CN104902890A - 用以治疗肠激躁症之山姜属植物萃取物 - Google Patents

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Abstract

本发明在此揭示山姜属(Alpinia spp.)植物萃取物的用途，其系用于制备一种可供治疗肠激躁症(IBS)之药物。所述萃取物系萃取自山姜属植物之新鲜及/或干燥果实，并使用如超临界流体、水、10-95％(体积％)乙醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷等溶剂来进行萃取，以得到适用于制备肠激躁症药物之萃取物。在某些实施方式中，由山姜属植物之水萃取物中，分离出具有可改善排便异常和/或改善腹痛之活性化合物；因此该些化合物为具有发展潜力的先导化合物，可用以制备治疗肠激躁症之药物。

Description

用以治疗肠激躁症之山姜属植物萃取物
技术领域
本发明内容是有关于治疗肠激躁症，更具体而言，本发明系有关于以山姜属植物萃取物来制造一种可供治疗肠激躁症之药物的用途。
背景技术
肠激躁症(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一种常见的功能性肠胃疾病，其无法由异常的生理数值来进行诊断。肠激躁症是肠道运动反应量出现差异加上对刺激或自发性收缩敏感度增加后的结果。因此，肠激躁症又名痉挛性肠症候群(spastic bowl syndrome)、黏液性肠症候群(mucous bowl syndrome)或神经性肠症候群(nervous bowl syndrome)；然而，肠激躁症与痉挛性结肠炎(spastic colitis)或溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)(例如，克隆氏病(Crohn’s disease))并非相同疾病。尽管目前对基础神经肠性机制以及脑-肠神经传导与其角色已有相当了解，但仍未找到一种可有效检测出IBS的生物标记。
依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration,FDA)所颁布之【肠激躁症临床试验评估药物治疗效果(Irritable BowelSyndrome-Clinical Evaluation of Drugs for Treatment)】，肠激躁症的两种主要病征为排便异常(abnormal defecation)及腹痛/腹部不适(abdominalpain or discomfort)。因此，唯有能同时改善或减缓病人排便异常及腹痛/腹部不适之化合物或组合物，才是合格有效可用来治疗患有肠激躁症病患之化合物或组合物。
目前可用来治疗肠激躁症的药物包括第3型5-羟基色胺受体拮抗剂(5-Hydroxytryptamine 3 receptor antagonist,5-HT-3)(例如，昂丹司琼(ondansetron)、阿洛司琼(alosetron)、西兰司琼(cilansetron)及/或格拉司琼(granisetron))、第4型5-羟基色胺受体促效剂(5-Hydroxytryptamine 4receptor agonist,5-HT-4)(例如，替加色罗(tegaserod))、镇痉剂(antispasmodic agents)、肌肉松弛剂(muscle relaxant)及三环抗抑郁剂(tricyclic antidepressants)。其中，阿洛司琼可改善约50％的肠激躁症临床症状，但也有约30-35％的患者会出现便秘或发生缺血性结肠炎(ischemiacolitis)这类严重副作用。5-HT4受体促效剂-替加色罗对IBS的治疗效果有限，且因会增加IBS患者罹患心脏病的风险，而于2007年经美国食品药物管理局裁决后下市。
有鉴于此，相关领域亟需提出一种可用以治疗肠激躁症之新方法及/或药剂。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施方式的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。
本揭示内容部份系基于发明人首度发现山姜属植物萃取物可作为一种有效药剂，其系用以治疗经诊断或疑似患有肠激躁症之个体。因此，本发明一态样是有关于利用山姜属植物萃取物来备制一种能治疗患有肠激躁症之个体的药物，其中该药物可有效治疗肠激躁症之排便异常及腹痛/腹部不适的病征。
依据本发明的实施方式，山姜属植物可以是益智仁(Alpinia oxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpinia hainanensis)或红荳蔻(Alpiniagalanga)。山姜属植物萃取物是由山姜属植物之植物部份所制得，具体而言，是由山姜属植物之新鲜或干燥果实所制得。
依据本发明实施方式，山姜属植物萃取物是依据一种包含以下步骤的方法制备而成：
(a)利用一第一溶剂来萃取山姜属植物，其中该第一溶剂是选自由一超临界流体(supercritical fluid,SFC)、水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯和正己烷所组成之群组；以及
(b)将步骤(a)所得之萃取物进行干燥处理。
依据本揭示内容某些实施方式，该第一溶剂为超临界流体(SFC)，其系选自由二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇及丙酮所组成之群组。在一实施例中，该SFC为液态的二氧化碳。依据本揭示内容之其他实施方式，所述方法更可包含使用一种超临界流体之共溶剂(co-solvent)。该共溶剂可以是甲醇或乙醇。
依据本揭示内容某些非必要的实施方式，所述方法更可包含步骤(a-1)：在执行步骤(b)前，加入一第二溶剂至萃取物中，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。在一实施例中，该第一溶剂为水，而该第二溶剂为95％(体积％)乙醇。
在某些实施方式中，所述方法更可包含步骤(a-2)：在执行步骤(b)前，对步骤(a-1)之萃取物进行管柱层析(column chromatography)。
在其他实施方式中，所述方法更可包含步骤(c)：将步骤(b)所得之冷冻干燥产物溶于一第二溶剂中，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及步骤(d)：将步骤(c)所得之产物进行浓缩或干燥处理。
在第一溶剂为50％(体积％)乙醇且第二溶剂为95％(体积％)乙醇的实施例中，所述方法更包含步骤(e)：在执行步骤(d)前，对步骤(c)之溶液进行管柱层析，其系依序以20％(体积％)乙醇、95％(体积％)乙醇及丙酮来洗提该管柱。
在第一溶剂为水且第二溶剂为95％(体积％)乙醇的实施例中，所述方法更包含步骤(f)：在执行步骤(d)前，对步骤(c)之溶液进行管柱层析，其系依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80％(体积％)乙醇来洗提该管柱。
依据本揭示内容的实施方式，可以将步骤(b)及(d)之产物，以及由管柱层析所收集之洗出物进行浓缩或干燥，以作为一种用以治疗肠激躁症之药物。
本发明另一态样是有关于一种治疗肠激躁症的方法，其系对一有需要的个体施用一有效量之本发明的山姜属植物萃取物，特别是山姜属植物的水萃物(water extract)，来治疗因肠激躁症所引起的排便异常及腹痛/腹部不适的病征。
依据本揭示内容的实施方式，益智仁萃取物包含香科酮(teucrenone)或伊砂黄素(isalpinin)；以及至少一种选自下列群组的活性化合物，该群组是由(4S,5S,6R)-5,6-二羟基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氢萘-1-酮((4S,5S,6R)-5,6-dihydroxy-6-methyl-4-propan-2-yl-2,3,4,5,7,8-hexahydronaphthalen-1-one(或称oxyphel lenodiol A)、6-α-羟基-7-表-α-莎草酮(6-α-hydroxy-7-epi-α-cyperone)、7-表-香科酮(7-epi-teucrenone)、及甲金黄酮(tectochrys in)所组成。
在由山姜属植物萃取物(特别是益智仁萃取物)所分离出的各化合物中，有六种已被证实具有减缓肠激躁症典型病征(即伴随排便改变之腹痛/腹部不适)的功效；因此该些化合物为具有发展潜力的先导化合物，可作为一种活性药剂来制备肠激躁症之治疗药物。依据本揭示内容之特定实施方式，(4S,5S,6R)-5,6-二羟基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氢萘-1-酮、6-α-羟基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮、香科酮及甲金黄酮分别具有抗排便异常之活性；而香科酮及伊砂黄素则被证实具有抗腹痛/腹部不适之活性(anti-abdominal pain or discomfort activity)。因此，香科酮或伊砂黄素，再加上至少一种选自由(4S,5S,6R)-5,6-二羟基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氢萘-1-酮、6-α-羟基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮、及甲金黄酮所组成之群组的化合物，可制成一种能治疗肠激躁症之病征的萃取物。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明之基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用之技术手段与实施态样。
