WO2010025589A1 - 长效姜黄衍生物及其制备方法和在制药中的应用 - Google Patents

Description

长效姜黄素衍生物及其制备方法和在制药中的应用

技术领域

本发明涉及一种姜黄素衍生物， 特别是涉及一种具有优良緩释效果的 长效姜黄素衍生物及其制备方法和在制药中的应用。 背景技术

姜黄素 (： curcuminoids, Cur)是从中药姜黄、 郁金的根、 茎中提取出来的 一种酚类色素,通常为姜黄素、 去曱氧基姜黄素和双去曱氧基姜黄素三种物 质的混合物，现代药理研究表明，其具有抗癌、 抗炎、 抗氧化、 降血脂、 抗抑 郁等多种药理活性,且毒副作用小。

抑郁症是一种复杂的心理障碍性疾病， 主要表现为情绪低落， 言语减 少， 精神、 运动迟緩， 其发病率逐年增加， 许多疾病常常并发抑郁症， 严 重危害人的身体健康。 目前临床上使用的抗抑郁症药物一般是通过影响单 胺递质的重吸收、 抑制单胺的代谢或阻断突触前抑制性自主或非自主受体 而发挥作用。 虽然这些药物对抑郁症均有很好的治疗作用， 但许多药物疗 效并不稳定， 而且毒副作用较大， 因此， 从传统的中草药中开发安全有效、 毒副作用小的抗抑郁症药物成为这一领域的研究方向。

目前用于治疗肿瘤的药物种类很多， 但每一种药物在抗癌的同时对正 常组织细胞亦有毒性作用， 还可能引起继发肿瘤以及肝、 肾毒性及骨髓抑 制、 消化道反应、 脱发等不良反应， 而迄今没有发现姜黄素有明显的毒副 作用。 众多细胞试验和动物试验证明姜黄素具有确切的抗肿瘤活性， 其抗 癌谱较广， 毒副作用小， 是一种具有广泛应用前景的抗癌新药， 目前已进 入临床前的毒理试验阶段。

姜黄是中药复方逍遥散中的主要成分， 姜黄素及其衍生物对抑郁动物 模型的抗抑郁作用研究已有文献报道。 从现有的文献来看， 姜黄素具有治 疗多种疾病的功能， 而且无毒、 副作用， 应用领域十分广阔， 其最主要原 因是姜黄素多酚结构的活性。 从其化学结构来看， 姜黄素主要包含三种物 质： 即姜黄素、 去曱氧基姜黄素、 双去曱氧基姜黄素,它们的化学结构如下：

姜黄素

去甲氧基姜黄素

双去甲氧基姜黄素

脂肪是人体的基本成分， 人体吸收后主要以 β -氧化的方式进行代谢， 姜黄素的半衰期极短约 1 小时， 且现有的姜黄素及其衍生物皆存在生物利 用度很低， 其水溶性、 酯溶性较差的问题。

有鉴于上述现有的姜黄素及其衍生物存在的缺陷，本发明人基于从事 此类医药产品多年丰富的实践经验及专业知识，积极加以研究创新，以期创 设一种新的长效姜黄素衍生物及其制备方法和在制药中的应用，能够改进 一般现有的姜黄素及其衍生物类物质的药效,使其更具有实用性。 经过不断 的研究、 设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。 发明内容

本发明的目的在于， 克服现有的姜黄素及其衍生物存在的缺陷， 而提 供一种新的长效姜黄素衍生物及其制备方法和在制药中的应用， 所要解决 的技术问题是使其在保证安全性、 无毒副作用的基础上， 力求达到增加酯 溶性， 延长作用时间， 降低用药量的目的， 从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。 依据 本发明提出的一种长效姜黄素衍生物， 其具有下列结构式：

R1和 R2为氢或曱氧基； R3和 R4各自独立的选自 C1-C50的烷基，该 烷基包括直链或支链烷基， 如乙基、 丙基、 异丙基、 叔丁基等。 R3 和 R4 还可以各自独立的选自 C1-C50的不饱和链烃， 包括例如烯基、 多浠基、 羟 基、 多羟基等， 或环状芳族基团。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。 前述的长效姜黄素衍生物，其中该长效姜黄素衍生物的碳 4', 4"位的基 团为 C1-C50的饱和脂肪酸类或其酰类与姜黄素类物质的碳 4'， 4"位羟基各 自独立的发生酯化反应所形成的酯类。

前述的长效姜黄素衍生物， 其中该长效姜黄素衍生物的碳 4'， 4"位的 基团为 C1-C50的不饱和脂肪酸类或其酰类、芳香族脂肪酸类或其酰类与姜 黄素类物质的碳 4'， 4"位羟基各自独立的发生酯化反应所形成的酯类。 前述的长效姜黄素衍生物， 其中姜黄素类物质是姜黄素、 去曱氧基姜 黄素或双去甲氧基姜黄素。

前述的长效姜黄素衍生物， 其中不饱和脂肪酸类包括棕榈油酸、 油酸、 亚油酸、 亚麻酸、 花生四浠酸、 二十碳五烯酸（EPA )或二十二碳六烯酸

( DHA X

前述的长效姜黄素衍生物， 其中所述 R3和 R4各自独立的为癸烷基、 亚油酸基或水杨酸基。

本发明的目的及解决其技术问题是还可以采用以下技术方案来实现 的。 依据本发明提出的一种长效姜黄素衍生物的制备方法， 包括以下步骤： 1 )称取 2~4 mmol姜黄素类物质， 溶解在二氧六环中， 加入 0.3~0.73克的 吡啶， 然后将 3.6~8.60 mmol的 C1-C50的饱和脂肪酸类、 不饱和脂肪酸类 及芳香族类或其酰类物质逐滴加入到体系中， 水水浴反应 1~2小时； 2 )上 述产物倒入到石油醚中过滤， 将沉淀溶解在乙酸乙酯中， 用 lmol/L的盐酸 溶液洗涤两次， 再用饱和碳酸钠溶液洗涤一次， 加入无水硫酸钠干燥， 然 后过滤， 将滤液旋干， 得粗产物姜黄素烷基酯； 3 )将上述粗产物姜黄素烷 基酯装在硅胶柱中， 使用 7: 1的石油醚和氯仿洗脱， 收集目标产物， 真空 干燥得姜黄素烷基酯。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。 前述的长效姜黄素衍生物的制备方法， 其中所述冰水浴反应过程通过 TLC监测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯展开。

