CN1174996C - 干细胞增殖抑制剂和刺激剂及其用途 - Google Patents

Abstract

公开的和要求保护的是干细胞调节因子的分离以及干细胞调节因子用于调节干细胞细胞周期和加快化疗后外周血细胞恢复的用途。亦公开和要求保护了干细胞增殖的抑制剂和刺激剂。

Description

干细胞增殖抑制剂和刺激剂及其用途

发明领域

本发明涉及干细胞增殖调节剂在治疗具有自身免疫疾病、衰老、癌症、脊髓发育不良、前白血病、白血病、牛皮癣、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、骨髓发育不良综合症、再生障碍性贫血或其它涉及增生过度或增生不足紊乱的疾病的人或动物中调节干细胞周期的用途以及这种化合物在止痛法的用途。本发明亦涉及治疗预期或已经暴露于化疗药物、其它破坏循环干细胞的药物或放射性照射的人或动物和在活体外治疗中保护对抗这种药物的方法。最后，本发明涉及自体和同种异体移植方法或基因转移以及增强这种程序的体内治疗的干细胞保持或扩增培养的改进。

发明背景

更新系统中的绝大多数终末期细胞是短命的，必须在生命期间连续更换。例如，血细胞源于多能造血干细胞(HSC)的自我更新群体。造血干细胞是一个亚群的造血细胞。可以从例如骨髓、脐带血或外周血(或者未动员或者用诸如G-CSF的药物动员)得到造血细胞；造血细胞包括干细胞群体、远祖细胞、分化细胞、辅助细胞、基质细胞和其它对产生成熟血细胞必须的环境起作用的细胞。造血远祖细胞是一个亚群的干细胞，其发育能力更具限制性。远祖细胞仅可以分化为一或二种谱系(例如仅产生红细胞的BFU-E和CFU-E或产生粒细胞和巨噬细胞的CFU-GM)，而干细胞(例如CFU-MIX或CFU-GEMM)可以产生多个谱系和/或其它干细胞。因为造血干细胞对造血系统和免疫系统的所有成熟细胞的发育是必需的，它们的存活对在用化疗或其它药物治疗的受治疗者中重建完全功能性宿主防御系统是必须的。

造血细胞的产生受一系列刺激造血细胞生长和分化的因子调节，一些这种因子例如红细胞生成素、GM-CSF和G-CSF正应用于临床实践。然而，尚未广泛地特征鉴定的该控制网络的一部分是控制干细胞循环状态的生理机制(Eaves等，Blood 78：110-117，1991；Lord，载于 Stem Cells(C.S.Potten编辑)第401-22页，1997(Academic Press，NY))。

Lord及其同事的早期研究表明，在正常和再生骨髓浸出物中存在可溶性蛋白因子，它们可以或者抑制或者刺激干细胞增殖(综述于：Lord和Wright，Blood Cells 6：581-593，1980；Wright和Lorimore，CellTissue Kinet.20：191-203，1987；Marshall和Lord，Int Rev.Cyt.167：185-261，1996)。这些活性分别命名为干细胞抑制剂(SCI)和干细胞刺激剂(SCS)。

至今，尚未从按照Lord等所述(以上引用的综述)制备的骨髓浸出物中纯化候选SCS分子。由于需要大量辐照小鼠的体内检测的内在困难，没有完成从主要来源(primary source)纯化或者SCS或者SCI。在克服这些困难的尝试中，Pragnell和同事开发了原始造血细胞(CFU-A)和做为抑制活性源的筛选细胞系的体外检测(参见Graham等Nature344：442-444，1990)。由于早先的研究已鉴别出巨噬细胞是可能的SCI源(Lord等Blood Cells 6：581-593，1980)，选择了小鼠巨噬细胞细胞系J774.2(Graham等Nature 344：442-444，1990)。Graham等使用了来自该细胞系的条件培养基进行纯化；分离了一抑制肽，证实它与先前描述的细胞因子巨噬细胞炎症蛋白1-α(MIP-1α)相同。已克隆MIP-1α受体；与其它化学激动剂受体相似，这些MIP-1α受体是七个跨膜域(或“G连接”)的受体，它偶联于G_抑制亚类(“G_i”)的鸟嘌呤核苷酸(GTP)结合蛋白(综述于Murphy，Cytokine & Growth Factor Rev.7：47-64，1996)。该Gi亚类的“抑制”定义指它对腺苷酸环化酶的抑制活性。

从细胞系而不是原始材料分离MIP-1α。虽然Graham等观察到MIP-1α的抗体消除了骨髓粗提物的活性，但其它工作者已显示其它抑制活性是重要的。例如，Graham等(J.Exp.Med.178：925-32，1993)建议TGFβ而不是MIP-1α是造血干细胞的主要抑制剂。另外，Eaves等(PNAS 90：12015-19，1993)建议，在正常骨髓中MIP-1α和TGFβ均以次最佳水平存在并且抑制需要这二种因子之间的协同作用。

最近，已产生其中该MIP-1α基因已通过同源重组缺失的小鼠(Cook等，Science 269：1583-5，1995)。这种小鼠的造血系统没有明显的紊乱，使对MIP-1α在正常体内平衡条件下做为干细胞循环的生理调节剂的作用产生疑问。类似地，尽管转化生长因子β(TGFβ)亦有干细胞抑制活性，但干细胞对该细胞因子应答需时很久，提示它不是存在于骨髓提取物中的内源因子；另外，TGFβ的中和抗体未消除骨髓上清液中的SCI活性(Hampson等，Exp.Hemat.19：245-249，1991)。

其它工作者已描述其它干细胞抑制因子。Frindel和其同事已从胎牛骨髓和从肝提取物中分离具有干细胞抑制活性的四肽(Lenfant等，PNAS 86：779-782，1989)。Paukovits等(Cancer Res.50：328-332，1990)已特征鉴定一个五肽，它在单体形式时是抑制剂，而在二聚体形式时是干细胞循环的刺激剂。亦有人认为其它因子在各种体外系统中具抑制性(参见Wright和Pragnell载于 Bailliere’s Clinical Haematology第5卷，第723-39页，1992(Bailliere Tindadall，Paris)；Marshall和Lord，IntRev.Cyt.167：185-261，1996)。

Tsyrlova等，SU 1561261 A1公开了干细胞增殖抑制剂的纯化方法。

共同拥有的申请WO94/22915和WO96/10634公开了干细胞增殖的抑制剂，其全文通过引用结合到本文中。

迄今，这些因子均未被批准用于临床。然而，需要有效的干细胞抑制剂。与化疗或放射治疗相关的主要毒性是正常增殖细胞的破坏，这可以导致骨髓抑制或胃肠毒性。有效的干细胞抑制剂将保护这些细胞并使这些治疗制度最佳化。正如根据临床情况确实需要各种各样的刺激性细胞因子(即诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子、flk2/flt3配体等刺激造血细胞循环的细胞因子)，亦可能需要各种抑制因子以处理相异的临床需要。