附图说明
图1A为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.2之精制水萃物(refined water extract)之与剂量-相关(dose-dependent)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图1B为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.2之精制水萃物抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图1C为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.3之精制水萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图1D为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.3之精制水萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图1E为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.1.1.1之水萃膏(water extract paste)及实施例1.2.1.1之乙醇萃膏(ethanol extract paste)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图1F为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.1.1.1之水萃膏及实施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2A为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.1.1之水萃膏与剂量-相关之抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中每组老鼠为10只，而*表示p<0.05；
图2B为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.1.1之水萃膏与剂量-相关的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2C为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.2.1.1之乙醇萃膏与剂量-相关之抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图2D为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.2.1.1之乙醇萃膏与剂量-相关之抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2E为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.1.1.1之水萃膏及实施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图2F为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.1.1.1之水萃膏及实施例1.2.1.1之乙醇萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2G为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.1.1.1之精制水萃膏(refined water extract paste)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图2H为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.1.1.1.1之精制水萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2I为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.2.1.1.2之精制乙醇萃膏(refined ethanol extract paste)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图2J为依据本发明一实施方式来阐述实施例1.2.1.1.2之精制乙醇萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图2K为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.3.1之丙酮萃物(acetone extract)及实施例1.4.1之乙酸乙酯萃物(ethyl acetate extract)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图2L为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.3.1之丙酮萃物及实施例1.4.1之乙酸乙酯萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图3A至图3C为线性图，其系依据本发明一实施方式来阐述(A)实施例1.1.2水萃膏(water extract pastes)、(B)实施例1.1.3水萃膏及(C)格拉司琼的抗脏器过度敏感效果，其中*代表投予PDC-1850、PDC-1918或格拉司琼与5-HTP的大鼠间具有显著差异(p<0.05)，而#代表基线(baseline)与投予5-HTP的大鼠间具有显著差异(p<0.05)；
图4A及图4B为线性图，其系依据本发明一实施方式来阐述(A)30mg/kg及(B)100mg/kg之实施例1.1.1.1水萃膏的抗脏器过度敏感效果，其中*表示p<0.05，而#代表基线(baseline)与投予5-HTP的大鼠间具有显著差异(p<0.05)；
图4C为依据本发明一实施方式来阐述200mg/kg之实施例1.1.1.1.1精制水萃膏的抗脏器过度敏感效果线性图；
图5A、图5B及图5C为线性图，其系依据本发明一实施方式来阐述(A)100mg/kg、(B)300mg/kg之实施例1.2.1.1乙醇萃膏，以及(C)10μg/kg格拉司琼的抗脏器过度敏感效果，其中*表示p<0.05，而#代表基线(baseline)与投予5-HTP的大鼠间具有显著差异(p<0.05)；
图5D为依据本发明一实施方式来阐述100mg/kg之实施例1.2.1.1.2精制乙醇萃膏的抗脏器过度敏感效果线性图；
图6A及图6B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例1.3.1之丙酮萃物及实施例1.4.1之乙酸乙酯萃物的抗脏器过度敏感效果线性图，其中每组老鼠为3只，且此处绘示一特定老鼠之结果；
图7A为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例2.1之水萃膏及实施例2.2之乙醇萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图7B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例2.1之水萃膏及实施例2.2之乙醇萃膏的抗排便异常效果柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图8A及图8B为线性图，其系依据本发明一实施方式来分别阐述(A)实施例2.1水萃膏及(B)实施例2.2乙醇萃膏的抗脏器过度敏感效果，其中每组老鼠为2只，且此处绘示一特定老鼠之结果；
图9A为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例3.1.1之水萃粉末及3.1.2之水萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图9B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例3.1.1之水萃粉末及3.1.2之水萃膏的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中每组老鼠为10只，且*表示p<0.05；
