WO2006072304A2 - Tumorantigene für therapeutische und diagnotische zwecke - Google Patents
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Classifications
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Definitions
- Tumor antigens for therapeutic and diagnostic purposes
- the present invention relates to tumor antigens from brain tumors and / or meningeal tumors, their use as a medicament or
- Meningeal tumors and methods outside the human or animal body for the diagnosis of such tumors or for checking the course of a therapeutic treatment are known.
- Brain tumors and cerebellar tumors are tumors which, especially as regards brain tumors, are most commonly caused by malignant tumors and, especially in the case of brain tumors, result in a short survival time of, on average, usually less than 16 months.
- the treatment of choice for brain and meningeal tumors is currently surgical removal.
- Immunologically based therapies are in the experimental phase.
- the postoperative follow-up mainly includes radiological examinations, which are more or less closely performed depending on the tumor grade. So far, there is no molecular or immunological marker that has been widely used in the diagnosis of these tumors in humans.
- the object of the present invention was therefore to develop a better approach for the diagnosis and therapy of brain tumors or meningeal tumors.
- epitope 4 amino acids of a protein from brain or
- Meningeal tumor cells for use as a medicament or therapeutic or in a diagnostic procedure outside the human or animal body.
- proteins or protein fragments with at least 4 amino acids act as antigens on the immune system, although these proteins are produced within the body ("autoantigen").
- the body's immune system is normally programmed to prevent the production of antibodies to the body's own proteins in order to prevent an autoimmune disease, a disease in which the immune system reacts against the body's own proteins. Nevertheless, it could be found that in the development of brain tumors or meningeal tumors by the tumor cells proteins are produced, affecting the immune system reacts to the corresponding patient by developing antibodies against this (s) protein (s), so the body responds to the formation of a tumor.
- s s protein
- These specific antibodies against the proteins from the tumor cells or against epitopes thereof can be detected in the body fluids or in the tissues of the patient.
- Such body fluids or tissues may be, for example, blood, serum, cerebrospinal fluid or lymph, or tissue samples such as tumor tissue taken.
- the tumors determined here each express antigens with high specificity, can be diagnosed by a targeted diagnosis of autoantibodies that can be isolated from the body fluids or tissues of patients, not only the presence of the tumor but also with a tumor specificity determine a certain accuracy.
- This specification of the type of tumor is an important diagnostic tool for the choice of the appropriate therapy and for the follow-up of a tumor treatment.
- the present work provides a multitude of specific autoantigens of brain tumors or meningeal tumors in
- tumor specific antigens capable of eliciting such an immune response have been identified and regions of the proteins have been determined to be particularly effective
- Amino acids preferably from 5 to 20 amino acids, more preferably from
- 6 to 15 amino acids, in particular from 8 to 12 amino acids trigger a particularly strong immune response, especially antibodies being formed against these epitopes very frequently.
- the development of antibodies to proteins or epitopes can be done through the normal immune response of humans or animals in the body, whereby a recognized as "foreign" or an endogenous protein can be fragmented by the immune cells and the fragments can be presented on the surface of the immune cells, so that the antibodies circulating in the blood can recognize the protein fragments presented to the immune system and trigger the immune response.
- the development of antibodies could also be triggered by alternative mechanisms in which proteins are released in the course of apoptotic or necrotic processes.
- GLEA2 glioma expressed antigen 2
- GLEA2 glioma expressed antigen 1
- GLEA2 glioma expressed antigen 2
- PHD finger protein 3 PHD finger protein 3
- meningeal tumors meningeal tumors
- meningiomas meningeal tumors
- Table 1 The specific antigens from meningeal tumors are shown in Table 1, the sequences are shown in the attached sequence listing.
- MGEA1, MGEA5, MGEA6, MGEA8, MGEA10, MGEAI1, MGEA22 or TANKS2 Heckel, D. et al., Human Molecular Molecules Genetics, 1997, Vol. 6, No. 12, 2031-41; Heckel, D. et al., Human Molecular Genetics, 1998, Vol. 7, No.12, 1859-72, Comtesse, N. et al. Clinical Cancer Research, 1999, Vol. 5, 3560-68; Comtesse, N.
- the proteins shown here or epitopes derived therefrom can be used as a medicament or therapeutic agent by injecting such protein or an epitope therefrom in an increased form into the human to cause an immune reaction in the human body.
- a protein or epitope fragment having at least 4 amino acids from the protein, preferred epitopes, see above
- monoclonal antibodies to such a protein or epitope develop, which can then be administered to the patient.
- the manner of producing monoclonal antibodies to a defined protein or epitope thereof will be apparent to those skilled in the art and is not a limitation of the present invention.
- proteins or epitopes described herein to develop assays such as drug screening assays
- development of, for example, a screening assay falls within the knowledge of one skilled in the art.
- targeted immunization can be used to develop antibodies and specific monoclonal antibodies against these autoantigens can be developed.
- polyclonal antibodies isolated from blood or specifically prepared monoclonal antibodies can be used for the diagnosis of autoantigens in body fluids or tissues of a patient.
- a poly- or monoclonal specific antibody is also included in the invention described herein.
- the antibodies may be characterized by their specificity for at least one of the proteins or epitopes described herein via binding properties.
- Such antibodies preferably in a purified state, can be used, for example, in assay methods such as the ELISA or other immunoassays, or used, for example, for Western blot determinations.
- a preferred diagnostic method for the detection of tumor antigens in body fluids or tissues of a patient is the so-called ELISA test.
- a diagnostic method such as.
- the ELISA either by presenting an antibody, the presence of the corresponding antigen in body fluids or tissues of a patient are detected, or by presenting the antigen or epitope the presence of the antibody specific against it in body fluids or tissues of a patient. All of these diagnostic procedures take place outside the body in laboratory tests.
- a poly- or monoclonal, preferably purified antibody also offers the possibility of using the antibody itself as a drug or therapeutic agent, for example by administering such an antibody in a suitable carrier medium to a patient in whose blood the specific antigen is detected can, but not the antibody.
- This procedure corresponds to a passive immunization, as it is already known from the treatment of various other diseases.
- the antigen produced by the tumor cell can also be "marked” on the tumor cell itself, so that an immune response of the body to the antigen-antibody complex is triggered.
- an antibody developed with the aid of the specific antigens mentioned here can also be used for the assay development of medicaments or therapeutics, such as eg. For the development of a screening assay for substances being studied for drug development.
- a method for detecting an antigen from brain tumor or meningeal tumor cells in body fluids or tissue of a patient comprises contacting such a sample with an optionally purified polyclonal or monoclonal antibody against the desired protein or epitope outside the body in laboratory assays.
- an antibody is applied to a suitable surface of a test vessel (for example, wells in a test dish ("x-well plate", where x is 24, 48, 96, 192, etc.) into which the sample to be examined is placed, allowed to stand for a time to allow binding of the antigen to the antibody presented, then reaction with a second specific antibody, the binding of which can in turn be detected with a specific detection system.
- a second variant is the detection of the antibody developed in the patient by presenting the specific protein or epitope in the appropriate examination plate, adding the sample to the well, allowing the binding of the antibody to the antigen presented and detecting the antibody binding by a suitable detection system.
- proteins, epitopes and / or antibodies to be used for the detection method can be provided in a diagnostic kit which simplifies the method to be performed may also contain other reagents and / or materials to make a diagnosis.
- the other constituents of the diagnostic kit are based on the desired detection method and are familiar to the person skilled in the art in each case in connection with detection methods or assays. Detection systems for the binding of an antibody to an antigen are widely available on the market, or goat anti-IgG antibodies, to which a color-developing protein is conjugated and corresponding color-developing substances. It is essential according to the invention that either a protein described herein or an epitope of such a protein or an antibody described herein, which is directed against such a protein or epitope, is included in the diagnostic kit.
- antigens and antibodies described herein offer the possibility of providing a targeted detection method including a specification of the
- Treatment should be followed diagnostically by simple sampling (eg blood).