前述的长效姜黄素衍生物的制备方法， 其中所述的脂肪酰类、 不饱和 脂肪酰类或芳香族酰类物质各自分别为癸酰氯、 亚油酰氯或水杨酰氯。

前述的长效姜黄素衍生物的制备方法， 其中姜黄素类物质是姜黄素、 去曱氧基姜黄素或双去曱氧基姜黄素。

本发明还公开了一种上述的长效姜黄素衍生物在制备抗抑郁症药物中 的应用。

前述的在制备抗抑郁症药物中的应用， 其中所述的长效姜黄素衍生物 包含有药学可接受的栽体， 如赋形剂和添加剂、 香味剂制成各种剂型， 包 括散剂、 片剂、 微丸、 胶嚢、 微嚢、 颗粒剂或液体衍生物。

前述的在制备抗抑郁症药物中的应用， 其中所述的长效姜黄素衍生物 在制备抗抑郁症的饮料、 食品、 食品添加剂或者保健品中的应用。

另外， 本发明还公开了一种上述的长效姜黄素衍生物在制备抗肿瘤症 药物中的应用。

前述的在制备抗肿瘤症药物中的应用， 其中所述的长效姜黄素衍生物 包含有药学可接受的载体， 如赋形剂和添加剂、 香味剂制成各种剂型， 包 括散剂、 片剂、 微丸、 胶嚢、 微嚢、 颗粒剂或液体衍生物。

前述的在制备抗肿瘤症药物中的应用， 其中所述的长效姜黄素衍生物 在制备抗抑郁症的饮料、 食品、 食品添加剂或者保健品中的应用。

前述的在制备抗肿瘤症药物中的应用， 其中所述的肿瘤症包括： 宫颈 癌、 肾癌、 乳腺癌、 胃癌、 结肠癌、 肺癌细胞、 肝癌、 前列腺癌、 食管癌、 骨髓瘤、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 淋巴瘤、 膀胱癌、 腺癌、 卵巢癌或皮肤 癌等， 且不仅仅局限于上述肿瘤或癌症。

借由上述技术方案， 本发明长效姜黄素衍生物及其制备方法和在制药 中的应用至少具有下列优点：

1 ) 药效延长；

2 ) 酯溶性增加， 生物利用度提高；

3 )安全、 无毒害作用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述， 为了能够更清楚了解本发明的 技术手段， 而可依照说明书的内容予以实施， 并且为了让本发明的上述和 其他目的、 特征和优点能够更明显易懂， 以下特举较佳实施例， 并配合附 图，详细说明如下。 附图的简要说明

图 1是本发明紫外吸收检测图。

图 2是本发明红外检测图。

图 3是本发明核磁共振检测图。

图 4是本发明小鼠体内姜黄素测定的曲线图。

图 5是本发明小鼠悬尾结果实验图 （n=15 , mean±S.E.M )₀

图 6 是本发明对小鼠强迫游泳不动时间的影响实验图 （η=15 , mean±S.E.M )。

图 7 是本发明对大鼠强迫游泳不动时间的影响实验图 （n=15 ， mean±S.E.M )。

图 8是本发明对荷瘤小鼠 S-180抗肿瘤实验图。

图 9是本发明荷瘤小鼠 HCT116抗肿瘤实验图。

图 10是本发明对肿瘤细胞凋亡的影响实验图。

图 11是本发明对荷瘤小鼠生存实验图。

图 12 ( a )、 12 ( b )是本发明对不同肿瘤细胞的抑制作用实验图。 实现发明的最佳方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效， 以下结合附图及较佳实施例， 对依据本发明提出的长效姜黄素衍生物及其 制备方法和在制药中的应用其具体实施方式、 方法、 步骤、 特征及其功效， 详细说明如后。

实施例 1

本发明的长效姜黄素衍生物，是采用姜黄素类物质与 C1-C50的饱和脂 肪酸类物质发生酯化反应所形成的酯类， 其反应结构式可表示成如下所示:

其中 n = 1 ~ 49

通过上述反应所生成的姜黄素烷基酯， 其制备方法包括如下步骤： 称取 2~4 mmol 姜黄素类物质， 溶解在 50 毫升的二氧六环中， 加入 0.3-0.73克的吡啶， 然后将 3.6~8.60 mmol的癸酸逐滴加入到体系中 , 水水 浴反应 2小时， 反应过程通过 TLC监测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯展开。

上述产物倒入到 40毫升的石油醚中， 过滤将沉淀溶解在 30毫升的乙 酸乙酯中， 用 lmol/L的盐酸溶液 20毫升洗涤两次， 再用饱和碳酸钠溶液 洗涤一次， 加入 3克无水 4酸钠干燥 2小时， 然后过滤， 将滤液旋干， 得 粗产物姜黄素癸酸酯。

将上述粗产物姜黄素癸酸酯装在硅胶柱中， 使用 7: 1的石油醚和氯仿 洗脱， 收集目标产物， 真空干燥得 1.07 ~ 1.67克终产物姜黄素癸酸酯。

本实施例中的姜黄素还可以是去曱氧基姜黄素或二去曱氧基姜黄素， 其中加入的原料癸酸仅仅是 C1-C50的饱和脂肪酸类物质的一种，是举例性 的， 而非限制性的， 其它的饱和脂肪酸制备方法同上， 只是在原料的加入 量上有区别。