图9C为依据本发明一实施方式来阐述实施例3.1.2之乙醇萃膏(即PDC-1885)的抗脏器过度敏感效果线性图，其中每组老鼠为6只，且*表示p<0.05，而#代表基线(baseline)与投予5-HTP的大鼠间具有显著差异(p<0.05)；
图10A为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例3.1.3之水萃膏及实施例3.2.1.1之乙醇萃物(ethanol extract)的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图10B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例3.1.3之水萃膏及实施例3.2.1.1之乙醇萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图10C为依据本发明一实施方式来阐述实施例3.1.3之水萃膏(即PDC-2469)的抗脏器过度敏感效果线性图，其中每组老鼠为2只；
图10D为依据本发明一实施方式来阐述实施例3.2.1.1之乙醇萃膏(即PDC-2470)的抗脏器过度敏感效果线性图，其中每组有2只老鼠，但此处绘示一特定老鼠之结果；
图11A为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例4.1之水萃膏及实施例4.2之乙醇萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中*表示p<0.05；
图11B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例4.1之水萃膏及实施例4.2之乙醇萃物的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中*表示p<0.05；
图11C为依据本发明一实施方式来阐述实施例4.1之水萃膏(即PDC-2473)的抗脏器过度敏感效果线性图，其中每组有2只老鼠，但此处绘示一特定老鼠之结果；
图12A为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例5.1、5.2、5.3及5.4之化合物的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中每组老鼠为5只，且*表示p<0.05；
图12B为依据本发明一实施方式来分别阐述实施例5.1、5.2、5.3及5.4之化合物的抗排便异常效果的柱状图，其系以30分钟所排出之粪便量来表示，其中每组老鼠为5只，且*表示p<0.05；
图12C为依据本发明一实施方式来阐述实施例5.5之化合物的抗排便异常效果的柱状图，其系以腹泻分数来表示，其中每组老鼠为5只，且*表示p<0.05；
图12D为依据本发明一实施方式来阐述实施例5.5之化合物的抗腹痛效果柱状图，其系以30分钟内所排出之粪便量来表示，其中每组老鼠为5只，且*表示p<0.05。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇之含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。同时，在此处「至少一」以及「一或多」等词汇当包含一、二、三或更多种。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施方式的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，「约」通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准偏差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
在此处「治疗」(treating)一词包含部份或完全地预防、改善、减缓及/或管理肠激躁症之相关病征(symptom)、次要病征(secondary disorder)或症状(condition)。「治疗」一词此处亦指施用或应用本发明之山姜属植物萃取物至一患有肠激躁症病征、症状、肠激躁症次要病征之个体或肠激躁症高危险群(predisposition)，以达到部份或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一或多个肠激躁症病征、症状、或次要病征之发生。肠激躁症之病征、症状及/或次要病征，包含但不限于，腹痛、腹部不适、排便频率异常(abnormal stool frequency)、排便形态异常(abnormal stool consistency)、腹泻和便秘。在此「治疗」亦可以是施用至患有肠激躁症早期病征或症状之个体，以降低该个体病征、次要病征或相关症状发展成为肠激躁症之风险。在此「治疗」为可以有效地减少一个或多个病征或临床标记。换句话说，在此治疗亦可以是降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展。
「有效量」(effective amount)一词在此处系指一药物的用量足以产生所欲的疗效反应。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。有效量亦指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重之比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。习知技艺者可依据动物模式的剂量来计算药物(如山姜属植物萃取物或由此分离之化合物)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域普通技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and DrugAdministration,FDA)所公告之「估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式之最大安全起始剂量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in InitialClinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用之最高安全剂量。
「个体」(subject)一词是指包含人类的动物，其系依据本揭示内容之方法，能接受山姜属植物萃取物及/或由此分离之化合物的治疗。除非特定指出，否则「个体」(subject)一词同时意指男性及女性，且可以是任何年龄，例如儿童或成人。
在本说明书中，「新鲜」(fresh)一词系指于采收后，尚未经过处理或仅经过最少处理(如，切段、切片及/或包装)的植物部份，且亦未基于保藏之目的而经过大幅干燥。此外，「新鲜」一词不必然与采收时间有严格的相关性。反之，「新鲜」在此只是用来区隔经干燥的植物部份以及未经干燥的植物部份。
「干燥」(dried)一词在此系用来形容植物部份经脱水后的含水量情形，干燥植物部份的含水量通常为1-20％(重量百分比)，较佳为约2-5％(重量百分比)。可利用任何习知的方法来进行干燥，包括利用日晒(sun drying)、烘干(oven drying)与冷冻干燥(freeze drying)等方式。
「山姜属植物萃取物」以及其他类似用语在此系指将山姜属植物(特别是选自由益智仁、月桃、草荳蔻或红荳蔻所组成之群组的山姜属植物)和一溶剂接触后，利用本文所述方法制得的混合物。当可想见，所述的萃取物包含了粗萃取物(crude extract)以及经处理、纯化后的精制萃取物(refined extract)。更明确地说，粗萃取物是由简单萃取所得的产物，其中所选的植物部分和至少一萃取剂(即，萃取溶剂)接触。在可任选的情形中，之后可将所得的粗萃取物进行一或多种分离及/或纯化处理，以得到精制萃取物。植物萃取物可以是液体形式(如，溶液、浓缩物或蒸馏物)，也可以是去除溶剂的固形物(如，膏、颗粒或粉末)。
本发明提供治疗患有肠激躁症之个体的方法，以及用来实施所述方法之药物制剂或膳食补充剂。
本发明一态样是关于发现可有效治疗肠激躁症，特别是减缓肠激躁症的相关病征之活性剂(active agents)。「减缓」(ameliorating或ameliorate)一词在此处系指能有效的治疗肠激躁症之病征或症状，包含任何客观或主观参数，例如减轻(abatement)、减缓(remission)或减少(diminishing)病征或可改善病人生理状况(基于生理检查之结果)。
依据本发明实施方式，所述方法包含对一经诊断或疑似患有肠激躁症之个体施用一有效量的山姜属植物萃取物或由此所纯化之化合物。该个体可以利用Rome II或Rome III步骤，佐以病历、生理检查及基本关于肠激躁症的检测，来诊断其是否患有肠激躁症。
在某些实施方式中，山姜属植物萃取物是经由口服途径施用至个体。然而，本发明并不局限于此。
依据本揭示内容的实施方式，适用于治疗肠激躁症之山姜属植物萃取物是依据实施例所阐述之步骤所制备。依据本揭示内容的实施例，将收集自山姜属植物的植物部份，特别是果实的部份，切成碎片并以适当的溶剂萃取以得到粗萃取物。在本发明的某些实施方式中，是使用益智仁的新鲜或干燥果实来制得本发明的萃取物。粗萃取物可依序经由浓缩及/或冷冻干燥处理，以制成一粗萃取物粉末或膏(paste)。另外，亦可将产物进一步进行如管柱层析的纯化或沈淀，以得到一精制萃取物或一纯化的化合物。
