CN105901380B - 一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学动物模型饲料技术领域，具体公开了一种用于制备酒精性肝病动物模型的鼠饲料。该鼠饲料由酪蛋白、L‑胱氨酸、DL‑蛋氨酸、麦芽糊精、膳食纤维素、黄原胶、重酒石酸胆碱、矿物质预混料、维生素预混料、胆固醇、胆酸钠、鱼油、酒精和水配制而成。将该鼠饲料用于制备动物酒精性肝病模型，可逐步造成小鼠酒精性脂肪肝、肝炎和肝纤维化，此模型与人类患病特征相似，病变有一定的发展过程，造模方法简便易行，成功率高、死亡率低、重复性好，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及医学动物模型饲料技术领域，具体涉及一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料。
背景技术
酒精性肝病是长期过量饮酒导致的肝脏疾病，其初期表现为酒精性脂肪肝，进而发展为酒精性肝炎、肝纤维化甚至是肝癌，最终无法治愈。酒精性肝病在西方国家是最常见的肝病，在我国随着经济的发展其发病率有增多的趋势，严重影响患者的生活质量，并给家庭和社会造成沉重的经济负担。酒精性肝病的发病机制非常复杂，现有治疗酒精性肝病的药物很少。研究一种有效治疗酒精性肝病的药物迫在眉睫，筛选药物依赖于动物模型。但是建立稳定的、形成时间短、形成率高的酒精性肝纤维化动物模型仍是临床研究和实验研究的难点。
目前临床上和实验上研究酒精性肝病使用的动物模型多采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型、Tsukaoto-French模型和Tipoe-Nanji酒精液体饲料模型(酒精性肝病动物模型的研究进展.安徽医药.2010,14(7):745-748)。这三种模型虽然很经典但是仍有一些不足。
首先是Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型一般只能造成酒精性脂肪肝，而无法形成更为严重的肝炎和纤维化。Tsukaoto-French模型是通过在动物胃内置入塑料导管，管周荷包缝合，导管经皮下隧道引至颈后，破皮引出，缝合固定导管(Mouse model ofchronicand binge ethanol feeding(the NIAAA model).Nature Protocols.2013,8(3):627-37)。虽然可以成功地建造酒精性肝炎和肝纤维化的模型，但是不符合临床酒精性肝病病人的饮酒方式，而且造模时间长，造模手术复杂，手术成功率低，动物死亡率高。Tipoe-Nanji酒精液体饲料以鱼油为主要脂肪，小鼠自由饮食，建立的雌性动物模型不仅有脂肪肝，还会伴有炎症和坏死甚至是轻度的肝纤维化，但是在雄性动物模型中无法形成纤维化。而研究酒精性肝病最好用雄性动物，因为男性酗酒者要远多于女性，男性酒精性肝病患者要远多于女性，所以雄性动物更能模拟现实情况。
发明内容
针对现有动物模型中存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料。
本发明将酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、麦芽糊精、膳食纤维素、黄原胶、重酒石酸胆碱、矿物质混合物、维生素混合物、胆固醇、胆酸钠、鱼油和酒精配制形成一种液体饲料，动物自由饮食此种鼠饲料加上5-7天一次的大剂量酒精灌胃，成功制备了酒精性肝病模型，包括脂肪化、肝炎和肝纤维化模型。本发明将满足临床研究和实验研究酒精性肝病的需要，预计会有很好的经济效益和社会效益。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，为浅黄色液体，由酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、膳食纤维素、黄原胶、重酒石酸胆碱、矿物质预混料、维生素预混料、胆固醇、胆酸钠、麦芽糊精、鱼油、酒精和水组成。
进一步，一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，每1L所述饲料组成如下：
酪蛋白41.4克；
