KR101835759B1 - Phf 20 를 이용한 암세포에 대한 정보 제공 방법 - Google Patents

Phf 20 를 이용한 암세포에 대한 정보 제공 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암세포 당대사 조절과 관련된 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 암세포에 대한 연구 및 진단에 있어서, PHF20 를 타깃으로 하여, 암세포에서 미토콘드리아의 생합성 증가, 혈관 신생 증가, 총 항산화 능력의 감소, 당화-의존적 ATP 생산능 증가 등에 대한 정보를 제공할 수 있으므로, 암의 진단, 치료제 개발 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

PHF 20 를 이용한 암세포에 대한 정보 제공 방법 {Method of providing information for cancer cell using PHF20}
본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암세포 당대사 조절과 관련된 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
현대 과학기술의 발달과 더불어 의학기술, 생명공학 및 유전공학이 발전함에 따라 암을 치료하기 위한 다양한 연구 및 방법들이 개발되고 있음에도 불구하고, 암은 아직 완치될 수 없는 중대한 질환으로 인식되고 있다. 이러한 암을 치료하기 위한 방법으로 절개술, 화학요법, 방사선요법, 절개술 등의 많은 방법이 개발되었지만 방사선 요법이나 절개술등은 주로 암의 초기진단이 이루어졌을 때에만 효과가 있을 뿐 말기암으로 진행된 상태에서는 소용이 없으며 화학요법을 주로 사용하여 치료할 수 밖에 없다. 1940년대부터 암치료에 도입된 화학요법은 암의 시기와 관계없이 비교적 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있어서 현재 많은 관심이 집중되고 있으며, 여러 가지 항암 화학요법제가 개발되고 있다.
그러나, 상기 항암제들은 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다. 또한, 대부분의 항암제는 세포 내 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로 효과를 나타내는데, 이들 항암제는 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직 세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위장관 점막 손상, 탈모등 여러 부작용이 나타나는 단점이 있다. 상기와 같은 암세포의 항암제에 대한 내성을 억제하고자, 단일 제제의 항암제를 사용하기보다는 교차 내성(cross-resistance)이 없고, 작용 기전이 서로 다른 약제를 사용하는 병용 요법(combined chemotherapy)이 사용되고 있다. 또한, 항암제의 부작용을 억제하기 위한 방법으로는, 부작용이 없는 새로운 항암제를 개발하거나 종래의 항암제를 최소 유효 농도로 사용하는 방법 등이 제시되고 있다.
최근 이러한 화학요법을 위한 항암제의 표적으로 아폽토시스(apoptosis)에 관여하는 여러 유전자 및 단백질의 차단에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구들은 지난 수 년동안 화학요법에 이용되었던 항암제들이 암세포의 유전자를 손상시켜 아폽토시스, 즉 계획된 세포 사멸(programmed cell death)을 유발시킨다는 것에 대한 발견에서부터 시작하여 사멸되지 않은 세포를 분화시키기 위한 세포분화 신호전달 조절 분자들을 발견하기에 이르렀다.
아폽토시스(programed cell death, apoptosis)는 세포의 다양한 생명활동에 매우 중요한 역할을 하는 메커니즘으로, 아폽토시스의 과잉 또는 불충분은 허혈(ischemia), 신경퇴행(neurodegeneration), 자가면역(autoimmunity), 바이러스 감염(viral infection), 종양(tumor) 등 여러 질병과 깊은 관련을 가진다. 세포사멸의 신호전달은 크게 세포내부(intrinsic)와 외부(extrinsic)의 경로로 나뉜다. 세포내부 경로의 경우 Bcl-2 패밀리 단백질군이 주요 조절자로 작용하며, 미토콘드리아(mitochondria)가 신호전달 및 조절의 허브(hub) 역할을 담당하고 있다.
미토콘드리아는 1990년대 이후부터 주요 성분이 세포사멸에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀져 세포사멸에서 매우 중요한 위치를 차지하게 되었다. 미토콘드리아는 외막(outer membrane)과 내막(inner membrane)으로 구성되어 있으며, 끊임없이 움직(move)이고, 결합(fusion)하며, 분열(fission)하는 역동적인 세포소기관이다. 미토콘드리아는 서로 연결된 관상의 네트워크(tubular network)를 형성하고 있으며, 미토콘드리아 결합-분열 기작(mitochondrial fusion-fission machinery)에 의해 그 모양(morphology)과 숫자가 정교하게 조절되고 있다. 세포사멸이 유도되면, 여러 가지 세포사멸 조절 단백질과 소포체(ER) 및 세포질에 존재하는 칼슘 이온 및 이와 관련된 단백질이 미토콘드리아로 이동하고, 미토콘드리아 형태 단백질(mitochondria-shaping protein)에 의해 미토콘드리아의 단편화(fragmentation)가 일어나게 된다. 이후 미토콘드리아 막 전위의 상실 및 미토콘드리아 외막 투과(mitochondria outer membrane permeabilization; 미토콘드리아 외막P)가 촉발됨으로써 미토콘드리아 내의 여러 단백질이 세포질로 빠져나와 핵의 응집 및 DNA 단편화 등이 일어나 마침내 세포가 죽게 된다.
이상적인 항암 약물은, 오직 암 세포 내부에서만 활성이며, 그 세포들의 핵심적인 구성요소를 표적으로 하거나 또는 핵심적인 프로세스를 방해하는 것이다. 상기와 같은 내용을 토대로 세포 에너지의 대부분을 공급하며 아폽토시스의 중요 조절자인 미토콘드리아는, 항암 요법에 있어서 바람직한, 세포 선별성을 제공할 수 있는 유효한 표적으로서 대두되고 있다. 암 세포에서 미토콘드리아에 선별적으로 작용함으로서 활성을 나타내는 세포독성 약물인 "마이토칸(mitocan)" 은, 동물 실험에서 보고된 바와 같이 부작용이 거의 없는 항암제로서 작용할 수 있기 때문에 암 치료에 있어서 상당히 매력이 있는 것으로 증명되고 있다 (Ko 등, 2004). 마이토칸은 암 세포 미토콘드리아의 에너지 생산 시스템을 방해하여, 암 세포 내부에서의 활성 산소종 (ROS) 증가 및 미토콘드리아 의존성 세포 사멸 시그널링 경로 활성화를 유도한다.