适用于萃取山姜属植物之例示性溶剂包含，但不限于超临界流体(如二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇及丙酮)、水、C1-4醇(如甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇及三丁醇(ter-butanol))、丙酮、乙酸乙酯及正己烷。依据本发明的某些实施方式，将山姜属植物的新鲜或干燥果实切碎后是以水进行萃取；而在其他实施方式中，则是以由水和10-95％(体积％)乙醇所组成的乙醇溶液进行萃取。举例来说，该乙醇溶液可以是10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90及95％(体积％)乙醇。在进一步的实施方式中，将山姜属植物的新鲜或干燥果实切碎后是以丙酮进行萃取。在更进一步的实施方式中，是使用乙酸乙酯作为萃取剂。依据本揭示内容的实施方式，将山姜属植物的果实碎片与萃取剂以重量比约1:5至1:50之比例混合，其中该比例可以是1:5、1:7、1:9、1:10、1:12、1:15、1:17、1:20、1:22、1:25、1:27、1:30、1:32、1:35、1:37、1:40、1:42、1:45、1:47及1:50；较佳的比例约为1:10至1:35，如1:5、1:7、1:10、1:15、1:20、1:22、1:25、1:27、1:30、1:32及1:35。在其他实施方式中，使用超临界流体作为萃取剂，其系可以添加或不添加一如甲醇或乙醇之共溶剂。
在可任选的实施方式中，将粗萃取物过滤、浓缩及/或干燥后，可供以作为一种治疗肠激躁症之相关病征的药物。
在可任选的实施方式中，进一步将带有相反极性之溶剂(如20-95％(体积％)乙醇)加入至粗水萃物(Crude Water Extract)等粗萃取物中，藉此产生一沈淀物。该上清液及/或沈淀物经浓缩及/或干燥后，可供作为一种可治疗肠激躁症之药物。
在再一实施方式中，可将该些由粗水萃物所得到的干燥上清液及/或沈淀物进一步利用管柱层析作纯化。再将该管柱层析洗出物进行浓缩及干燥处理，以制得一精制萃取物粉末，其系适于供制备一种可治疗肠激躁症之药物。适用于管柱层析之例示性的洗提液包含，但不限于水、10-95％(体积％)乙醇(其包含，但不限于10％、15％、20％、25％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(体积％)乙醇)，以及丙酮。在一实施例中，依序以水、30％及95％乙醇来洗提该管柱。在另一实施例中，依序以20％、50％及95％乙醇来洗提该管柱。在其他实施例中，依序以20％及95％乙醇，以及丙酮来洗提该管柱。在再另一实施例中，依序以40％、70％及95％乙醇，以及丙酮来洗提该管柱。
本发明的另一态样是有关于一种由上述山姜属植物萃取物所分离出来的化合物，例如由益智仁的粗水萃膏(crude water extract paste)所分离出来的化合物。
依据本揭示内容的实施方式，对山姜属植物萃取物进行一系列的管柱层析，例如硅胶层析(silica gel chromatography)及/或高效液体层析(highpressure liquid chromatography,HPLC)，并依据本揭示内容实施例所述流程产生不同分馏物(fraction)。之后对各分馏物进行检测且利用光谱分析来鉴定其中各活性化合物之结构，其中光谱分析包含但不限于质谱分析(Massspectrometry,MS)、1H-NMR及13C-NMR分析。再将鉴别出来的各分馏化合物进行是否能改善肠激躁症之相关病征(即，排便异常及腹痛)的功能性试验。该些化合物为具有发展潜力之先导化合物，可供发展适用于治疗肠激躁症之药物。
在特定实施例中，所鉴别出来的化合物是选自以下群组：
本揭示内容因此是有关于一种可供治疗肠激躁症的医药组合物。在某些实施方式中，山姜属植物萃取物或本揭示内容之活性化合物可以与医药上可接受的载体(carriers)或赋形剂(excipients)一起配制成医药组合物，其可以是固体、半固体或液体形式，例如锭片、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂和注射剂。因此，活性化合物可以经由不同途径施用，包含口服、颊内(buccal)、直肠(rectal)、非口服(parenteral)及腹腔(intraperitoneal)等方式。在药剂的形式上，山姜属植物萃取物或活性化合物可以单独或与其他已知的药学活性剂合并施用以治疗肠激躁症。各途径所适用之不同药剂型式为该技术领域习知技艺者所熟知的。需知在任何情况下，最佳施用途径取决于疾病的本质或严重程度，或是治疗的特定状况。
在某些实施方式中，本揭示内容之药学组合物是以固体剂型作口服施用。该些固体剂型可以是胶囊、密封袋、锭片、丸剂、锭剂、粉末或颗粒。在该些剂型中，将活性成分(如山姜属植物萃取物或任一种上述化合物)与至少一种药学上可接受之赋形剂混合。任何上述之固体剂型可选择性地包含包衣(coatings)和壳层(shells)，例如肠溶包衣(enteric coatings)及用以改善任何成分之释放率的包衣。该些包衣的范例为该技术领域所熟知的。在一实施例中，本揭示内容的医药组合物为锭片，例如快速释放锭片(quick-releasetablets)。在另一实施例中，本揭示内容的医药组合物配制为持续释放剂型(sustained release forms)。在再另一实施方式中，本揭示内容的医药组合物为粉末，其系包覆于软式及硬式明胶胶囊中。
在某些实施方式中，本揭示内容的医药组合物是以液体剂型作口服施用。液体剂型可以更包含一缓冲药剂以维持一期望的pH值。亦可将液体剂型填充于软式明胶胶囊中。举例来说，液体可以包含一溶液、悬浮液、乳胶、微浮胶、沈淀物或任何期望的液体介质，其系带有山姜属植物萃取物或任何上述之化合物，或一药学上可接受之衍生物、盐类或其溶剂合物，或其组合。液体可加以设计来改善山姜属植物萃取物或上述化合物之溶解度，以形成一包含药物的乳胶或经释放后的分散质(disperse phase)。
在某些实施方式中，本揭示内容的医药组合物是适用于非口腔施用的剂型，例如注射施用，其系包含但不限于皮下、弹丸注射(bolus injection)、肌肉、腹腔及静脉注射。医药组合物可以配制成油性或水性的等张悬浮液、溶液或乳胶，且可以包含处方药剂(formulatoary agents)，例如悬浮、稳定或分散药剂。另外，组合物可以制成干燥形式，例如粉末、晶体或冷冻干燥的固体，并附与使用前为无菌且无热原(pyrogen-free)的水或等张生理食盐水。组合物亦可置于无菌的安瓶(ampoules)或小瓶(vials)中。
下文举出多种实施例来阐明本发明之部分态样，以使本发明所属技术领域中具有通常知识者能藉以实践本发明。因此不应将这些实施例视为对本发明范围之限制。本发明所属技术领域中具有通常知识者基于此处提的说明，当可在不需过度推衍的情形下运用本发明。此处提及的所有文献，皆视为已完全引用而成为本说明书的一部份。
实施例
实施例1制备益智仁萃取物
1.1粗水萃物(Crude Water Extract)
将干燥且切碎的益智仁(购买自海南，中国)果实以1:10比例与逆渗透(reverse osmot ic，RO)水混合后，煮沸且回流1小时，可得一粗萃取物。以350筛目的滤网过滤该粗萃取物，以滤除益智仁的部份。保留其滤液，并将益智仁的部份以相同方式进行另一水萃取后，合并两次萃取滤液以得到一粗水萃物。
1.1.1粗水萃粉末(Crude Water Extract Powders)(PDC-2014)
藉由冷冻干燥来浓缩实施例1.1所述之粗水萃物，以得到粗水萃粉末(PDC-2014)。
1.1.1.1水萃膏(Water Extract Paste)(PDC-2363)
进一步将95％(体积％)乙醇加至粗水萃粉末(PDC-2014)并过滤(2号滤纸)后，浓缩滤液至干燥以得到一水萃膏(PDC-2363)。
1.1.1.1.1精制水萃膏(Refined Water Extract Pastes)A(PDC-2529)及B(PDC-2530)
将20％(体积％)乙醇加至水萃膏(PDC-2363)后，注入HP-20大孔隙管柱(HP-20 Diaion column)以进行纯化。依序以20％(体积)乙醇、95％(体积)乙醇及丙酮来洗提该管柱。将20％乙醇之洗出物进行浓缩，以得到一精制水萃膏A(PDC-2529)；分别收集且合并95％乙醇及丙酮之洗出物，以得到一精制水萃膏B(PDC-2530)。
1.1.2精制水萃物(Refined Water Extract)(PDC-1850)
以1:1体积比将95％(体积)乙醇加至实施例1.1所述之粗水萃物，以350筛目的滤网过滤该混合物；将滤液进行离心、浓缩及冷冻干燥以得到一精制水萃膏(PDC-1850)。
1.1.3精制水萃物(PDC-1918)
以1:1体积比将95％(体积)乙醇加至实施例1.1所述之粗水萃物，并以350筛目的滤网过滤混合物；将滤液进行离心，且将体积浓缩至原体积之1/3。