L-胱氨酸0.5克；
DL-蛋氨酸0.3克；
膳食纤维素10克；
黄原胶3.0克；
重酒石酸胆碱0.53克；
矿物质预混料8.75克；
维生素预混料2.5克；
胆固醇2.0克；
胆酸钠0.2克；
麦芽糊精12.8-25.6克；
鱼油30-40克；
酒精25-50克(酒精以乙醇计量，酒精的具体形式为白酒)；
余量为水。
更进一步，一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，每1L所述饲料组成如下：
酪蛋白41.4克；
L-胱氨酸0.5克；
DL-蛋氨酸0.3克；
膳食纤维素10克；
黄原胶3.0克；
重酒石酸胆碱0.53克；
矿物质预混料8.75克；
维生素预混料2.5克；
胆固醇2.0克；
胆酸钠0.2克；
麦芽糊精25.6克；
鱼油36克；
酒精50克(酒精以乙醇计量，酒精的具体形式为白酒)；
余量为水。
上述各配方的用于制备酒精性肝病动物模型的饲料的制备方法，步骤如下：
1)将酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、膳食纤维素、黄原胶、重酒石酸胆碱、矿物质预混料、维生素预混料、胆固醇和胆酸钠加入容器中，然后加入水，搅拌均匀，得混合物A；
2)再将麦芽糊精加入另一容器中，然后加入水，搅拌均匀后加入到混合物A中，搅拌均匀，瓶装后密封，4℃保存备用；
3)将鱼油和酒精加入到步骤2)的瓶中，搅拌均匀得用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，其外观为浅黄色液体。
本发明的用于制备酒精性肝病动物模型的饲料优选作为鼠饲料，用于制备酒精性肝病模型鼠。
本发明还提供了一种制备酒精性肝病动物模型的方法，包括以下步骤：
1)模型制备过程中，动物每天自由饮食所述饲料；2)喂养第二周开始每5-7天灌胃酒精一次，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每1-2周逐级增加为5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg，最后灌胃剂量稳定在8g/kg。
其中，酒精的灌胃剂量都是以乙醇来计量。
在模型制备中，H&E染色发现，饲养第五周小鼠肝组织脂质空泡较多，脂质蓄积严重，并且随着周数增加肝组织脂质蓄积越严重；Masson染色发现，饲养第八周小鼠肝组织开始出现肝炎和纤维化现象。因此，本发明的饲料所制备的酒精性肝病动物模型符合临床上的酒精性肝病病人的饮酒方式，与其症状和发展过程相似程度很高。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1、运用了雄性小鼠成功建造酒精性肝病模型，且可使酒精性肝病有一定的发展过程，使动物模型的临床症状和病理学改变更接近真实的酒精性肝病。
2、所述鼠饲料的制备方法操作简单，便于推广应用。
3、利用所述饲料制备酒精性肝病动物模型，简单易行，安全，稳定性好，造模成功率高，建模时间短，对动物伤害很小，且症状高度符合临床酒精性肝病的症状；
4、通过本发明的鼠饲料建立的酒精性肝病动物模型，可以用来研究酒精性肝病的发病过程和机制，筛选治疗酒精性肝病的药物，探索药物的作用机理，具有十分重要的意义。
附图说明
图1为经H&E染色发现小鼠肝脏组织病理学上的变化图。
图2为经Masson染色发现小鼠肝脏组织病理学上的变化图。
H&E染色结果
HE染色20x，图中标尺的长度为100μm。A、B、C、D和E分别表示配对喂养组、模型组第4、7、8、13次灌胃后肝脏组织切片染色图。酒精模型组肝脏可见肝细胞脂肪化(▲，脂肪空泡)、肝细胞坏死(
细胞核溶解)和炎症病灶
Masson染色结果
Masson染色20x，图中标尺的长度为100μm。A、B、C、D和E分别表示配对喂养组、模型组第4、7、8、13次灌胃后肝脏组织切片染色图。酒精模型组肝脏可见纤维化(←，纤维化)。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式解释为对本发明权利要求书请求保护范围的限制。以下实施例中所用原料均可以从市场上购得。
实施例1
一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，以制备1L所述饲料为例，其制备方法如下：