이처럼 미토콘드리아는 각종 질병, 특히 암에서 중요 표적이 될 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지 이와 같은 치료제 및 이를 타깃으로 한 질병에 대한 연구가 부족한 실정이다.
본 발명자들은 암세포의 당대사를 조절하여 암을 치료할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, PHF20이 암세포에서 미토콘드리아의 생합성의 증가와 연관이 있으며, 이와 관련된 다양한 혈관신생, 당화 의존적 ATP 생산능의 변화를 유도한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 암세포 당대사를 조절하는 PHF20를 타깃으로 하여, 이를 검출하는 제제를 통해 암세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법으로, 상기 정보는 암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종인, 암세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 암세포에 대한 정보 제공용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 PHF20 의 발현양을 측정하는 단계; 후보물질을 처리하는 단계; PHF20의 발현양의 변화를 측정하는 단계; 를 포함하는, 암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 억제하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 암세포에 대한 연구 및 진단에 있어서, PHF20 를 타깃으로 하여, 암세포에서 미토콘드리아의 생합성 증가, 혈관 신생 증가, 산소소비 촉진, 총 항산화 능력의 감소 등에 대한 정보를 제공할 수 있으므로, 암의 진단, 치료제 개발 등에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 대장암에서 PHF20의 발현이 증가됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 암 조직과 주변 조직들 사이의 비교를 통해 대장암 조직에서 높은 수준의 PHF20 염색되는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c 및 도 1d는 아데노바이러스-매개된 PHF20 (Ad-PHF20) 과다발현 후 mito-tracker로 확인한 결과 및 질량의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 pDS-Mito-Red 를 아데노 바이러스 감염 24시간 전 일시적으로 HCT116 세포에 형질 감염 시키고 공초점 현미경을 통해 미토콘드리아의 형태적인 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 1f는 미토콘드리아 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 1g는 시트레이트 합성효소 활성을 PHF-20 과다발현 세포에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1h는 배양 시간에 따른 상대적 산소 소모량의 증가를 PHF20 과다 발현 세포에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 Ad-PHF20 군에서 mtDNA 및 PGC1α mRNA 변화를 정량적 실시간 PCR을 통해 확인한 결과 및 TFAM 의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 PHF20 의 넉다운에 의한 mtDNA, PGC1α 및 TFAM 의 mRNA 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 ChIP 분석을 통해 과다발현된 Flag-PHF20 가 직접적으로 PGC1α 의 프로모터에 결합함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2d는 ChIP 분석을 통해 PGC1α프로모터 영역에서 PHF20 과의 상호작용을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2e는 PHF20 과다발현된 HCT116세포에서 PGC1α 프로모터-매개된 루시퍼라아제 활성의 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2f는 PHF20 넉다운된 HCT116 세포에서 PGC1α 프로모터-매개된 루시퍼라아제 활성의 감소를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 PHF20 과다발현 세포에서 세포성 ROS, 미토콘드리아 의존성 ROS 가 PHF20 과다발현 HCT116 세포에서 증가됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 형광 현미경 하에서 mito-SOX의 발현의 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d는 NAC(N-Acetyl-L-cysteine) 및 카탈라아제가 처리된 PHF20 과다발현 세포에서의 ROS 생산의 억제를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3e는 PHF20 과다발현에 의한 총 항산화 활성(TAC)의 변화를 HCT116 p53(-/-), HCT116 p53(+/+) 군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 PHF20 과다발현에서 미토콘드리아 막 전위를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 PHF20 과다발현 세포에서 막전위의 감소를 JC-1 염색약을 이용한 FACs 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 세포 내 ATP 수준이 PHF20 과다발현 세포에서 현저하게 감소됨을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4d는 PHF20 과다발현에 의한 당화-의존적 및 OxPhos system-dependent ATP 생산 사이의 ATP 생산 비율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4e는 PHF20 과다발현 세포 배양 배지에서의 젖산 측정결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 PHF20 과다발현 마우스에 독시사이클린(doxycycline) 함유 식이(Doxy) (PHF20(Doxy))를 공급한 후 종양 부피의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5b는 PHF20 과다발현 마우스에 독시사이클린(doxycycline) 함유 식이(Doxy) (PHF20(Doxy))를 공급한 후 종양의 응혈이 발생하지 않음을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 PHF20 과다발현 및 독시사이클린 함유 식이(PHF20(Doxy))에 의한 종양의 사이즈 및 부피의 증가를 나타낸 도이다.
도 5d는 PHF20 과다발현 및 독시사이클린 함유 식이(PHF20(Doxy))에 의한 종양 무게의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5e는 PHF20 과다발현 및 독시사이클린 함유 식이(PHF20(Doxy))에 의한 PGC1α 및 NRF2, HO-1, VEGF 의 발현 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과 및 densitometry 로 측정된 상대적 밀도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5f는 PHF20 과다발현 및 독시사이클린 함유 식이 실험군(PHF20(Doxy))에서 항-PGC1α, 항-NRF2, 항-VEGF 항체를 이용한 면역조직화학적 분석 결과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5g는 PHF20 과다발현 및 독시사이클린 함유 식이 실험군(PHF20(Doxy))에서 정량적 PCR을 통해 PHF20, PGC1α, NRF2의 mRNA 수준의 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5h는 PHF20(Doxy) 에서 종양의 확대 이미지를 통해 종양 내부 혈관의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5i는 PHF 20 과다발현된 HCT116 세포에서 혈관 신생 단백질의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 PHF20의 과다발현에 의한 ROS 생산의 증가, 혈관생성능 증가, 총 항산화 능력의 감소, 미토콘드리아 생합성 증가 및 암세포로의 대사성 전환 기전에 대한 모식도를 나타낸 도이다.