如图 〜³ ^所示,， 本实施例制备的 黄素姿，醋， 通过紫外吸收检测、 酸酯。

实施例 2

本发明的长效姜黄素衍生物，是采用姜黄素类物质与 C1-C50的饱和脂 肪酰类物质发生酯化反应所形成的酯类， 其反应结构式可表示成如下所示：

其中 n = l ~ 49， （： 11 112 11 + 1 ( 0 0 1 中 （ R为鹵素原子如 Cl、 Br、 I等）。

通过上述反应所生成的姜黄素烷基酯， 其制备方法包括如下步骤： 称取 2~4 mmol 姜黄素类物质， 溶解在 50 毫升的二氧六环中， 加入 0.3-0.73克的吡啶， 然后将 3.6~8.60 mmol的癸酰氯逐滴加入到体系中， 冰 水浴反应 2小时， 反应过程通过 TLC监测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯展开。 上述产物倒入到 40毫升的石油醚中， 过滤将沉淀溶解在 30毫升的乙 酸乙酯中， 用 lmol/L的盐酸溶液 20毫升洗涤两次， 再用饱和碳酸钠溶液 洗涤一次， 加入 3克无水 酸钠干燥 2小时， 然后过滤， 将滤液旋干， 得 粗产物姜黄素癸酸酯。

将上述粗产物姜黄素癸酸酯装在硅胶柱中， 使用 7: 1的石油醚和氯仿 洗脱， 收集目标产物， 真空干燥得 1.07 - 1.67克终产物姜黄素癸酸酯。

本实施例中的姜黄素还可以是去曱氧基姜黄素或二去曱氧基姜黄素,其 中加入的原料癸酰氯仅仅是 C1-C50的饱和脂肪酰类物质的一种，是举例性 的，而非限制性的， 其它的饱和脂肪酸制备方法同上， 只是在原料的加入量 上有区别。

如图 1 ~ 3所示， 本实施例制备的姜黄素癸酸酯， 通过紫外吸收检测、 红外吸收检测或核磁共振检测， 证明所得产物为姜黄素癸酸酯， 其结构式 如下所示：

实施例 3

本发明的长效姜黄素衍生物，是采用姜黄素类物质与 C1-C50的不饱和 脂肪酸类或其酰类物质发生酯化反应所形成的酯类， 其反应结构式可表示 成^口下所示：

其中 n = 1 ~ 49， C n H2 n -lCOOR中（ R为卤素原子如 Cl、 Br、 I等）。 通过上述反应方程式所生成的姜黄素烯基酯，其制备方法包括如下步 骤：

称取姜黄素类物质 2~4m mo l、 二氯曱烷 140 m l 和吡啶 73. 4 m l , 室 温搅拌下于 l h 内滴加亚油酰氯 0. 229 mo 1 的二氯曱烷 100 m 1溶液， 于 50 °C保温反应 3 h。 反应过程通过 TLC监测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯展开,到 达终点后，搅拌下将反应混合物转至水 200 m 1 和二氯曱烷 200 m 1 的混 合液中，有机相依次用 lmol/L的盐酸溶液 20毫升洗涤两次，再用饱和碳酸 钠溶液洗涤一次， 加入 3克无水硫酸钠干燥 2小时， 然后过滤， 将滤液旋 干， 得粗产物姜黄素亚油酸酯。

将上述粗产物姜黄素亚油酸酯装在硅胶柱中， 使用 7: 1的石油醚和氯 仿洗脱， 收集目标产物， 真空干燥得 1.07 - 1.67克终产物姜黄素亚油酸酯。 本实施例中的姜黄素还可以是去曱氧基姜黄素或二去曱氧基姜黄素， 其中加入的原料亚油酰氯还可以是人体所需的棕榈油酸、 油酸、 亚麻酸、 花生四烯酸、 DHA或二十碳五烯酸（EPA )等的酰化物， 其它的不饱和脂 肪酸制备方法同上， 只是在原料的加入量上有区别。

本实施例中的原料亚油酰氯还可以是其他的支链或直链的不饱和脂肪 酸以及含有 1个到多个双键、 双键处于不同的位置及顺序的不饱和脂肪酸， 已通过元素分析、 IR或 FAB-M S 确证其结构， 其结构式如下所示：

实施例 4

本发明的长效姜黄素衍生物，是采用姜黄素类物质与 C1-C50的芳香族 脂肪酸类物质或其酰类发生酯化反应所形成的酯类， 其反应结构式可表示 成如下所示：

通过上述反应所生成的姜黄素芳香基酯， 其制备方法包括如下步骤： 称取 2~4 mmol 姜黄素类物质， 溶解在 50 毫升的二氧六环中， 加入 0.3-0.73克的吡啶， 然后将 3.6〜8.60 mmol的水杨酸或水杨酰氯加入到体系 中， 水水浴反应 2小时， 反应过程通过 TLC监测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯 展开。

上述产物倒入到 40毫升的石油醚中， 过滤将沉淀溶解在 30毫升的乙 酸乙酯中， 用 lmol/L的盐酸溶液 20毫升洗涤两次， 再用饱和碳酸钠溶液 洗涤一次， 加入 3克无水硫酸钠干燥 2小时， 然后过滤， 将滤液旋干， 得 粗产物姜黄素水杨酸酯。

将上述粗产物姜黄素水杨酸酯装在硅胶柱中， 使用 7: 1的石油醚和氯 仿洗脱， 收集目标产物， 真空干燥得 1.07 - 1.67克终产物姜黄素水杨酸酯。

本实施例中的姜黄素还可以是去曱氧基姜黄素或二去甲氧基姜黄素， 其中加入的原料水杨酸或水杨酰氯还可以是其它的芳香族脂肪酸或其酰类， 制备方法同上， 只是在原料的加入量上有区别。

本实施例制备的姜黄素水杨酸酯， 通过紫外吸收检测、 红外吸收检测 或核磁共振检测，确证结构正确。

通过上述实施例 1 - 6可知， 本发明的姜黄素衍生物是由姜黄素类物质 与 C1-C50的饱和脂肪酸类或其酰类、 C1-C50的不饱和脂肪酸类或其酰类 以及 C1-C50的芳香族脂肪酸类或其酰类物质酯化反应所得。酯化后的姜黄 素进入体内将被分解为酯和姜黄素两部分， 酯进入氧化途径代谢， 姜黄素 可以发挥药效作用， 酯化后的姜黄素在酯溶性上要强于单纯的姜黄素类物 质， 同时可达到维持药效的目的。 本发明的姜黄素衍生物与现有技术的姜 黄素类物质一样医药用途广泛， 且其緩释效果又优于姜黄素， 其可用于治 疗抑郁症、 癌症、 肝纤维化或慢性肾功能衰竭等病症。 以下通过动物实验 证明本发明的姜黄素衍生物的医药用途及其药学效果。