另外，需要快速逆转这种抑制剂的活性。Lord等的初始研究(上述引用的综述)证实，可以通过加入该刺激活性逆转该抑制活性。虽然已鉴别各种干细胞刺激性细胞因子(参见上述)，但均未证实它们表现出Lord和其同事描述的在骨髓提取物存在的活性和具有逆转该抑制剂活性的能力。

造血远祖细胞和干细胞主要存在于正常成人的骨髓中。在某些条件下，例如化疗或用诸如G-CSF的细胞因子治疗时，大量的远祖细胞和干细胞移出进入外周血，该过程被称为“动员”(综述于Simmons等，Stem Cels 12(增刊1)：187-202，1994；Scheding等，Stem Cells 12(增刊1)：203-11，1994，Mangan，Sem.Oncology 22：202-9，1995；Moolten，Sem.Oncology22：271-90，1995)。最近发表的数据提示大多数活动的远祖细胞在细胞周期中不活跃(Roberts和Metcalf，Blood 86：1600-，1995；Donahue等，Blood 87：1644-，1996；Siegert和Serke，Bone Marrow Trans.17：467-1996；Uchida等，Blood 89：465-72，1997)。

血红蛋白是分子量约为64,000道尔顿的高度保守四聚体蛋白。它由二个α链和二个β链组成。每个链结合一个血红素(亚铁原卟啉IX)分子-一种含铁的辅基。脊椎动物的α和β链可能来源于单个祖先基因，该基因复制然后分歧；这二种链在其之间和在各种脊椎动物之间保持高度序列相同性(参见图16A)。在人类中，在16号染色体上的α链簇含有二个编码相同多肽的α基因(α1和α2)以及编码其它类α链的基因(ζ和θ)和几个非转录假基因(参见图16B人类α链的cDNA和氨基酸序列)。在11号染色体上的β链簇含有一个β链基因(α1和α2)以及几个类β基因(δ、ε、Gγ和Aγ)和至少二个不表达假基因(参见图16C的人类β链的cDNA和氨基酸序列)。

这些基因的表达在发育中有变化。在已深入特征鉴定的人类血细胞生成中，胚胎成红细胞相继合成二个ζ链和二个ε链的四聚体(GowerI)、二个α链和二个ε链的四聚体(Gower II)或二个ζ链和二个γ链的四聚体(Hb Portland)。随着胚胎发生的进行，主要形式由包含二个α链和二个γ链的胎血红蛋白(Hb F)组成。在胎儿期开始合成成人血红蛋白(二个α链和二个β链)；在出生时约50％的血红蛋白是成人形式并在年龄为约6个月时完成转换。成人中的大多数血红蛋白(约97％)是二个α链和二个β链的变种(Hb A)并有少量可检测到的Hb F或δ链(Hb A2)。

已使用几种方法在大肠杆菌和在酵母中表达重组血红蛋白链(例如Jessen等，Methods Enz.231：347-364，1994；Looker等，Methods Enz.231：364-374，1994；Ogden等，Methods Enz.231：374-390，1994；Martin deLlano等，Methods Enz.231：364-374，1994)。因此尚远未可能通过重组方法高产率表达分离的人类α链(例如Hoffman等，PNAS 87：8521-25，1990；Heman等，Biochem.31：8619-28，1992)。显然，假定该分离α链的构象不稳定并在大肠杆菌中快速降解。共表达β链和α链导致二者的表达增加(Hoffman等和Hernan等，在所引的书中)。虽然该α链已做为与β链的一部分和因子Xa识别位点的融合蛋白表达(Nagai和Thorgersen，Methods Enz.231：347-364，1994)，但在这些条件下它做为不溶性包含体表达。

该β链和该α链均含有触珠蛋白结合位点。触珠蛋白是对血红蛋白有极高亲和性的血清蛋白(例如Putnam载于 The Plasma Proteins- Structure，Function and Genetic Control(F.W.Putnam编辑)第二卷，第1-49页(Academic Press，NY)；Hwang和Greer，JBC 255：3038-3041，1980)。触球蛋白运输至肝脏是循环血红蛋白的主要分解代谢途径。在该α链上有一个触球蛋白结合位点(氨基酸121-127)，在该β链上有二个触球蛋白结合位点(氨基酸区11-25和131-146)(Kazim和Atassi，Biochem J.197：507-510，181；McCormick和Atassi，J.Prot.Chem.9：735-742，1990)。

通过血红蛋白的蛋白水解降解得到了具有阿片制剂活性的生物学活性肽(综述于Karelin等，Peptides 16：693-697，1995)。血红蛋白α链在氨基酸94-95之间有一个酸不稳定切割位点(Shaeffer，J.Biol.Chem.269：29530-29536，1994)。

Kregler等(Exp.Hemat.9：11-21，1981)已公开了血红蛋白对小鼠骨髓CFU-C祖代集落具有增强活性。这种检测证实对与诸如CFU-MIX的干细胞相反的CFU-GM和CFU-M祖代群体的作用。作者在血红蛋白的分离α链和β链都观察到活性。该活性被N-乙基马来酰亚胺处理消除，提示Kregler等巯基是必需的。该观察与该刺激活性对胰蛋白酶消化有抗性的事实耦合，提示Kregler等C末端疏水域或“核心”区负责该活性。Moqattash等(Acta.Haematol.92：182-186，1994)已公开了重组血红蛋白对CFU-E、BFU-E和CFU-GM远祖细胞数量有刺激作用，与用氯高铁血红素观察到的类似。Mueller等(Blood 86：1974，1995)已公开了纯化的成人血红蛋白以与氯高铁血红素类似的方式刺激红细胞类祖代。

Petrov等(Bioscience Reports 15：1-14，1995)公开了“未鉴别的骨髓肽(myelopeptide)混合物”治疗W^v/W^v小鼠先天性贫血的用途。该混合物增加了脾集落尤其是红细胞类类型的数量。

已就其对血细胞形成的影响广泛地检测了血红素和氯高铁血红素(有关综述参见S.Sassa，Seminars Hemat.25：312-20，1998和N.Abraham等，Int.J.Cell Cloing 9：185-210，1991)。成红细胞的成熟需要血红素；氯高铁血红素(氯亚铁原卟啉IX，即具有另外一个氯离子的血红素)在体外增强CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E的增殖。类似地，氯高铁血红素在长期骨髓培养物中增加细胞构成。