- simple sampling eg blood
- Cerebral or meningeal tumors constitute the proteins described herein,
- the proteins and epitopes presented herein can also be used for ex vivo stimulation of T cells for the development of vaccines, taking a blood sample from a human or animal, isolating the T cells and in a cell culture approach with the corresponding proteins and epitopes be stimulated. The stimulated T cells can then be used to develop and / or produce a vaccine.
- the antigens GLEA1, GLEA2 and PHF3 are very specific antigens from brain tumors since an antibody reaction to these antigens can be detected in a large number of patients with brain tumors.
- an immune reaction (antibody development) on GLEA2 also leads to a significantly increased survival of the patient compared to patients who have a corresponding tumor, but do not form an antibody response to GLEA2.
- regions in this protein could be localized, so-called “hotspots", which particularly frequently led to an immune response in brain tumor patients, which correspond in particular to the regions of amino acids 427 to 441 (VTNTFKKTDDFGSSN), amino acids 240 to 287 (KPENDIVKSPQENLREPKRKRGRPPSIAPTAVDSNSQTLQPITLELRR) and the
- at least one epitope is to be considered in each case which consists of the so-called.
- such an epitope comprises at least 4 amino acids, preferably from a hotspot region of one of the antigens described here, eg one of the hotspot regions from GLEA 2.
- Preferred epitopes from GLEA2 are in Table 2 with the corresponding sequences and the indication of the hotspot area (Sequence region in the protein in which the epitope is found) reproduced.
- any of the proteins and epitopes described herein may be used to detect antibodies recognizing these proteins / epitopes in patient samples.
- the proteins / epitopes can be isolated and purified or prepared by peptide synthesis, either by isolation and optionally fragmentation of the protein from a patient sample or by expression in cell cultures (eg bacterial, yeast or insect cell cultures) or in tissue cultures.
- cell cultures eg bacterial, yeast or insect cell cultures
- tissue cultures eg bacterial, yeast or insect cell cultures
- FIG. 1 shows the fine mapping of a "hot spot" region from GLEA2 with overlapping peptides.
- Figure 2 shows "hot spot” regions in the protein sequence of GLEA 2
- Human fetal brain polyA + RNA (BD Bioscience) and meningioma poly A + RNA were used to prepare an expression library using a ZAP expression vector in lambda phage (Stratagene), as described previously in Heckel et al. , 1997, Hum. Mol. Genet. , November 6 (12): 2031-41.
- Example 2 Screening of the expression library with sera from patients with brain tumor or meningeal tumor (SEREX Immunoscreening)
- E. coli XL1 Blue MRF 'cells were transfected with the recombinant bacteriophage (preparation see Example 1) and NZCYM-tetracycline agar plates. plated.
- Recombinant protein expression was induced by placing filters (Stratagene Duralose UV TM membranes) soaked in 10 mM isopropyl -1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside (IPTG). The incubation was carried out for about 4 hours at 37 ° C, after which the plates were stored at 4 ° C overnight. The filters containing the recombinantly expressed proteins were then removed from the plates and washed twice with TBS / O, 05 # Tween 20.
- the filters were incubated with each one of the sera for 3.5 to 4 hours at 37 ° C.
- the formed antigen-antibody complexes on the membrane were detected with a second antibody (goat anti-IgG) to which an alkaline phosphatase was conjugated by adding the second antibody in 1x TBS, 0.05 # (w / v) skim milk powder was added.
- serum positive clones were prepared by the addition of 0.05 # 5-bromo-4-chloro-3-indulyl phosphate and O, OU p-nitroblue tetrazolium chloride in the accompanying developing solution such as previously described (Hecke, et al., 1997) visualized by blue staining.
- the blue-stained clones were isolated and the pBK-CMV phagemids were excised in vivo using ExAssist Interference-Resistant Helper phage (Stratagene) as described in the manufacturer's instructions.
- the plasmids were propagated in E. coli XLOLR, isolated and subjected to DNA sequencing.
- DNA sequencing has identified the particularly effective antigens against brain and tumorous tumors described herein.
- Example 3 Identification of antigens reactive with antibodies from sera from brain or meningeal tumor patients
- the cDNA clones whose expression product was already recognized as being reactive were examined by means of a serological spot assay for their reactivity with patient sera.
- the spot assay was performed with minor modifications as described in the publication by Scanlan, MJ et al. , Cancer Immunity, (2001), Vol. 1, p. 4 has been described.
- nitrocellulose membranes were coated with NZCYM / 0.7 # Agarose / 2.5 mM IPTG film and applied to agar (NZCYM / 0.7 # agarose) in an 86 x 128 mm Omni Tray (Nalgene Nunc International) plate ,
- agar NZCYM / 0.7 # agarose
- Omni Tray Nalgene Nunc International
- 40 ⁇ l of monoclonal phage stock having a concentration of about 5,000 pfu / ⁇ l (plaque-forming units per ⁇ l) were incubated with 40 ⁇ l of exponentially growing E. coli XLI Blue MRF cells at 37 ° C. Aliquots of 0.7 ⁇ l were transferred to the pretreated membranes using a replication punch (TSP 96 pin replication system, Nalgene Nunc International).
- the membranes were kept at 37 ° C overnight incubate, remove the agarose film and incubate the membranes with pre-absorbed patient serum at a 1: 100 dilution.
- the detection of the antigen-antibody complexes was carried out as in the conventional OOen SEREX (see Example 2). In total, 45 antigen-encoding clones were spotted per membrane and three times the library were duplicated as duplicates.
- MGEAIl 53 4 17 * 0 * Sera from 62 patients with glioblastoma were also examined.
- the diagnosis of glioblastoma multiforme was independently confirmed by two neuropathologists.
- the prognostic value of autoantibodies to GLEAI, GLEA2 and PHF3 was estimated by analysis of survival after treatment.
- the median survival of patients in the group was 11.2 months.
- GLEAl antibody-positive patients were mild increased to 13.2 months.
- the relative risk for GLEAl-positive patients was 0.61.
- the two-tailed log-rank test showed a p-value of 0.16, indicating a non-significant effect of GLEAl on survival.
- a significantly prolonged survival rate was found in patients who had GLEA2 antibodies, with a mean survival of 17.4 months.
- the GLEA2-negative patients had only a mean survival of 7.2 months.
- GLEA2 autoantibody-positive patients showed a relative risk of 0.5 with a log-rank test p-value of 0.012.
- Example 6 epitopes from GLEA2 with increased antigenic activity
- the protein sequence of GLEA2 was epitope-engineered by breaking down the sequence into several, partially overlapping fragments and testing the resulting epitopes for their antigenic activity.
- Epitopes were prepared using the spot technique, following the manufacturer's instructions (Auto Spot Robot ASP222, ABIMED), which comprise the protein sequences of the GLEA2 protein, by first producing 15-mer peptides with an overlap region of 8 amino acids each , The fine mapping of particularly reactive regions of the protein was then carried out with 8-mer and 15-mer peptides with a shift of one amino acid to each other. Non-specific binding was achieved by intensive blocking with 10 # Skim milk powder, 10% blocking buffer (Sigma), 5 # sucrose in TBST buffer prevented. The sera were diluted 1: 500 for incubation with peptide filters.
- the filters were washed several times in succession, the bound serum antibodies were detected using a second goat anti-human IgG (H + L) (Dianova) conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and visualized by a chemiluminescent reaction ,
- Epitope mapping was performed with sera from 28 glioblastoma patients and 4 patients from other glioma subtypes (oligoastrocytoma, oligodendroglioma, piliomyxoides astrocytoma, anaplastic oligoastrocytoma III) already known to be reactive with GLEA2.
- oligoastrocytoma oligodendroglioma
- piliomyxoides astrocytoma piliomyxoides astrocytoma, anaplastic oligoastrocytoma III
- the determination of linear epitopes was achieved in 18 patients, six sera were reactive towards two different epitopes.
- epitopes were found distributed throughout the sequence of the GLEA2 protein, three sequence regions appeared to be particularly immunogenic ("hot spots"). Both from the amino acid region 240-287, as well as from the region 499-546 (based on SEQ ID NO 1), in each case at least four epitopes were "detected" particularly frequently by patient sera, ie they were reactive with an antibody of the respective sera.