以1:1体积比将水加至上述之浓缩水萃取物后，将混合物注入一HP-20大孔隙管柱(Diaion,Mitsubishi Chemistry Inc.)，其中浓缩物与干燥管柱填充材料之重量比约为1:20。依序以3倍柱床体积之RO水、1倍柱床体积之30％(体积％)乙醇及3倍柱床体积之95％(体积)乙醇来洗提该管柱。分别收集且合并两种乙醇洗出物。然后在减压下浓缩该合并之洗出物，直至大致将乙醇移除后，冷冻干燥残留物以得到精制水萃膏(refined water extract pastes)(PDC-1918)。
1.2粗乙醇萃物(Crude Ethanol Extract)
将干燥且切碎的益智仁(购买自海南，中国)果实以1:10(体积％)的比例与50％(体积％)乙醇混合，煮沸且回流1小时，以得到一粗乙醇萃物。以350筛目的滤网过滤该粗乙醇萃物，且将益智仁的果实部份以50％(体积％)乙醇再一次利用相同方式进行萃取后，收集且合并两次滤液，以得到一粗乙醇萃物。
1.2.1粗乙醇萃粉末(Crude Ethanol Extract Powders)(PDC-1941)
先以350筛目过滤实施例1.2所述之粗乙醇萃物，在减压下浓缩该滤液，直至大致将溶剂移除后，再冷冻干燥残留物以得到粗乙醇萃粉末(PDC-1941)。
1.2.1.1乙醇萃膏(Ethanol Extract Paste)(PDC-2364)
将95％乙醇加至实施例1.2.1所述之粗乙醇萃粉末且利用2号滤纸过滤，再浓缩干燥该滤液以得到一乙醇萃膏(PDC-2364)。
1.2.1.1.1精制乙醇萃膏(Refined Ethanol Extract Pastes)A(PDC-2371)、B(PDC-2372)、C(PDC-2373)及D(PDC-2374)
将40％(体积％)乙醇加至乙醇萃膏(PDC-2364)后，注入HP-20大孔隙管柱以进行纯化。依序以40％(体积)乙醇、70％(体积)乙醇、95％(体积)乙醇及丙酮来洗提该管柱。分别收集40％及70％乙醇之洗出物后，进行浓缩及冷冻干燥，以得到萃膏A(PDC-2371)及B(PDC-2372)；分别收集95％乙醇及丙酮之洗出物后，进行浓缩以得到精制萃膏C(PDC-2373)及D(PDC-2374)。
1.2.1.1.2精制乙醇萃膏E(PDC-2531)及F(PDC-2532)
将20％(体积％)乙醇加至乙醇萃膏(PDC-2364)后，注入HP-20大孔隙管柱以更进一步进行纯化。依序以20％(体积)及95％(体积)乙醇来洗提该管柱。分别浓缩该洗出物以得到精制萃膏E(PDC-2531)及F(PDC-2532)。
1.3粗丙酮萃物(Crude Acetone Extract)
益智仁之粗丙酮萃物是依照实施例1.2所述之相似步骤所制备，除了将乙醇置换为丙酮。
1.3.1粗丙酮萃膏(Crude Acetone Extract Pastes)(PDC-2479)
在减压下，浓缩实施例1.3所述之粗丙酮萃物，直至大致将溶剂移除后，冷冻干燥残留物以得到粗丙酮萃膏。
1.4粗乙酸乙酯萃物(Crude Ethyl Acetate Extract)
益智仁之乙酸乙酯粗萃物是依照实施例1.2所述之相似步骤所制备，除了将乙醇置换为乙酸乙酯。
1.4.1粗乙酸乙酯萃膏(Crude Ethyl Acetate Extract Pastes)(PDC-2478)
在减压下，浓缩实施例1.4所述之粗乙酸乙酯萃物，直至大致将溶剂移除后，冷冻干燥残留物以得到粗乙酸乙酯萃膏。
1.5超临界流体萃物(Supercrit ical Fluid Extract,SCF)
在此特定实施例中，益智仁是在超临界温度及压力下，以含或不含改善之共溶剂(例如，乙醇)的超临界流体(例，二氧化碳)来进行萃取。
1.5.1 SCF萃物A
将干燥且切碎的益智仁果实置于压力盘(pressure cell)，在低于5℃的温度下打入液态二氧化碳至压力盘的热区(heating zone)，其中压力及温度分别设置为300巴(bar)及50℃。接着，依序扩充流体至第一及第二分离器(separators)，以将萃取物质由CO2分离出，其中该第一及第二分离器的压力及温度分别设置为60及45巴，以及45及20℃。萃取过程约耗时150分钟，且由此得到SCF萃物A。
1.5.2 SCF萃物B
SCF萃物B是依照实施例1.5.1所述之相似步骤所制成，除了在萃取流程中包含一共溶剂－乙醇；藉此得到一SCF萃物B。
实施例2制备草荳蔻萃取物
2.1水萃膏(PDC-2471)
草荳蔻之水萃膏是依序依照实施例1.1、1.1.1及1.1.1.1所述之相似步骤所制成。
2.2乙醇萃膏(PDC-2472)
草荳蔻之粗乙醇萃物是依序依照实施例1.2、1.2.1及1.2.1.1所述之相似步骤所制成。
实施例3制备红荳蔻萃取物
3.1粗水萃物
红荳蔻之粗水萃物是依照实施例1.1所述之相似步骤所制成。
3.1.1粗水萃粉末(PDC-2147)
在减压下，浓缩实施例3.1所述之粗水萃物，直至得到一水萃粉末。
3.1.2水萃膏(PDC-1885)
以1:1之体积比将95％(体积％)乙醇加至实施例3.1所述之粗水萃物，且形成一沈淀物。接着以10,000rpm离心混合物5分钟，以移除沈淀物。收集上清液，且在减压下进一步进行离心，直至大致将溶剂移除。冷冻干燥残留物以得到水萃膏。
3.1.3水萃膏(PDC-2469)
于实施例3.1.1所述之粗水萃粉分加入95％(体积％)乙醇(1公克的粉末于30毫升乙醇)，利用超音波震荡该混合液至少1小时，并以2号滤纸过滤，在减压下浓缩该滤液以得到一水萃膏。
3.2粗乙醇萃物
红荳蔻之粗乙醇萃物是依照实施例1.2所述之相似步骤所制成。
3.2.1粗乙醇萃粉末
在减压下，浓缩实施例3.2所述之粗乙醇萃物，直至大致将溶剂移除，且冷冻干燥残留物以得到粗乙醇萃粉末。
3.2.1.1乙醇萃膏(PDC-2470)
将95％乙醇加至实施例3.2.1所述之粗乙醇萃粉末且以2号滤纸过滤，接着浓缩该滤液至干燥以得到一乙醇萃膏。
实施例4制备月桃萃取物
4.1水萃膏(PDC-2473)
月桃之粗水萃膏是依序依照实施例1.1、1.1.1及1.1.1.1所述之相似步骤所制成。
4.2乙醇萃膏(PDC-2474)
月桃之乙醇萃膏是依序依照实施例1.2、1.2.1及1.2.1.1所述之相似步骤所制成。
实施例5纯化及鉴别实施例1之益智仁活性化合物
利用层析法分离及纯化化合物，且藉由MS及NMR来确认及鉴别该些化合物个别之结构。
5.1鉴别6-α-羟基-7-表-α-莎草酮(化合物PDC-2460)
将实施例1.1.1.1所述之水萃膏注入硅胶过滤(silica gel filtration，默克，台湾)，再以正己烷及乙酸乙酯来洗提该管柱，由此可得到7个分馏部分(FR-1、FR-2、FR-3、FR-4、FR-5、FR-6及FR-7)。接着将7个分馏部分中的第二分馏部分(即FR-2)注入RP-18胶管柱(RP-18gel column，默克，台湾)，且以80％甲醇来洗提该管柱，由此可再得到6个分馏部分(FR-21、FR-22、FR-23、FR-24、FR-25及FR-26)。合并分馏FR-25及FR-1部分后，将该合并分馏部分注入另一RP-18胶管柱，且以80％甲醇来洗提该管柱以制得另外3个分馏部分(FR-25(1)1、FR-25(1)2及FR-25(1)3)。将FR-25(1)2分馏部分注入另一硅胶纯化以产生另外5个分馏部分(FR-25(1)21、FR-25(1)22、FR-25(1)23、FR-25(1)24及FR-25(1)25)。以制备型HPLC分析(preparative HPLC analysis)由第三分馏部分(FR-25(1)23)来纯化出化合物PDC-2460。
MS:分子量(Mw.)234(Bruker MS)[M-H]-(233).(C15H22O2)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 1.60(1H,m,H-1)、1.83(1H,m,H-1)、2.42(1H,m,H-2)、2.62(1H,m,H-2)、4.90(1H,s,H-6)、2.53(1H,br,s,H-7)、1.52(1H,m,H-8)、2.19(1H,m,H-8)、1.35(1H,m,H-9)、1.47(1H,m,H-9)、4.38(1H,s,H-12)、4.81(1H,s,H-12)、1.73(3H,s,H-13)、1.38(3H,s,H-14)及1.88(3H,s,H-15)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 38.84(C-1)、34.17(C-2)、199.90(C-3)、132.11(C-4)、159.94(C-5)、69.60(C-6)、47.64(C-7)、18.57(C-8)、35.02(C-9)、35.03(C-10)、145.25(C-11)、111.46(C-12)、22.96(C-13)、25.72(C-14)、10.43(C-15)。
5.2鉴别7-表-香科酮(化合物PDC-2453)
RP-18胶管柱(默克，台湾)，且以70％甲醇洗提该管柱，可由此得到5个分馏部分(FR-41、FR-42、FR-43、FR-44及FR-45)。将FR-43分馏部分注入另一RP-18胶管柱，且以70％甲醇洗提该管柱，可再得到6个分馏部分(FR-431、FR-432、FR-433、FR-434、FR-435及FR-436)。合并FR-432及FR-433分馏部分后，将该合并分馏部分注入另一硅胶纯化，以进一步得到7个分馏部分(FR-432(433)1、FR-432(433)2、FR-432(433)3、FR-432(433)4、FR-432(433)5、FR-432(433)6及FR-432(433)7)。以制备型HPLC分析由第四分馏部分(FR-432(433)4)中纯化出化合物PDC-2453。