为了进一步考察本发明按照上述制备方法所获得的姜黄素衍生物的长 效性及抗抑郁作用， 本发明人进行了多种动物实验， 其中包括小鼠血浆中 姜黄素的测定、 小鼠急性抗抑郁实验、 大鼠慢性应激抗抑郁实验、 大鼠糖 水偏爱实验及血清学检测。 实脸结果表明该姜黄素衍生物保持了原有的姜 黄素药效作用， 克服了姜黄素作用时间短的缺陷， 延长了药物作用时间， 达到了预期的效果。 实验方案和结果如下：

实验例 1 小鼠血浆中姜黄素的测定

小鼠给药方式： 皮下注射， 给药剂量： 100mg/kg体重， 取样： 给药后 分别于 5min 、 10min、 30min 、 45min、 lh 、 1.5h、 2h、 6h及第 2、 3、 4、 5、 6、 7天小鼠摘眼球取血， 每个取血点 6只小鼠， 将血液置于涂有肝素的 采血管中， 样品离心后取上清 0.2ml， 乙酸乙酯萃取两次， 冷冻真空抽干， 曱醇溶解至 0.2ml， 用于 HPLC测定。

标准曲线的制备： 取 0.5mg左右姜黄素， 加入一定量的花生油使其浓 度为 0.5mg/ml。 取空白血浆， 精密加入不同浓度的姜黄素。 按血浆样品制 备方法一起制备标准品。

姜黄素 HPLC-MS/MS测定方法： 谱条件： 色谱柱： Waters XTrra C18 反相柱（2.1 x 150 mm, 5 μπι ); 流动相： 乙腈比 0.1%甲酸水溶液（ 97:3 , ν/ν )； 流速： 300 μΐ/min; 柱温： 40 °C ; 进样量： 20 μ1。 质谱条件： ESI离 子源， 负离子检测， Curtain Gas (CUR): 10 L/min, Collision Gas(CAD): medium, lonSpray Voltage(IS): - 4500 V ， Temperature(TEM): 500 。C, Ion Source Gas 1(GS1): 40 L/min, Ion Sourse Gas 2(GS2): 40 L/min。 选择性多反 应监测 （MRM )， 用于定量分析的离子反应及对应 Declustering Potential (DP)、 Collision Energy (CE) 、 Entrance Potential (EP)分别为 m/z 367.1—216.9, DP: - 50 V, CE: - 15 V, EP: - 6 V。

如图 4所示， 小鼠给药后分别于 5min 、 10min、 30min 、 45min、 lh 、 1.5h、 2h、 6h及第 2、 3、 4、 5、 6、 7天小鼠摘眼球取血， HPLC-MS/MS 法姜黄素在血浆中的含量。 如图 4所示， 通过一次性给药后， 在第一天血 浆中姜黄素出现峰值， 之后进入平緩期一直持续到第 7天， 仍然能够在小 鼠体血浆内检测的姜黄素。

实验例 2 急性抗抑郁作用实验

2.1小鼠悬尾实驺

请参阅图 5所示， 实验分 3个组（每组 24只雄性 ICR小鼠）： 对照组、 姜黄素组（ 10mg/kg )、 长效姜黄素组（ 18.4mg/kg，一次性给入 20天的量） 分别于给药后 3天、 7天和 14天进行悬尾实验， 姜黄素组不参与第 14天的 实验。 距小鼠尾尖部末梢约 lcm的部位用胶带粘在特制铁架台上， 动物距 离地面高度为 50cm。 观察 6min内实验动物行为， 并记录最后 4min内小鼠 的累计不动时间。

小鼠悬尾实验显示， 给药后第 3天、 第 7天 10mg/kg的姜黄素剂量对 减少悬尾累计不动时间没有显著性差异， 18.4mg/kg的长效姜黄素剂量与对 照组相比， 给药 3天后小鼠累计不动时间减少了 50.7 %， 给药 7天后小鼠 累计不动时间减少了 59.5 % ,给药 14天后小鼠累计不动时间减少了 31.8 %， 与对照组相比， *P<0.05, ** Ρ<0·01 , *** Ρ<0.001。

2.2 小鼠强迫游泳实验

请参阅图 6所示， 实验分 3个组（每组 24只雄性 ICR小鼠）： 对照组、 姜黄素组（ 10mg/kg )、 长效姜黄素组（ 18.4mg/kg，一次性给入 20天的量） . 分别于给药后 3天、 7天和 14天进行强迫游泳实验， 姜黄素组不参与第 14 天的实验。

正式测试前 24小时， 将小鼠置于水深 10cm的玻璃圓缸（高 25cm， 直 径 10cm ) 内， 水温 24士 1 °C， 作强迫游泳训练 15分钟。 24小时后， 再次将 小鼠置于水深 10cm的玻璃圓缸内强制游泳 6 min, 观察并记录最后 4分钟 内小鼠的累 不动时间； 当 鼠停止挣扎： 浮在水中保持不动， 或仅做一 给药后第 3天、第 7天小鼠强迫游泳结果显示， 10mg/kg的姜黄素剂量 对减少强迫游泳实验的累计不动时间没有显著性差异， 18.4mg/kg 的长效 姜黄素剂量与对照组相比， 给药 3天后小鼠累计不动时间减少了 62.1 % , 给药 7天后小鼠累计不动时间减少了 74.7 %， 给药 14天后小鼠累计不动时 间减少了 37.8 % , *P<0.05, ** P<0.01 ， *** P<0.001。