“阿片制剂”是具有与吗啡(鸦片中的主要活性物质)类似的镇痛性质的物质。阿片制剂可以是小有机分子(例如吗啡和其它生物碱或合成化合物)、或诸如脑啡肽、内啡肽、强啡肽和其化学衍生物。内源阿片制剂肽在体内从较大的前体产生-Met-和Leu-脑啡肽的前体是前脑啡肽原，α、β和γ内啡肽的前体是前阿黑皮素原，强啡肽A和B、α-新内啡肽和β-新内啡肽的前体是前强啡肽原。另外，可以从非传统来源例如诸如α或β酪蛋白、面筋、乳清蛋白、细胞色素或血红蛋白之类的蛋白的蛋白水解或水解或从诸如蛙皮肤(皮啡肽)或牛肾上腺髓质的其它物质得到具有阿片制剂活性的肽。这种肽已被命名为“外啡肽(exorphins)”以与经典的内啡肽相对照；它们亦被称为非典型阿片制剂肽(Zioudrou等，JBC 254：2446-9，1979；Quirion和Weiss，Peptides4：445，1983；Loukas等，Biochem.22：4567，1983；Brantl，Eur.J.Pharm.106：213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.111：293-4，1985；Brantl等，Eur.J.Pharm.125：309-10，1986；Brantl和Neubert，TIPS 7：6-7，1986；Glamsta等，BBRC 184：1060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104：499-28，1993；Petrov等，Bioscience Reports 15：1-14，1995；Karelin等，Peptides 16：693-7，1995)。其它内源肽，例如Tyr-MIF-1家族，亦显示出具有阿片制剂活性(Reed等，Neurosci.and Biobehav.Rev.18：519-25，1994)。

阿片制剂通过与三个主要药理学类的内源阿片制剂受体-μ、δ和κ结合而发挥其作用。已克隆了代表每个药理学类的受体并显示出它们是偶联至G_i的G连接受体(综述于：Reisine和Bell，TINS 16：506-510，1993；Uhl等，TINS 17：89-93，1994；Knapp等，FASEB J.9：516-525，1995；Satoh和Minami，Pharm.Ther.68：343-64，1995；Kieffer，Cell.Mol.Neurobiol.15：615-635，1995；Reisine，Neuropharm.34：463-472，1995；Zaki等，Ann.Rev.Pharm.Toxicol.，36：379-401，1996)。

可以得到每种受体类型的特异性激动剂和拮抗剂，这些受体例如为μ受体(它们选择性地被DAMGO和DALDA激活，并选择性地被CTOP和naloxonazine拮抗)、κ受体(它们选择性地被GR 89696延胡索酸盐或U-69593激活，并选择性地被盐酸nor-binaltorphimine拮抗)和δ受体(它们选择性地被DADLE和DPDPE激活，并选择性地被natrindole拮抗)。另外，有对所有这三种受体亚型起作用的广谱拮抗剂(例如纳洛酮)和激动剂(例如羟戊甲吗啡)。

典型和非典型阿片制剂肽均可以化学改变或衍生，以改变其特异性阿片制剂受体结合特性(综述于Hruby和Gehrig，Med.Res.Rev.9：343-401，1989；Schiller，Prog.Med.Chem.28：301-40，1991；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104：499-28，1993；Handbood ofExperimental Pharmacology，A.Hertz(编辑)第104/I和104/II卷，1993，Springer Verlag，Berlin；Karelin等，Peptides 16：693-7，1995)。实例包括皮啡肽(例如DALDA)和脑啡肽(例如DADLE、DAMGO或DAMME)的衍生物。通常不与阿片制剂受体结合的肽例如生长抑素亦可以被衍生，以表现特异性阿片制剂受体结合(例如CTOP(Hawkins等，J.Pharm.Exp.Ther.248：73，1989)。亦可以从诸如改变了受体结合特性的吗啡的生物碱衍生类似物(例如海洛因、可待因、氢吗啡酮、羟氢吗啡酮、羟甲左吗喃、左洛啡烷、可待因、氢可酮、羟考酮、烯丙吗啡、纳洛酮、纳曲酮、丁丙诺啡、butanorphanol和纳布啡)；另外，结构与吗啡不相关的小分子亦可以作用于阿片制剂受体(例如哌替啶及其同性质物阿法罗定、地芬诺酯和芬太尼)(参见Handbook of ExperimentalPharmacology，在所引的书中；Goodman和Gilman的 The Pharmacological Basis of Therapeutics，第七版，A.G.Gilman，L.S.Goodman，T.W.Rall和F.Murad(编辑)1985 Macmillan Publishing Co.NY)。

内源阿片制剂肽(脑啡肽、内啡肽和强啡肽)具有一个保守N末端四肽Tyr-Gly-Gly-Phe，其后是Leu或Met和任何其余的C末端序列。去除N末端Tyr的羟基(产生一个N末端Phe)导致Met-脑啡肽活性的显著丧失。这些结构数据导致“信息-地址”假说，根据该假说，N末端“信息”赋予生物学活性，而C末端“地址”赋予特异性和增强的效力(Chavkin和Goldstein，PNAS 78：6543-7，1981)。外啡肽一般具有取代典型阿片制剂肽的N末端Tyr-Gly的Tyr-Pro；据认为该脯氨酸残基赋予对抗氨肽酶降解的较高稳定性(Shipp等，PNAS 86：287-，1989；Glamsta等，BBRC 184：1060-6，1992)。

最近通过与μ、δ和κ阿片制剂受体的序列相关性克隆了一个孤儿受体(orphan receptor)(“ORLl”)(Mollereau等，FEBS 341：33-38，1994；Fukuda等，FEBS 343：42-46，1994；Bunzow等，FEBS 347：284-8，1994；Chen等，FEBS 347：279-83，1994；Wang等，FEBS 348：75-79，1994；Keith等，Reg.Peptides 54 143-4，1994；Wick等，Mol.Brain Res.27：37-44，1994.Halford等，J.Neuroimmun.59：91-101，1995)。已克隆该受体的配体，各称为伤害感受肽(nociceptin)或孤儿肽(orphanin)FQ(以下称为“伤害感受肽”)并显示为衍生自一较大的前体的十七肽(Meunier等，Nature377：532-535，1995；Reinscheid等，Science 270：792-794，1995)。已证实它具有体内原伤害性、痛觉过敏功能，与具有止痛性质的典型片制剂相反。伤害感受肽具有Phe-Gly-Gly-Phe...N末端基序，与上述讨论的经典阿片制剂肽的Tyr-Gly-Gly-Phe...N末端基序形成对照。与经典阿片制剂肽的阿片制剂活性需要N末端Tyr相一致，伤害感受肽对该μ、δ或κ阿片制剂受体几乎没有表现出亲和性或没有亲和性。类似地，广谱阿片制剂拮抗剂纳洛酮对ORL1没有可察觉的亲和性。