MS:Mw.234(Bruker MS)[M-H]-(233).(C15H22O2)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 2.10(1H,d,J＝15Hz,H-1)、2.26(1H,d,J＝15Hz,H-1)、5.86(1H,br,s,H-3)、2.28(1H,br,d,J＝13Hz,H-5)、1.52(1H,m,H-6)、2.34(1H,m,H-6)、1.75(1H,m,H-8)、2.05(1H,m,H-8)、1.42(1H,m,H-9)、1.45(1H,m,H-9)、5.08(2H,br,s,H-12)、1.83(3H,s,H-13)、0.95(3H,s,H-14)、1.91(3H,s,H-15)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 54.09(C-1)、198.95(C-2)、126.92(C-3)、162.24(C-4)、44.87(C-5)、33.05(C-6)、74.69(C-7)、31.55(C-8)、37.63(C-9)、37.43(C-10)、146.02(C-11)、114.13(C-12)、18.63(C-13)、16.89(C-14)、21.96(C-15)。
5.3鉴别香科酮(化合物PDC-2464)
将实施例5.1所述之7个分馏部分中的第三分馏部分(即，FR-3)注入一RP-18胶管柱(默克，台湾)，且以70％甲醇洗提该管柱，可由此得到6个分馏部分(FR-31、FR-32、FR-33、FR-34、FR-35及FR-36)。将FR-34分馏部分注入另一RP-18胶管柱，且以70％甲醇洗提该管柱，可再得到6个分馏部分(FR-341、FR-342、FR-343、FR-344、FR-345及FR-346)。合并FR-343及FR-4分馏部分后，将该合并分馏部分注入另一硅胶纯化，以进一步得到7个分馏部分(FR-341(4)1、FR-341(4)2、FR-341(4)3、FR-341(4)4、FR-341(4)5、FR-341(4)6及FR-341(4)7)。将FR-341(4)4分馏部分注入另一以RP-18胶管柱，且以70％甲醇洗提该管柱，以制得另外的6各分馏部分(FR-341(4)41、FR-341(4)42、FR-341(4)43、FR-341(4)44、FR-341(4)45及FR-341(4)46)。再进一步将FR-341(4)44分馏部分注入硅胶纯化，并以制备型HPLC由第六分馏部分(即，FR-341(4)46)纯化出化合物PDC-2464。
MS:Mw.234(Bruker MS)[M-H]-(233)(C15H22O2)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 2.26(2H,d,J＝3.5Hz,H-1)、5.88(1H,br,s,H-3)、2.93(1H,m,H-5)、1.64(1H,t,J＝13.1Hz,H-6)、1.78(1H,m,H-6)、1.46(1H,m,H-8)、1.92(1H,m,H-8)、1.36(1H,m,H-9)、1.84(1H,m,H-9)、4.85(1H,t,J＝1.4Hz,H-12)、5.07(1H,s,H-12)、1.83(3H,s,H-13)、0.87(3H,s,H-14)、1.83(3H,s,H-15)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 54.04(C-1)、199.12(C-2)、127.12(C-3)、163.27(C-4)、42.61(C-5)、33.42(C-6)、74.33(C-7)、30.89(C-8)、35.26(C-9)、37.12(C-10)、151.68(C-11)、109.51(C-12)、19.02(C-13)、15.80(C-14)、21.87(C-15)。
5.4鉴别(4S,5S,6R)-5,6-二羟基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氢萘-1-酮(或称Oxyphellenodiol A)(化合物PDC-2454)
将实施例5.1所述之7个分馏部分中的第四分馏部分(即，FR-4)注入一RP-18胶管柱，且以70％甲醇洗提该管柱，可由此得到5个分馏部分(FR-41、FR-42、FR-43、FR-44及FR-45)。将FR-44分馏部分注入另一RP-18胶管柱，且以70％甲醇洗提该管柱，可再得到5个分馏部分(FR-441、FR-442、FR-443、FR-444及FR-445)。以制备型HPLC由第二分馏部分(即，FR-442)中纯化出化合物PDC-2454。
MS:Mw.238(Bruker MS)[M-H]-(237)(C14H22O3)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 2.18(1H,m,H-1)、2.45(1H,m,H-1)、1.63(1H,m,H-2)、1.75(1H,m,H-2)、4.15(1H,br,s,H-4)、2.60(1H,m,H-6)、1.92(2H,m,H-7)、2.26(1H,m,H-8)、2.45(1H,m,H-8)、2.18(H,m,H-11)、0.86(3H,d,J＝6.9Hz,H-12)、1.02(3H,d,J＝6.9Hz,H-13)、1.18(3H,s,H-14)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 21.40(C-1)、32.08(C-2)、72.31(C-3)、75.08(C-4)、157.81(C-5)、40.00(C-6)、22.21(C-7)、34.94(C-8)、199.95(C-9)、132.41(C-10)、29.76(C-11)、19.11(C-12)、21.53(C-13)、21.72(C-14)。
5.5鉴别甲金黄酮(化合物PDC-2521)
将实施例5.1所述之7个分馏部分中的第一分馏部分(即，FR-1)注入一RP-18胶管柱，且以75％甲醇洗提该管柱，可由此得到5个分馏部分(FR-11、FR-12、FR-13、FR-14及FR-15)。进一步以制备型HPLC分析FR-12分馏部分，可得到化合物PDC-2521。
MS:268(Bruker MS)[M+H]+(269)(C16H12O4)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 6.66(1H,d,H-3)、6.36(1H,d,J＝2.1Hz,H-6)、6.49(1H,d,J＝2.1Hz,H-8)、7.87-7.89(1H,m,H-2’)、7.49-7.55(1H,m,H-3’)、7.49-7.55(1H,m,H-4’)、7.49-7.55(1H,m,H-5’)、7.87-7.89(1H,m,H-6’)、3.87(1H,s,OME)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 163.98(C-2)、105.83(C-3)、182.51(C-4)、162.10(C-5)、98.17(C-6)、165.55(C-7)、92.66(C-8)、157.75(C-9)、105.67(C-10)、131.24(C-1’)、126.28(C-2’)、129.08(C-3’)、131.85(C-4’)、129.08(C-5’)、126.28(C-6’)、55.82(OME)。
5.6鉴别伊砂黄素(化合物PDC-2524)
将实施例5.1所述之7个分馏部分中的第一分馏部分(即，FR-1)注入一RP-18胶管柱，且以75％甲醇洗提该管柱，可由此得到5个分馏部分(FR-11、FR-12、FR-13、FR-14及FR-15)。进一步对FR-12分馏部分进行制备型HPLC分析，可以得到化合物PDC-2524。
MS:284(Bruker MS)[M+H]+(285)(C16H12O5)
1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 6.36(1H,d,J＝2.1Hz,H-6)、6.49(1H,d,J＝2.1Hz,H-8)、8.19-8.17(1H,m,H-2’)、7.46-7.51(1H,m,H-3’)、7.46-7.51(1H,m,H-4’)、7.46-7.51(1H,m,H-5’)、8.19-8.17(1H,m,H-6’)、3.87(1H,s,OME)。
13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 145.20(C-2)、136.54(C-3)、175.41(C-4)、160.74(C-5)、98.01(C-6)、165.88(C-7)、92.18(C-8)、156.96(C-9)、103.97(C-10)、130.64(C-1’)、127.57(C-2’)、128.61(C-3’)、130.28(C-4’)、128.61(C-5’)、127.57(C-6’)、55.87(OME)。