- a peptide consisting of the amino acids DQDRSKGDSDPKPGSPK from the C-terminal sequence region at position 888-905 of the GLEA2 protein was synthesized and injected into a test animal (rabbit). The recovery of the antibody directed against this peptide from the blood of the animal and its purification was carried out according to standard methods.
- Example 8 Western blot analysis of tissue lysates
- Tumor tissue from a brain tumor (glioblastoma multiforme) was homogenized in SDS buffer and sonicated. The samples thus obtained were then stored at -7O 0 C.
- the tissue lysates thus prepared were diluted 1:10 with loading buffer for Western blot analysis and separated by electrophoresis on a 10% PAA gel. The gel was blotted and the proteins transferred to a PVDF membrane. After blocking the nonspecific binding sites for 30 min in I PBS, 5 # (w / v) skimmed milk powder, the membrane was incubated with purified polyclonal antibody (see example 7) from rabbit, which in I PBS, 5 # (w / v ) Skimmed milk powder was diluted, incubated.
- Dilution factor for the antibody was 1: 10,000.
- Antigen-antibody complexes formed on the membrane were detected by means of a second antibody (goat anti-rabbit IgG conjugated to HRP) diluted 1: 2500 in I PBS, 5 # (w / v) skimmed milk powder.
- the specific signals could be visualized by a chemiluminescent reaction.
- Specificity control of the obtained signals was carried out by using monoclonal anti-tubulin antibodies.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Tumorantigene aus Hirntumoren und/oder Hirnhauttumoren, deren Verwendung als Medikament oder Therapeutikum oder zur Diagnose außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers zur Behandlung bzw. Erkennung von Hirn- oder Hirnhauttumoren sowie auf Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers zur Diagnose solcher Tumore oder zur Überprüfung des Verfahrensverlaufs einer therapeutischen Behandlung.
Description
Tumorantigene für therapeutische und diagnostische Zwecke
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Tumorantigene aus Hirntumoren und/oder Hirnhauttumoren, deren Verwendung als Medikament oder
Therapeutikum oder zur Diagnose außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, zur Behandlung bzw. Erkennung von Hirn- oder
Hirnhauttumoren sowie auf Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers zur Diagnose solcher Tumore oder zur Überprüfung des Verfahrensverlaufs einer therapeutischen Behandlung.
Hirntumoren und Hirnhäuttumoren sind Tumorerkrankungen, die insbesondere was Hirntumore betrifft, in den häufigsten Fällen von malignen Tumoren verursacht werden und insbesondere im Falle von Hirntumoren zu einer kurzen Überlebensdauer von durchschnittlich meistens weniger als 16 Monaten führen. Die Therapie der Wahl für Hirn- und Hirnhauttumoren ist im Augenblick die chirurgische Entfernung. Immunologisch basierte Therapien befinden sich in der experimentellen Phase. Die postoperative Nachsorge beinhaltet vor allem radiologische Untersuchungen, die je nach Tumorgrad mehr oder weniger engmaschig durchgeführt werden. Es gibt bislang keinen molekularen oder immunologischen Marker, der in größerem Umfang Eingang in die Diagnostik dieser Tumoren beim Menschen gefunden hat.
In der Diagnostik können Hirn- und Hirnhauttumoren nur aufgrund von bei den Patienten verursachten Symptomen und daraufhin Veranlassen radiologischer Untersuchungen identifiziert werden. Mit der radiologischen Diagnostik können jedoch keine Aussagen über die feingewebliche Zusammensetzung der Tumoren getroffen werden. Hierfür ist eine operative Probenentnahme notwendig, verbunden mit den üblichen operativen Risiken. Hinsichtlich der Therapie ist zwar für einen Großteil der Hirn- bzw. Hirnhauttumoren die chirurgische Entfernung die
Methode der Wahl , jedoch bestehen Grenzen für die radikale Entfernung z. B. eine ausgedehnte Invasion in die Schädelbasis. In diesen Fällen kann es zu einem chronischen Fortschreiten mit immer wieder zu stellenden, zum Teil nur palliativen Operationsindikationen kommen. Für die in der klinischen Praxis derzeit verwendeten Verfahren der Diagnostik und Therapie ist festzustellen, dass sich die Überlebenszeit von Patienten mit malignen Hirn- oder Hirnhauttumoren in der letzten Dekade nur unwesentlich verlängert hat.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, einen besseren Ansatz für die Diagnostik und Therapie von Hirntumoren oder Hirnhauttumoren zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen, das nicht GLEA2, MGEAl, MGEA5, MGEA6, MGEA8,
MGEAlO, MGEAIl, MGEA22 oder TANKS2 ist, oder ein Fragment mit wenigstens
4 Aminosäuren („Epitop") eines Proteins aus Hirn- oder
Hirnhauttumorzellen zur Verwendung als Medikament oder Therapeutikum oder in einem diagnostischen Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
Diese Proteine oder Proteinfragmente mit wenigstens 4 Aminosäuren, sog. Epitope, aus Hirntumor- oder Hirnhauttumorzellen wirken als Antigene auf das Immunsystem, obwohl diese Proteine innerhalb des eigenen Körpers hergestellt werden („Autoantigen") .
Das körpereigene Immunsystem ist normalerweise so programmiert, dass keine Antikörper gegen körpereigene Proteine gebildet werden, um eine Autoimmunerkrankung, also eine Erkrankung bei der das Immunsystem gegen körpereigene Proteine reagiert, zu vermeiden. Dennoch konnte gefunden werden, dass bei der Entwicklung von Hirntumoren oder Hirnhauttumoren von den Tumorzellen Proteine hergestellt werden, auf die das Immunsystem
des entsprechenden Patienten durch Entwicklung von Antikörpern gegen diese(s) Protein(e) reagiert, der Körper also auf die Ausbildung eines Tumors reagiert. Diese spezifischen Antikörper gegen die Proteine aus den Tumorzellen oder gegen Epitope daraus können in den Körperflüssigkeiten oder in Gewebe des Patienten nachgewiesen werden. Solche Körperflüssigkeiten oder Gewebe können beispielsweise Blut, Serum, Liquor oder Lymphe sein, oder auch Gewebeproben, wie beispielsweise entnommenes Tumorgewebe.
Da gefunden wurde, dass die hier bestimmten Tumoren jeweils Antigene mit hoher Spezifität exprimieren, lässt sich durch eine gezielte Diagnostik der Autoantikörper, die sich aus den Körperflüssigkeiten oder -geweben der Patienten isolieren lassen, nicht nur das Vorhandensein des Tumors diagnostizieren sondern auch eine Tumorspezifitat mit einer gewissen Genauigkeit bestimmen. Diese Spezifizierung der Art des Tumors ist ein wichtiges Diagnosemittel für die Wahl der geeigneten Therapie und für die Verlaufskontrolle einer Tumorbehandlung.
Die vorliegende Arbeit stellt eine Mehrzahl von spezifischen Autoantigenen bereit, die von Hirntumoren oder Hirnhauttumoren in
Patienten exprimiert werden und die eine spezifische Immunantwort durch
Entwicklung von Antikörpern gegen diese tumorspezifischen Antigene auslöst. Die tumorspezifischen Antigene, die in der Lage sind, eine solche Immunantwort auszulösen, wurden identifiziert und es wurden Bereiche der Proteine bestimmt, die eine besonders hohe Effektivität als
Epitop aufweisen. Dies bedeutet, dass Proteinfragmente von wenigstens 4
Aminosäuren, bevorzugt von 5 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt von
6 bis 15 Aminosäuren, insbesondere von 8 bis 12 Aminosäuren eine besonders starke Immunantwort auslösen, indem gerade gegen diese Epitope besonders häufig Antikörper gebildet werden.
Die Entwicklung von Antikörpern gegen Proteine oder Epitope kann über die normale Immunreaktion des Menschen oder Tieres im Körper erfolgen, wobei ein als „fremd" erkanntes oder auch ein körpereigenes Protein durch die Immunzellen fragmentiert und die Fragmente auf der Oberfläche der Immunzellen präsentiert werden können, so dass die im Blut zirkulierenden Antikörper die dem Immunsystem so präsentierten Protein- fragmente erkennen können und die Immunantwort auslösen. Die Entwicklung von Antikörpern könnte auch über alternative Mechanismen, bei denen Proteine im Zuge apoptotischer oder nekrotischer Prozesse freigesetzt werden, ausgelöst werden.