2.3 小鼠脑内单胺及 ^代谢产物含量测定

给药后第 3、 7天（长效姜黄素）， 将小鼠快速断头处死， 在水上迅速 分离出海马， 称重后放入 Eppendorf管中， 置于 -80°C冰箱中保存。

每 lOOmg脑组织中加入 200μ1冰冷 Α液（ 0.4mol/L HCLO4 )，冰浴中超 声匀浆， 4°C避光静置 60min, 离心 20min(12,000rpm， 4°C), 取上清液， 加 入半量体积的 B 液（0.2mol/L 拧檬酸钾， 0.3mol/L K₂HP0₄和 0.2mol/L EDTA )，涡旋混匀 10 min, 4°C避光静置 60 min,再次离心 20 min( 12，000rpm， 4°C ), 取上清液进行单胺测定。

脑组织中 5-HT、 NA、 DA、 5-HIAA和 DOPAC的含量采用高效液相电 化学法测定。 样品上清液过滤（孔径 0.22μπι )处理后， 取 20μ1自动进样。 色语柱为 Diamonsmm C18 (150x4.6mm I.D., 5μηι),流动相组成： 125mmol/L 枸橼酸-柠檬酸钠緩沖液（ p H=4.3 )， 0.1mmol/L EDTA, 1.2mmol/L辛烷 基磺酸钠， 16%曱醇。 流速： 1.0ml/min。 检测器工作电压分别为： 50， 100, 200, 300, 400和 500mV。 脑组织中单胺及其代谢产物的含量以 ng/g湿组 织重表示。

如表 1所示， 长效姜黄素（ 18.4mg/kg ) 于第 3、 7增加海马 5-HT的含 量； 去甲肾上腺素水平也明显升高； 海马的 5-HT转换率在长效姜黄素组有 下降趋势。

表 1 长效姜黄素对小鼠海马区 5-HT, NA, DA及其代谢产物的影响 ( n=12 , mean士 S.E.M )

剂 量 海马 （ng/g)

分组

数 (mg kg) 5-HT 5-HIAA 5-HIAA/5-HT Noradrenaline Dopamine DOPAC

532.4±23.6 177.9±14.9 0.34±0.03 245.2± 19.5 18.6±4.6 12.3±2.2 对照组

534.0±26.0 177.1±14.0 0.32±0.02 241.5±28.4 18.9±1.7 12.9±2.7

10 541.2±31.8 175.7±13.8 0.32±0.03 245.6±12.2 19.1±3.6 12.4±1.2 姜黄素

10 534.6±28.9 179.2±14.9 0.33±0.03 246.6±1 1.2 18.8±5.4 1 1.9±1.8 长效姜 18.4 713.1±19.2** 183.4±14.2 0.25±0.02 369.9±12.3** 20.3±5·9 13.1±2.0 黄素 18.4 725.0±30.4** 186.3±8.4 0.25±0.03 372.2±21.6** 21.2±5.6 14.6±2.1 与对照组相比， * Ρ<0.05, ** Ρ<0.01

实验例 3 大鼠慢性应激抗抑郁作用实验

3.1大鼠慢性应激模型的建立

实验分 6个组（每组 12只 SD雄性大鼠）： 正常对照组、 模型组、 低剂 量组（4.6mg/kg )、 中剂量组 （9.2mg/kg ) 高剂量组 （18.4mg/kg )和阳性 对照组（丙咪嗪）。 给药组和模型组每 7天给药一次， 每次给药量为 7天的 总量，丙咪嗪每天给药一次。不同剂量的长效姜黄素（4.6， 9.2和 18.4mg/kg ) 皮下一次给药 7天的量， 丙咪嗪 ( 10mg/kg )腹腔注射 21天， 末次给药后 30分钟（丙咪嗪）开始实验。 正常对照组对大鼠进行正常饲养， 除了称量 体重， 测试体温和糖水测试， 不进行任何刺激， 其他各组每组都进行同等 类型， 同等强度的刺激， 实验过程中刺激种类的实施顺序采用不可预知的 方式进行， 并且同种刺激强度逐次递增。

慢性应激时程共计 20天， 每日一次， 时间： 上午 9: 00 ~下午 2: 00 之间， 应激方案如下： 高速水平震荡 45min; 夹尾（距尾根 lcm ): lmin; 禁水 24h ； 制动 1.5h; 禁食 24h ； 水水刺激（水温 10°C ) 5min; 足底电击 ( 1mA, 时程 ls， 1次 /min ): 30 min; 换笼孤养 24 h; 制动 2h; 夹尾（距尾 根 1cm ): lmin; 禁水 24h ； 高速水平震荡 1.5h; 禁食 24h ； 夹尾（距尾 才艮 lcm ): lmin; 足底电击（ lmA， 时程 ls， 1次 /min ): 40 min; 水水刺激 5分钟； 换笼孤养 24 h; 高速水平震荡 60min; 足底电击 （ lmA， 时程 ls， 1次 /min ): 50 min; 禁水 24h ； 制动 2.5h; 换笼孤养 24 h。

3.2大鼠体温测定

用数字测温仪前端蘸取液体石蜡顺滑插入大鼠肛门内 1cm左右， 读取 两次数据， 取平均值。

21 天慢性应激后， 与正常大鼠相比， 模型组大鼠体温明显降低， 有极 显著性差异;长效姜黄素给药组大鼠各个剂量都有一定程度的增加， 和应激 对照组相比， 都有极显著性； 丙咪嗪对应激大鼠体温没有明显影响， 如表 2 所示。

表 2 长效姜黄素对慢性应激鼠体温的影响 （°C) (n=10-12, mean士 S.E.M.).