본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 PHF 20 을 타깃으로 하는 검출 제제는 PHF20 의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여 PHF20 의 발현량의 변화를 확인함으로써, PHF20 발현 증가에 의해 유도되는 미토콘드리아 생합성 (biogenesis) 증가, 혈관 신생 증가, 총 항산화능의 감소 및 당화-의존적 ATP 생산능의 증가에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 암 세포로의 대사성 전환에 대한 정보를 제공할 수 있다.
PHF 20은 p53 및 NF- kB의 신호전달의 중요한 조절자로 작용할 수 있으며, 다분화능 줄기세포 유도의 재프로그래밍 과정에서도 중요한 조절자로 작용할 수 있다. PHF20은 인간에서 PHF20 유전자에 의해 암호화되며, 인간에서는 NP_057520, 마우스에서는 NP_766262 단백질로 표시될 수 있다.
PHF20은 각종 암세포에서 발현될 수 있으며, 이에 의해 본원 발명에서 목적하는 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 암은 편평세포 암, 소형 세포 폐암, 비-소형 세포 폐암, 폐암, 복막암, 결장암, 담도 종양, 비인두암, 후두암, 기관지암, 구강암, 골육종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 방광암, 흑색종, 뇌암, 신경 교종, 뇌종양, 피부암, 췌장암, 유방암, 간암, 골수암, 식도암, 대장암, 위암, 자궁경부암, 전립선암, 난소암, 두경부암 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 본원 발명의 바람직한 일 예에서는 대장암을 타깃으로 하여 정보를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 검출 제제는 PHF20 의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
PHF20의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제인 경우, PHF20 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 ‘프라이머’란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 PHF20 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
상기 ‘증폭 반응’은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 ‘프로브’라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다.
본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법으로, 상기 제제는 PHF20 의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제로, PHF20 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 암세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법으로, 상기 제제는 PHF20 의 단백질 발현수준을 측정하는 제제로, PHF20 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 암세포에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 PHF20 의 검출에 의해 제공될 수 있는 정보는 단순히 암세포의 유무와는 차별화된 것으로, 암세포에서의 미토콘드리아 생합성, 혈관 신생, 산소 소비, 총 항산화능에 대한 구체적이고 개별적인 정보로, 이러한 정보를 통해 궁극적으로 암세포로의 대사성 전환을 확인할 수 있게 한다.
PHF20 이 과다발현된 것으로 확인되는 경우, 상기 미토콘드리아 생합성 (biogenesis)은 증가되고, 혈관 신생 증가, 산소 소비량 증가, 총 항-산화능의 감소 및 당화-의존적 ATP 생산능의 증가된다는 것을 암세포에서 확인할 수 있다.
미토콘드리아는 인체 내에서 다양한 대사과정에 영향을 미치는 중요한 세포 기관으로, 포유 동물의 미토콘드리아는 1500개 이상의 단백질을 함유한다. 이 중 13개의 주요 단백질이 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 에 의해 생성되며, 미토콘드리아의 형태 분포 및 기능은 미토콘드리아 융합과 분열 및 생합성에 의해 조절되므로, 미토콘드리아 생합성은 복합적 생리적 조건에 의해 조절되며 세포의 대사 및 이와 관련된 질병에 대한 정보를 제공할 수 있는 중요한 대상이 된다.
미토콘드리아 생합성의 주요 조절인자는 PGC1-α (peroxisomal proliferator activated receptor γ coactivator-1 α), NRF-1(nuclear respiratory factor), TFAM (mitochondrial transcription factor A) 로 알려져 있다.
본 발명에 따르면, PHF20 의 과다발현은 세포에서 mtDNA, PGC1-α, TFAM 의 발현을 증가시키고, 미토콘드리아의 질량을 증가시키므로 암세포에서 호기성 대사 작용 유도를 위해 대사 전환을 유도하는 것을 알 수 있으며, PHF 20 의 발현 측정을 통해 암세포에서의 미토콘드리아 생합성 증가에 대한 정보를 제공할 수 있다.
혈관신생은 암세포의 성장 및 전이에 중요한 역할을 하는 기전으로, 암세포는 혈관 내피세포 성장 인자의 분비를 통해 신생 혈관을 만들며, 이를 통해 다시 종양에 산소와 영양분을 공급하고, 다른 곳으로 전이하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따르면, PHF20 과다발현은 암세포에서 혈관 신생을 유도하므로, PHF20 의 발현 측정을 통해 암세포에서의 혈관 신생능에 대한 정보를 제공할 수 있다.
총 항-산화능(total antioxidant capacity; TAC)은 비효소적 항산화물질에 의해 활성산소가 제거되는 것의 총량이다. 각각의 다른 항산화물질 분자들을 측정하는 것은 현실적으로 어려움이 있으며, 더구나 다양한 항산화물질은 상호 부가적(additive)인 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 측면에서 총 항산화능은 유용한 측정방법이다. 본 발명에 따르면, PHF20 발현 증가에 의하여 암세포의 총-항산화능이 감소하므로, PHF20 의 발현 측정을 통해 암세포에서의 총 항산화능에 대한 정보를 제공할 수 있다.