In Fischer, U. et al . Clin.Exp.Immunol. 2001; 126: 206-213 wurde bereits ein antigen wirkendes Protein aus Hirntumoren, das als glioma expressed antigen 2 (GLEA2) bezeichnet wird, allgemein beschrieben. Dieses Protein wurde in der hier vorliegenden Arbeit weiter untersucht und die antigene Wirkung weiter charakterisiert.
In den vorliegenden Untersuchungen wurden neben GLEA2 zwei weitere Antigene aus Hirntumoren als spezifische Autoantigene für diese Art von Tumor im menschlichen oder tierischen Körper erkannt und diese beiden, sowie GLEA2, wurden genauer untersucht. Die Proteine werden als glioma expressed antigen 1 (GLEAl) , glioma expressed antigen 2 (GLEA2) und PHD- finger protein 3 (PHF3) bezeichnet. Die genannten drei Antigene finden sich sehr häufig bei Patienten mit Hirntumoren (über 40#) in Blut- oder Gewebeproben, allerdings auch in sehr niedrigen Prozentsätzen in Serenproben von Nicht-Tumorpatienten.
Es wurde herausgefunden, dass Patienten, die eine Antikörperreaktion gegen diese gefundenen Proteine zeigen, eine signifikant höhere Lebenserwartung haben als Patienten, bei denen keine Immunantwort auf diese Antigene vorliegt.
Auch für Hirnhauttumoren (Meningeome) wurden mehrere von diesen Tumoren hergestellte spezifische Antigene gefunden, gegen die Patienten Autoimmunantikörper entwickeln können und wodurch deren Überlebensrate deutlich verlängert wurde. Die spezifischen Antigene aus Hirnhauttumoren sind in Tabelle 1 dargestellt, die Sequenzen sind dem anhängenden Sequenzprotokoll zu entnehmen.
Tabelle 1 ist aus Gründen des Umfangs nach den Ansprüchen angehängt.
Einige in Meningeom-Patienten gefundene, für Hirnhauttumoren spezifische Antigene sind bereits beschrieben worden, insbesondere die Antigene, die als MGEAl, MGEA5, MGEA6, MGEA8, MGEAlO, MGEAIl, MGEA22 oder TANKS2 bezeichnet wurden (Heckel , D. et al . , Human Molekular Genetics, 1997, Vol . 6, No. 12, 2031-41; Heckel , D. et al . , Human Molekular Genetics, 1998, Vol . 7, No.12, 1859-72; Comtesse, N. et al . , Clinical Cancer Research, 1999, Vol .5, 3560-68; Comtesse, N. et al . , Biochemical and Biophysical Research Comm. , 2001, 283, 634-640, Comtesse, N. et al . , Oncogene, 2002, 21, 239-247 und Monz, D. et al . , Clinical Cancer Research, 2001, Vol .7, 113-119) .
Es wäre wünschenswert, die Entwicklung von Hirn- oder Hirnhauttumoren in einem Patienten zu einem sehr frühen Zeitpunkt diagnostizieren zu können und ein Medikament oder Therapeutikum zu entwickeln, das die Immunantwort des Menschen auf das spezifische Antigen unterstützt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die hier aufgezeigten Proteine oder daraus entwickelte Epitope als Medikament oder Therapeutikum verwendet werden, indem ein solches Protein oder ein Epitop daraus in gesteigerter Form dem Menschen injiziert wird, um eine Immunreaktion im Körper des Menschen auszulösen.
Außerdem kann ein solches Protein oder Epitop (Fragment mit wenigstens 4 Aminosäuren aus dem Protein, bevorzugte Epitoplängen siehe oben) für die Entwicklung eines Medikamentes oder Therapeutikums zur Behandlung von Hirn-oder Hirnhauttumoren verwendet werden, beispielsweise um monoklonale Antikörper gegen ein solches Protein oder Epitop zu entwickeln, welche dann dem Patienten verabreicht werden können. Die Art der Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen ein definiertes Protein oder Epitop daraus ist dem Fachmann geläufig und stellt keine Limitierung der vorliegenden Erfindung dar.
Darüber hinaus soll auch die Verwendung eines der hier beschriebenen Proteine oder Epitope zur Entwicklung von Assays, beispielsweise Screening-Assays für Medikamente, unter den hier verwendeten Begriff zur „Entwicklung oder Herstellung eines Medikamentes oder Therapeutikums" fallen. Die hier bereitgestellten Proteine und Epitope sind so spezifisch für die Hirntumoren oder Hirnhauttumoren, dass in Kenntnis der Spezifität des Proteins oder des Epitops eine Entwicklung beispielsweise eines Screening-Assays in den Kenntnisbereich eines Fachmanns auf diesem Gebiet fällt.
Durch die Kenntnis der spezifischen Proteine und der geeigneten Epitope lässt sich eine gezielte Immunisierung zur Entwicklung von Antikörpern durchführen, darüber hinaus können spezifische monoklonale Antikörper gegen diese Autoantigene entwickelt werden. Auch die entweder aus Blut isolierten polyklonalen Antikörper oder spezifisch hergestellte monoklonale Antikörper können für die Diagnose von Autoantigenen in Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Patienten verwendet werden. Somit fällt auch ein solcher poly- oder monoklonaler spezifischer Antikörper unter die hier beschriebene Erfindung. Die Antikörper können durch ihre Spezifität für wenigstens eines der hier beschriebenen Proteine oder Epitope über Bindungseigenschaften charakterisiert werden.
Solche Antikörper, bevorzugt in gereinigtem Zustand, können beispielsweise in Assaymethoden wie dem ELISA oder anderen Immunoassays eingesetzt werden oder beispielsweise für Western-Blot-Bestimmungen verwendet werden. Der Einsatz von Antikörpern in Diagnosemethoden ist dem Fachmann bekannt und daher soll jede Art der Verwendung des Antikörpers in einem Diagnoseverfahren unter den Umfang der vorliegend beanspruchten Erfindung fallen. Ein bevorzugtes Diagnoseverfahren für den Nachweis von Tumorantigenen in Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Patienten ist der sog. ELISA-Test.
Somit können gemäß der vorliegenden Erfindung über ein Diagnoseverfahren, wie z. B. den ELISA, entweder durch Vorlegen eines Antikörpers das Vorhandensein des entsprechenden Antigens in Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Patienten nachgewiesen werden, oder durch Vorlegen des Antigens oder Epitops das Vorhandensein des dagegen spezifischen Antikörpers in Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Patienten. All diese Diagnoseverfahren finden außerhalb des Körpers in Laboruntersuchungen statt.
Die Bereitstellung eines poly- oder monoklonalen, bevorzugt gereinigten Antikörpers bietet außerdem die Möglichkeit den Antikörper selbst als Medikament oder Therapeutikum zu verwenden, beispielsweise durch Verabreichung eines solchen Antikörpers in einem geeigneten Trägermedium an einen Patienten, in dessen Blut zwar das spezifische Antigen nach- gewiesen werden kann, nicht aber der Antikörper. Diese Vorgehensweise entspricht einer passiven Immunisierung, wie sie bereits aus der Behandlung verschiedener anderer Erkrankungen bekannt ist. Durch eine passive Immunisierung lässt sich das von der Tumorzelle hergestellte Antigen auch an der Tumorzelle selbst „markieren", so dass eine Immunantwort des Körpers auf den Antigen-Antikörper-Komplex ausgelöst wird.
Ein mit Hilfe der hier genannten spezifischen Antigene entwickelter Antikörper kann darüber hinaus auch für die Assay-Entwicklung von Medikamenten oder Therapeutika eingesetzt werden, wie z. B. für die Entwicklung eines Screening-Assays für Substanzen, welche für die Medikamentenentwicklung untersucht werden.
