)。
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Claims (19)
1.药物组合物，包含PHF20肽和药学上可接受的赋形剂，所述PHF20肽来源于PHF20蛋白并作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，其中，PHF20肽包含氨基酸序列WQFNLLTHV(SEQ IDNO:2)。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，还包含佐剂。
3.PHF20肽在制备用于在有需求的对象中治疗、预防、或管理乳腺癌的药物组合物中的用途,所述PHF20肽来源于PHF20蛋白并作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述PHF20肽包含氨基酸序列WQFNLLTHV(SEQ IDNO:2)。
5.根据权利要求3所述的用途，所述对象还被给予免疫反应调节剂。
6.根据权利要求3所述的用途，其中，所述对象的树突状细胞的负性调控分子被敲减。
7.根据权利要求3所述的用途，其中，所述对象被给予所述药物组合物的同时或者之后，还被诱导抗-PD-1闭锁。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述对象被给予有效剂量的抗-PD-1siRNA。
9.根据权利要求7所述的用途，所述对象被给予有效剂量的抗-PD-1抗体。
10.根据权利要求3所述的用途，所述对象是人。
11.根据权利要求3所述的用途，其中，所述对象被给予负载在树突状细胞上的PHF20肽。
12.根据权利要求3所述的用途，其中，在使所述对象足以产生细胞毒性T细胞(CTL)反应的条件下给予所述对象所述药物组合物。
13.根据权利要求3所述的用途，所述对象还被给予包含PHF20抗体的药物组合物。
14.根据权利要求7所述的用途，所述对象还被给予包含PHF20抗体的药物组合物。
15.一种用于制备治疗乳腺癌的药物组合物的方法，包括(a)从对象中分离细胞群，该细胞群含有或能够产生CTLs和/或TH细胞；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂联用；(c)筛选所述细胞群中的对PHD20肽特异性的CTLs或TH细胞或者两者的混合；以及(d)将所筛选的细胞群配制在药物组合物中，其中，所述PHF20肽来源于PHF20蛋白并作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。
16.一种用于制备治疗乳腺癌的药物组合物的方法，包括(a)从对象中分离细胞群，该细胞群含有或能够产生CTLs、TH细胞或者两者的混合；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂联用；(c)筛选所述细胞群中对PHF20肽特异性的CTLs或TH细胞或者两者的混合；(d)从筛选出的对PHF20肽特异性的CTLs或TH细胞或者两者的混合中克隆T细胞受体(TCR)基因；(e)将步骤(c)克隆出的TCR基因转导入：i.患者来源的细胞；或ii.供体的细胞；或iii.真核和原核细胞以产生单克隆TCR(mTCRs)；和(f)将步骤(e)转导的细胞或产生的mTCRs配制在药物组合物中，其中所述PHF20肽来源于PHF20蛋白并作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述PHF20肽包含氨基酸序列WQFNLLTHV(SEQ ID NO:2)。
18.PHF20抗体在制备用于在有需求的对象中治疗、预防、或管理乳腺癌的药物组合物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，抗体是人源化抗体，或人类抗体，或单克隆抗体。
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