1)将酪蛋白41.4克、L-胱氨酸0.5克、DL-蛋氨酸0.3克、膳食纤维素10克、黄原胶3.0克、重酒石酸胆碱0.53克、矿物质预混料8.75克、维生素预混料2.5克、胆固醇2.0克和胆酸钠0.2克加入容器中，然后加入适量的水，搅拌均匀，得混合物A；
2)再将麦芽糊精12.8-25.6克加入另一容器中，然后加入适量的水，搅拌均匀后加入到混合物A中，搅拌均匀，瓶装后密封，4℃保存备用。
3)将30-40克鱼油和25-50克酒精(酒精以乙醇计量，酒精的具体形式为白酒)加入到步骤2)的瓶中，搅拌均匀得1L用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，其外观为浅黄色液体。
实施例2
一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，以制备1L所述饲料为例，其制备方法如下：
1)将酪蛋白41.4克、L-胱氨酸0.5克、DL-蛋氨酸0.3克、膳食纤维素(罗盖特水溶性膳食纤维，法国罗盖特)10克、黄原胶3.0克、重酒石酸胆碱0.53克、矿物质预混料(Dyets.Inc#210011)8.75克、维生素预混料(Dyets.Inc#310011)(http://dyets.com/ vitamin-mixes/)2.5克、胆固醇2.0克和胆酸钠0.2克加入容器中，然后加入适量的水，搅拌均匀，得混合物A；
2)再将麦芽糊精25.6克加入另一容器中，然后加入适量的水，搅拌均匀后加入到混合物A中，搅拌均匀，瓶装后密封，4℃保存备用。
3)将36g鱼油(DSM#MEG-3，含12％-13％DHA和18％-20％EPA)；113.2ml 56°红星二锅头(北京红星股份有限公司)加入到上述饲料中，搅拌均匀即得，其外观为浅黄色液体，体积为1L。
本实施例中所用25.6克麦芽糊精和50克酒精热量等量于115.2克麦芽糊精；黄原胶作为饲料中的增稠剂、悬浮剂和乳化剂。
实施例3制备酒精性肝病动物模型
雄性昆明小鼠，分为2组：模型组15只昆明小鼠和其配对喂养组6只昆明小鼠。每只小鼠单笼饲养，每天自由饮食实施例2制备的饲料。配对喂养组鼠饲料为麦芽糊精代替上述饲料中的酒精配制而成。喂养第二周开始，模型组每5-7天灌胃酒精一次(56°红星二锅头，北京红星股份有限公司监制)，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每次逐级增加为5g/kg、6g/kg、6g/kg。第四次灌胃后，选取一只动物取肝脏，经过10％福尔马林固定，H&E染色和Masson染色后，进行病理组织形态学观察。
其中，酒精的灌胃剂量都是以乙醇来计量，以下实施例同。
模型组小鼠肝脏病理组织形态学可见大量肝细胞坏死(细胞核溶解)和脂肪化(脂肪空泡)(结果见图1B、2B)，但尚未形成纤维化。
实施例4制备酒精性脂肪肝病动物模型
在实施例3的基础上继续进行试验，雄性昆明小鼠，分为2组：模型组14只动物和其配对喂养组6只昆明小鼠。每只小鼠单笼饲养，每天自由饮食实施例2制备的鼠饲料。配对喂养组鼠饲料为麦芽糊精代替上述饲料中的酒精配制而成。喂养第二周开始，模型组每5-7天灌胃酒精一次(56°红星二锅头，北京红星股份有限公司监制)，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每次逐级增加为5g/kg、6g/kg、6g/kg、7g/kg、7g/kg、8g/kg。第七次灌胃后，选取一只动物取肝脏，经过10％福尔马林固定，H&E染色和Masson染色后，进行病理组织形态学观察。
模型组小鼠在第七次灌胃后肝脏病理组织形态学可见大量肝细胞坏死(细胞核溶解)和脂肪化(脂肪空泡)(图1C)，程度比实施例3中的严重。Masson染色可见纤维化病灶(图2C)。
实施例5制备酒精性纤维化肝病动物模型