당화-의존적 ATP 생산능(glycolysis-dependent ATP production)은, 미토콘드리아를 이용하여 ATP 생산을 하지 않고 당화 의존적으로 ATP를 생산하는 암세포 대사의 특징이다 이다. 본 발명에 따르면, PHF20의 발현 증가에 의해 총 ATP 생산이 감소함에도 불구하고 당화-의존적 ATP 생산은 PHF20 과다발현 세포에서 증가되고, 이는 PHF20 이 호기성 해당작용으로의 대사성 전환을 촉진한다는 것을 나타내므로, PHF20의 발현량 측정을 통해, 암세포에서의 당화-의존적 ATP 생산능에 대한 정보를 확인할 수 있으며, 암세포에서 호기성 해당작용이 유도되었는지에 대한 정보를 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 설명한 바에 따른 PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 산소 소비량, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 암세포에 대한 정보 제공용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophiles (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 상기 본 발명에서 제작될 수 있는 키트의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
또한 본 발명은 PHF20 의 발현양을 측정하는 단계; 후보물질을 처리하는 단계; PHF20의 발현양의 변화를 측정하는 단계; 를 포함하는, 암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 억제하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 PHF20의 발현양이 증가하면, PHF20 에 의해 암세포의 미토콘드리아 생합성이 증가하고, 혈관 신생 증가, 산소 소비량의 증가, 총 항산화능의 감소, 당화-의존적 ATP 생산능의 증가가 유도되어 최종적으로 암세포로의 대사성 전환이 일어나게 된다. 따라서, 이와 같은 기전을 차단하여 암세포로의 대사성 전환을 억제하는 새로운 암 치료제를 스크리닝 하기 위하여, PHF20 의 발현량을 감소시키는 후보 물질을 검출하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
항체 및 시약
모든 상업적 항체는 하기와 같이 구입하여 사용하였다: 항-PHF20 및 항-COXIV 항체 (Cell Signaling), 항-GFP 및 항-actin 항체 (Santa Cruz), 항-PAR 및 항-PARP (BD Biosciences), 항-SDHA, 항-MTCOI, 및 항-ND6 항체 (Abcam). HRP conjugated 항-마우스 및 항-rabbit IgG 항체 (Calbiochem). Red-mitotracker, mito-sox, CM-H2DCFH-DA 및 JC-1(Invitrogen).
세포 배양 및 자극
HCT116 세포는 10% 우태아혈청, 2mM 글루타민, 100유닛/ml 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 에서 유지하였다. 이들 세포들은 제조사의 지시에 따라 jetPEI (Q-biogene) 시약을 이용하여 형질감염되었다. 바이러스 감염을 위하여, HCT116세포는 세포가 80% 컨플루언스에 도달하였을 때 적절한 아데노바이러스를 이용하여 감염시켰다. 배지는 감염 후 6시간마다 교체하였으며, 시간연속적인 실험에서는 교체하지 않았다.
발현 벡터의 구축
Flag 표지된 전장 PHF20 ENTR-Flag-PHF20 구조체가 프라이머와 함께 준비된다: 5' GAC GAA TTC ATG ACA AAG CAT CCA CCT AAC 및 3' GAC CTC GAG TCA TGT TGA GCA GCA GAG GGC. PCT 산물은 포유류 발현 벡터, pENTR-3C의 EcoR I 및 Xho I 사이에 서브클론된다. 야생형 PHF20, GFP 및 LacZ 를 위한 아데노바이러스 발현 벡터는 Adenoviral Expression Kit (Invitrogen)에 의해 준비된다.
이미지 분석 및 간접 면역 형광 분석
HCT116 세포는 유리 커버슬립 상에서 50-70% 컨풀루언트까지 성장하고, 48시간 동안 LacZ- 또는 PHF20- 아데노바이러스로 감염시켰다. 미토콘드리아는 MitoTracker Red FM dye로 염색하였으며, 세포는 실온에서 10분동안 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, Fluoromount-G (Vector Laboratories) 로 10분 동안 부착시킨 후 공초점 현미경을 이용하여 시각화 하였다.
미토콘드리아 분획의 단리
HCT116 세포를 PBS로 세척하고 미토콘드리아 분획 완충액(20mM Hepes, pH8.0, 10mM KCl, 1.5mMgCl2 , 1mM EDTA, 250mM sucrose, 1mM PMSF, 10g/ml leupeptin, 10g/ml aprotinin, 및 0.2mM sodium orthovanadate) 에서 30분 동안 얼음상에서 재부유 시킨후, 균질화하였다. 파괴되지 않은 세포 및 핵은 10분 동안의 1500g 원심분리를 통해 펠렛화하였다. 상청액은 연속적으로 10000g 에서 30분 동안 4도 조건에서 원심분리시켰으며, post-mitochondrial fraction을 위한 새로운 튜브로 이동시켰다. 그 후, 상청액을 1시간 동안 4도에서 10,000g로 원심분리하고, 상청액을 세포질 분획으로 사용하였다. post-mitochondrial fraction 펠렛을 500ul 미토콘드리아 분획 완충액으로 세척하고, 미토콘드리아 단리를 위해 사용하였다. 단리된 미토콘드리아는 2M 염화나트륨, 100mM 탄산나트륨(pH 11.2), 또는 1% Triton X-100 로 30분동안 처리하였다. 상기 시료들을 상청액(S) 및 침강(P) 분획으로 분리하기 위한 초원심분리를 수행하였으며, 트리카복실산 활성의 분석에 사용하였다.
유세포 분석
세포 당 미토콘드리아 질량을 MitoTracker Red FM (Molecular Probes)을 이용한유세포 분석기(FACs) 로 측정하였다. HCT116 세포는 트립신화에 의하여 수집하였으며, 0.5ml PBS에 부유시키고, 100nM 의 MitoTracker Red FM 으로 30분 동안 암환경의 실온에서 염색시키고, FACS Calibur (BD Bioscience) 로 분석하였다.
유세포 분석기에 의한 세포성 슈퍼옥사이드 생산의 측정
HCT116 세포를 LacZ 또는 PHF20-아데노바이러스로 48시간 동안 감염시키고, 그 후 이를 HBSS 내 5uM CM-H2DCFDA 으로 염색하고, 37도에서 10분동안 배양하였다. 미토콘드리아에서 생산되는 과산화수소의 측정을 위하여 Mito-SOX (Molecular Probes)를 사용하였다. 세포를 5uM Mito-SOX와 함꼐 37도에서 10분 동안 배양되었으며, 수집되고 FACS Calibur (BD Bioscience)로 분석하였다.
산소 소비의 측정
HCT116 세포를 LacZ 또는 PHF20-아데노바이러스로 48시간 동안 감염시키고, 5 Χ 105 세포를 DMEM 이로 이어지는 96-well BD Oxygen Biosensor System plate (BD Biosciences) 의 개별적 웰에 최종 부피가 웰당 200ul이 되도록 추가하였다. 플레이트들을 5% CO2 의 가습화된 배양기에서 37도 30분 조건으로 유지하였다. 플레이트는 SAFIRE multimode microplate spectrophotometer에서 120분 동안 10분 간격으로 판독하였다.
ATP 결정
ATP 측정을 위하여, 상업적으로 판매되는 luciferin-luciferase assay kit를 사용하였다. 간략하게 HCT116 세포를 LacZ 또는 PHF20-아데노바이러스로 72시간 동안 감염시키고, ice-cold PBS로 일회 세척하였으며, 세포들을 체세포 ATP 방출 시약으로 용해시켰다. 루시페린 기질 및 루시퍼라아제 효소를 추가하고 Perkin Elmer 3B spectroflurometer 상에서 바이오루미니센스를 측정하였다. 전체-세포 ATP의 함량은 running an internal standard에 의해 측정하였다. 세포성 ATP 수준은 미처리된 대조군 세포의 비율에 대하여 변환하였다.
ChIP 분석 및 루세퍼라아제 -기반 프로모터 분석
ChIP 분석을 이전에 기술된 프로토콜에 의해 수행하였다. HCT116 세포를 mock 또는flag-PHF20 발현 벡터를 이용한 형질감염 24시간 후에 포름알데하이드로 고정시켰다. 수용성 크로마틴 시료를 항-래빗 IgG 대조군, 항-PHF20, 항-Flag 항체를 이용하여 4도 조건에서 하룻밤동안 면역침강시켰다. 면역침강된 물질로부터 DNA를 단리하였으며, 이를 PCR로 증폭하였다. 사용된 프로모터는 다음과 같다.
인간 PGC1-α (-325/-592): 5’-GCATCATGTGATAAGCTC-3’ (정방향), 5’-CTTCAAGCATCATGCTGTG-3’ (역방향).
PCR 은 95℃ 에서 5 분, 94℃ 에서 1 분, 60℃ 에서 1 분, 및 72℃ 에서 1 분으로 설명된 온도 사이클에서 개시되었으며, 28-30 사이클동안 증폭하였다. 증폭된 산물은 2% 아가로오스 겔에서 시각화 하였다. 루시퍼라아제-기반 프로모터 분석을 위하여, HCT116 세포는 pGL3-PGC1α promoter-Luciferase (a gift from Joo-Ho Shin, Sungkyunkwan University, South Korea) 로 형질감염시켰다.
HCT116 / Tet -On inducible PHF20 세포의 생성
HCT116 세포를 lentivirus-TET3G로 처리하고 HCT116-TET3G 대장암 세포를 생성하기위하여 G418(200ug/ml) 를 이용하여 선택하였다. 그 후 HCT116-TET3G 세포를 pLVX-TRE3G-PHF20으로 형질감염시켰으며, Tet-On inducible PHF20 세포를 퓨로마이신 (1.25ug/ml) 으로 선택하였다. PHF20 의 발현은 독시사이클린(Doxy) 를 갖는 배지에서 확인하였다.
이종이식 마우스 모델의 제조
모든 동물관련 과정은 충남대학교 동물 윤리위원회에 의해 승인받은 프로토콜에 의해 수행하였다(CNU-00248). 연구를 위하여, 8주령의 BALB/cSlc-nu / nu mice (21-23g) 수컷 마우스를 Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japan)에서 구입하였으며, 무균 환경에서 유지하였다. Confluent HCT116/Tet-On On inducible PHF20 세포를 수확하고, ice-cold serum free DMEM 로 2회 세척하였으며, trypan blue exclusion으로 살아있는 세포의 수를 계수 하였다. 상기 세포들을 동일 배지에 부유시켰으며, 0.25 mL 부피 내 2.5×106 세포로 각 마우스의 우측 허벅지에 피하 주사하였다. 9마리의 마우스를 랜덤하게 2개의 그룹으로 나누고, 정상 식이 (PHF20-Con) 또는 독소루비신-함유 식이 (3.464g/kg; PHF20-Doxy) 로 25일 동안 처리하였다. 마우스를 정기적으로 관찰하였으며, 종양의 크기를 캘리퍼스로 측정하고 하기 식에 따라 25일 동안 종양의 부피를 분석하였다. Volume = 0.5 × (width)2 × length {Nam, 2010 #64}
실시예 1. PHF20 과다발현 HCT 116에서의 미토콘드리아 질량 증가 및 산소 소비 증가
대장암에서 PHF20의 과다발현의 영향을 확인하기 위하여, PHF20을 정상 및 암 조직에서 과다발현시켰다. 암 조직은 악성 대장암 수술을 받은 3명의 환자(P1-P3) 로부터 얻었다. PHF20이 과다발현 되었는지 확인하기 위하여, 항-PHF20 항체를 이용한 조직의 면역조직화학적 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 1a 및 도 1b 에 나타내었다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, PHF20의 발현 수준은 정상 세포와 비교하여 대장암 조직에서 뚜렷하게 증가되었다. 또한 도 1b에 나타낸 바와 같이, 암 조직과 주변 조직들 사이의 비교를 통해 대장암 조직에서 높은 수준의 PHF20 염색이 나타나는 것이 확인되며, 이는 대장암에서 PHF20 의 과다발현의 잠재적인 역할을 나타낸다.
HCT116 세포의 미토콘드리아 질량은 미토콘드리아가 종양 대사에서 신호전달 허브의 일종이기 때문에 이를 확인대상으로 하였다. HCT116 세포를 LacZ- (Ad-LacZ), PHF20-adeonvirus (Ad-PHF20) 또는 아데노바이러스가 없는 대조군(control)로 48시간 동안 감염시켰으며, 미토콘드리아를 MitoTracker Red FM 염색을 통해 염색시키고, 미토콘드리아 질량을 유세포 분석기(FACs)로 분석하였다. 각각의 결과는 3개의 독립적 실험의 결과로 확인하였으며, 확인 결과를 도 1c 및 도 1d에 나타내었다.
도 1c 및 도 1d 에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스-매개된 PHF20 (Ad-PHF20) 과다발현 후 mito-tracker로 확인한 결과, 미토콘드리아의 질량은 통계적 유의도를 나타내며 증가하였다. 세포당 형광 강도의 평균 (Y-축) 을 계산하였다. 시료당 최소 만개의 세포가 각각의 실험에서 측정되었다.
추가적인 확인을 위하여, pDS-Mito-Red를 아데노 바이러스 감염 24시간 전 일시적으로 HCT116 세포에 형질 감염 시키고 공초점 현미경을 통해 미토콘드리아의 형태적인 변화를 관찰하였으며, 도 1e에 나타낸 바와 같이, PHF20-adeonvirus (Ad-PHF20) 군에서 미토콘드리아가 뚜렷하게 증가하였음을 확인하였다.
HCT116 세포를 LacZ- (Ad-LacZ), PHF20-adeonvirus (Ad-PHF20) 또는 아데노바이러스가 없는 대조군(control)로 48시간 동안 감염시켰으며, 미토콘드리아 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. nuclear-encoding respiration chain proteins, NDUFA9(complex I subunit), SDHA(complex II subunit), NQCRC2(complex Ⅲ subunit), COX IV(complex IV subunit IV), mitochondrial-encoding respiration chain proteins, MT-CO1(complex IV subunit I), MT-ND1(complex I), MT-CYB(complex Ⅲ) 및 다른 미토콘드리아성 단백질 MnSOD 항체를 사용하였으며, 결과를 도 1f에 나타내었다. 또한 동일 모델에서 시트레이트 합성 효소의 활성을 측정한 결과를 도 1g에 나타내었다.
도 1f에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석은 미토콘드리아 산화적 인산화 (mitochondrial oxidative phosphorylation, OXPHOS) 시스템, 특히 mtDNA-암호화 유전자; MT-CO1 (complex IV), MT-ND1 (complex I) 및 MT-CYB (complex Ⅲ)들이 PHF-20 과다발현 세포에서 상향 조절되어 있다는 것을 나타내었다. 도 1g에 나타낸 바와 같이, 또한, 시트레이트 합성효소 활성이 PHF20 과다발현 세포에서 뚜렷하게 증가되었고, 추가적으로 PHF20에 의하여 미토콘드리아 질량이 증가된 것을 확인하였다.
HCT 세포를 48 시간동안 LacZ- (Ad-LacZ), PHF20-adeonvirus (Ad-PHF20) 또는 아데노바이러스가 없는 대조군(control)으로 감염시키고, 동일량의 세포를 분리하여 96-웰 BD Oxygen Biosensor plate 에 옮겼다. 각 웰의 형광강도를 485 nM에서 SAFIRE multimode microplate spectrophotometer를 이용하여 측정하였으며, 상대적 산소 소비량을 측정한 결과를 도 1h에 나타내었다.
도 1h에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아가 세포에서 산소의 주요 소비자이기 때문에 상기 산소 소비 또한 대조군 세포와 비교하여 PHF20 과다발현 세포에서 뚜렷하게 증가되었다. 상기와 같은 결과를 통해 PHF20은 HCT116 세포에서 미토콘드리아 생합성 및 산소 소비를 촉진하는 역할을 할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2. PHF20 - 매개된 미토콘드리아 생합성의 PGC1α를 통한 전사적 조절
미토콘드리아 생합성이 증가된 전사를 통해 발생한다는 것이 암시되며, 이는 “Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α)” 라고 불리는 핵 단백질을 요구하는 것으로 예상하였다. 이를 확인하기 위하여, PHF20가 미토콘드리아 생합성에 미치는 영향을 추가적으로 평가하였다. 보다 구체적으로 HCT 세포를 48 시간동안 LacZ- (Ad-LacZ), PHF20-adeonvirus (Ad-PHF20) 또는 아데노바이러스가 없는 대조군(control)으로 감염시켰다. PHF 20의 과다발현을 확인하였으며, mtDNA 및 PGC1α mRNA 변화를 정량적 실시간 PCR을 통해 아메노바이러스-PHF20 감염 2일 후에 확인하였다. mtDNA의 분석을 위하여, mitochondrial cytochrome B 유전자 카피 수를 베타-엑틴의 수에 관하여 정량하였으며, 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, Ad-PHF20 군에서 mtDNA의 mRNA 수준은 PGC1α mRNA와 함께 증가되었다. 또한 미토콘드리아 전사인자 A의 PGC1α 의 주요 타깃인 TFAM(mitochondrial transcription factor A) 또한 PHF20 과다발현 세포에서 뚜렷하게 증가되었다.
이와 같은 유전자 발현의 증가가 PHF20에 의한 것임을 추가적으로 검증하기 위하여 siRNA 매개 PHF20 넉다운을 수행하고 발현 변화를 확인하였다. HCT 116 세포를 일시적으로 siRNA-비-침묵(siRNA-non-silencing, NS), siRNA-PHF20, 또는 미처리 대조군 (Control) 으로 48시간 동안 처리하고, PHF20 의 넉다운과 관련 유전자들의 발현 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 나타낸 바와 같이, siRNA-PHF20 을 처리한 결과, PHF20 이 효과적으로 넉다운되고 그 결과 mtDNA 및 PGC1α mRNA, TFAM의 발현이 대조군 이하로 감소하였음을 확인하였다.
PHF20 에 의한 PGC1α 의 가능한 전사적 조절을 확인하기 위하여 ChIP 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 2c 및 도 2d 에 나타내었다.
도 2c에 나타낸 바와 같이, 항-Flag 항체를 이용한 ChIP 의 분석은 과다발현된 Flag-PHF20 가 직접적으로 PGC1α 의 프로모터에 결합한다는 것을 나타낸다 (-325/-592). 또한 도 2d에 나타낸 바와 같이, 항-PHF20 항체와 PHF20에 대한 내생적 ChIP 분석 또한 PGC1α프로모터 영역에서 PHF20 과의 상호작용을 분명하게 나타내었다.
루시퍼라아제 활성 측정을 통해 PHF20 과다발현된 HCT116세포에서 PGC1α 프로모터에 의해 유발되는 루시퍼라아제 활성을 평가하였으며, 이를 도 2e 및 2f에 나타내었다.
도 2e 및 도 2f에 나타낸 바와 같이, PGC1α 프로모터-매개된 루시퍼라아제 활성은 PHF20 과다발현된 세포에서 뚜렷하게 증가하였으나, PHF20-넉다운 세포에서는 뚜렷하게 감소하였다.