Auch eine solche Assay-Entwicklung soll unter die Definition der hier beschriebenen Erfindung fallen.
Ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens aus Hirntumor- oder Hirnhauttumorzellen in Körperflüssigkeiten oder Gewebe eines Patienten umfasst das Inkontaktbringen einer solchen Probe mit einem ggf. gereinigten polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gegen das gesuchte Protein oder Epitop außerhalb des Körpers in Laboruntersuchungen. Hierbei wird beispielsweise ein Antikörper an eine geeignete Oberfläche eines Untersuchungsgefäßes (beispielsweise Vertiefungen in einer Untersuchungsschale („x-well Platte", bei der x beispielsweise 24, 48, 96, 192 usw. ist) , in die die zu untersuchende Probe gegeben wird, eine Zeit lang stehen gelassen wird, um eine Bindung des Antigens an den vor- gelegten Antikörper zuzulassen, anschließend Reaktion mit einem zweiten spezifischen Antikörper, dessen Bindung wiederum mit einem spezifischen Nachweissystem nachgewiesen werden kann.
Eine zweite Variante ist der Nachweis des im Patienten entwickelten Antikörpers durch Vorlegen des spezifischen Proteins oder Epitops in der entsprechenden Untersuchungsplatte, Zugabe der Probe in die Vertiefung, Zulassen der Bindung des Antikörpers an das vorgelegte Antigen und Nachweis der Antikörperbindung durch ein geeignetes Nachweissystem.
Diese für das Nachweisverfahren zu verwendenden Proteine, Epitope und/oder Antikörper können zur Vereinfachung des durchzuführenden Verfahrens in einem Diagnosekit bereitgestellt werden, der darüber
hinaus weitere Reagenzien und/oder Materialien enthalten kann, um eine Diagnose durchzuführen. Die sonstigen Bestandteile des Diagnosekits richten sich nach dem angestrebten Nachweisverfahren und sind dem Fachmann jeweils in Zusammenhang mit Nachweisverfahren oder -Assays geläufig. Nachweissysteme für die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen sind vielfach auf dem Markt erhältlich, bzw. Ziege-Anti -IgG- Antikörper, an den ein farbentwickelndes Protein ankonjugiert ist und entsprechende farbentwickelnden Substanzen. Wesentlich ist gemäß der Erfindung, dass entweder ein hier beschriebenes Protein oder ein Epitop aus einem solchen Protein oder ein hier beschriebener Antikörper, der gegen ein solches Protein oder Epitop gerichtet ist, in dem Diagnosekit enthalten ist.
Die hier beschriebenen Antigene und Antikörper bieten die Möglichkeit, ein gezieltes Nachweisverfahren einschließlich einer Spezifizierung des
Tumors in einem für den Patienten wenig belastenden Diagnoseansatz durchzuführen, und zwar bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt der
Tumorentwicklung. Außerdem kann der Verlauf einer therapeutischen
Behandlung anhand einfacher Probeentnahme (z. B. Blut) diagnostisch verfolgt werden. Neben der verbesserten Diagnostik von Patienten mit
Hirn- oder Hirnhauttumoren stellen die hier beschriebenen Proteine,
Epitope und Antikörper ideale Ansatzpunkte für die Entwicklung von
Medikamenten und Therapeutika dar, so dass eine Therapie ebenfalls zu einem relativ frühen Zeitpunkt mit möglichst niedriger Belastung des Patienten durchgeführt werden kann.
Neben den oben beschriebenen Verfahren können die hier vorgestellten Proteine und Epitope auch zur ex vivo-Stimulierung von T-Zellen für die Entwicklung von Vaccinen verwendet werden, wobei einem Menschen oder Tier eine Blutprobe entnommen wird, die T-Zellen isoliert werden und in einem Zellkulturansatz mit den entsprechenden Proteinen und Epitopen
stimuliert werden. Die so stimulierten T-ZeIlen können dann zur Entwicklung und/oder Herstellung eines Vaccins verwendet werden.
Wie bereits erwähnt, stellen die Antigene GLEAl, GLEA2 und PHF3 sehr spezifische Antigene aus Hirntumoren dar, da in einer Vielzahl von Patienten mit Hirntumoren eine Antikörperreaktion gegen diese Antigene nachgewiesen werden kann. Insbesondere eine Immunreaktion (Antikörper- entwicklung) auf GLEA2 führt darüber hinaus zu einer deutlich erhöhten Überlebensdauer des Patienten im Vergleich zu Patienten, die zwar einen entsprechenden Tumor haben, jedoch keine Antikörperreaktion auf GLEA2 ausbilden. Bei genauerer Untersuchung des GLEA2, dessen vollständige Proteinsequenz als SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben ist, ergab sich, dass bestimmte Bereiche des Proteins eine besonders starke Immunreaktion hervorrufen, da gegen diese Bereiche gerichtete Antikörper besonders häufig in Patienten gefunden werden, wenn diese Sequenzabschnitte in Form von Epitopen mit Patientenseren in Kontakt gebracht wurden, die eine Immunreaktion auf GLEA2 entwickelt hatten. Somit konnten Bereiche in diesem Protein lokalisiert werden, sog. „Hotspots", die besonders häufig zu einer Immunantwort bei Hirntumorpatienten führten. Diese Bereiche entsprechen insbesondere den Bereichen der Aminosäuren 427 bis 441 (VTNTFKKTDDFGSSN) , der Aminosäuren 240 bis 287 (KPENDIVKSPQENLREPKRKRGRPPSIAPTAVDSNSQTLQPITLELRR) und der Aminosäuren 499 bis 546 (PSASDKPSQETLTRKRVSASSPTTKDKEKNKEKKFKEFVRVKPKKKKK) . Obwohl gemäß der Erfindung grundsätzlich alle möglichen Epitope aus den hierin beschriebenen Proteinen der Tumorzellen, die als Antigene wirken, verwendet werden können, ist als eine bevorzugte Ausführungsform jeweils wenigstens ein Epitop zu betrachten, welches aus den sog. Hotspot- Bereichen der Antigene stammt. Wie oben bereits beschrieben, umfasst ein solches Epitop wenigstens 4 Aminosäuren, bevorzugt aus einem Hotspot- Bereich eines der hier beschriebenen Antigene, z. B. einem der Hotspot- Bereiche aus GLEA2. Bevorzugte Epitope aus GLEA2 sind in Tabelle 2 mit den entsprechenden Sequenzen und der Angabe des Hotspot-Bereiches
(Sequenzbereich im Protein, in dem das Epitop zu finden ist) wiedergegeben.
Tabelle 2
Jedes der hier beschriebenen Proteine und Epitope kann beispielsweise zum Nachweis der diese Proteine/Epitope erkennenden Antikörper in Patientenproben verwendet werden. Die Proteine/Epitope können entweder durch Isolierung und ggf. Fragmentierung des Proteins aus einer Patientenprobe oder durch Expression in Zellkulturen (z. B. Bakterien- , Hefen- oder Insektenzellkulturen) oder in Gewebekulturen isoliert und gereinigt oder durch Peptidsynthese hergestellt werden. Die Art der Bereitstellung des entsprechenden Proteins oder Peptids/Epitops spielt für die erfindungsgemäße Darstellung keine Rolle.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung und deren Entwicklung im Detail erläutern, ohne dass die Erfindung auf diese speziellen Ausführungsformen eingeschränkt ist.
Abbildungen:
Figur 1 zeigt das Fein-Mapping eines „Hot Spot" Bereiches aus GLEA2 mit überlappenden Peptiden.
Figur 2 zeigt „Hot Spot" Bereiche in der Protein-Sequenz von GLEA 2
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer cDNA-Expressionsbibliothek
Menschliche fötale Hirn-PoIyA+ -RNA (BD Bioscience) und Meningeom-PoIy A+ -RNA wurde verwendet, um mit Hilfe eines ZAP-Expressionsvektors in Lambda-Phagen (Stratagene) eine Expressionsbibliothek herzustellen, wie es zuvor in Heckel et al . , 1997, Hum. Mol . Genet. , November 6 (12) : 2031-41 beschrieben ist.