已观察到脑啡肽对固定压力条件下的体内鼠血细胞形成有影响(Goldberg等，Folia Biol.(Praha)36：319-331，1990)。Leu-脑啡肽抑制骨髓血细胞形成，而met-脑啡肽刺激骨髓血细胞形成。Goldberg等相信，由于对糖皮质激素水平和T淋巴细胞迁移的影响，这些作用是间接的。Krizanac-Bengez等(Biomed.&Pharmacother.46：367-43，1992；Biomed.&Pharmacother.49：27-31，1995；Biomed.&Pharmacother.50：85-91，1996)观察了这些化合物在体外的作用。用Met-或Leu-脑啡肽或纳洛酮预处理鼠骨髓影响了在集落检测中观察到的GM远祖细胞的数量。这个作用是高度可变的并导致抑制、刺激或无作用；另外，没有清晰的剂量反应。Krizanac-Bengez等将该可变性归于昼夜节律和辅助细胞。

近来，已证实其中该μ阿片制剂受体已通过同源重组缺失的小鼠的每个股骨中有增加数量的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM。与正常小鼠相比，在这些μ受体剔除的小鼠中髓和脾祖代更快速地循环。未确定这些作用是否由这些动物中该μ受体缺失导致的对骨髓干细胞直接或间接的影响引起(Broxmeyer等，Blood 88：338a，1997)。

I.癌症的化疗和放疗

对刺激性生长因子的生产性研究导致多种这些因子(红细胞生成素，G-CSF、GM-CSF等)的临床应用。这些因子已降低与化疗和放射治疗相关的死亡率和发病率。对正在进行化疗或放射的病人的其它临床益处可以通过阻断干细胞进入细胞循环的通路由此保护它们免受毒性副作用的替代策略而实现。这种保护的逆转使得化疗或放疗之后骨髓功能快速恢复。

II.骨髓和干细胞移植、活体外干细胞扩增和肿瘤净化

骨髓移植(BMT)是对各种血液学的、自身免疫和恶性疾病的有用治疗。目前的疗法包括从脐带血、胎肝或从外周血(或者未动员或者已用诸如G-CSF或环磷酰胺动员)以及从骨髓得到的造血细胞；所述干细胞可以未纯化、部分纯化(例如CD34⁺群体的亲和纯化)或高度纯化(例如使用诸如CD34、CD38或若丹明的标记物通过荧光激活细胞分选)。目前正使用活体外造血细胞操作以将初始干细胞扩增为适于移植的群体。该方法的优化需要：(1)能保持血细胞形成的长期重建的足够数量的干细胞；(2)排除诱导移植物抗宿主的T淋巴细胞和(3)不存在残留恶性细胞。该方法可以通过包括干细胞抑制剂和/或干细胞刺激剂而优化。

用细胞毒性药物净化造血细胞以清除残留恶性细胞的效力由于这些化合物对正常造血细胞和特别是干细胞的毒性而受限制。需要在净化期间有效保护正常细胞；通过用有效抑制剂将干细胞退出循环可以提供保护。

III.外周干细胞的收获

对自体移植而言，外周血干细胞(PBSC)比骨髓提供一些潜在的优点。由于肿瘤牵扯或先前的化疗而无适当骨髓收获位点的病人仍可进行PBSC收集。使用血液干细胞消除了不能很好耐受的病人中全身麻醉的需要和外科手术步骤。对收集血细胞必需的分离性输血技术是有效的，并在大多数主要的医疗中心可广泛利用。该方法的主要限制是外周血中干细胞的低正常稳定状态频率和它们在用药物或生长因子(例如环磷酰胺、G-CSF、干细胞因子)动员程序后的高循环状态。有效的干细胞抑制剂可用于将这种细胞回复至静止状态，由此防止它们通过分化损失。

IV.治疗高增殖性紊乱

一些疾病的特征在于高增殖状态，其中异常调节的干细胞引起末期细胞的过量产生。这种疾病状态包括但不限于牛皮癣(其中表皮细胞过量产生)、特征在于肠息肉出现的胃肠道内的前恶性疾病和早期干细胞未被HIV感染但却快速循环导致干细胞耗尽的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。干细胞抑制剂将可用于这类疾病的治疗。

V.治疗低增殖性紊乱

一些疾病的特征在于低增殖状态，其中异常调节的干细胞引起末期细胞的不足量产生。这种病态包括脊髓发育不良综合症或再生障碍性贫血(其中血细胞产生不足)和细胞再生和更换缺陷的与衰老相关的病况。干细胞刺激剂将可用于这种病况的治疗。

VI.基因转移

目前正在临床背景下应用将遗传信息转移入造血细胞的能力。造血细胞是基因治疗的有用的靶，因为在活体外操作和处理这种组织时易于接近和广泛的经验以及因为血液细胞透过组织的能力。另外，通过将功能基因插入人造血系统的原始干细胞中，可以修正某些人类遗传缺陷。

使用逆转录病毒载体或者基因转移的物理技术将基因导入人类造血细胞有几个限制：(1)造血组织中干细胞的低频率需要发展高效基因转移技术；和(2)更快循环的干细胞证实对载体感染更敏感，但是通过用生长因子刺激干细胞增殖增加感染频率对长期基因表达产生负作用，因为含有转基因的细胞被迫不可逆地分化并丧失其自我更新。可以通过使用干细胞抑制剂以防止分化和自我更新的丧失和用干细胞刺激剂调节干细胞进入循环，并因此有助于逆转录病毒介导的基因转移而改进这些问题。

发明概要

本发明涉及包括为干细胞增殖的抑制剂和/或刺激剂的肽和多肽的化合物(INPROL和阿片制剂化合物)及其用途。

本发明包括以以下性质为特征的干细胞增殖抑制剂：

(a)鼠集落形成脾(CFU-S)检测中比活(IC₅₀)小于等于20ng/ml(参见实施例4)，

(b)分子量大于10,000道尔顿并小于100,000道尔顿(通过超滤)，

(c)活性对胰蛋白酶降解敏感，

(d)比MIP-1α或TGFβ疏水性更强，并可通过反相层析与这二者分离(参见实施例12)，

(e)在水溶液中于37℃、55℃或75℃加热1小时后保持生物学活性并且

(f)用丙酮中的1％盐酸沉淀后保持生物学活性。

本发明的另一特征及其与其它候选干细胞抑制剂(例如MIP-1α、TGFβ和各种寡肽)的区别在于，在短期预温育后的体外检测中达到抑制的能力(参见实施例5)。

本发明亦包括含有INPROL以治疗各种疾病的药用组合物。

本发明提供通过给予受治疗者有效量的干细胞抑制组合物治疗预期暴露下能够杀死或损伤干细胞的药物的该受治疗者的方法。通过该方法保护的干细胞可以是通常在骨髓、脐带血、胎肝中存在并在其中分裂的或动员进入外周血循环的造血干细胞。尽管根据荧光激活细胞分选(FACS)分析大多数动员的干细胞是静止的，但证实多能干细胞是循环的并可以被干细胞抑制量的INPROL抑制。另一方面，干细胞可以是上皮的，例如位于肠或头皮或身体的其它区域，或者是位于生殖器官内的生殖细胞。本发明的方法可以合乎需要地用于人类，虽然该方法亦包括动物治疗。如本文使用的术语“受治疗者”或“患者”指诸如包括人类的哺乳动物的动物。