实施例6山姜属植物萃取物有效治疗由dl-5-羟基色胺酸(dl-5-Hydroxytryptophan,5-HTP)所引发之排便异常及/或脏器过度敏感
在肠道神经系统中，血清素(serotonin)是一种主要且重要的单胺型神经传导物(monoamine-type neurotransmitter)。体内有95％血清素表现于肠道中，其主要是由似肠亲铬细胞(enterochromaffin like cells,ECL cells)及肠道神经元所表现；其余血清素则是表现于中枢神经系统中。血清素可以增加介于肠胃道及中枢神经系统间之内脏神经元的敏感度，且参与肠道的整合功能。
由于血清素在肠激躁症中系为一种新兴的神经传导物质，本发明利用可转化为血清素的dl-5-羟基色胺酸(dl-5-Hydroxytryptophan,5-HTP)作为肠激躁症之刺激剂(stimulant)，并以此来评估实施例1至4所述之山姜属植物萃取物于治疗肠激躁症之排便异常病征的功效。同时，利用5-HTP作为刺激剂，亦可以肠激躁症发病之决定性因素-腹痛/腹部不适，以及动物体所表现的行为反应，来评估实施例1至4所述之山姜属植物萃取物于治疗肠激躁症之腹痛/腹部不适病征的功效。
实验流程通过台湾泛球药理股份有限公司研究所、阳明大学与辅仁大学的动物管理及使用委员会的核准，并遵循国家动物保护相关规范。
评估由5-HTP所引发腹泻及/或排便异常之动物模式
雄性ICR小鼠(乐斯科公司，台湾)饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养温度约22℃至24℃，湿度约40％至50％，光暗循环为12小时。在试验开始时，每一只小鼠的体重约为30至34克。试验过程中提供饮水与标准囓齿类饲料供任意取食。
每组小鼠为10只，且于第一天口服施用测试组老鼠二剂本发明之山姜属植物萃取物(即500mg/kg、1,000mg/kg或2,000mg/kg)，而于第二天施用第三剂；另外于施用第三剂山姜属植物萃取物60分钟后，施用一剂5-HTP(腹腔注射，10mg/kg)。在某些情况下，是以腹腔注射来取代口服方式来施用本发明之山姜属植物萃取物。为比对目的，于施用5-HTP之30分钟前分别给予对照组动物一剂盐酸乐必宁(loperamide hydrochloride)(口服，2mg/kg)、盐酸昂丹司琼(ondansteron hydrochloride)(口服，2mg/kg)或盐酸格拉司琼(graniserton hydrochloride)(口服，2mg/kg)。于5-HTP注射30分钟后，观察各动物的排便状况，并依此记录30分钟的排便数量及腹泻分数。腹泻分数是以由0至3的分数表来描述粪便的黏稠度，其中0代表粪便为固体状，1代表粪便为松散状，2代表粪便为部份液体状，及3代表粪便为水状。
评估由5-HTP所引发脏器过度敏感之动物模式
雄性Sprague-Dawley大鼠(乐斯科公司，台湾)饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养温度约22℃至24℃，湿度约40％至50％，光暗循环为12小时。在试验开始时，每一只大鼠的体重约为200至350克。试验过程中提供饮水与标准囓齿类饲料供任意取食。
除非另有说明，本实验每一实验组包括6只大鼠，并在非空腹状态下进行实验，待测药物与阳性对照药物皆以口服方式或腹腔注射投予各组大鼠。于第一天，在乙醚麻醉下，将肌电图(electromyogram,EMG)电极植入各老鼠的腹外斜肌(abdominal external oblique muscle)；之后予以6天术后恢复期。于第8天，以皮下注射方式施用各动物一剂5-HTP(10mg/kg)来引发脏器过度敏感，并进行结直肠扩张刺激(colorectal distentin,CRD)，以肌电图(electromyogram,EMG)纪录之。此外，对各载体组动物分别施用与实验组相应的载体，其给药方式与剂量和各相应的实验组相同。
由屈肌反射异常(Abnormal Wi thdrawal Reflex,AWR)来评估慢性脏器过度敏感之动物模式
在此模式中，藉由测量AWR来研究行为反应，其中AWR是一种与内脏运动反射(visceromotor reflex)类似的不自主运动反射(involuntary motorreflex)。AWR是依刺激的强度来评分。
雄性Sprague-Dawley大鼠(乐斯科公司，台湾)饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养温度约22℃至24℃，湿度约40％至50％，光暗循环为12小时。在试验开始时，每一只大鼠的体重约为200至为350克。试验过程中提供饮水与标准囓齿类饲料供任意取食。除非另有说明，本实验每一实验组包括6只大鼠，并在非空腹状态下进行实验，待测药物与阳性对照药物皆以口服方式或腹腔注射投予各组大鼠。
行为研究是依据前述流程来进行(AL-CHAER et al.,Gastroenterology2000,119:1276-1285)。简言之，将大鼠置于小留西特(Lucite)隔间(20x 8x8公分)之一高架有机玻璃平台(elevated Plexiglas platform)上，且容许试验动物有充分的时间清醒及适应(1小时)。除非另有说明，实验组每只大鼠以腹腔注射方式施用5-HTP(10mg/kg)引发大鼠的脏器过度敏感，实验动物出现动物行为模式AWR现象，AWR的测量是由遮盲观察员(blinded observers)目测动物的反应及AWR的分数所组成，其中AWR之分数标准如下：0为没有行为反应；1为无法移动，仅头部能简单动作；2为腹部肌肉轻度收缩，但无法由平台抬起腹部；3为腹部肌肉强力收缩，且可由平台抬起腹部；4为腹部肌肉剧烈收缩，且将身体拱起并抬起盆腔结构。行为测量是以二位不同的遮盲观察员进行重复。
所有的结果皆表示成平均值±标准偏差；n为各组的动物只数。以单向(one-way)ANOVA分析搭配杜纳氏t检定(Dunnett’s t test)来比较各组动物间的差异。当p值小于或等于0.05时代表具有统计上的显著差异。
6.1实施例1之益智仁可有效治疗肠激躁症之排便异常及腹痛/腹部不适
第1图及第2图阐述了实施例1所述之益智仁于治疗肠激躁症之排便异常的效果。分别藉由测量腹泻分数及30分钟内的粪便计数来评估其效果。如第1图所示，相对于施用一鸦片类受体之致效剂(opioid receptor agonist)-乐必宁或一5-HT3受体之拮抗剂(5-HT3 receptor antagonist)-昂丹司琼，口服施用一最小剂量(1,000mg/kg)之实施例1.1.2、1.1.3、1.1.1.1、1.1.1.1.1、1.2.1.1及1.2.1.1.2所述的水及乙醇萃取物，可有效治疗肠激躁症之排便异常。当以腹腔施用的方式给予实施例1.1.1.1所述之益智仁萃取物时，可更显注地改善肠激躁症的排便异常，其中一30mg/kg低剂量的施用即足以产生抗排便异常的作用，而100mg/kg的剂量则可展现一显著的效果，其仅为口服施用的1/10剂量(第2A至2J图)。相似地，益智仁的丙酮萃物或乙酸乙酯萃物亦能治疗肠激躁症之排便异常(第2K及2L图)。
在治疗肠激躁症的相关病征上，亦将实施例1所述之萃取物的抗排便异常效果同时与另一常见之处方镇痉剂-玫若雷(mepenzolate)进行比对，且实施例1.1.1.1及1.2.1.1所述之萃取物皆较玫若雷(50mg/kg，口服施用3次)更为有效地舒缓相关病征(结果未显示)。
第3至6图阐述了实施例1所述之益智仁萃取物的抗脏器过度敏感效果。如第3图及第4图所述，实施例1.1.2之精制水萃膏(即PDC-1850)、实施例1.1.3之精制水萃膏(即PDC-1918)、实施例1.1.1.1之水萃膏(即PDC-2363)及实施例1.1.1.1.1之精制水萃膏(即PDC-2530)皆能治疗由5-HTP所引发的脏器过度敏感(即与载体组相比)，且其效果甚至较5-HT3受体拮抗剂-格拉司琼更为显著。相似地，50％的益智仁乙醇萃物(即实施例1.2.1.1或PDC-2364及实施例1.2.1.1.2或PDC-2532)(第5A、5B及5D图)，以及益智仁EA(即实施例1.4.1或PDC-2478)及丙酮萃物(即实施例1.3.1或PDC-2479)(第6A及6B图)亦分别具有相同抗5-HTP所引发之脏器过度敏感的效果。
表1及表2总结以AWR分数所评估的行为反应。
表1
*表示施用实施例1.1.1.1之萃取物、格拉司琼及5-HTP的大鼠组间具有显著差异(p<0.05)。
表2
*表示施用实施例1.2.1.1.2之萃取物、格拉司琼及5-HTP的大鼠组间具有显著差异(p<0.05)。
如表1所示，施以实施例1.1.1.1水萃膏(即PDC-2363)进行治疗的大鼠，其AWR分数会显著地低于对照组或接受格拉司琼治疗的大鼠。由此可证，实施例1.1.1.1的益智仁萃取物可有效治疗5-HTP所引发的脏器过度敏感。
相似地，于表2中，施以实施例1.2.1.1.2精制乙醇萃膏(即PDC-2532)进行治疗的大鼠，其AWR分数会显著地低于该些对照组之大鼠。由此可证，实施例1.2.1.1.2的益智仁萃取物可有效地治疗5-HTP所引发的脏器过度敏感。
综观以上，该些结果指出由上述方法所制备的益智仁萃取物，可用以治疗肠激躁症的相关病征，具体来说，是指排便异常及腹痛/腹部不适。
6.2实施例2之草荳蔻萃取物可有效治疗肠激躁症之排便异常及腹痛/腹部不适