分组 剂量 (mg/kg) 应激前体温 应激后体温

对照组 36.99±0.136 37.05±0.068

模型组 36.93±0.140 36.46±0.122^###

长效姜黄素组 4.6 37.06±0.125 37.40±0.079***

9.2 37.06±0.158 37.45±0.074'"

18.4 37.00±0.122 37.48±0.088"*

丙咪。秦组 10 36.83±0.142 36.34±0.083

与对照组相比 ^# P<0.05， 麵 P<0.001. *P<0.05, 与模型组相比" P<0.01 and *** P<0.001,

3.3大鼠糖水测试

实验前在安静的房间内， 训练动物适应含糖饮水， 每笼同时放置 2个 水瓶， 第 1个 24小时， 2瓶均装有 1%的糖水， 随后 24小时， 1个水瓶装 1%蔗糖水， 1个瓶装纯水，接下来 23小时禁水， 进行动物的基础糖水 /纯水 消耗实验， 同时给予每只大鼠事先定量好的 2瓶水： 1瓶 1%蔗糖水， 1瓶 纯水， 1小时后， 取此 2瓶水并称量， 计算动物的总液体消耗、 糖水消耗、 纯水消耗， 糖水偏爱性 =糖水消耗量 /总液体消耗量 χ 100%， 在连续给予姜黄 素 14天后进行实验。

应激开始前进行的糖水测试表明， 各组之间对糖水的偏爱没有显著差 异， 应激结束后测试结果显示， 与正常对照组相比， 模型组大鼠对糖水的 偏爱性明显降低， 两者之间有极著显著性差异， 长效姜黄素给药组的中剂 量和高剂量对糖水的偏爱有明显的改善作用，与模型对照组有显著性差异， 长效姜黄素给药组的低剂量和丙咪嗪对应激大鼠的糖水偏爱没有影响，如表 3所示。 表 3糖水测试结果 (％) (n=10-12, mean士 S.E.M.).

组别 剂量 (mg/kg) 应激前糖水量（ml ) 应激后糖水量 (ml) 对照组 73.3±8.6 82.9±4.3 模型组 73.3±8.3 59.4±4.8 长效姜黄素组 4.6 60.2±9.2 54.1±4.7

9.2 60.4±9.2 72.8±3.

18.4 66.8±8.6 71.6±2.3* 丙咪 ^σ秦组 10 74.8±7.8 67.5±5.0 与对照组相比. ^# ΡΟ.05, 羅 Ρ<0.001， 与模型组相比， *Ρ<0.05， ** Ρ<0.01 and Ύθ.001

3.4大鼠强迫游泳实验

请参阅图 7所示， 正式测试前 24小时， 将大鼠置于水深 23cm的玻璃 圆缸（高 40cm， 直径 18cm ) 内， 水温 24士 1 °C , 作强迫游泳训练 15分钟。 在末次给药后 30min (丙咪嗪）， 再次将大鼠置于水深 23cm的玻璃圆缸内 强迫游泳 6 min， 观察并记录 4分钟内大鼠的累计不动时间。 当大鼠停止挣 扎， 浮在水中保持不动， 或仅做一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上 的时间视为不动时间。

大鼠强迫游泳实验显示， 4.6， 9.2, 和 18.4mg/kg的长效姜黄素剂量依 赖性减少强迫游泳实验的累计不动时间， 与模型对照组相比， 大鼠累计不 动时间分别减少了 37.6 % , 49.4 %和 58.9 %。 长效姜黄素在强迫游泳模型中 抗抑郁作用与经典抗抑郁药丙咪嗪相似（10mg/kg )。 丙咪嗪强迫游泳实验 中累计不动时间的抑制百分率是 40.5 %，与对照组相比， *P<0.05，** P<0.01 和 *** p<o.001。

3.5血清皮质酮含量测定

本实验采用竟争法检测血清中皮盾酮含量， 其原理是标本中的抗原和 一定量的酶标抗原竟争与固相抗体结合。 标本中抗原量含量愈多， 结合在 固相上的酶标抗原愈少， 最后的显色也愈浅。

21 天应激实验结束后次日断头杀鼠， 取全血 5 ~ 10ml， 其中一部分全 血室温放置 20min后离心： lOOOrpm, lOmin, 分离血清， -80°C冻存备用。 采用血清皮质酮试剂盒检测。

模型对照组大鼠血清皮质酮含量明显高于正常组大鼠， 两者有显著性 差异， 长效姜黄素给药组及丙咪嗪组使皮质酮含量明显下降， 与模型对照 组相比差异有显著性。 如表 4所示。 表 4 长效姜黄素对血清皮质酮的影响 (n=6， mean±S.E.M.)- 组别 剂量 (mg/kg) 血清皮质酮 （nmol/L) 对照组 219.4±12.4

模型组 314.8士25.0^#

长效姜黄素组 4.6 239.5±33.7*

9.2 222.9±30.6*

18.4 199.6±28.0**

丙咪嗪组 10 137.0±15.3*"

与对照组相比 ^# P<0.05，麵 P<0.001， 与模型组相比 *P<0.05， ** P<0.01和 P<0.001

结果

通过对小鼠一次性给药， 小鼠体内持续至第 7天仍然可以检测到姜黄 素， 表明该药物在小鼠体内持续存在， 达到了预期的緩释目的。 两种绝望 模型急性给药， 与模型组相比， 姜黄素组在 3天、 7天后累计不动时间无显 著差异， 但长效姜黄素组在 3、 7、 14天后累计不动时间减少， 并具显著差 异。 小鼠单胺递质的测定结果显示， 一次给药在第 3、 7 天长效姜黄素组海 马区增加 5-HT的含量。 表明一次性给以长效姜黄素衍生物后， 抗抑郁作用 仍可维持至少在一周以上。 在大鼠慢性应激模型中， 长效姜黄素慢性给药 每 7天一次至 21天， 能明显减少游泳累计不动时间， 逆转糖水偏爱实验味 觉快感下降趋势。 应激大鼠血清中皮质酮含量明显增加， 给予长效姜黄素 后皮质酮含量明显下降， 表明在大鼠应激模型中长效姜黄素衍生物具有持 续的抗抑郁作用。

通过对不同的动物模型抗抑郁作用的研究， 长效姜黄素衍生物保留了 姜黄素固有的抗抑郁药效， 同时也起到緩释， 延长药效的效果， 具有良好 的临床应用前景。

以下实验例 4~9将介绍本发明的长效姜黄素衍生物在抗肿瘤症药物中 的动物实验及结果分析。

实验例 4荷瘤小鼠 S-180抗肿瘤实脸

ICR雄性小鼠， 分为 5组（n=15， 每组）， 长效姜黄素给药组分高、 中、 低三个剂量； 阳性对照组给予 5-FU; 试验时每只小鼠腋下接种 S-180肉瘤 细胞（ x l0⁷ )。 次日开始给药， 长效姜黄素组一次给予 7 天的药量， 5-FU 每天一次给药。 7天后， 小鼠断头处死， 取瘤， 称体重、 瘤重。