本发明提供通过给予受治疗者有效量的干细胞刺激组合物治疗具有低增殖干细胞的该受治疗者的方法。通过该方法刺激的干细胞可以是通常存在于骨髓、脐带血、胎肝或动员进入外周血循环的造血干细胞；这种干细胞可以预先已用干细胞抑制有效量的INPROL置于静止状态。干细胞刺激有效量的INPROL将在需要时(例如在为用于活体外扩增、或体内用于干细胞移植和移入后而收获干细胞之后)刺激干细胞循环。或者，干细胞可以是上皮的，例如位于肠或头皮或身体的其它区域，或者是位于生殖器官内的生殖细胞。

在另一方面，本发明提供保护和恢复正在进行化疗的患者的造血、免疫或其它干细胞系统的方法，它包括给予该患者干细胞抑制有效量的INROL和/或通过给予干细胞刺激有效量的INROL在化疗或放疗之后刺激恢复。

在再一方面，本发明涉及一个方法，即通过给予患有癌症的患者干细胞抑制有效量的INPROL以保护骨髓、胃肠道或其它器官的干细胞免受化疗或放疗的毒性作用和/或通过给予干细胞刺激量的INPROL在化疗或放疗之后刺激恢复而辅助治疗任何癌症，包括那些以实体瘤为特征的癌症(例如乳腺、结肠、肺、睾丸、卵巢、肝脏、肾脏、胰脏、大脑、肉瘤)。

本发明的又一方面涉及治疗白血病(例如慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、骨髓瘤、霍奇森病)，包括用有效量的INPROL处理其中含有增殖性白血病细胞的造血细胞以抑制正常干细胞增殖，并用细胞毒性药物处理该骨髓以消灭白血病细胞。该方法可以通过接着用其它刺激其增殖的药物处理该骨髓而加强；例如，干细胞刺激量的集落刺激因子和/或INPROL。在一个实施方案中于体内进行该方法。或者，该方法亦可用于活体外用于移植的造血细胞的净化和扩增。

在再一方面，该方法涉及治疗具有由增殖干细胞引起的任何紊乱的受治疗者。通过给予该受治疗者有效量的INPROL以抑制或刺激上述干细胞的增殖，治疗这类紊乱，例如牛皮癣、骨髓发育不良、一些自身免疫病、衰老中的免疫抑制、脊髓发育不良综合症、再生障碍性贫血或AIDS中的干细胞耗尽。

本发明提供可逆地保护干细胞免受能够杀伤或损害干细胞的细胞毒性药物损伤的方法。该方法涉及给予预期暴露给这种药物的受治疗者有效干细胞抑制量的INPROL。

本发明亦提供在放疗或放疗后的恢复期可逆地刺激干细胞增殖的方法。该方法涉及给予预期暴露给这种药物的受治疗者有效干细胞刺激量的INPROL。

本发明亦提供：

通过以下程序从猪或其它骨髓分离的干细胞增殖抑制剂(参见实施例12)：

(a)提取骨髓并通过过滤除去颗粒物质，

(b)于56℃热处理40分钟，接着在冰浴中冷却，

(c)通过于4℃、10,000g离心30分钟除去沉淀，

(d)通过向含有1％(体积)浓盐酸的10倍(体积)搅拌冰冻丙酮中加入上清液，并于4℃温育16小时进行酸沉淀，

(e)通过于4℃、20,000g离心30分钟分离沉淀物并用冷丙酮清洗，接着干燥，

(f)通过反相层析分离，并通过抑制用5-氟尿嘧啶预处理并在鼠IL-3的存在下温育的骨髓细胞的集落形成、以及通过280nm吸收和通过SDS-PAGE监测活性。

本发明亦提供：

包括前述步骤的基本不含其它蛋白材料的干细胞增殖抑制剂的纯化方法，以下有更详细的描述。

本发明亦提供：

治疗人类或动物的方法，其中干细胞增殖抑制剂用来改进由干细胞高增殖引起的免疫抑制。

本发明亦提供：

治疗人类或动物的方法，其中干细胞刺激量的INPROL改进由干细胞低增殖引起的骨髓抑制。

本发明亦提供：

治疗人类或动物的方法，其中在所述干细胞通过暴露给细胞毒性药物或辐射程序诱导增殖后给予所述干细胞增殖抑制剂。干细胞通常为静止的，但在化疗后被刺激进入细胞周期。这使得它们对第二次化疗给药更加敏感；本方法保护它们抵抗这种处理。

本发明亦提供：

治疗人类或动物的方法，其中在给予干细胞抑制量的INPROL之前或之后，给予干细胞增殖刺激剂(例如干细胞刺激量的INPROL)以促进骨髓再生。干细胞抑制量的INPROL减慢干细胞通过细胞周期的速率并保护对抗化疗或放射；干细胞刺激量的INPROL逆转该抑制并促进骨髓恢复。相反地，可以用干细胞刺激量的INPROL促进骨髓恢复，而一旦达到骨髓恢复就接着用干细胞抑制量的INPROL将干细胞回复至静止。

本发明亦提供：

治疗人类或动物的方法，其中将所述干细胞增殖抑制剂做为佐剂在为提高免疫应答的疫苗接种之前或同时给予。

本发明亦提供：

治疗哺乳动物中免疫缺陷的方法，包括给予所述哺乳动物免疫刺激量的INPROL。

本发明亦提供：

治疗哺乳动物中疼痛的方法，包括给予所述哺乳动物诱导痛觉缺失量的INPROL。

本发明亦提供：

治疗接受细胞毒性药物或放射治疗的人类或动物的方法，它包括给予有效量的干细胞增殖抑制剂以保护干细胞免受损伤。

本发明亦提供：

治疗接受细胞毒性药物或放射治疗的人类或动物的方法，它包括给予有效干细胞刺激量的INPROL以增强治疗后的恢复。

本发明亦包括包含血红蛋白和药学上可接受载体的药用组合物。

本发明亦包括药用组合物，它包含(a)一多肽链，选自由血红蛋白α链、血红蛋白β链、血红蛋白γ链、血红蛋白δ链、血红蛋白ε链和血红蛋白ζ链、包含人α血红蛋白链的第1-97氨基酸的多肽链(“肽1-97”)和包含人α血红蛋白链的第1-94氨基酸的多肽链(“肽1-94”)组成的组和(b)一药学上可接受载体。这种药用组合物可以包含选自所述组的单个多肽、选自所述组的多肽混合物或以二聚体或多体形式存在的选自所述组的多肽以及含或不含血红素。