이를 종합하면, PHF20이 PGC1α 프로모터에 직접적으로 결합할 수 있으며, PGC1α 전사 강화를 통해 미토콘드리아의 생합성을 촉진한다는 것을 확인하였다.
실시예 3. PHF20 에 의한 총 항-산화 능력 및 세포성 ROS 생산의 변화
PHF20이 미토콘드리아의 생합성을 촉진함을 확인하였으므로, 미토콘드리아가 ROS 생산의 주요 원천임을 고려하여, 세포성 ROS 수준을 모니터링하였다. HCT116 세포를 상응하는 아데노바이러스로 48시간 동안 감염시키고, CM-H2-DCFDA(chloromethyl-2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 및 ROS의 넓은 스펙트럼과 반응하는 세포 투과성 형광 염색약으로 염색하였다. 과산화수소 및 로테논이 세포성 ROS 및 미토콘드리아 ROS에 대한 양성 대조군으로 각각 사용되었다. 보다 구체적으로 HCT116 세포를 Ad-LacZ 또는 Ad-PHF20 로 48시간 동안 감염시키거나 30 분동안 500 uM H2O2로 처리한 후, 세포를 30분동안 CM-H2DCFH 에서 배양하였다. HCT 116 세포는 감염되었거나 30분 동안 로테논 (10uM)로 처리하였다. 미토콘드리아에서 생산되는 슈퍼옥사이드(O2-)는 H2O2 로 전환될 수 있으므로, 슈퍼옥사이드의 검출을 위하여 세포들은 30 분동안 MitoSox 로 표지하였다. ROS 생산을 FAC로 측정하였으며, 상대적 형광강도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 3a 및 도 3b 에 나타낸 바와 같이, 세포성 ROS 는 PHF20 과다발현 세포에서 현저하게 증가하였다. 이전 결과와 유사하게, 미토콘드리아 ROS는 뚜렷하게 증가하였다. Mito-SOX 를 갖는 세포를 염색한 결과는 미토콘드리아 의존성 ROS가 PHF20 과다발현 HCT116 세포에서 증가되었음을 나타낸다.
상기와 같은 결과를 시각적으로 확인하기 위하여, pEGFP-N1 또는 pEGFP-N1-PHF20으로 48시간 동안 HCT116 세포를 형질감염시켰으며, 30 분 동안 MitoSox 로 염색하고 형광 현미경 하에서 이미지를 확인하였고, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.
PHF20 유도된 ROS의 생산을 추가적으로 평가하기 위하여, NAC(N-Acetyl-L-cysteine)와 같은 항산화제 및 카탈라아제를 사용하였다. 보다 구체적으로, Ad-LacZ, Ad-PHF20으로 48 시간 동안 HCT116 세포를 감염시켰으며, NAC (20 mM) 또는 카탈라아제 (5000 U/ml) 으로 추가적으로 24시간 동안 처리하였고, 500 uM H2O2으로 30분 동안 처리하였다. 세포를 CM-H2DCFH 로 30분 동안 염색하였고, 총 세포성 ROS를 FACs 으로 검출하였다. 결과를 도 3d에 나타내었다.
도 3d에 나타낸 바와 같이, PHF20에 의해 유도되는 ROS의 증가된 생산은 세포에 NAC 및 카탈라아제를 전처리한 경우 효과적으로 억제되었다. 그러나, 세포 내 ROS 의 수준은 ROS 생산 및 항-산화 능력의 균형에 의해 유지되었다. 그러므로 총 항산화 활성(TAC) 에 대한 PHF20 의 효과를 평가하였으며, 그 결과를 도 3e 에 나타내었다.
도 3e에 나타낸 바와 같이, HCT116 p53(-/-) 에서는 TAC에 어떠한 영향도 미치지 않았으므로, TAC 는 PHF20 과다발현 HCT116 세포에서 p53-의존적 방식으로 하향 조절되었다. 이를 종합하면, PHF20 은 미토콘드리아 생합성 촉진 및 총 항산화 능력의 감소를 통해 미토콘드리아 ROS 를 증가시켰다는 것을 보여준다.
실시예 4. HCT116 세포에서의 종양 호기성 해당으로의 PHF20 - 매개된 대사성 쉬프트
PHF20-매개 미토콘드리아 생합성 및 ROS 생산이 미토콘드리아 기능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 미토콘드라아 막 전위 및 ATP 생산을 모니터링하였다. Ad-PHF20으로 72시간 동안 감염시키고 세포를 연속적으로 JC-1 염색약으로 염색하였으며, 결과를 도 4a 및 도 4b 에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 이는 미토콘드리아에서 잠재적-의존성 축적을 나타내었고, 녹색에서 적색으로 형광 방출성 쉬프트를 나타내었다. 특히 도 4a에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 막의 탈분극은 PHF20 과다 발현된 세포에서 대조군과 비교하여 J-aggregates (적색 형광) 의 손실 및 JC-1 모노머(녹색형광) 의 축적을 나타낸다. 또한 도 4b에 나타낸 바와 같이 JC-1 염색약을 이용한 FACs 분석은 PHF20 과다발현 세포에서 막전위의 감소를 추가적으로 나타내었다. Q4 집단은 (Ad-PHF20)은 총 세포 집단의 35%까지 축적되었다. 양성 대조군(H2O2) 은 Q4 집단의 84% 였으며, 음성 대조군(Ad-LacZ) 는 Q4 집단의 7% 였다.
도 4c 에 나타낸 바와 같이, 세포내 ATP 수준은 PHF20 과다발현 세포에서 현저하게 감소되었으며 이는 이들 세포에서 미토콘드리아의 기능이 감소되었음을 나타낸다. 2-deoxyglucose (2-DG) 및 올리고마이신 (oligomycin)의 사용에 의하여, 당화-의존적 및 산화적 인산화 시스템-의존적 ATP (OxPhos system-dependent ATP) 생산 사이의 ATP 생산 비율을 계산하였다. 올리마이신은 단백질 채널을 차단하고, 산화적 인산화 시스템-의존적 ATP 을 억제하는 반면 2-DG 는 당화-의존적 ATP 생산을 차단한다.