请参阅图 8所示， 长效姜黄素给药组与对照组相比瘤重 /体重存在显著 性差异；肿瘤抑制率低剂量组为 28.5%,中剂量组为 57.8%高剂量组 50.1%, 5-FU组为 55.8%。

实验例 5荷瘤小鼠 HCT116抗肿瘤实验

ICR雄性小鼠， 分为 5组（n=15， 每组）， 长效姜黄素给药组分高、 中、 低三个剂量； 阳性对照组给予 5-FU; 试验时每只小鼠腋下接种 HCT116细 胞（ χ 10⁷ )。 次日开始给药， 长效姜黄素组一次给予 7天的药量， 5-FU每 天一次给药。 7天后， 小鼠断头处死， 取瘤， 称体重、 瘤重。

请参阅图 9所示， 长效姜黄素给药组与对照组相比瘤重 /体重存在显著 性差异；肿瘤抑制率低剂量组为 29.6%，中剂量组为 58.4%高剂量组 49.3%， 5-FU组为 52.8%。

实验例 6长效姜黄素对肿瘤细胞凋亡的影响实验

ICR雄性小鼠（n=15 ) 长效姜黄素组一次性给入 7天的药量； 阳性对 照组为 5-FU, 每天一次给药； 对照组给予溶剂； 试验时每只小鼠腋下接种 S180细胞（ x l 0⁷ )。 7天后， 小鼠断头处死， 取瘤。 制备瘤液， 乙醇固定后 流式细胞计测定细胞周期。

请参阅图 10 所示， 长效姜黄素组促进了细胞的凋亡， 其凋亡水平为 44.7, 对照组肿瘤细胞凋亡水平为 22.9， 5-FU组为 29.1 (同时参阅表 5 )。

表 5肉瘤细胞周期测定结果

实脸例 7荷瘤小鼠生存实验

ICR雄性小鼠，分为 2组（ n=30，每组），试验时每只小鼠腋下接种 S-180 肉瘤细胞（ x l 0⁵ )， 次日开始给药， 长效姜黄素组一次给予 7天的药量， 对 照组给予溶剂， 并记录下各组的生存率。

请参阅图 11 所示， 对照组中位生存时间为 13.5 天， 95%可信区间为 9.5 14.7天，长效姜黄素组中位生存时间为 17.5天， 95%可信区间为 12.8 ~ 20.2天， Kaplan-meier分析显示两组之间生存期的差别具有统计学意义。

实验例 8长效姜黄素对肿瘤细胞抑制作用实猃

将稳定传代的肿瘤细胞 Hela细胞、 肾癌细胞 7860、 乳腺癌细胞、 胃癌 细胞、 直肠癌细胞、 肺癌细胞、 肝癌细胞 HepG2、 前列腺癌细胞、 食管癌、 肉瘤细胞、 神经胶质瘤细胞、 黑色素瘤细胞、 淋巴瘤细胞、 膀胱癌细胞在 显微镜下计数（ X 10⁴ ), 于 96孔板 C0₂饱和水汽下培养 24h,分别加入长效 姜黄素 （终浓度 25μΜ )及对照溶剂， 72h后 ΜΤΤ法检测长效姜黄素对肿 瘤细胞的抑制作用。 计算抑制率。

请参阅图 12 ( a )、 12 ( b )所示， 本发明的长效姜黄素衍生物对十四种 细胞都产生抑制作用 （P<0.05 ), 不同的细胞种类抑制率各不相同， 详细结 果如下表 6所示。

表 6长效姜黄素对肿瘤细胞的增值抑制作用 （ PO.05 ) 细胞种类 抑制率(％)

Hela细胞 37.3 ± 2.4

肾癌细胞 7860 60.6 ± 1.8

乳腺癌细胞 BT474 52.7 ± 1.6

直肠癌细胞 HCT1 16 58.9 ± 2.1

胃癌细胞 MGC80-3 42.6 ± 1.7

肺癌细胞 A549 35.9 ± 1.2

肝癌细胞 HepG2 43.7 ± 1.4

前列腺癌细胞 39.7 ± 1.3

食管癌细胞 35.5 ± U

肉瘤细胞 45.5 ± 1.6

神经胶质瘤细胞 58.8 ± 1.5

黑色素瘤细胞 49.9 ± 2.0.

淋巴瘤细胞 55.8 ± 1.7

膀胱癌细胞 55.2 ± 1.0

从图 12 ( a )、 12 ( b )及表 6可以看出， 本发明的长效姜黄素衍生物对 上述不同肿瘤细胞均产生显著的抑制作用， 且抑制率都达到了 35.5%以上， 其对肾癌的抑制率达到最高值， 为 60.6%。

长效姜黄素衍生物用于制备成医药上的任何可用剂型的实施例：

实施例 1

用化学合成方法制备长效姜黄素， 加入溶剂采用常规方法制备的针剂。 用法用量： 肌注每 3-7日注射一次长效姜黄素 100-500mg。

实施例 2

用化学合成方法制备长效姜黄素， 加入赋形剂环糊精， 采用常规方法 压片， 制成片剂或颗粒剂。

用法用量： 口服， 每 3-7日服用长效姜黄素 100-500mg。

实施例 3

按照上述实施例的方法制备的长效姜黄素， 加入水及适量增溶剂如聚 乙二醇溶解， 采用常规方法制成规格为 20mg/ml的长效姜黄素口服液。

用法用量： 口服， 每 3-7日服用长效姜黄素 100-500ml。

实施例 4

按照上述实施例的方法制备的长效姜黄素， 软胶嚢材质选用明胶和山 梨醇， 制备成规格为 20mg/粒的长效姜黄素胶囊。

用法用量： 口服， 每 3-7日服用长效姜黄素 100-500mg。

长效姜黄素衍生物用于制备食品、 饮料或保健品中的实施例：

实施例 5

在 50kg面粉中加入 1-5克的长效姜黄素及适量营养素和添加剂， 做成 抗抑郁或抗肿瘤功能的面条或饼干。

实施例 6

在 50kg纯净水中加入 1-5克的长效姜黄素及适量橙汁或菠萝、 芒果和 添加剂， 做成抗抑郁或抗肿瘤功能的软饮料。

实施例 7

在 1克高钙片或 lml口服液中加入 10-50mg长效姜黄素做成抗抑郁或 抗肿瘤的保健品。

以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式 上的限制， 虽然本发明已以较佳实施例揭露如上， 然而并非用以限定本发 明，任何熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明技术方案范围内，当可利 用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但 凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、 等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