依据上述之相似步骤来评估实施例2所述之草荳蔻萃取物于治疗肠激躁之相关症病征的效果。第7图及第8图阐述该些结果。于患有肠激躁症的动物中，相对于该些对照组，草荳蔻之水萃物(即PDC-2471)及乙醇萃物(即PDC-2472)皆能降低动物体之腹泻分数及/或粪便量，以及由5-HTP所引发的脏器过度敏感(第8A及8B图)。
6.3实施例3之红荳蔻萃取物可有效治疗肠激躁症之排便异常及腹痛/腹部不适
第9图及第10图阐述了实施例3所述之红荳蔻萃取物于治疗肠激躁症之相关病征的效果。于患有肠激躁症的动物中，相对于该些对照组，草荳蔻的水萃物(即PDC-2147及PDC-1885)能降低动物体之腹泻分数及/或粪便量(可见于第9A及9B图)，以及由5-HTP所引发的脏器过度敏感(第9C图)。红荳蔻之乙醇萃物亦展现相似的效果(第10图)。
6.4实施例4之月桃萃取物可有效治疗肠激躁症之排便异常及腹痛/腹部不适
第11图阐述了实施例4所述之月桃萃取物于治疗肠激躁症之相关病征的效果。于患有肠激躁症的动物中，相对于该些对照组，水萃物(即PDC-2473)及乙醇萃物(即PDC-2474)皆能降低动物体之腹泻分数及/或粪便量(可见于第11A及11B图)，以及由5-HTP所引发的脏器过度敏感(第11C图)。
实施例7实施例5之化合物能有效抑制肠激躁症之排便异常
利用实施例6所述之相似步骤来评估由实施例1.1.1.1益智仁水萃膏所分离且纯化的化合物(即PDC-2363)之抗排便异常的效果。第12图阐明该些结果。
纯化的化合物PDC-2453、PDC-2454、PDC-2460及PDC-2464皆能抑制由5-HTP所引发之腹泻(第12A图)且减少粪便量(第12B图)。化合物PDC-2521亦呈现相似之抗排便异常的效果(第12C及12D图)。因此，该些化合物具有发展为治疗肠激躁症之药物的潜力。
实施例8实施例5之化合物可有效治疗肠激躁症之腹痛/腹部不适
藉由AWR分数所评估的动物行为反应，可探讨实施例5所述之化合物抗脏器过度敏感效果，且表3总结该些结果。
表3
*表示施用实施例5所述之化合物与5-HTP的大鼠组间具有显著差异(p<0.05)。
如表3所示，施用实施例5.3之化合物(即PDC-2464)或实施例5.6之化合物(即PDC-2524)的大鼠，其AWR分数显著地低于对照组之大鼠。由此可证该些由益智仁所分离的活性化合物可有效治疗与IBS相关的腹痛/腹部不适。
当可理解上述实施方式与实施例仅为例示，且本领域普通技术人员可对齐进行各种修饰。上文提出之说明书、实施例与数据的目的在于使本说明书的结构完备，并作为实作本发明之例示。虽然本揭示内容已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本揭示内容，任何本领域普通技术人员，在不脱离本揭示内容之精神和范围内，当可作各种之更动与润饰，因此本揭示内容之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。

Claims (30)

1.一种用来制造一可治疗肠激躁症之药物的山姜属(Alpinia spp.)植物萃取物，包含：
香科酮或伊砂黄素；以及
至少一种选自以下之活性化合物：(4S,5S,6R)-5,6-二羟基-6-甲基-4-丙-2-基-2,3,4,5,7,8-六氢萘-1-酮、6-α-羟基-7-表-α-莎草酮、7-表-香科酮或甲金黄酮。
2.如权利要求1所述之萃取物，其中该山姜属植物可以是益智仁(Alpinia oxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpiniahainanensis)或红荳蔻(Alpinia galanga)。
3.如权利要求2所述之萃取物，其中该萃取物是由包含下述步骤的方法所制成：
(a)以一第一溶剂萃取该山姜属植物，其中该第一溶剂是选自由一超临界流体、水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷所组成之群组；以及
(b)干燥步骤(a)之萃取物。
4.如权利要求3所述之萃取物，其中该超临界流体可以是二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇或丙酮。
5.如权利要求4所述之萃取物，其中该步骤(a)更包含一超临界流体之共溶剂，该共溶剂为甲醇或乙醇。
6.如权利要求3所述之萃取物，其中该第一溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；且所述萃取是藉由将该山姜属植物与该第一溶剂以重量比约为1：1至1:50的比例混合来进行。
7.如权利要求6所述之萃取物，其中所述方法更包含：
(a-1)在执行步骤(b)前，加入一第二溶剂至该萃取物，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。
8.如权利要求7所述之萃取物，其中所述方法更包含：
(a-2)在执行步骤(b)前，对步骤(a-1)之萃取物进行管柱层析。
9.如权利要求8所述之萃取物，其中该管柱层析系依序以水、30％(体积％)乙醇及95％(体积％)乙醇来洗提该管柱；且干燥该洗出物以制备出该萃取物。
10.如权利要求3所述之萃取物，其中所述方法更包含：
(c)将步骤(b)之冷冻干燥产物溶于一第二溶剂中，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及
(d)浓缩或干燥步骤(c)之产物。
11.如权利要求10所述之萃取物，其中该第一溶剂为水，且该第二溶剂为95％(体积％)乙醇。
12.如权利要求10所述之萃取物，其中该第一溶剂为50％(体积％)乙醇，且该第二溶剂为95％(体积％)乙醇。
13.如权利要求12所述之萃取物，其中所述方法更包含：
(e)在执行步骤(d)前，对步骤(c)之溶液进行管柱层析，其系依序以20％(体积％)乙醇、95％(体积％)乙醇及丙酮来洗提该管柱。
14.如权利要求11所述之萃取物，其中所述方法更包含：
(f)对步骤(d)之产物进行管柱层析，其系依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80％(体积％)乙醇来洗提该管柱。
15.如权利要求14所述之萃取物，其中步骤(f)之产物包含香科酮。
16.一种治疗一罹患肠激躁症之个体的方法，包含对该个体施用一有效量的权利要求1所述的山姜属植物萃取物，以改善与肠激躁症相关的排便异常及腹痛症状。
17.如权利要求16所述之方法，其中该山姜属植物可以是益智仁(Alpiniaoxyphylla)、月桃(Alpinia zerumbet)、草荳蔻(Alpinia hainanensis)或红荳蔻(Alpinia galanga)。
18.如权利要求17所述之方法，其中该萃取物是由包含下述步骤的方法所制成：
(a)以一第一溶剂萃取该山姜属植物，其中该第一溶剂是选自由一超临界流体、水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷所组成之群组；以及
(b)干燥步骤(a)之萃取物。
19.如权利要求18所述之方法，其中该超临界流体可以是二氧化碳、水、甲烷、乙烷、丙烷、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇或丙酮。
20.如权利要求19所述之方法，其中该步骤(a)更包含一超临界流体之共溶剂，该共溶剂为甲醇或乙醇。
21.如权利要求18所述之方法，其中该第一溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；且藉由将该山姜属植物与该第一溶剂以重量比约为1：1至1:50的比例混合来进行萃取。
22.如权利要求21所述之方法，其中所述方法更包含下述步骤：
(a-1)在执行步骤(b)前，加入一第二溶剂至该萃取物，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷。
23.如权利要求22所述之方法，其中所述方法更包含下述步骤：
(a-2)在执行步骤(b)前，对步骤(a-1)之萃取物进行管柱层析。
24.如权利要求23所述之方法，其中该管柱层析系依序以水、30％(体积％)乙醇及95％(体积％)乙醇来洗提该管柱；且干燥该洗出物以制备该萃取物。
25.如权利要求18所述之方法，其中所述方法更包含下述步骤：
(c)将步骤(b)之冷冻干燥产物溶于一第二溶剂中，该第二溶剂可以是水、C1-4醇、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；以及
(d)浓缩或干燥步骤(c)之产物。
26.如权利要求25所述之方法，其中该第一溶剂为水，且该第二溶剂为95％(体积％)乙醇。
27.如权利要求25所述之方法，其中该第一溶剂为50％(体积％)乙醇，且该第二溶剂为95％(体积％)乙醇。
28.如权利要求27所述之方法，其中所述方法更包含下述步骤：
(e)在执行步骤(d)前，对步骤(c)之溶液进行管柱层析，其系依序以20％(体积％)乙醇、95％(体积％)乙醇及丙酮来洗提该管柱。
29.如权利要求26所述之方法，其中所述方法更包含下述步骤：
(f)对步骤(d)之产物进行管柱层析，其系依序以正己烷、乙酸乙酯及70-80％(体积％)乙醇来洗提该管柱。
30.如权利要求29所述之方法，其中步骤(f)之产物包含香科酮。
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