本发明亦包括具有以下序列的肽：

Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val(“肽43-45”)，Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys

其中这二个Cys残基形成二硫键(“环肽43-45”)，

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys

其中这二个Cys残基通过碳桥连接，

Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala(“肽64-82”)，和

包含如图16A中的人α血红蛋白的前97个N末端氨基酸的肽。

本发明亦包括由保持干细胞抑制和/或刺激性能的人α链的修饰形式组成的蛋白和肽序列。这种修饰包括但不限于C末端疏水域的去除或修饰(导致溶解特性改进)和/或触珠蛋白结合域的去除或修饰(导致药物动力学特性改进)。人α血红蛋白中的C末端疏水域包含从氨基酸98(苯丙氨酸)至141(精氨酸)的区域，并含有总共44个氨基酸中的23个疏水氨基酸。该整个域或一个或多个这些疏水氨基酸(6个丙氨酸、4个缬氨酸、8个亮氨酸、2个脯氨酸和3个苯丙氨酸)可以通过缺失除去(“缺失的”C末端疏水域)。或者，一个或多个这些氨基酸可以被非极性氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)置换(“置换的”C末端疏水域)。

在另一实施方案中，使用诸如羧甲基化的化学修饰，这降低该区的疏水性特征和增加溶解度。

在另一实施方案中，用人β血红蛋白序列的对应亲水区置换疏水残基。例如，在人β血红蛋白序列中，氨基酸107(甘氨酸)至117(组氨酸)之间的区或氨基酸130(酪氨酸)至139(天冬酰胺)之间的区都是相对亲水性的，每个或二者都可以置换人α血红蛋白中相当的疏水性区。

结合蛋白结合域包含于C末端疏水性区之内，并由氨基酸121-127组成。该区可以通过缺失全部除去，或该区内的一个或多个氨基酸可以缺失(“缺失的”C末端结合蛋白结合域)。该区或该区内的一个或多个氨基酸可以用诸如多聚丙氨酸或多聚甘氨酸或具有该多肽与结合蛋白结合但保持干细胞抑制活性的作用的其它氨基酸置换(“置换的”C末端结合蛋白结合域)。

本发明的其它实施方案包括对应于β血红蛋白链(或者在C末端疏水区内和/或在一或二个结合蛋白结合域(氨基酸11-25和氨基酸136-146)内)的修饰，和对应于所述δ、γ、ε和/或ζ血红蛋白链的修饰。

本发明亦包括编码上述鉴别的肽的DNA序列、含有所述DNA序列的载体和含有所述载体的宿主细胞。这些肽可以用标准化学技术(例如固相合成)或通过使用重组技术(包括诸如那些使用谷胱甘肽S转移酶(D.B.Smith和K.S.Johnson，Gene 67：31-40，1988)、硫氧还蛋白(La Vallie等，Biotechnology 11：187-193，1993)或遍在蛋白(Butt等，PNAS86：2540-4，1989；Cherney等，Biochem.30：10420-7，1991；Baker等，JBC269：25381-6，1994；美国专利5,132,213；5,196,321和5,391,490和PCTWO 91/17245)的融合系统)合成。每个这些文章、申请和专利通过引用结合到本文中。

本发明另外包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用可以结合阿片制剂受体(最好为μ亚类阿片制剂受体)的化合物接触造血细胞。本发明另外包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用可以结合伤害感受肽受体(例如ORL1)的化合物接触造血细胞。另外，本发明包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用可以接触“阿片制剂样”受体的化合物接触造血细胞。

已从血红蛋白分离出表现阿片制剂活性的肽(称为“hemorphins”)(例如Brantl等，Eur.J.Pharm，125：309-10，1986；Davis等，Peptides 10：747-51，1989；Hoffman等，PNAS 87：8521-25，1990；Hernan等，Biochem.31：8619-28，1992；Karelin等，Bioch.Biophys.Res.Comm，202：410-5，1994；Zhao等，Ann.N.Y.Acad.Science 750：452-8，1995；Petrov等，Bioscience Reports，15：1-14，1995；Karelin等，Peptides 16：693-697，1995)。每个这些文章通过引用结合到本文中。亦存在其它非典型阿片制剂肽和小分子(Zioudrou等，JBC 254：2446-9，1979；Quirion和Weiss，Peptides 4：445，1983；Loukas等，Biochem.22：4567，1983；Brantl，Eur.J.Pharm.106：213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.111：293-4，1985；Brantl和Neubert，TIPS 7：6-7，1986；Hruby和Gehrig，Med.Res.Rev.9：343-401，1989；Schiller，Prog.Med.Chem.28：301-40，1991；Glamsta等，BBRC 184：1060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104：499-28，1993；Handbook of Experimental Pharmacology，A.Hertz(编辑)第104/I和104/II卷，1993，Spinger Verlag，Berlin；Reed等，Neurosci.andBiobehav.Rev.18：519-25，1994；Karelin等，Peptides 16：693-7，1995)。每个这些文章通过引用结合到本文中。通过其结合阿片制剂、INPROL、hemorphin、外啡肽、伤害感受肽、Tyr-MIF-1家族成员、生物碱和/或其它以通过包含适量纳洛酮方式拮抗的或者抑制或者刺激干细胞增殖的化合物的能力，定义本文使用的“阿片制剂样受体”(参见实施例29和38)。

另外，本发明包括鉴别受体和配体的方法，包括在受体结合检测中使用INPROL(最好为诸如肽1-94、1-97、43-55或64-82的肽形式)。另外，本发明包括鉴别受体和配体的方法，包括在腺苷酸环化酶检测中使用INPROL。

本发明另外包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用可以激活最好是G_抑制亚型的那些GTP结合蛋白的化合物(例如肥大细胞脱粒肽)接触造血细胞。

本发明亦包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用选自具有以下序列的hemorphin肽组的肽接触造血细胞：

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro，

Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和

Tyr-Pro-Trp-Thr.

上述肽具有与其它非典型阿片制剂肽的序列类似性和/或与其类似的生物学活性，这些非典型阿片制剂肽诸如Tyr-MIF-1家族(综述参见Reed等，Neurosci.Biobehav.Rev.18：519-25，1994)、酪蛋白源性casomorphins(Brantl等，Hoppe-Seyler的Z.Physiol.Chem. 360：1211-16，1979；Loukas等，Biochem.22：4567-4573，1983；Fiat和Jolles，Mol.Cell.Biochem.87：5-30，1989)、得自称为cytochrophins的细胞色素b的肽(Brantl等，Eur.J.Pharm.111：293-4，1985)、各种来自人类或非人类物种的外啡肽和阿片制剂肽(Zioudrou等，JBC 254：2446-9，1979；Brantl，Eur.J.Pharm.106：213-14，1984；Brantl等，Eur.J.Pharm.125：309-10，1986；Brantl和Neubert，TIPS 7：6-7，1986；Glamsta等，BBRC 184：1060-6，1992；Teschemacher，Handbook Exp.Pharm.104：499-28，1993；Karelin等，Peptides 16：693-7，1995)以及源自筛选结合阿片制剂受体的组合文库的肽(综述参见Dooley等，Peptide Research 8：124-137，1995)的那些非典型阿片制剂肽。每个这些文章通过引用结合到本文中。

本发明亦包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用选自Tyr-MIF-1相关肽、casomorphins、cytochrophins和外啡肽的一种肽接触造血细胞。特别包括的是具有以下序列的Tyr-MIF-1肽：

Tyr-Pro-Try-Gly-NH₂，

Tyr-Pro-Lys-Gly-NH₂，

Tyr-Pro-Leu-Gly-NH₂，和

Pro-Leu-Gly-NH₂.

本发明亦包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用选自以下阿片制剂肽接触造血细胞：

(D-Ala²，N-Me-Phe⁴，谷氨酰基⁵)-脑啡肽    (DAMGO)

(D-Arg²，Lys⁴)-皮啡肽-(1-4)-酰胺         (DALDA)

(Phe⁴)-皮啡肽(Dermorphine)(1-4)酰胺

Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Arg-NH₂，

Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Lys-NH₂，和

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Val-NH₂.

本发明亦提供抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用选自吗啡、可待因、美沙酮、海洛因、哌替啶、阿法罗定、地芬诺酯、芬太尼、舒芬太尼、阿芬太尼、羟甲左吗喃、氢可酮、双氢可待因、羟考酮、氢吗啡酮、丙氧芬、丁丙诺啡、埃托啡、羟氢吗啡酮右旋丙氧吩(dextopropoxyphene)和甲氮_酚的阿片制剂激动剂化合物接触造血细胞。特别包括地是抑制量小于10^-7摩尔的吗啡。

本发明亦包括抑制或刺激干细胞增殖的方法，包括用选自纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、喷他佐辛、纳布啡和环丁羟吗喃的阿片制剂拮抗剂或混合激动剂/拮抗剂接触造血细胞。特别包括的是抑制量小于10^-8摩尔的纳洛酮。

本发明亦包括刺激干细胞增殖的方法，包括用干细胞刺激量的选自INPROL、肌红蛋白、DAMGO和DALDA的蛋白或肽接触造血细胞。

本发明亦包括在哺乳动物中进行基因治疗的方法，包括：

a)从所述哺乳动物取出造血细胞，

b)在活体外用干细胞刺激量的INPROL和/或阿片制剂化合物处理所述造血细胞，

c)用预先确定的基因转染或感染所述造血细胞，

d)在活体外用干细胞抑制量的INPROL和/或阿片制剂化合物接触所述转染的造血细胞，

e)将步骤d的造血细胞移植入所述哺乳动物

f)可选地在体内用干细胞抑制或刺激量的INPROL和/或阿片制剂化合物处理所述哺乳动物。

本发明亦包括进行活体外干细胞扩增的方法，包括用干细胞抑制量的INPROL和至少一种刺激性细胞因子处理所述造血细胞。在用该刺激性细胞因子接触之前、之中和/或之后，将INPROL与该造血细胞接触。活体外干细胞扩增使得可以从诸如脐带血、胎肝、化疗后等或纯化后(例如通过使用诸如CD34、CD38或若丹明的荧光激活细胞分选)的自体骨髓的有限来源产生足够量的干细胞。选择性生长特定造血谱系的能力也使得临床医生根据个别患者的需要特异性地设计干细胞移植物。

本发明亦包括进行活体外干细胞扩增的方法，包括用干细胞刺激量的INPROL在有或无至少一种其它刺激性细胞因子的情况下处理造血细胞。在用所述刺激性细胞因子接触之前、之中和/或之后，将INPROL与所述造血细胞接触。在活体外，干细胞刺激剂使得干细胞和/或祖代扩增而干细胞抑制剂使得干细胞保持在其未分化状态。亦可通过在体内使用干细胞抑制量的INPROL以保持干细胞处于静止状态直至将其移入而优化该程序，之后可以使用干细胞刺激量的INPROL刺激骨髓再生。可选地，可以将造血细胞分成二种制备物，一种用干细胞刺激量的INPROL处理以促进干细胞和/或祖代扩增，而另一种用干细胞抑制量的INPRO处理以保持干细胞处于其未分化状态。然后可以将这二种制制备物合并并输入患者。

本发明亦包括药用组合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一种选自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽焦Glu-Glu-Asp-Cys-Lys、四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)的抑制化合物。

本发明亦包括药用组合物，它包含(a)INPROL和(b)至少一种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子、δ样蛋白和flk2/flt3配体的刺激性细胞因子。

本发明描述了一种干细胞抑制剂(INPROL)，它不同于本领域已知的其它抑制剂，例如MIP-1α、TGFβ、Frindel和同事的四肽或Paukovits和同事的五肽(参看Wright和Pragnell，1992(在所引的书中))。自然发生的天然INPROL的分子量通过超滤测定超过10,000道尔顿，该分子量使其区别于所述四肽以及所述五肽。它在反相层析系统中比MIP-1α或TGFβ的更具疏水性，使其与这些细胞因子区别。另外，它的作用方式不同于任何以前描述的抑制剂，在于当它仅用于预温育期时在一个体外检测中有活性。例如MIP-1α仅用于预温育期时不是有效的(实施例5)。另外，自然发生INPROL在测定“高增殖潜力细胞”(HPP-PFC)的检测中有活性，而MIP-1α则无(实施例6)。INPROL与本领域已知的那些刺激剂不同，所述刺激剂例如为IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子和flk2/flt3配体。自然发生的INPROL与这些细胞因子几乎没有或没有序列相似性。

附图简述

图1-4显示纯化各阶段后产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图1-泳道1是糜蛋白酶原，泳道2是卵清蛋白，泳道3是BSA，泳道4是小于30kD的部分，泳道5是30-50kD部分，泳道6是50-100kD部分。