工业应用性

本发明的长效姜黄素衍生物是将姜黄素类物质进行酯化反应所得的 酯， 其緩释效果优于单纯的姜黄素类物质释放效果， 这使得姜黄素在体内 的利用度大大提高， 同时提高了姜黄素的药物活性， 具有较高的医用价值。 本发明的姜黄素衍生物与现有技术的姜黄素类物质一样医药用途广泛， 其 可用于治疗抑郁症、 肿瘤症、 肝纤维化或慢性肾功能衰竭等病症。

Claims

权 利 要 求

1、 一种长效姜黄素衍生物， 其特征在于其具有下列结构式:

H

其中：

Rl和 R2为氢或曱氧基；

R3和 R4各自独立的选自 C1-C50的烷基。

2、 根据权利要求 1所述的长效姜黄素衍生物， 其特征在于： 其中该长 效姜黄素衍生物的碳 4', 4"位的基团为 C1-C50的饱和脂肪酸类或其酰类、 芳香族脂肪酸类或其酰类与姜黄素类物质的碳 4'，4"位羟基各自独立的发生 酯化反应所形成的酯类。

3、 根据权利要求 1所述的长效姜黄素衍生物， 其特征在于： 其中该长 效姜黄素衍生物的碳 4', 4"位的基团为 C1-C50的不饱和脂肪酸类或其酰类、 芳香族脂肪酸类或其酰类与姜黄素类物质的碳 4',4' '位羟基各自独立的发生 酯化反应所形成的酯类。

4、 根据权利要求 2或 3所述的长效姜黄素衍生物， 其特征在于： 所述 姜黄素类物质是姜黄素、 去甲氧基姜黄素或双去曱氧基姜黄素。

5、 根据权利要求 3所述的长效姜黄素衍生物， 其特征在于： 所述不饱 和脂肪酸类包括棕榈油酸、 油酸、 亚油酸、 亚麻酸、 花生四烯酸、 二十碳 五烯酸或二十二碳六烯酸。

6、 根据权利要求 1或 2或 3或 5所述的长效姜黄素衍生物， 其特征在 于： 所述 R3和 R4各自独立的为癸烷基、 亚油酸基或水杨酸基。

7、 一种制备如权利要求 1所述的长效姜黄素衍生物的方法， 其特征在 于其包括以下步骤：

1 )称取 2~4 mmol姜黄素类物质， 溶解在二氧六环中， 加入 0.3~0.73 克的吡啶， 然后将 3.6~8.60 mmol的 C1-C50的脂肪酸类、 不饱和脂肪酸类 及芳香族类或其酰类物质逐滴加入到体系中， 水水浴反应 1~2小时；

2 )上述产物倒入到石油醚中过滤，将沉淀溶解在乙酸乙酯中，用 lmol L 的盐酸溶液洗涤两次， 再用饱和碳酸钠溶液洗涤一次， 加入无水硫酸钠干 燥， 然后过滤， 将滤液旋干， 得粗产物姜黄素烷基酯；

3 )将上述粗产物装在硅胶柱中， 使用 7: 1 的石油醚和氯仿洗脱， 收 集目标产物， 真空干燥得终产物姜黄素烷基酯。

8、根据权利要求 7所述的长效姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于： 所述冰水浴反应过程通过薄层层析法检测， 3: 1的氯仿和乙酸乙酯展开。

9、根据权利要求 7所述的长效姜黄素衍生物的制备方法，其特征在于： 所述的脂肪酰类、 不饱和脂肪酰类或芳香族酰类物质各自分别为癸酰氯、 亚油酰氯或水杨酰氯。

10、 根据权利要求 7所述的长效姜黄素衍生物的制备方法， 其特征在 于： 姜黄素类物质是姜黄素、 去曱氧基姜黄素或双去曱氧基姜黄素。

11、 一种如权利要求 1或 2或 3或 5或 7所述的长效姜黄素衍生物在 制备抗抑郁症药物中的应用。

12、 根据权利要求 11所述的应用， 其特征在于所述的长效姜黄素衍生 物包含有药学可接受的载体， 如赋形剂和添加剂、 香味剂制成各种剂型， 包括散剂、 片剂、 微丸、 胶嚢、 微嚢、 颗粒剂或液体衍生物。

13、 根据权利要求 11所述的应用， 其特征在于所述的长效姜黄素衍生 物在制备抗抑郁症的饮料、 食品、 食品添加剂或者保健品中的应用。

14、 一种如权利要求 1或 2或 3或 5或 7所述的长效姜黄素衍生物在 制备抗肿瘤症药物中的应用。

15、 居权利要求 14所述的应用， 其特征在于所述的长效姜黄素衍生 物包含有药学可接受的载体， 如赋形剂和添加剂、 香味剂制成各种剂型， 包括散剂、 片剂、 微丸、 胶嚢、 微嚢、 颗粒剂或液体衍生物。

16、 根据权利要求 14所述的应用， 其特征在于所述的长效姜黄素衍生 物在制备抗肿瘤症的饮料、 食品、 食品添加剂或者保健品中的应用。

17、 根据权利要求 16所述的应用， 其特征在于所述的肿瘤症包括： 白 血病、 宫颈癌、 肾癌、 乳腺癌、 胃癌、 结肠癌、 肺癌细胞、 肝癌、 前列腺 癌、 食管癌、 骨髓瘤、 神经胶质瘤、 黑色素瘤、 淋巴瘤、 膀胱癌、 腺癌、 卵巢癌或皮肤癌。