在实施例4的基础上继续进行试验，雄性昆明小鼠，分为2组：模型组13只昆明小鼠和其配对喂养组6只昆明小鼠。每只小鼠单笼饲养，每天自由饮食实施例2制备的鼠饲料。配对喂养组鼠饲料为麦芽糊精代替上述饲料中的酒精配制而成。喂养第二周开始，模型组每5-7天灌胃酒精一次(56°红星二锅头，北京红星股份有限公司监制)，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每次逐级增加为5g/kg、6g/kg、6g/kg、7g/kg、7g/kg、8g/kg，最后灌胃剂量稳定在8g/kg。第八次灌胃后，选取两只动物取肝脏，经过10％福尔马林固定，H&E染色和Masson染色后，进行病理组织形态学观察。
模型组小鼠在第八次灌胃后肝脏病理组织形态学可见大量肝细胞坏死(细胞核溶解)和脂肪化(脂肪空泡)(图1D)，其程度比实施例3中的严重，和实施例4相当。Masson染色可见纤维化病灶(图2D)，其程度和实施例4相当。
实施例6制备酒精性纤维化肝病动物模型：
在实施例5的基础上继续进行试验，雄性昆明小鼠，分为2组：模型组8只昆明小鼠和其配对喂养组6只昆明小鼠。每只小鼠单笼饲养，每天自由饮食实施例2制备的鼠饲料。配对喂养组鼠饲料为麦芽糊精代替上述饲料中的酒精配制而成。喂养第二周开始，模型组每5-7天灌胃酒精一次(56°红星二锅头，北京红星股份有限公司监制)，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每次逐级增加为5g/kg、6g/kg、6g/kg、7g/kg、7g/kg、8g/kg，最后灌胃剂量稳定在8g/kg。第十三次灌胃后，处死所有动物取肝脏，经过10％福尔马林固定，H&E染色和Masson染色后，进行病理组织形态学观察。
配对喂养组小鼠肝脏正常，没有出现肝细胞坏死和脂肪空泡现象(图1A)，也无纤维化和炎症病灶(图1A)，模型组小鼠在第十三次灌胃后，肝脏可见大量肝细胞坏死(细胞核溶解)和脂肪化(脂肪空泡)以及炎症病灶(图1E)。Masson染色可见纤维化病灶(图2E)。模型组动物8只动物中有7只出现纤维化，发生率为87.5％。如果从实施例4开始统计，14只动物中有12只出现纤维化，发生率为85.7％。此数据表明，本发明中的饲料成功地使雄性小鼠形成了纤维化模型，成模时间短，最早可在液体饲料饲养8周，即灌胃酒精7次后成模，成模率高，总成模率为85.7％。
Claims (4)
1.一种制备酒精性肝病动物模型的方法，包括以下步骤：
1）模型制备过程中，动物每天自由饮食一种用于制备酒精性肝病动物模型的饲料；
2）喂养第二周开始每5-7天灌胃酒精一次，起始灌胃剂量为4g/kg，以后每1-2周逐级增加为5 g/kg、6 g/kg、7 g/kg、8 g/kg，最后灌胃剂量稳定在8 g/kg；
其中，酒精的灌胃剂量都是以乙醇来计量；
每1升所述饲料组成如下：
酪蛋白41.4克；
L-胱氨酸0.5克；
DL-蛋氨酸0.3克；
膳食纤维素10克；
黄原胶3.0克；
重酒石酸胆碱0.53克；
矿物质预混料8.75克；
维生素预混料2.5克；
胆固醇2.0克；
胆酸钠0.2克；
麦芽糊精12.8-25.6克；
鱼油30-40克；
酒精25-50克；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酒精的具体形式为白酒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每1升所述饲料组成如下：
酪蛋白41.4克；
L-胱氨酸0.5克；
DL-蛋氨酸0.3克；
膳食纤维素10克；
黄原胶3.0克；
重酒石酸胆碱0.53克；
矿物质预混料8.75克；
维生素预混料2.5克；
胆固醇2.0克；
胆酸钠0.2克；
麦芽糊精25.6克；
鱼油36克；
酒精50克；
余量为水。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述饲料的制备方法步骤如下：
1）将酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、膳食纤维素、黄原胶、重酒石酸胆碱、矿物质预混料、维生素预混料、胆固醇和胆酸钠加入容器中，然后加入水，搅拌均匀，得混合物A；
2）再将麦芽糊精加入另一容器中，然后加入水，搅拌均匀后加入到混合物A中，搅拌均匀，瓶装后密封，4℃保存备用；
3）将鱼油和酒精加入到步骤2）的瓶中，搅拌均匀得用于制备酒精性肝病动物模型的饲料，其外观为浅黄色液体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |