JP2009539780A - ２０（ｓ）−プロトパナキサジオールの抗うつ薬製造への使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの抗うつ薬製造への新規の使用を提供する。薬理試験研究の結果が示すように、本化合物はうつ病モデルラットの脳内のＮＥ、５−ＨＴ、ＨＡＶの量を明らかに増加させ、５−ヒドロキシトリプトファンの振戦作用およびレボドパの行動影響作用を明らかに増強することができ、５−ＨＴおよびＮＡの再取り込みを阻害することができる。
Description
本発明は、医薬分野に関する。具体的には、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの抗うつ薬製造への使用に関する。
うつ病は、有病率、罹患率ともに高く、人類の健康を脅かす疾病である。症状は主として憂うつ感として現れ、精神疾患の中では気分障害に分類される。うつ病の症状は、気分の落ちこみ、思考力の低下、気力の減退の「３つの低下」と総称される。中でも中心的な症状は気分の落ちこみであり、患者は憂うつ感、悲哀感にとらわれ、それが元となって絶望感、無力感および無価値感を抱くようになり、また興味や喜びを感じなくなる。その心理的な症状としては、焦燥感、罪責感、妄想や幻覚、注意力および記憶力の低下、自殺念慮などがある。また、身体的な症状としては、睡眠障害、食欲減退、体重減少、性欲減退、倦怠感などがある。
うつ病の発病は、一般に比較的緩慢で、数週間から数ヶ月まで様々である。少数ではあるが、心理社会的要因に誘発された場合は、比較的急激に発病する。通常、最初は不眠、食欲不振、意気消沈、仕事の能率の低下などの症状が現れ、その後、抑うつ感、失望感、さらには気力喪失、自殺念慮などの症状がしだいに顕著になってくる。
欧米の先進国では、うつ病は一般に広くみられる精神疾患となっており、うつ病の生涯罹患率は６〜８％であるが、人口の老齢化が進むにつれて、６０才以上の人口グループにおける罹患率は２０〜５０％にまで高まっている。調査によれば、米国では、うつ病の罹患率は心臓病に次いで２番目に高く、その治療コストは年間約４４０億ドルに達するという。うつ病はまさに世界的に深刻な問題となっている。
中国でも、生活のテンポが速まるとともに様々なストレスが増大し、精神疾患の罹病率は年々上昇する傾向にある。うつ病の診断および治療は各地の地域診療所や一次医療機関の医師の間でもますます重視され、全国で多くの患者が診断、治療を受けるようになった。現在、うつ病患者はすでに精神科の外来・入院患者総数の２０〜３０％を占めており、また専門家の予測によれば、中国のうつ病患者のうち受療患者の割合は、２０１０年には現在の２５％から４０％にまで上昇するという。患者のうち女性の数が男性を上回るが、これは女性の方が生活の上で負担が重く、ストレスを受ける時間が長いことに関係するとみられる。うつ病は発病率が高いにもかかわらず、その発病の原因は現在でも十分に明らかにされていないが、社会心理的な要因、遺伝、体内の生化学的変化および神経内分泌が関与していると考えられる。中国の抗うつ薬の市場規模はまだ小さいが、急速に拡大しており、大きな潜在力を有している。
現在、うつ病の治療方法は、依然として主に抗うつ薬の服用である。１９５０年代に最初に開発された、うつ病治療薬はモノアミンオキシダーゼ阻害薬であったが、これは強い毒性・副作用を有するため、三環系抗うつ薬がこれに取って代わった。そして現在では、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩｓ）が主流薬となっている。第２世代の抗うつ薬は、第１世代の抗うつ薬と比べ、安全性が高く、忍容性に優れている。これら三環系抗うつ薬には、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、クロミプラミン、デシプラミン、プロトリプチリンなどがある。治療効果は認められているものの、安全性で劣り、過量に服用した場合には致死率が高い。有害事象も多く、その主なものとしては心血管毒性、過度の鎮静、抗コリン性副作用などがある。また、これらの薬剤は効き目が遅く、しかも毎日何回も服用する必要があるため、患者の服薬遵守性が低い。選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩｓ）は、患者の忍容性が良好で、副作用、特に心血管および抗コリン性の副作用が軽度であるが、胃腸症状および性機能障害がやや顕著に現れる。治療にパロキセチンを用いたときには鎮静、口の渇き、便秘などの症状が多くみられ、フルオキセチンでは焦燥感、不安、食欲不振、不眠などの症状が比較的多くみられ、セルトラリンは下痢を引き起こすことが多い。現在のところ、副作用が軽度で、他の薬剤と併用しても副作用が少なく、しかも多量に服用しすぎても危険の少ない、理想的な抗うつ薬はまだ開発されていない。
現在最も多く使用されているのはＳＳＲＩ系の薬剤であるが、服用後に胃腸の異常を訴える患者が増えており、睡眠障害および性機能障害もＴＣＡ系薬剤よりさらに多く引き起こされている。中でも特に重要視されているのが「５−ＨＴ症候群」であり、これは脳幹の５−ＨＴ１Ａ受容体の過剰な刺激が原因で生じるものであって、臨床的症状としてはミオクローヌス、高熱、高血圧があり、死亡の危険性もある。さらに、一部の抗うつ薬は患者の自殺念慮を強めることも報告されている。したがって、自然由来成分による安全で高い薬効を有する天然抗うつ薬の開発が急がれている。
プロトパナキサジオールは、ジオール系サポニンのアグリコンであり、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールと２０（Ｒ）−プロトパナキサジオールとがある。これらは互いに鏡像異性体であり、次のような構造を有する。
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール ２０（Ｒ）−プロトパナキサジオール
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、重要なサポニンのアグリコンの一つである。（特許文献１）、（特許文献２）においてその抗腫瘍活性について開示されているが、その抗うつ活性の面については本発明の以前には国内外ともにいかなる報告もなされていない。
本発明の目的は、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの抗うつ薬製造における使用を提供することである。
本発明者らは、プロトパナキサジオールを含有するトチバニンジン属植物または葉のトータルサポニンエキスおよびアマチャヅル属植物のアマチャヅルエキスを原料として、有機溶剤中で酸化分解反応を行い、カラムクロマトグラフィーにより精製し、高純度のプロトパナキサジオールを高い効率で得ることに成功した。この方法は、中国において特許を取得済みである（中国特許第２００４１００１８０３８８号明細書）。
本発明は、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールのうつ病治療薬の製造への使用である。
上記の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、ヒトを含む哺乳動物のうつ病治療薬の製造に使用される。
ここで、本発明に記載のうつ病としては、気分の落ち込み、興味の喪失、喜びの喪失を主徴とし、その心理的症候群には焦燥感、罪責感、精神病的症状（妄想および幻覚）、認知症状（注意力および記憶力の低下）、自殺念慮および行為、精神運動性抑制や激越などがあり、その身体的症候群には睡眠障害、食欲異常、性機能減退、気力喪失、朝重く夜軽い日内変動などが含まれる。
うつ病は、国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ−１０）によれば、うつ病エピソード、反復性うつ病性障害、双極性感情障害および持続性気分障害に分類される。このうちうつ病エピソードには、軽症、中等症、重症の３つのタイプがある。また、感情障害の基本的症状に基づいた分類では、うつ病は抑うつ性障害と双極性障害とに分けられる。
感情障害の分類について研究を行う過程でいくつかの概念が生まれており、この中には、正式な診断分類体系からは除外されているものの、臨床においてはなお広く使用されているものも一部ある。これらの概念には、大うつ障害、気分変調性障害、気分循環障害、小うつ障害、反復性短期抑うつ障害、月経前不快気分障害、産後抑うつ障害、統合失調症後の抑うつ障害、季節性感情障害、双極性Ｉ型障害、双極性ＩＩ型障害、非定型うつ病、抑うつ性昏迷、急速交代型双極性障害など、および単極性／双極性障害、内因性／反応性うつ病、精神病性／神経性うつ病、原発性／続発性うつ病、仮面うつ病、重複うつ病、更年期うつ病、抑制型／激発型うつ病、身体的疾病の併発による感情障害、薬物誘発の感情障害がある。
上記の「身体的疾病の併発による感情障害」における身体的疾病とは、神経系の疾病、心血管の疾病（心筋症、うっ血性心不全、心筋梗塞）、局部的または系統的な腫瘍、感染性疾病、内分泌障害、炎症性疾病、ビタミン欠乏症などをいう。
本発明の目的を達成するために、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを製薬に使用可能な補助材料と混合し、製剤を調製した。
上記薬物の製剤の剤形は、本分野で使用されているどのタイプのものでもよいが、内服剤、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤または顆粒剤が好適である。
上記の「製薬に使用可能な補助材料」も本分野の当業者に既知のものであり、剤形に応じて必要なものを選択し、組み合わせればよい。例えば内服液には、溶剤として水を使用し、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤を組み合わせ、さらに蔗糖などの甘味料を加えてもよい。
製剤中の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの含有率は使用量により決めればよく、例えば単位薬剤量中に１０〜１００ｍｇの活性成分を含有させてもよい。
生理活性アミンは、抑うつ型感情障害と密接な関わりがある。感情障害の患者には生理活性アミンのレベルおよび生理活性アミンの神経経路機能ないし構造に異常が存在する。ノルエピネフリン（ＮＥ）とセロトニン（５−ＨＴ）は感情障害に最も密接に関与していると考えられており、ＮＥおよび／または５−ＨＴの再取り込み阻害剤が抗うつ薬の中心となっている。
一連の薬理、薬効学的試験を実施した結果、本発明の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは抗うつ作用を有することが明らかになった。
うつ病動物モデル試験の結果から、次のことが明らかになった。１）レセルピン誘発眼瞼下垂についてのうつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）は、マウスのレセルピン誘発眼瞼下垂に対し明らかな抑制作用があることが示された。２）レセルピン誘発運動障害についてのうつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）は、マウスのレセルピン誘発運動障害に対して明らかな抑制作用があることが示された。３）マウス尾懸垂法による後天性絶望うつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与は、マウスの尾懸垂における無動時間を明らかに短縮できることが示された。１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）では、マウスの尾懸垂における無動時間を著しくまたは明らかに短縮できることが示された。４）マウス強制水泳法による後天性絶望うつ病モデル試験により、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与は４分間の水泳時間中におけるマウスの累計無動時間を著しくまたは明らかに短縮できることが示された。１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）では、いずれも４分間の水泳時間中におけるマウスの累計無動時間を著しく短縮できることが示された。５）慢性ストレス性うつ病モデルラットによる行動学的試験により、１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、動物の垂直運動の回数を極めて著しく、または著しく増加させることができ、動物の水平運動の回数を著しくまたは明らかに増加できることが示された。６）ピンチ法によるラットのうつ病モデル試験により、次のことが示された。即ち、１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、いずれも動物の垂直運動の回数を極めて著しく増加させ、動物の水平運動の回数を著しく増加させることができる。３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、動物の垂直運動の回数を明らかに増加できる。６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはモデルラットの脳内のＮＥの量を明らかに増加させ、３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはモデルラットの脳内のＮＥ、５−ＨＴ、ＨＡＶの量を明らかに増加させることができる。
抗うつ薬理作用の分析試験の結果、次のことが明らかになった。１５および７．５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、５−ヒドロキシトリプトファンの振戦作用およびレボドパの行動影響作用を明らかに増強することができる。また、１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、それぞれ順に、５−ＨＴおよびＮＡの再取り込みを極めて著しく、著しく、および明らかに抑制することができる。
本発明の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、植物原料に由来し、生産方法は簡単で、生産コストは低廉であるが、確かな治療効果を有しており、抗うつ薬の分野におけるその使用には大きな将来性が期待できる。
後述する本発明の具体的実施例により本発明がいっそう明確に理解されると考えるが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
田七（ノトジンセン）サポニン５．０ｋｇ、ｎ−ブタノール６０ｋｇ、ナトリウムエトキシド６．０ｋｇを反応器に投入して撹拌し、酸素を通気し、反応器内に気泡が連続的に発生する状態に保ち、加温して９５±５℃に制御し、７２時間反応させた後、５０℃まで冷却した。ｎ−ブタノール飽和の水を加えて２回洗浄し（１回目は７０ｋｇ、２回目は３０ｋｇ）、水層を分取して捨て、ｎ−ブタノール層を減圧濃縮により乾燥させ、ｎ−ブタノールを回収した。残渣に５０ｋｇの水を加えて撹拌し、酢酸エチルで３回抽出した（それぞれ２５ｋｇ、１２ｋｇ、および１２ｋｇ）。水層は捨てて酢酸エチル層を合わせ、各回１５ｋｇの飽和食塩水で２回洗浄し、水層を分取して捨てた。酢酸エチル層に３ｋｇの無水硫酸ナトリウムを加え、乾燥した。酢酸エチル層を減圧濃縮により乾燥させ、酢酸エチルを回収し、プロトパナキサジオールの粗抽出物を得た。粗抽出物に酢酸エチル２．０ｋｇを加えて混和し、シリカゲルカラムに注入し、カラムクロマトグラフィーを行った。順に石油エーテル（６０〜９０℃）−酢酸エチル（３：１）２００Ｌおよび石油エーテル（６０〜９０℃）−酢酸エチル（１：１）５００Ｌにより、流速：８±２Ｌ／時間にて溶出し、４．０±０．５Ｌを１画分として、溶出液を収集した。ＴＬＣにより各溶出液の成分を測定し、単一成分溶出液を減圧濃縮し、残渣を７０℃で１６時間真空乾燥し、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを得た。
田七（ノトジンセン）サポニン５．０ｋｇ、ｎ−ブタノール６０ｋｇ、ナトリウムエトキシド６．０ｋｇを反応器に投入して撹拌し、酸素を通気し、反応器内に気泡が連続的に発生する状態に保ち、加温して９５±５℃に制御し、７２時間反応させた後、５０℃まで冷却した。ｎ−ブタノール飽和の水を加えて２回洗浄し（１回目は７０ｋｇ、２回目は３０ｋｇ）、水層を分取して捨て、ｎ−ブタノール層を減圧濃縮により乾燥させ、ｎ−ブタノールを回収した。残渣に５０ｋｇの水を加えて撹拌し、酢酸エチルで３回抽出した（それぞれ２５ｋｇ、１２ｋｇ、および１２ｋｇ）。水層は捨てて酢酸エチル層を合わせ、各回１５ｋｇの飽和食塩水で２回洗浄し、水層を分取して捨てた。酢酸エチル層に３ｋｇの無水硫酸ナトリウムを加え、乾燥した。酢酸エチル層を減圧濃縮により乾燥させ、酢酸エチルを回収し、プロトパナキサジオールの粗抽出物を得た。粗抽出物に酢酸エチル２．０ｋｇを加えて混和し、シリカゲルカラムに注入し、カラムクロマトグラフィーを行った。順に石油エーテル（６０〜９０℃）−酢酸エチル（３：１）２００Ｌおよび石油エーテル（６０〜９０℃）−酢酸エチル（１：１）５００Ｌにより、流速：８±２Ｌ／時間にて溶出し、４．０±０．５Ｌを１画分として、溶出液を収集した。ＴＬＣにより各溶出液の成分を測定し、単一成分溶出液を減圧濃縮し、残渣を７０℃で１６時間真空乾燥し、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを得た。
実施例２
１０ｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに乳糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒し、カプセルに封入し、１粒が５０ｍｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを含有するカプセル剤を得た。
１０ｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに乳糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒し、カプセルに封入し、１粒が５０ｍｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを含有するカプセル剤を得た。
実施例３
適量の乳化剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎなど）を水に溶解させ、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール１０ｇを添加し、磨砕して一次乳化液を得、さらに水を添加して１０００ｍＬとし、経口内服液を得た。
適量の乳化剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎなど）を水に溶解させ、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール１０ｇを添加し、磨砕して一次乳化液を得、さらに水を添加して１０００ｍＬとし、経口内服液を得た。
実施例４
実施例３の一次乳化液において、水の代わりに注射用水を添加し、ろ過、滅菌、封入を行い、注射液を得た。
実施例３の一次乳化液において、水の代わりに注射用水を添加し、ろ過、滅菌、封入を行い、注射液を得た。
実施例５
１０ｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに乳糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒、乾燥し、ステアリン酸マグネシウムを適量添加し、打錠して、１錠当たり５０ｍｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを含有する錠剤を得た。
１０ｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに乳糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒、乾燥し、ステアリン酸マグネシウムを適量添加し、打錠して、１錠当たり５０ｍｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを含有する錠剤を得た。
実施例６
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに蔗糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒し、乾燥して、顆粒剤を得た。
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに蔗糖を適量添加して混和し、７０％のエタノールを結合剤として用いて造粒し、乾燥して、顆粒剤を得た。
実験例１
本分野において抗うつ活性の証明のために用いられる代表的な試験モデルにより、本発明の薬理、薬効学的な面について試験した。
本分野において抗うつ活性の証明のために用いられる代表的な試験モデルにより、本発明の薬理、薬効学的な面について試験した。
１．レセルピン誘発眼瞼下垂についてのうつ病モデル試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、上海中薬創新研究センターの製品で、ロット番号：０５０５０１、含有率：９３．６２％を使用した。用量および使用方法：臨床では体重６０ｋｇの成人が毎日５０ｍｇ内服するとして、成人一日当りの薬剤使用量は５０ｍｇ／２４ｈ÷６０ｋｇ体重＝０．８３ｍｇ／ｋｇ体重と計算した。試験時の調製方法：２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに適量の０．３％ＣＭＣＮａ＋Ｔｗｅｅｎ８０溶液を添加し、超音波混合して、必要な濃度の混濁液を調製して使用した。
フルオキセチンは、米国リリー社の製品で、２０ｍｇ／粒、ロット番号：Ａ１０３４００を、使用する直前に、０．３％ＣＭＣＮａ溶液を用いて必要な濃度に調製した。
レセルピン注射液は、広東邦民製薬廠有限公司の製品で、規格：１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号：０５０４１１を用いた。
０．３％ＣＭＣＮａ＋Ｔｗｅｅｎ８０溶液は、０．３％ＣＭＣＮａとＴｗｅｅｎ８０との体積比を２００：１として混合して調製した。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、上海中薬創新研究センターの製品で、ロット番号：０５０５０１、含有率：９３．６２％を使用した。用量および使用方法：臨床では体重６０ｋｇの成人が毎日５０ｍｇ内服するとして、成人一日当りの薬剤使用量は５０ｍｇ／２４ｈ÷６０ｋｇ体重＝０．８３ｍｇ／ｋｇ体重と計算した。試験時の調製方法：２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールに適量の０．３％ＣＭＣＮａ＋Ｔｗｅｅｎ８０溶液を添加し、超音波混合して、必要な濃度の混濁液を調製して使用した。
フルオキセチンは、米国リリー社の製品で、２０ｍｇ／粒、ロット番号：Ａ１０３４００を、使用する直前に、０．３％ＣＭＣＮａ溶液を用いて必要な濃度に調製した。
レセルピン注射液は、広東邦民製薬廠有限公司の製品で、規格：１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号：０５０４１１を用いた。
０．３％ＣＭＣＮａ＋Ｔｗｅｅｎ８０溶液は、０．３％ＣＭＣＮａとＴｗｅｅｎ８０との体積比を２００：１として混合して調製した。
２）動物
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表２に記載の薬物および用量を１日１回１０日間強制経口投与した。各群のマウスに対し、最後の投薬から６０分後にレセルピン注射液２ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。注射してから６０分後にマウスをラックに置いて２分間観察し、各群の中で眼瞼が少なくとも半分以上閉じたマウスの匹数を計数した。各群のデータに対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果は表２のとおりである。
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表２に記載の薬物および用量を１日１回１０日間強制経口投与した。各群のマウスに対し、最後の投薬から６０分後にレセルピン注射液２ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。注射してから６０分後にマウスをラックに置いて２分間観察し、各群の中で眼瞼が少なくとも半分以上閉じたマウスの匹数を計数した。各群のデータに対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果は表２のとおりである。
表２は、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与がマウスのレセルピン誘発眼瞼下垂に対し明らかな抑制作用を有することを示している（Ｐ＜０．０５）。
２．レセルピン誘発運動障害についてのうつ病モデル試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよびレセルピン注射液：１．（１）１）参照。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよびレセルピン注射液：１．（１）１）参照。
２）動物
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表３に記載の薬物および用量を１日１回１０日間強制経口投与した。各群のマウスに対し、最後の投薬から６０分後にレセルピン注射液２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した。注射してから６０分後にマウスを直径７．５ｃｍの円形のろ紙の中央に置き、各動物群のうち３０秒経過後もまだろ紙の内側に留まっている個体数を観察、計数した。フィッシャー正確確率検定により統計した。結果を表３に示す。
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表３に記載の薬物および用量を１日１回１０日間強制経口投与した。各群のマウスに対し、最後の投薬から６０分後にレセルピン注射液２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した。注射してから６０分後にマウスを直径７．５ｃｍの円形のろ紙の中央に置き、各動物群のうち３０秒経過後もまだろ紙の内側に留まっている個体数を観察、計数した。フィッシャー正確確率検定により統計した。結果を表３に示す。
表３は、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与がマウスのレセルピン誘発運動障害に対し明らかな抑制作用を有することを示している（Ｐ＜０．０５）。
３．マウス尾懸垂法による後天性絶望うつ病モデル試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
２）動物
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
１）マウス尾懸垂試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール単回投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、９〜１０週齢、体重２２〜２４ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表４に記載の薬物および用量をそれぞれに１回だけ強制経口投与した。各群に対して投薬から６０分後に、マウスの尾の先端から１ｃｍの箇所を接着テープで直径１ｃｍのＰＶＣチューブに貼り付けた。その際、マウスの尾をひねったり折り重ねたりしないようにする。次いでマウスを、頭部がテーブル面から５ｃｍ離れるようにして、ＰＶＣチューブに逆さに吊り下げた。２匹ごとのマウスの間は仕切り板で隔離して互いに干渉し合わないようにし、各マウスにつき６分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表４に示す。
１）マウス尾懸垂試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール単回投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、９〜１０週齢、体重２２〜２４ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表４に記載の薬物および用量をそれぞれに１回だけ強制経口投与した。各群に対して投薬から６０分後に、マウスの尾の先端から１ｃｍの箇所を接着テープで直径１ｃｍのＰＶＣチューブに貼り付けた。その際、マウスの尾をひねったり折り重ねたりしないようにする。次いでマウスを、頭部がテーブル面から５ｃｍ離れるようにして、ＰＶＣチューブに逆さに吊り下げた。２匹ごとのマウスの間は仕切り板で隔離して互いに干渉し合わないようにし、各マウスにつき６分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表４に示す。
表４は、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与がマウスの尾懸垂における無動時間を明らかに短縮できたことを示している（Ｐ＜０．０５）。
２）マウス尾懸垂試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表５に記載の薬物および用量を１日１回１０日間連続して強制経口投与した。各群に対して最後の投薬から６０分後に、マウスの尾の先端から１ｃｍの箇所を直径１ｃｍのＰＶＣチューブに接着テープで貼り付けた。その際、マウスの尾をひねったり折り重ねたりしないようにする。次いでマウスを、頭部がテーブル面から５ｃｍ離れるようにして、ＰＶＣチューブに逆さに吊り下げた。２匹ごとのマウスの間は仕切り板で隔離して互いに干渉し合わないようにし、各マウスにつき６分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。結果を表５に示す。
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表５に記載の薬物および用量を１日１回１０日間連続して強制経口投与した。各群に対して最後の投薬から６０分後に、マウスの尾の先端から１ｃｍの箇所を直径１ｃｍのＰＶＣチューブに接着テープで貼り付けた。その際、マウスの尾をひねったり折り重ねたりしないようにする。次いでマウスを、頭部がテーブル面から５ｃｍ離れるようにして、ＰＶＣチューブに逆さに吊り下げた。２匹ごとのマウスの間は仕切り板で隔離して互いに干渉し合わないようにし、各マウスにつき６分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。結果を表５に示す。
表５は、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与がマウスの尾懸垂における無動時間を著しく、または明らかに短縮できたことを示している（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。
４．マウス強制水泳法による後天性絶望うつ病モデル試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよびレセルピン注射液：１．（１）１）参照。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよびレセルピン注射液：１．（１）１）参照。
２）動物
昆明系マウス：すべて雄性、実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：すべて雄性、実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
１）マウスの強制水泳試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール単回投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、９〜１０週齢、体重２２〜２４ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表６に記載の薬物および用量をそれぞれに１回だけ強制経口投与した。各群に対して投薬から６０分後に、２５℃の水を水深１０ｃｍまで入れた高さ２０ｃｍ、直径１４ｃｍの２５００ｍＬビーカーにマウスを１匹ずつ入れ、各マウスにつき６分間のうち後の４分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表６に示す。
１）マウスの強制水泳試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール単回投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、９〜１０週齢、体重２２〜２４ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表６に記載の薬物および用量をそれぞれに１回だけ強制経口投与した。各群に対して投薬から６０分後に、２５℃の水を水深１０ｃｍまで入れた高さ２０ｃｍ、直径１４ｃｍの２５００ｍＬビーカーにマウスを１匹ずつ入れ、各マウスにつき６分間のうち後の４分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表６に示す。
表６は、マウスの４分間の水泳中における累計無動時間に対し、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与が１５および７．５ｍｇ／ｋｇの用量では著しい短縮効果があり（Ｐ＜０．０１）、３．７５ｍｇ／ｋｇの用量では明らかな短縮効果があることを示している（Ｐ＜０．０５）。
２）マウスの強制水泳試験における２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール反復投与の影響
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表７に記載の薬物および用量を１日１回１０日間連続して強制経口投与した。各群に対し最後の投薬から６０分後に、２５℃の水を水深１０ｃｍまで入れた高さ２０ｃｍ、直径１４ｃｍの２５００ｍＬビーカーにマウスを１匹ずつ入れ、各マウスにつき６分間のうち後の４分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表７に示す。
昆明系マウス５０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に無作為抽出により５つの群に分け、表７に記載の薬物および用量を１日１回１０日間連続して強制経口投与した。各群に対し最後の投薬から６０分後に、２５℃の水を水深１０ｃｍまで入れた高さ２０ｃｍ、直径１４ｃｍの２５００ｍＬビーカーにマウスを１匹ずつ入れ、各マウスにつき６分間のうち後の４分間中の累計無動時間を計測した（無動の基準は、呼吸を除き、動物の体のどの部分も動いていない状態とする）。試験データは、ｔ検定により統計した。結果を表７に示す。
表７は、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与がいずれもマウスの４分間の水泳中における累計無動時間を著しく短縮できたことを示している（Ｐ＜０．０１）。
５．慢性ストレス性うつ病モデルラットの行動学的試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
２）動物
ＳＤ系ラット：すべて雄性、実験動物生産許可証：ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
ＳＤ系ラット：すべて雄性、実験動物生産許可証：ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
モデル作成用の動物は、すべて１つのケージに１匹ずつ単独隔離飼育し、２１日間にわたり様々なストレスを与えた。すなわち、冷水水泳（４℃、５分間）、テイルピンチ（３分間）、絶水（４０時間）、絶食（４０時間）、つがい飼育ならびに高湿、拘束および終夜照明刺激などの各種刺激をそれぞれ平均２〜３回ずつ与えた。正常モデルのラットは、１つのケージに５匹ずつ飼育し、いかなる刺激も与えなかった。各投薬群には、モデル作成と同時に、表８に記載の薬物および用量を２１日間連続して強制経口投与した。オープンフィールド法を用いて行動を観察した。本実験には、高さ４０ｃｍ、長さ／幅８０ｃｍの直方体の蓋なしケースの周壁と底面とを面積の等しい２５区画に白線で区分したものを使用した。ラットが底面の区画線を横切った回数を水平運動（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）、直立した回数を垂直運動（ｒｅａｒｉｎｇ）としてスコアした。２２日目に観察を行い、各ラットにつき１回測定し、１回の測定時間は３分間とし、水平運動のスコアと垂直運動のスコアを計数した。結果をｔ検定により統計した。結果を表８に示す。
モデル作成用の動物は、すべて１つのケージに１匹ずつ単独隔離飼育し、２１日間にわたり様々なストレスを与えた。すなわち、冷水水泳（４℃、５分間）、テイルピンチ（３分間）、絶水（４０時間）、絶食（４０時間）、つがい飼育ならびに高湿、拘束および終夜照明刺激などの各種刺激をそれぞれ平均２〜３回ずつ与えた。正常モデルのラットは、１つのケージに５匹ずつ飼育し、いかなる刺激も与えなかった。各投薬群には、モデル作成と同時に、表８に記載の薬物および用量を２１日間連続して強制経口投与した。オープンフィールド法を用いて行動を観察した。本実験には、高さ４０ｃｍ、長さ／幅８０ｃｍの直方体の蓋なしケースの周壁と底面とを面積の等しい２５区画に白線で区分したものを使用した。ラットが底面の区画線を横切った回数を水平運動（ｃｒｏｓｓｉｎｇ）、直立した回数を垂直運動（ｒｅａｒｉｎｇ）としてスコアした。２２日目に観察を行い、各ラットにつき１回測定し、１回の測定時間は３分間とし、水平運動のスコアと垂直運動のスコアを計数した。結果をｔ検定により統計した。結果を表８に示す。
表８の結果からわかるように、モデルラットの垂直運動と水平運動はいずれも極めて著しく減少しており（Ｐ＜０．００１）、これはモデル作成が成功したことを示している。モデル群と比較し、１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、ラットの垂直運動の回数を極めて著しく、または著しく増加させ（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１）、ラットの水平運動の回数を著しく、または明らかに増加させることができた（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。
６．拘束具法によるうつ病モデルラット試験
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
（１）試験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
２）試薬
過塩素酸：天津市東方化工廠、ロット番号０５０６１７。
Ｎａ２ＥＤＴＡ：汕頭市洗隴化工廠、ロット番号０４０２０４。
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）：フルカ（Ｆｌｕｋａ）社製、規格１ｇ／ボトル、純度９８％、ＥＣ Ｎｏ．２０３０２４１、ロット・充填番号４８２５６／３ ４２９３２。
３，４−ジヒドロキシベンジルアミン臭化水素酸（ＤＨＢＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９８％以上、ＥＣ Ｎｏ．２４０３８２８、ロット・充填番号３１１６１２／１ ５２８３２。
５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴ）：フルカ社製、規格１００ｍｇ／ボトル、純度９８％以上、ＥＣ Ｎｏ．２４４４６４４、ロット・充填番号３５７３４５／１ ４０８０８。
５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９９％以上、ＥＣ Ｎｏ．２００１９５４、ロット・充填番号４０３２６２／１ ２２７０８。
ホモバニリン酸（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＨＶＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９９％以上、ＥＣ Ｎｏ．２０６１７６７、ロット・充填番号４１７８６５／１ ６２６０９。
ノルアドレナリン（ＮＡ）：中国薬品生物製品鑑定所製、純度９８％以上、規格１００ｍｇ／ボトル、ロット番号１６９−９４０２。
アドレナリン（Ａｄｒ）：中国薬品生物製品鑑定所製、純度９８％以上、規格５０ｍｇ／ボトル、ロット番号０１５４−９４０２。
過塩素酸：天津市東方化工廠、ロット番号０５０６１７。
Ｎａ２ＥＤＴＡ：汕頭市洗隴化工廠、ロット番号０４０２０４。
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）：フルカ（Ｆｌｕｋａ）社製、規格１ｇ／ボトル、純度９８％、ＥＣ Ｎｏ．２０３０２４１、ロット・充填番号４８２５６／３ ４２９３２。
３，４−ジヒドロキシベンジルアミン臭化水素酸（ＤＨＢＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９８％以上、ＥＣ Ｎｏ．２４０３８２８、ロット・充填番号３１１６１２／１ ５２８３２。
５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴ）：フルカ社製、規格１００ｍｇ／ボトル、純度９８％以上、ＥＣ Ｎｏ．２４４４６４４、ロット・充填番号３５７３４５／１ ４０８０８。
５−ヒドロキシインドール−３−酢酸（５−ＨＩＡＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９９％以上、ＥＣ Ｎｏ．２００１９５４、ロット・充填番号４０３２６２／１ ２２７０８。
ホモバニリン酸（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＨＶＡ）：フルカ社製、規格２５０ｍｇ／ボトル、純度９９％以上、ＥＣ Ｎｏ．２０６１７６７、ロット・充填番号４１７８６５／１ ６２６０９。
ノルアドレナリン（ＮＡ）：中国薬品生物製品鑑定所製、純度９８％以上、規格１００ｍｇ／ボトル、ロット番号１６９−９４０２。
アドレナリン（Ａｄｒ）：中国薬品生物製品鑑定所製、純度９８％以上、規格５０ｍｇ／ボトル、ロット番号０１５４−９４０２。
３）計測器
島津製作所製のＨＰＬＣ（ＬＣ−１０ＡＴ）、電気化学検出器（Ｌ−ＥＣＤ−６Ａ）および浙江大学智能信息研究所製クロマトグラフワークステーション（Ｎ２０００）。
島津製作所製のＨＰＬＣ（ＬＣ−１０ＡＴ）、電気化学検出器（Ｌ−ＥＣＤ−６Ａ）および浙江大学智能信息研究所製クロマトグラフワークステーション（Ｎ２０００）。
４）動物
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
１）モデル作成方法：ＳＤラット６０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重２００〜２５０ｇ）を取り出し、無作為に６つの群に分け、表９に記載の薬物および用量を各群それぞれに１日１回強制経口投与した。投薬を開始した日から、各群のＳＤラットに拘束具を装着し、（個別ケージで）２１日間飼育した。拘束具は、厚さ０．２ｃｍ、直径４ｃｍの赤色の有機ガラス２枚を首枷のように組み合わせたものである（拘束具は動物の大きさに応じて調節することができる）。
１）モデル作成方法：ＳＤラット６０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重２００〜２５０ｇ）を取り出し、無作為に６つの群に分け、表９に記載の薬物および用量を各群それぞれに１日１回強制経口投与した。投薬を開始した日から、各群のＳＤラットに拘束具を装着し、（個別ケージで）２１日間飼育した。拘束具は、厚さ０．２ｃｍ、直径４ｃｍの赤色の有機ガラス２枚を首枷のように組み合わせたものである（拘束具は動物の大きさに応じて調節することができる）。
２）測定基準：拘束具の装着前と装着後のラットの様子（跳びはねる、ケージや拘束具をつかんだり噛んだりする、絶えず鋭い鳴声を上げる、反応が鈍い、動きが緩慢、目を細める、目脂が出る、毛が黄ばむ、糞が小さい／乾いている／少ない、尾が赤茶けかつ鱗状の剥離片が出る、痩せ細るなど）を観察し、２１日目にラットの行動を測定した（測定方法は慢性ストレス性ラットモデルと同じ）。結果を表９に示す。
３）脳内神経伝達物質の測定：
脳組織の調製：ラットを大腿動脈から放血致死させて全脳を摘出し、小脳を除去した後に秤量し、予冷した０．１ｍｏｌ／Ｌの過塩素酸（Ｎａ２ＥＤＴＡを０．０５％含有）９５０μＬおよび２μｇ／ｍＬのＤＨＢＡ５０μＬを添加し、超音波混合を行った。１１０００ｒｐｍにて１０分間高速遠心分離を行い、上清液を１０μＬ採取して測定した。結果は下記の式により算出し、各神経伝達物質はｎｇ／ｇ脳組織湿重量として表した。
脳組織の調製：ラットを大腿動脈から放血致死させて全脳を摘出し、小脳を除去した後に秤量し、予冷した０．１ｍｏｌ／Ｌの過塩素酸（Ｎａ２ＥＤＴＡを０．０５％含有）９５０μＬおよび２μｇ／ｍＬのＤＨＢＡ５０μＬを添加し、超音波混合を行った。１１０００ｒｐｍにて１０分間高速遠心分離を行い、上清液を１０μＬ採取して測定した。結果は下記の式により算出し、各神経伝達物質はｎｇ／ｇ脳組織湿重量として表した。
クロマトグラフ条件：１０Ａ ＨＰＬＣ（島津製作所）、Ｌ−ＢＣＤ−６Ａ電気化学検出器（島津製作所）、分離カラムはハイパーシルＯＤＳカラム、５μｍ、２００ｍｍ×４．６ｍｍＩＤグラッシーカーボン電極；電気化学検出器の範囲は０．１〜５００ｎＡ；ポンプ流速は１．２ｍＬ／分、作動電圧は＋０．７５Ｖ；酸化法；記録およびデータ処理はＮ２０００クロマトグラフワークステーション（浙江大学智能信息研究所）を使用し、参照電極と作用電極との電圧差は０．７５Ｖ。移動相：０．１ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸−０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３７、脱イオン蒸留水により調製、メタノールを１０％含有する。イオン対Ｂ８１．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ジ−ｎ−ブチルアミン１．３ｍｍｏｌ／Ｌを加え、混和した後にＧ４ガラス漏斗で脱気して使用した。
標準液の調製：ＤＨＢＡを２μｇ／ｍＬに調製し、ＮＥ、ＤＡ、ＤＯＰＡＣ、５−ＨＴ、５−ＨＩＡＡおよびＨＡＶをいずれも２０μｇ／ｍＬに調製した。ＮＥ、ＤＡ、ＤＯＰＡＣ、５−ＨＴ、５−ＨＩＡＡおよびＨＡＶを各々２０μＬずつ採取し、混合してから０．１ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸を８０μＬ添加し、これを標準混合液６とする。次いで、標準混合液６を５０μＬ採取してＤＨＢＡ５０μＬを加え、さらに０．１ｍｍｏｌ／Ｌの過塩素酸９００μＬを添加して、これを標準混合液７とし（１００ｎｇ／ｍＬ）、１０μＬ採取して測定した。
計算：
結果を表１０に示す。
表９から明らかなように、モデルラットの垂直運動と水平運動はいずれも著しく減少しており（Ｐ＜０．００１）、これはモデル作成が成功したことを示している。モデル群と比較し、１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、いずれもモデルラットの垂直運動の回数を極めて著しく増加させ（Ｐ＜０．００１）、モデルラットの水平運動の回数を著しく増加させることができた（Ｐ＜０．０１）。３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、モデルラットの垂直運動の回数を明らかに増加させることができた（Ｐ＜０．０５）。
表１０の結果から明らかなように、モデル群は対照群と比べ、脳内のＤＯＰＡＣ、５−ＨＩＡＡおよびＨＡＶの量に明らかな低下（Ｐ＜０．０５）が、および脳内のＮＥおよび５−ＨＴの量には著しい低下（Ｐ＜０．０１）が見られ、これはモデル作成が成功したことを示している。６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの２１日間連続投与はモデルラットの脳内のＮＥの量を明らかに増加させることができ（Ｐ＜０．０５）、３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの２１日間連続投与はモデルラットの脳内のＮＥ、５−ＨＴおよびＨＡＶの量を明らかに増加させることができた（Ｐ＜０．０５）。
７．抗うつ薬理作用の分析
７．１ Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファン（Ｌ−５−ＨＴＰ）誘発のマウス振戦試験
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール：１．（１）１）参照。
Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファン：シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、ロット番号１１２Ｋ１２５８。
７．１ Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファン（Ｌ−５−ＨＴＰ）誘発のマウス振戦試験
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール：１．（１）１）参照。
Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファン：シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、ロット番号１１２Ｋ１２５８。
２）動物
昆明系マウス：すべて雄性、実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：すべて雄性、実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
昆明系マウス７０匹（雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に層化無作為抽出により７つの群に分け、各群のマウスに対し表１１に記載の薬物および用量を１回強制経口投与した。投薬から６０分後に、各マウスの腹腔に５−ヒドロキシトリプトファンを２００ｍｇ／ｋｇ（マウスに振戦を起こさせない最大用量）注射し、次いでマウスを１匹ずつ個別のケージ（１６×２７ｃｍ）に入れ、２０分以内に振戦を生じたマウスの数を計数した。得られた数値に対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果を表１１に示す。
昆明系マウス７０匹（雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に層化無作為抽出により７つの群に分け、各群のマウスに対し表１１に記載の薬物および用量を１回強制経口投与した。投薬から６０分後に、各マウスの腹腔に５−ヒドロキシトリプトファンを２００ｍｇ／ｋｇ（マウスに振戦を起こさせない最大用量）注射し、次いでマウスを１匹ずつ個別のケージ（１６×２７ｃｍ）に入れ、２０分以内に振戦を生じたマウスの数を計数した。得られた数値に対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果を表１１に示す。
表１１の結果は、Ｌ−５−ＨＴＰのみを、または試験薬のみを投与した場合はマウスには振戦は生じないが、試験薬投与後にさらに５−ＨＴＰを投与したときは、用量が増えるにつれ、振戦を生じるマウスの数が増加し、１５および７．５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは５−ＨＴＰ誘発振戦を明らかに増強できることを示している（Ｐ＜０．０５）。
７．２ レボドパ行動増強効果についての試験
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
レオドパ錠：北京曙光薬業有限責任公司製、ロット番号０４１１２０、規格０．２５ｇ×１００錠。使用直前に蒸留水で溶解して２０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を採取して使用した。
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールおよびフルオキセチン：１．（１）１）参照。
レオドパ錠：北京曙光薬業有限責任公司製、ロット番号０４１１２０、規格０．２５ｇ×１００錠。使用直前に蒸留水で溶解して２０ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を採取して使用した。
２）動物
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
昆明系マウス：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
昆明系マウス７０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に層化無作為抽出により７つの群に分け、各群のマウスに対し表１２に記載の薬物および用量を１回だけ強制経口投与した。投薬から６０分後に、各マウスの腹腔にレボドパを２００ｍｇ／ｋｇ（マウスに走り回りを起こさせない最大用量）注射し、次いでマウスを１匹ずつ個別のケージに入れ、３０分以内に走り回り行動を示したマウスの数を計数した。得られた数値に対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果を表１２に示す。
昆明系マウス７０匹（すべて雄性、８〜９週齢、体重１８〜２２ｇ）を取り出し、体重を基に層化無作為抽出により７つの群に分け、各群のマウスに対し表１２に記載の薬物および用量を１回だけ強制経口投与した。投薬から６０分後に、各マウスの腹腔にレボドパを２００ｍｇ／ｋｇ（マウスに走り回りを起こさせない最大用量）注射し、次いでマウスを１匹ずつ個別のケージに入れ、３０分以内に走り回り行動を示したマウスの数を計数した。得られた数値に対しフィッシャー正確確率検定を行った。結果を表１２に示す。
表１２の結果は、レボドパのみをまたは試験薬のみを投与した場合はマウスに走り回り行動は生じないが、試験薬投与後にさらにレボドパを投与したときは、用量が増えるにつれ、走り回りを起こすマウスの数が増加し、１５および７．５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールにはレボドパの行動影響を明らかに増強する働きがあることを示している（Ｐ＜０．０５）。
７．３ ５−ＨＴ再取り込み阻害試験
（１）実験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール：上海中薬創新研究センター製、ロット番号０５０５０１、含有率９３．６２％。調製方法：２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを０．９％の塩化ナトリウム注射液で必要な濃度に希釈し、超音波混合する。
フルオキセチン：米国リリー社製、２０ｍｇ／粒、ロット番号Ａ１０３４００。使用直前に、０．９％の塩化ナトリウム注射液で必要な濃度に調製し、超音波混合する。
０．９％塩化ナトリウム注射液：四川科倫薬業股分有限公司製、規格５００ｍＬ／ボトル、ロット番号Ｂ０５０９２５。
（１）実験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール：上海中薬創新研究センター製、ロット番号０５０５０１、含有率９３．６２％。調製方法：２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを０．９％の塩化ナトリウム注射液で必要な濃度に希釈し、超音波混合する。
フルオキセチン：米国リリー社製、２０ｍｇ／粒、ロット番号Ａ１０３４００。使用直前に、０．９％の塩化ナトリウム注射液で必要な濃度に調製し、超音波混合する。
０．９％塩化ナトリウム注射液：四川科倫薬業股分有限公司製、規格５００ｍＬ／ボトル、ロット番号Ｂ０５０９２５。
２）試薬
ＮａＨＣＯ３：重慶東試化工有限公司製、ロット番号２００３０６２４。
Ｎａ２ＣＯ３：成都科龍化工試剤廠製、ロット番号２００５０８１１。
［１４Ｃ］−５−ＨＴ：米国デュポン社製、規格２５０μＣｉ／ボトル、ロット番号３１６７２４３、比活性３．７ＭＢｑ／ｍＬ。
ＮａＨＣＯ３：重慶東試化工有限公司製、ロット番号２００３０６２４。
Ｎａ２ＣＯ３：成都科龍化工試剤廠製、ロット番号２００５０８１１。
［１４Ｃ］−５−ＨＴ：米国デュポン社製、規格２５０μＣｉ／ボトル、ロット番号３１６７２４３、比活性３．７ＭＢｑ／ｍＬ。
３）計測器
ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ） ＬＳ ６００００ＩＣ液体シンチレーションカウンター。
ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ） ＬＳ ６００００ＩＣ液体シンチレーションカウンター。
４）動物
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
雄性のＳＤラット８匹を断頭し、すばやく視床下部を分離して秤量し、９倍の体積の０．３２ｍｏｌ／Ｌの冷温の蔗糖溶液を加えて漿液状に混合した後、この混合液を０〜４℃にて遠心分離した（３４２０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を２００μＬ採取し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［１４Ｃ］−５−ＨＴ（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび薬液２０μＬを添加した（対照群には０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを添加）。各群１０本ずつ作成し、混和してからＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で５分間培養した。別に１本の試験管に上清液２００μＬを注入し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［１４Ｃ］−５−ＨＴ（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを加え、混和した後にＣＯ２インキュベーターに入れ、０℃で５分間培養した。取り出して遠心分離した（７４８０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を吸い出し、シンチレーション用容器にあけ、シンチレーション液１０ｍＬを加えて計数を行った（３回実施）。３７℃および０℃培養時の試料のｄｐｍ値の差が再取り込み量を示している。
雄性のＳＤラット８匹を断頭し、すばやく視床下部を分離して秤量し、９倍の体積の０．３２ｍｏｌ／Ｌの冷温の蔗糖溶液を加えて漿液状に混合した後、この混合液を０〜４℃にて遠心分離した（３４２０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を２００μＬ採取し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［１４Ｃ］−５−ＨＴ（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび薬液２０μＬを添加した（対照群には０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを添加）。各群１０本ずつ作成し、混和してからＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で５分間培養した。別に１本の試験管に上清液２００μＬを注入し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［１４Ｃ］−５−ＨＴ（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを加え、混和した後にＣＯ２インキュベーターに入れ、０℃で５分間培養した。取り出して遠心分離した（７４８０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を吸い出し、シンチレーション用容器にあけ、シンチレーション液１０ｍＬを加えて計数を行った（３回実施）。３７℃および０℃培養時の試料のｄｐｍ値の差が再取り込み量を示している。
表１３が示すように、１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは５−ＨＴ再取り込みをそれぞれ順に極めて著しく、著しく、および明らかに阻害することができ（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）、阻害率は順に２５．５％、２０．１％および１７．０％であった。
７．４ ＮＡ再取り込み阻害試験
（１）実験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよび０．９％塩化ナトリウム注射液：７．３（１）１）参照。
（１）実験材料
１）薬品
２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール、フルオキセチンおよび０．９％塩化ナトリウム注射液：７．３（１）１）参照。
２）試薬
ＮａＨＣＯ３：重慶東試化工有限公司製、ロット番号：２００３０６２４。
Ｎａ２ＣＯ３：成都科龍化工試剤廠製、ロット番号：２００５０８１１。
［３Ｈ］−ノルアドレナリン：米国デュポン社製、規格２５０μＣｉ／ボトル、ロット番号３２４２６８１、比活性３．７ＭＢｑ／ｍＬ。
ＮａＨＣＯ３：重慶東試化工有限公司製、ロット番号：２００３０６２４。
Ｎａ２ＣＯ３：成都科龍化工試剤廠製、ロット番号：２００５０８１１。
［３Ｈ］−ノルアドレナリン：米国デュポン社製、規格２５０μＣｉ／ボトル、ロット番号３２４２６８１、比活性３．７ＭＢｑ／ｍＬ。
３）計測器
ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ） ＬＳ ６００００ＩＣ液体シンチレーションカウンター。
ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ） ＬＳ ６００００ＩＣ液体シンチレーションカウンター。
４）動物
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
ＳＤ系ラット：実験動物生産許可証ＳＣＸＫ（川）２００３−０６。
（２）試験方法および結果
雄性のＳＤラットを断頭し、すばやく線状体を分離して秤量し、９倍の体積の０．３２ｍｏｌ／Ｌの冷温の蔗糖溶液を加えて漿液状に混和した後、この混合液を０〜４℃にて遠心分離した（３４２０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を２００μＬ採取し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］−ノルアドレナリン（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび薬液２０μＬを添加した（対照群には０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを添加）。各群１０本ずつ作成し、混和した後にＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で５分間培養した。別に１本の試験管に上清液２００μＬを注入し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］−ノルアドレナリン（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを加え、混和してからＣＯ２インキュベーターに入れ、０℃で５分間培養した。取り出して遠心分離した（７４８０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を吸い出し、シンチレーション用容器にあけ、シンチレーション液１０ｍＬを加えて計数を行った（３回実施）。３７℃および０℃培養時の試料のｄｐｍ値の差が再取り込み量を示している。
雄性のＳＤラットを断頭し、すばやく線状体を分離して秤量し、９倍の体積の０．３２ｍｏｌ／Ｌの冷温の蔗糖溶液を加えて漿液状に混和した後、この混合液を０〜４℃にて遠心分離した（３４２０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を２００μＬ採取し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］−ノルアドレナリン（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび薬液２０μＬを添加した（対照群には０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを添加）。各群１０本ずつ作成し、混和した後にＣＯ２インキュベーターに入れ、３７℃で５分間培養した。別に１本の試験管に上清液２００μＬを注入し、６２．５ｎｍｏｌ／Ｌの［３Ｈ］−ノルアドレナリン（クレブス−ヘンゼライト重炭酸塩緩衝液により調製）８００μＬおよび０．９％塩化ナトリウム注射液２０μＬを加え、混和してからＣＯ２インキュベーターに入れ、０℃で５分間培養した。取り出して遠心分離した（７４８０ｒｐｍ、１０分間）。上清液を吸い出し、シンチレーション用容器にあけ、シンチレーション液１０ｍＬを加えて計数を行った（３回実施）。３７℃および０℃培養時の試料のｄｐｍ値の差が再取り込み量を示している。
表１４が示すように、１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはＮＡ再取り込みをそれぞれ順に極めて著しく、著しく、および明らかに阻害することができ（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）、阻害率は順に１６．２％、１１．５％、および８．２％であった。
結論：
（１）抗うつ作用についての動物モデル試験
１）レセルピン誘発眼瞼下垂についてのうつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）はレセルピンによるマウスの眼瞼下垂に対し明らかな抑制作用を有することが示された。
（１）抗うつ作用についての動物モデル試験
１）レセルピン誘発眼瞼下垂についてのうつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）はレセルピンによるマウスの眼瞼下垂に対し明らかな抑制作用を有することが示された。
２）レセルピン誘発運動障害についてのうつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）はレセルピンによるマウスの運動障害に対し明らかな抑制作用を有することが示された。
３）マウス尾懸垂法による後天性絶望うつ病モデル試験により、１５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与はマウスの尾懸垂における無動時間を明らかに短縮でき、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）はマウスの尾懸垂における無動時間を著しくまたは明らかに短縮できることが示された。
４）マウス強制水泳法による後天性絶望うつ病モデル試験により、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの単回投与はマウスの４分間水泳における累計無動時間を著しくまたは明らかに短縮でき、１５、７．５、および３．７５ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールの反復投与（１０日間）はいずれもマウスの４分間水泳における累計無動時間を著しく短縮できることが示された。
５）慢性ストレス性うつ病モデルラットの行動学的試験により、１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはラットの垂直運動の回数を極めて著しくまたは著しく増加でき、ラットの水平運動の回数を著しくまたは明らかに増加できることが示された。
６）拘束具法によるラットのうつ病モデル試験により、次のことが示された。１３．３３および６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはいずれもラットの垂直運動の回数を極めて著しく増加させ、ラットの水平運動の回数を著しく増加させることができ、３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはラットの垂直運動の回数を明らかに増加させることできる。６．６７ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはモデルラットの脳内のＮＥの量を明らかに増加させ、３．３３ｍｇ／ｋｇの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールはモデルラットの脳内のＮＥ、５−ＨＴおよびＨＡＶの量を明らかに増加させることができる。
（２）抗うつ薬理作用の分析試験により、次のことが示された。１５および７．５ｍｇ／ｋｇの用量の２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、５−ヒドロキシトリプトファンの振戦作用およびレボドパの行動影響の作用を明らかに増強することができる。また、１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、それぞれ順に、５−ＨＴおよびＮＡの再取り込みを極めて著しく、著しく、および明らかに阻害することができる。
以上から明らかなように、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは抗うつ作用を有し、うつ病エピソード、反復性うつ病性障害、双極性感情障害および持続性気分障害を治療するための抗うつ薬などうつ病治療薬の製造に使用することができる。
本発明は、２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールのうつ病治療薬の製造における使用を提供するものである。薬理試験研究の結果が示すように、本化合物はうつ病モデルラットの脳内のＮＥ、５−ＨＴ、ＨＡＶの量を明らかに高め、５−ヒドロキシトリプトファンの振戦作用およびレボドパの行動影響の作用を明らかに増強するとともに、５−ＨＴおよびＮＡの再取り込みを阻害することができる。
Claims (5)
- ２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールのうつ病治療薬の製造への使用。
- ヒトを含む哺乳動物のうつ病治療薬の製造への使用であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
- 前記うつ病がうつ病エピソード、反復性うつ病性障害、双極性感情障害および持続性気分障害を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
- 前記うつ病エピソードに軽症、中等症および重症の３つのタイプがあることを特徴とする請求項３に記載の使用。
- 前記薬品が内服剤、注射剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、または顆粒剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
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