Beispiel 2: Screenen der Expressionsbibliothek mit Seren
aus Patienten mit Hirntumor oder Hirnhauttumor (SEREX Immunoscreening)
Aus 10 ml -Proben Blut von Patienten mit Hirn- oder Hirnhauttumoren wurde das Serum isoliert und bei -750C gelagert. Vor der Verwendung für das
Immunoscreening wurde das Serum fünfmal gegen E. coli XLl Blue MRF' präabsorbiert und ebenfalls fünfmal gegen Bakterien, die durch nicht- rekombinante ZAP-Expressionsphagen lysiert worden waren, wie es zuvor in
Hecke! et al . , 1997, Hum. Mol . Geriet. , November 6 (12) : 2031-41, beschrieben ist. Das präabsorbierte Serum wurde auf eine
Endkonzentration von 1 : 100 in Ix TBS, 0,5# (w/v) Trockenmilch und
0,OU Thimerosal verdünnt.
E. coli XLl Blue MRF' -Zellen wurden mit den rekombinanten Bakteriophagen (Herstellung s. Beispiel 1) transfiziert und auf NZCYM-Tetracyclin Agarplatten. ausplattiert. Die rekombinante Proteinexpression wurde durch Auflegen von Filtern (Duralose-UV™-Mebranen von Stratagene) , die mit 1O mM Isopropyl -1-thio-ß-D-galactopyranosid (IPTG) vollgesogen waren, induziert. Die Inkubation wurde für ungefähr 4 Stunden bei 37°C durchgeführt, wonach die Platten bei 4°C über Nacht gelagert wurden. Die Filter, die die rekombinant exprimierten Proteine enthielten, wurden anschließend von den Platten entfernt und zweimal mit TBS/O,05# Tween 20 gewaschen. Nach Blockieren der Membranen mit S% (w/v) Magermilch, wurden die Filter mit jeweils einem der Seren für 3,5 bis 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe auf der Membran wurden mit einem zweiten Antikörper (Anti IgG aus Ziege) , an den eine alkalische Phosphatase ankonjugiert war, detektiert, indem der zweite Antikörper in Ix TBS, 0,05# (w/v) Magermilchpulver zugegeben wurde. Nach dreimaligem Waschen der Filter in Ix TBS, wurden serumpositive Klone durch die Zugabe von 0,05# 5-Brom-4-chlor-3-indulylphosphat und 0,OU p- Nitroblau-Tetrazoliumchlorid in der beigefügten Entwicklungslösung wie
zuvor beschrieben (Hecke! et al . , 1997) durch Blaufärbung sichtbar gemacht.
Die blaugefärbten Klone wurden isoliert und die pBK-CMV Phagemide wurden in vivo ausgeschnitten unter Verwendung eines ExAssist Interference- Resistant Helper Phagen (Stratagene) , wie es in den Instruktionen des Herstellers beschrieben ist. Die Plasmide wurden in E. coli XLOLR vermehrt, isoliert und einer DNA-Seqenzierung unterworfen.
Durch die DNA-Seqenzierung wurden die hierin beschriebenen, besonders wirksamen Antigene gegen Hirn- bzw. Hirnhauttumoren identifiziert.
Beispiel 3: Identifizierung von Antigenen, die mit Antikörpern aus Seren von Hirn- oder Hirnhauttumorpatienten reaktiv sind
In einer zweiten Screening-Runde wurden die cDNA-Klone, deren Expressionsprodukt bereits als reaktiv erkannt wurde (also die hier gemäß der Erfindung spezifizierten Klone, die ein antigen wirkendes Protein codieren) , mittels serologischem Spot-Assay auf ihre Reaktivität mit Patientenseren hin untersucht. Der Spot-Assay wurde mit geringen Abwandlungen durchgeführt, wie in der Publikation von Scanlan, M. J. et al . , Cancer Immunity, (2001) , Vol . 1, S. 4 beschrieben wurde. Hierzu wurden Nitrozellulose-Membranen mit einem Film aus NZCYM/0,7# Agarose /2,5 mM IPTG überzogen und auf Nährboden (NZCYM/0,7# Agarose) in einer 86 x 128 mm Omni Tray (Nalgene Nunc International ) Platte aufgebracht. Jeweils 40 μl monoklonaler Phagenstock mit einer Konzentration von etwa 5.000 pfu/μl (Plaque forming units pro μl) wurden mit 40 μl exponentiell wachsenden E.coli XLl Blue MRF'Zellen bei 37°C inkubiert. Aliquots von 0,7 μl wurden mit Hilfe eines Replikationsstempels (TSP 96 pin replication System , Nalgene Nunc International ) auf die vorbehandelten Membranen übertragen. Die Membranen wurden über Nacht bei 37°C
inkubiert, der Agarosefilm entfernt und die Membranen mit präabsorbiertem Patientenserum in einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Die Detektion der Antigen-Antikörper-Komplexe erfolgte wie beim herkömmlich OOen SEREX (siehe Beispiel 2) . Insgesamt wurden pro Membran 45 Antigen-codierende Klone und dreimal die Bank jeweils als Duplikate gespottet.
Es wurden 24 Seren von Meningeom-Patienten untersucht. Dabei konnte für 22 Antigene eine Reaktion ausschließlich mit Seren von Meningeom- Patienten nachgewiesen werden. Darunter die bereits schon als Antigene in Meningeomen beschriebenen MGEA5(s) und MGEAIl. Für 16 Antigene wurde eine doppelt so häufige Antikörper-Antwort in Meningeom-Patienten im Vergleich zur Kontrol1gruppe nachgewiesen. Darunter die bereits schon als Antigene in Meningeomen beschriebenen Antigene MGEA6 und TANKS2. Die für Meningeome identifizierten Antigene (Name und Identifikation) sind Tabelle 1 zu entnehmen, die wegen des Umfangs dieser Anmeldung nach den Ansprüchen angehängt ist. Die Ergebnisse der Screeningtests sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3:
Antigene bei Hi rnhauttumoren (Meni ngeome) absolute Frequenz der AK- Antwort prozentuale Frequenz der
AK -Antwort
Gen-Symbol Sequenz-ID Meningeom- Kontrollseren Meningeom- Kontrollseren
Nr. patienten (von 24) (von 8) patienten
_ _
ANK2 4, 5 6
ARHGAP18 6 2
BRAP 7 13 54* 13* cl3orf24 4 YlX 0*
C6orfl53 9 4 17* OX
DLD 10 6 25* 12%
FLJ10747 11 2 8X
HNRPAl 12, 13 13 1 54* 13*
IGFBP5 14 2 8* 0*
INA 15 6 1 25* 13*
IQWDl 16
12 1 50* 13*
(PC326)
KIAA0555 17 8 1 33* 13*
KIAA0999 18 1 33* 13*
KIAA1344 19 12 50* 0*
MAP4K4 20, 21, 22 1 4* 0*
CXl
NIN 23, 24, 25,
4 17* 0*
26, 27
NIT2 28 3 13* 0*
NKTR 29 9 38* 0*
NSEPl 30 4 17* 0*
PAFAHlBl 31 0*
PUM2 32
SASHl 33 8 1 33* 13*
SC65 34 4 17* 0*
SFRSIl 35 6 1 25* 13*
SLC6A3 36 8 1 33* 13*
SNRK 37 18 3 75* 38*
S0X2 38 7 29* 0*
TBC1D4 39 6 25* 0*
TNKS 40 2 8* 0*
TPM3 41, 42 1 4* 0*
TRAl 43 6 1 25* 13*
USP37 44 6 25* 0*
ZBTB5CKIAA0345
33* 13*
54)
MOCSl 46, 47, 48 12 1 50* 13*
MGEA5 49 2 8* 0*
MGEAδs 50 2 8* 0*
TNKS2 51 13 2 54* 25*
MGEA6 52 10 1 42* 13*
MGEAIl 53 4 17* 0*
Es wurden außerdem Seren aus 62 Patienten, die an einem Glioblastom litten, untersucht. Die Diagnose von Glioblastoma multiforme wurde unabhängig voneinander von zwei Neuropathologen bestätigt.
Die Analyse der 62 Seren der Glioblastoma-Patienten ergab, dass in 15 Seren (24,2*) Antikörper gegen GLEAl (SEQ ID NR.2) , in 30 Seren (48,4*) Antikörper gegen GLEA2 (SEQ ID Nr. 1) und in 35 Seren (56,5*) Antikörper gegen PHF3 (SEQ ID Nr.3) gefunden wurden.
Es gab eine signifikante Korrelation zwischen dem Auftreten von Autoantikörpern gegen GLEAl und GLEA2 (p = 0,007, Fisher's zweiseitiger Exakter Test) , GLEAl und PHF3 (p = 0,001) und GLEA und PHF3 (p = 0,00004) . Der Fisher's Exakte Test wurde ausgeführt, um auf eine signifikante Korrelation des gleichzeitigen Auftretens von Antikörpern gegen GLEAl, GLEA2 und PHF3 in demselben Patienten zu testen. Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen allen Autoantikörpern mit einem p-Wert von 0,007 für GLEAl und GLEA2, einem p-Wert von 0,001 für GLEAl und PHF3 und einem p-Wert von 4xlO'5 von GLEA2 und PHF3 gefunden.
Beispiel 5: Überlebensraten der Patienten
Der prognostische Wert von Autoantikörpern gegen GLEAl, GLEA2 und PHF3 wurde durch Analyse der Überlebensrate nach der Behandlung abgeschätzt.
Die mittlere Überlebensrate von Patienten in der Gruppe war 11,2 Monate.
Es wurden individuelle Überlebensraten mit dem Auftreten von GLEAl- , GLEA2- und PHF3-Autoantikörpern in Beziehung gesetzt, durch Anwendung des log-rank-Tests und der Cox-Regressionsanalyse. Die mittlere
Überlebensrate von GLEAl-Antikörper-positiven Patienten war leicht
erhöht auf 13,2 Monate. Das relative Risiko für GLEAl-positive Patienten war 0,61. Der zweiseitige log-rank-Test zeigte einen p-Wert von 0,16, was auf einen nicht signifikanten Effekt von GLEAl auf die Überlebensrate hinwies. Dagegen wurde eine signifikant verlängerte Überlebensrate von Patienten gefunden, die GLEA2-Antikörper aufwiesen, mit einer mittleren Überlebensrate von 17,4 Monaten. Die GLEA2-negativen Patienten hatten nur eine mittlere Überlebensrate von 7,2 Monaten. GLEA2-Autoantikörper-positive Patienten zeigten ein relatives Risiko von 0,5 bei einem log-rank-Test p-Wert von 0,012.
Ebenso wurde eine erhöhte mittlere Überlebensrate von 14,5 Monaten bei Patienten gefunden, die PHF3-Autoantikörper aufwiesen, im Vergleich zu einer mittleren Überlebensrate von 7,2 Monaten bei Patienten, die keine PHF3-Autoantikörper aufwiesen. Das relative Risiko für PHF3- Autoantikörper-positive Patienten war 0,44 mit einem log-rank-Test p- Wert von 0,0031.
Beispiel 6: Epitope aus GLEA2 mit erhöhter antigener Wirkung
Die Proteinsequenz von GLEA2 wurde einem sog. Epitop-Mapping unterzogen, indem die Sequenz in mehrere, teilweise überlappende Fragmente zerlegt wurde und die so entstandenen Epitope auf ihre Wirksamkeit als Antigen untersucht wurden.
Es wurden mit Hilfe der Spots-Technik nach Anleitung des Hersteller (Auto-Spot-Robot ASP222, ABIMED) Epitope hergestellt, die die Proteinsequenzen des GLEA2-Proteins umfassen, indem zunächst 15-mer Peptide mit einem Überlappungsbereich von jeweils 8 Aminosäuren zueinander hergestellt wurden. Das Fein-Mapping besonders reaktiver Bereiche des Proteins wurde dann mit 8-mer und 15-mer Peptiden mit einem Shift von jeweils einer Aminosäure zueinander durchgeführt. Eine unspezifische Bindung wurde durch intensives Blocken mit 10#
Magermi1chpulver, 10% Blockierpuffer (Sigma) , 5#Sucrose in TBST Puffer verhindert. Die Seren wurden 1:500 für die Inkubation mit Peptidfi1tern verdünnt. Die Filter wurden mehrfach aufeinanderfolgend gewaschen, die gebundenen Serumantikörper wurden mit Hilfe eines zweiten Ziege-Anti - Mensch IgG (H+L) (Dianova) , an den Meerrettich-Peroxidase (HRP) ankonjugiert war, detektiert und durch eine Chemolumineszenz-Reaktion sichtbar gemacht.
Das Epitop-Mapping wurde mit Seren von 28 Glioblastoma-Patienten und 4 Patienten anderer Glioma-Subtypen (Oligoastrozytoma, Oligodendroglioma, piliomyxoides Astrocytoma, anaplastisches Oligoastrocytoma III) , von denen eine Reaktivität mit GLEA2 bereits bekannt war, durchgeführt. Bei der Inkubation der Peptid-Filter mit sekundärem Antikörper, mit Seren gesunder Kontroll -Personen und mit Seren GLEA2-negativer Patienten konnte keinerlei Chemolumineszenz in den Ansätzen gefunden werden. Die Bestimmung linearer Epitope konnte in 18 Pateienten erzielt werden, sechs Seren waren gegenüber zwei verschiedenen Epitopen reaktiv. Obwohl die identifizierten Epitope über die gesamte Sequenz des GLEA2-Proteins verteilt gefunden wurden, erschienen drei Sequenzbereiche als besonders immunogen („Hot Spots") Sowohl aus dem Aminosäurebereich 240-287, als auch aus dem Bereich 499-546 (bezogen auf SEQ ID NR. 1) wurden jeweils wenigstens vier Epitope besonders häufig durch Patientenseren „erkannt", waren also mit einem Antikörper der jeweiligen Seren reaktiv.
Sieben Seren der Glioblastoma-Patienten, wie auch alle vier Seren der Patienten mit anderen Gliom-Typen reagierten mit Sequenzen aus dem Bereich 427-VTNTFKKTDDFGSSN-441 entweder mit dem Peptid VTNTFKK (2 Patienten) , KTDD (1 Patient) oder KTDDFGSSN (4 Patienten) . Diese Peptide überlappen jeweils bezüglich des Lysins an Position 433 (in SEQ ID Nr. 1) . Die mittlere Überlebensrate von Patienten, die auf die Sequenz 427- VTNTFKKTDDFGSSN-441 reaktiv waren, betrug 20,3 Monate. Tabelle 4 gibt zusammenfassend die Daten wieder.
Tabelle 4:
n.b.= nicht bestimmt
Beispiel 7: Herstellung polyklonaler Antikörper
Ein Peptid, bestehend aus den Aminosäuren DQDRSKGDSDPKPGSPK aus dem C- terminalen Sequenzbereich an Position 888-905 des GLEA2 Proteins (SEQ ID Nr. 1) wurde synthetisiert und einem Versuchstier (Kaninchen) injiziert. Die Gewinnung des gegen diese Peptids gerichteten Antikörpers aus dem Blut des Tiers und dessen Reinigung erfolgte nach Standardmethoden.
Beispiel 8: Western Blot Analyse von Gewebe-Lysaten
Tumorgewebe aus einem Hirntumor (Glioblastoma multiforme) wurde in SDS- Puffer homogenisiert und mit Ultraschall behandelt. Die so erhaltenen Proben wurden anschließend bei -7O0C gelagert. Die so hergestellten Gewebe-Lysate wurden für die Western Blot Analyse 1:10 mit Ladepuffer verdünnt und durch Elektrophorese auf einem 10% PAA-GeI aufgetrennt. Das Gel wurde geblottet und die Proteine auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen für 30 min in l'PBS, 5#(Gew/Vol) Magermilchpulver wurde die Membran mit gereinigtem polyklonalen Antikörper (s. Bsp. 7) aus Kaninchen, der in l'PBS, 5#(Gew/Vol) Magermilchpulver verdünnt war, inkubiert. Der
Verdünnungsfaktor für den Antikörper war 1:10.000. Auf der Membran gebildete Antigen-Antikörper-Komplexe wurdenmit Hilfe eines zweiten Antikörpers detektiert (Ziege-Anti -Kaninchen IgG, konjugiert mit HRP) , der 1:2500 in l'PBS, 5#(Gew/Vol) Magermilchpulver verdünnt war. Die spezifischen Signale konnten durch eine Chemolumineszenz-Reaktion sichtbar gemacht werden. Eine Spezifitätskontrolle der erhaltenen Signale wurde durch Einsatz von monoklonalen Anti -Tubulin-Antikörpern durchgeführt.
Die Untersuchung der GLEA2-Expression durch Western-Blot-Untersuchungen in gesunden und Tumor-Geweben mit polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen ergab eine ubiquitäre Expression eines 115 kD Proteins in gesunden Geweben, welche in Tumorgeweben nicht wiedergefunden werden konnte. In Tumorgewebe wurde dagegen mit denselben Antikörpern ein starkes Signal einer Bande mit 40 kD detektiert. Mittels Northern-Blot wurde für entsprechende Tumorgewebe ein um 1,3 kb verkürztes Transkript nachgewiesen, wodurch sich die 40 kD-Bande erklären lässt. Durch Zusatz des Peptids aus Beispiel 7 in den Inkubationsansatz verschwand die Bande bei 40 kD. Dies bedeutet, das die polyklonalen Antikörper spezifisch an dieses Peptid binden. Somit unterscheidet sich das Protein, das im Tumorgewebe zu finden ist auf molekularer Basis von dem Protein, das in gesunden Geweben von demselben Gen exprimiert wird.
Claims
1. Protein aus Hirnhauttumorzellen, das nicht MGEAl, MGEA5, MGEA6, MGEA8, MGEAlO, MGEAIl, MGEA22 oder TANKS2 ist, oder Fragment mit wenigstens 4 Aminosäuren („Epitop") eines Proteins aus Hirnhauttumorzellen zur Verwendung als Medikament oder Therapeutikum oder in einem diagnostischen Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
2. Verwendung eines Proteins, welches nicht MGEAl, MGEA8, MGEAlO oder MGEA22 ist, oder eines Fragments mit wenigstens 4 Aminosäuren („Epitop") eines Proteins aus Hirnhauttumorzellen zur Herstellung eines Medikamentes oder Therapeutikums zur Behandlung von Hirnhauttumoren.
3. Antikörper gegen wenigstens ein Epitop aus einem Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen zur Verwendung als Medikament oder Therapeutikum oder in einem Diagnoseverfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
4. Antikörper gegen wenigstens ein Epitop aus einem Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzeπen zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder Therapeutikums zur Behandlung von Hirn- oder Hirnhauttumoren.
5. Verwendung wenigstens eines Proteins, das nicht MGEAl, MGEA5, MGEA6, MGEA8, MGEAlO, MGEAIl, MGEA22 oder TANKS2 ist, oder wenigstens eines mindestens 4 Aminosäuren umfassenden Fragments eines Proteins („Epitop") aus Hirnhauttumorzellen zum Nachweis wenigstens eines Antikörpers gegen eines dieser Proteine in einer Probe außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
6. Verwendung wenigstens eines mindestens 4 Aminosäuren umfassenden Fragments eines Proteins („Epitop") aus Hirntumorzellen zum
Nachweis wenigstens eines Antikörpers gegen eines dieser Proteine in einer Probe außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers.
7. Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers zum Nachweis eines Hirnhauttumors bei einem Patienten, umfassend das
Inkontaktbringen einer Probe mit wenigstens einem Protein, das nicht MGEAl, MGEA5, MGEA6, MGEA8, MGEAlO, MGEAIl, MGEA22 oder TANKS2 ist, oder wenigstens einem mindestens 4 Aminosäuren umfassenden Fragment eines Proteins aus Hirnhauttumorzellen.
8. Verfahren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers zum Nachweis eines Hirntumors bei einem Patienten, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe mit wenigstens einem mindestens 4 Aminosäuren umfassenden Fragment eines Proteins aus Hirntumorzellen.
9. Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Probe Blut, Serum, Liquor, Lymphflüssigkeit oder Gewebe ist.
10. Diagnose-Kit zur Diagnostik von Hirn- oder Hirnhauttumoren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, enthaltend wenigstens ein Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen oder wenigstens ein mindestens 4 Aminosäuren umfassendes Fragment eines Proteins aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen.
11. Diagnose-Kit zur Diagnostik von Hirn- oder Hirnhauttumoren außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, enthaltend wenigstens einen Antikörper gegen wenigstens ein Epitop aus einem Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen.
12. Assay zur Bestimmung des Vorkommens eines Antikörpers in einer Probe, wobei der Antiköper gegen ein Epitop aus einem Protein aus
Hirn- oder Hirnhauttumorzellen gerichtet ist.
13. Produkt oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Protein aus Hirn- oder Hirnhauttumorzellen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PHF3 (SEQ ID Nr.3) , ANK2 Isoform 1 (SEQ ID Nr.4) , ANK2 Isoform 2 (SEQ ID Nr.5) , ARHGAP18 (SEQ ID Nr. 6) , BRAP (SEQ ID Nr.7) , cl3orf24 (SEQ ID Nr.8) , c6orfl53 (SEQ ID Nr. 9) , DLD (SEQ ID Nr. 10) , FLJ10747 (SEQ ID Nr. 11) , HNRPAl Isoform 1 (SEQ ID Nr. 12) , HNRPAl Isoform 2 (SEQ ID Nr. 13) , IGFBP5 (SEQ ID Nr. 14) , INA (SEQ ID Nr. 15) , IQWDl (SEQ ID Nr. 16) , KIAA0555 (SEQ ID Nr. 17) , KIAA0999 (SEQ ID Nr. 18) , KIAA1344 (SEQ ID Nr. 19) , MAP4K4 Isoform 1 (SEQ ID Nr. 20) , MAP4K4 Isoform 2 (SEQ ID Nr. 21) , MAP4K4 Isoform 3 (SEQ ID Nr. 22) , NIN Isoform 1 (SEQ ID Nr.23) , NIN Isoform 2 (SEQ ID Nr.24) , NIN Isoform 3 (SEQ ID Nr. 25) , NIN Isoform 4 (SEQ ID Nr.26) NIN Isoform 5 (SEQ ID Nr. 27) , NIT2 (SEQ ID Nr.28) , NKTR (SEQ ID Nr. 29) , NSEPl SEQ ID Nr.30) , PAFAHlBl (SEQ ID Nr.31) , PUM2 (SEQ ID Nr. 32) , SASHl (SEQ ID Nr. 33) , SC65 (SEQ ID Nr.34) , SFRSIl (SEQ ID Nr. 35) , SLC6A3 (SEQ ID Nr. 36) , SNRK (SEQ ID Nr. 37) , S0X2 (SEQ ID Nr. 38) , TBC1D4 (SEQ ID Nr.39) , TNKS (SEQ ID Nr.40) , TPM3 Isoform 1 (SEQ ID Nr.41) , TPM3 Isoform 2 (SEQ ID Nr. 42) , TRAl (SEQ ID Nr. 43) , USP37 (SEQ ID Nr. 44) und ZBTB5 (SEQ ID Nr. 45) oder aus einer Kombination von wenigstens zweien dieser Proteine, bzw. wenigstens ein Epitop aus wenigstens einem dieser Proteine oder aus GLEA2 (SEQ ID Nr. 1) , GLEAl (SEQ ID Nr. 2) , MOCSl Isoform 1 (SEQ ID Nr. 46) , MOCSl Isoform 2 (SEQ ID Nr.47) , MOCSl Isoform 3 (SEQ ID Nr.48) , MGEA5 (SEQ ID Nr. 49) , MGEA5s (SEQ ID Nr. 50) , TNKS2 (SEQ ID NR. 51) , MGEA6 (SEQ ID Nr.52) und/oder MGEA 11 (SEQ ID Nr.53) .
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