도 4c 및 도 4d에 나타낸 바와 같이, 이들 세포에서 총 ATP 생산은 비록 감소할지라도 당화-의존적 ATP 생산은 PHF20 과다발현 세포에서 증가되고, 이는 PHF20 이 호기성 해당작용으로의 대사성 전환을 촉진한다는 것을 나타낸다.
추가적으로 PHF20 과다발현 세포 배양 배지에서의 젖산 측정에 의해 PHF20의 대사성 전환효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 4e 에 나타내었다. 도 4e 에 나타낸 바와 같이, PHF20의 과다발현에 의하여, 당화-의존적 ATP 생산이 증가된다는 것을 나타낸다. 이러한 결과를 통해 PHF20 이 HCT116 세포에서 호기성 해당을 위한 분자적 스위치로서 작용한다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 누드 마우스 이종모델에서 종양 성장을 촉진하는 PHF 20 과다 발현
In vivo에서 PHF20의 생리학적인 기능을 확인하기 위해서, 누드 마우스에서 HCT116 대장암 세포를 갖는 이종이식 모델을 Tet-On inducible PHF20 세포를 이용하여 제조하였으며, 누드마우스에 정상 식이(Con) 또는 독시사이클린(doxycycline) 함유 식이(Doxy)를 공급하였다. 독시사이클린 함유 식이가 공급된 마우스에서는 PHF20이 발현하는 종양세포가 형성되므로, 종양이 형성된 누드마우스에서 종양의 길이 및 넓이, 부피를 캘리퍼스를 통해 26일 동안 측측정하였고, 26일째에 종양을 적출하였다. 측정 결과를 도 5 a 내지 d에 나타내었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, Doxy 처리된 군에서 대조군과 비교하여 HCT116 이종 이식편의 종양 성장을 뚜렷하게 촉진하였다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, Doxy 처리된 군에서 종양의 응혈은 일어나지 않았으며, 이는 PHF20이 종양에서 혈관신생 작용을 조절한다는 것을 나타낸다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 단리된 종양 사진은 PHF20의 과다발현을 통해 종양 사이즈 및 부피가 증가하였음을 시각적으로 보여주며, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 종양의 무게의 통계적 분석 역시 종양 무게의 증가를 나타내었다.
실시예 2에서 PHF20의 과다발현이 PGC1 α와 관련되어 있으며, 혈관신생을 유도하는 것을 확인하였으므로, Doxy 처리된 종양에서 PGC1 α 및 NRF2, HO-1, VEGF 의 발현 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, densitometry 에 의해 이의 상대적 밀도를 확인하고, 그 결과를 도 5e에 나타내었다.
도 5e에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블랏 분석은 추가적으로 Doxy 처리된 종양에서 PGC1 α가 상향조절됨을 나타낸다. 항-산화 시스템의 주요 조절자인 nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) 및 heme oxygenase 1(HO-1) 는 PHF20 과다발현 종양에서 상향 조절되었다. 게다가 혈관생성 및 혈관신생을 촉진하는 혈관 내피성 성장인자(VEGF) 또한 PHF20 과다발현 종양에서 증가하였다.
항-PGC1α, 항-NRF2, 항-VEGF 항체를 이용한 면역조직화학적 분석 및 정량적 PCR을 통해 mRNA의 상대적 발현 수준을 변화를 추가적으로 확인하였으며 그 결과를 도 5f 및 도 5g에 나타내었다. 도 5f 및 도 5g 에 나타낸 바와 같이, HCT116 종양의 면역조직학적 분석 결과 PHF20, PGC1 α, NRF2 의 mRNA 수준은 상향 조절되었다. 각각의 결과는 GAPDH mRNA 수준에 의해 조정되었다.
종양의 확대 이미지를 통해 종양의 형태학적인 분석을 수행하였으며, 종양 내부 혈관의 변화를 확인하고 그 결과를 도 5h에 나타내었다.
도 5h에 나타낸 바와 같이, 종양의 형태학적인 분석은 종양 내부의 혈관이 Doxy 처리된 종양에서 잘 발달되어있음을 나타내었다. 이와 같은 결과를 통해 PHF20은 종양에서 혈관 신생을 유도하는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 추가적으로 확인하기 위하여 PHF 20 과다발현된 HCT116 세포에서 혈관 신생 단백질의 발현이 증가되는지를 R&D 시스템에서 구입한 human angiogenesis assay kit를 사용하여 확인하였다. 혈관신생 단백질로는 angiogenin, basic fibroblast growth factor (FGF-2) 및 Insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) 를 대상으로 확인하였으며, 그 결과를 도 5i에 나타내었다.
도 5i에 나타낸 바와 같이, 대부분이 혈관 신생 단백질이 PHF20 과다발현된 HCT116 세포에서 상향조절되었다. 이러한 결과를 통해 PHF20 과다발현이 HCT116 이종이식에서 PGC 1α, 항산화 유전자 및 혈관신생성 유전자의 증가와 함께 종양의 성장을 촉진함을 확인하였다.

Claims (7)

  1. PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 대장암 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는, 대장암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법으로,
    상기 정보는 대장암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종인, 대장암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 PHF20 의 mRNA 발현수준을 측정하는 제제로, PHF20 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출 제제는 PHF20 의 단백질 발현수준을 측정하는 제제로, PHF20 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 대장암 세포에 대한 정보를 제공하는 방법.
  5. PHF 20 (PHD finger protein 20) 검출 제제를 포함하는, 대장암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생, 총 항산화능 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 대장암 세포에 대한 정보 제공용 키트.
  6. 대장암 세포에서 PHF20 (PHD finger protein 20)의 발현양을 측정하는 단계;
    후보물질을 처리하는 단계;
    대장암 세포에서 PHF20의 발현양의 변화를 측정하는 단계; 를 포함하는, 대장암 세포의 미토콘드리아 생합성 (biogenesis), 혈관 신생 및 당화-의존적 ATP 생산능으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 억제하는 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
  7. 삭제
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