图2-泳道1是硫酸铵沉淀(40-80％)后，泳道2-5是DEAE部分(泳道#2代表所述活性部分)。

图3-泳道1是硫酸铵沉淀后的上清液，泳道2是所述活性DEAE部分，泳道3-5代表凝胶过滤部分(泳道#5代表所述活性部分)

图4-泳道2代表终产物。

图5显示最终纯化的反相HPLC层析图谱。

图6显示在无(对照＝0％抑制)和有各种量的从猪骨髓纯化的INPROL(pINPROL)的情况下氚标记的胸苷掺入(cpm)FDCP-mix系的细胞。根据对照值将数据归一化。

图7显示在用丙酸睾酮(TSP)、TSP加pINPROL、或载体(对照)处理小鼠后在细胞周期的S期的细胞百分比。每组含有25只动物(每个时间点3-4只)。

图8显示在用或不用pINPROL处理的情况下，用二个剂量5-FU处理的小鼠的存活情况。每个组含有30只动物。

图9显示在用或不用pINPROL处理的情况下辐射小鼠的存活。每个组含有50只动物。

图10A和10B显示用Ara-C或Ara-C加pINPROL处理后1周(10A)和3周(10B)时正常骨髓长期培养细胞的再生。

图11显示在致死辐射和用与培养基(对照)或pINPROL(25ng/ml)预温育4小时后的3×10⁴骨髓细胞移植后小鼠(每组75只)的存活。监测存活30天。

图12显示培养14天后由致死辐射和用pINPROL或培养基预温育4小时的供体骨髓细胞恢复的小鼠骨髓细胞形成的CFU-GM数量。

图13显示来自淋巴长期培养物的悬浮细胞，将其每周取出、清洗并在与培养基或pINPROL预温育4小时后与IL-7(10ng/ml)铺平板。

图14显示用pINPROL处理的白血病外周血细胞的改进的种群恢复能力。通过有和无pINPROL的情况下铺平板粘连和非粘连LTC细胞并在第7天计数CFU-GM，测定长期培养起始细胞(LTC-IC)。根据对照值将数据归一化。

图15A显示于53％乙腈洗脱的纯化pINPROL的C4反相层析图谱。泳道1是粗材料，泳道2是分子量标准参照物而泳道3是纯化材料。图15B显示于43.9％乙腈洗脱的MIP-1α的C4反相层析图谱。图15C显示粗pINPROL制备物和反相层析后的纯化制备物的SDS-PAGE层析图谱。

图16显示血红蛋白序列：图16A显示人α血红蛋白的cDNA序列和氨基酸序列，图16B显示人β血红蛋白的cDNA序列和氨基酸序列。编号系按照所述氨基酸。图16C显示人、鼠和猪血红蛋白的α和β链的氨基酸序列比较。

图17显示pINPROL(图17A)和结晶猪血红蛋白(图17B)的C4反相HPLC描图比较。

图18显示结晶猪血红蛋白C4反相HPLC分离部分的SDS-PAGE凝胶。泳道1显示分子量标准参照物，泳道2显示源自第一峰(于47.11分钟)的部分48-49，泳道3显示源自第二峰(于49.153分钟)的部分50-51，泳道4显示源自第三峰(于52.25分钟)的部分54-55，泳道5显示源自第四峰(于53.613分钟)的部分56-57。

图19显示pINPROL(图19A)和纯化猪β血红蛋白(图19B)的双向凝胶电泳比较。

图20显示纯化猪α血红蛋白、β血红蛋白或pINPROL在FDCP-MIX检测中的效果比较。

图21显示用小洗脱梯度反相分离猪血红蛋白。

图22A显示Hochuli等(1988)的质粒；图22B显示Loetscher等(1991)的质粒；图22C显示pDSUb质粒。

图23显示在圆石检测(cobblestone assay)中用INPROL处理的结果。

为更完全地理解本文描述的本发明，提出来以下详细描述。该描述做为本发明的实例，不应理解为具体限制本发明，并且认为本领域技术人员视野内的那些变化在本发明的范围之内。

推荐实施方案详述

INPROL可逆地抑制或刺激干细胞分裂。虽然不愿受制于特定的理论，但认为干细胞抑制剂和刺激剂通过影响干细胞通过细胞周期的速率施加其作用。具体地说，根据使用的量，INPROL在暂时性地抑制或刺激造血干细胞细胞分裂中有效。临床上使用可以抑制或刺激干细胞增殖的化合物的能力使得可以在例如化疗、干细胞移植或基因治疗方案中精巧地控制造血干细胞的循环。因此，可以使用本发明的方法通过保护干细胞免受由用于消灭癌症或病毒感染细胞的化疗药物或放射引起的损伤或通过刺激这种损伤后的恢复，而减轻化疗对患者的造血、骨髓和免疫系统的不良副作用。在本发明的一个实施方案中，将INPROL以足以抑制干细胞分裂的剂量给予患者，同时化疗药物作用于病态细胞。在化疗药物执行其功能后，被INPROL抑制的干细胞不需另外处理而回复为分裂中的细胞。如欲增强血细胞发生的再生，可以附加使用刺激性生长因子、细胞因子或干细胞刺激量的INPROL。

本文使用的术语“INPROL”包括如在实施例中纯化的哺乳动物和非哺乳动物蛋白、血红蛋白、血红蛋白α链(有或无血红素基团)、血红蛋白β键(有或无血红素基团)、α链和β键(有或无血红素基团)的混合物、具有抑制和/或刺激干细胞增殖的能力的包括胚胎、胎儿或成人形式(例如α、β、γ、δ、ε或ζ链，或者单独或者做为混合物，二聚体或多聚体，有或无血红素基团)的这些蛋白的片段或类似物。术语“ INPROL”包括这些蛋白的自然发生以及非自然发生(例如重组和/或合成产生)形式。术语“INPROL多肽”指由40个或更多氨基酸组成的INPROL。

本文使用的术语“阿片制剂化合物”是包括阿片制剂但不包括INPROL的化合物，它与阿片制剂受体(或与阿片制剂受体有序列相关性的受体，例如ORL1)结合并施加或者激动剂、拮抗剂或混合激动剂/拮抗剂活性。例如，存在μ受体(由DAMGO和DALDA选择性地激活，并被CTOP和naloxonazine选择性地拮抗)、κ受体(由GR 89696延胡索酸或U-69593选择性地激活，并被盐酸nor-bianltrophimine选择性地拮抗)和δ受体(由DADLE和DPDPE选择性地激活，并被natrindole选择性地拮抗)的特异性激动剂和拮抗剂。另外，有作用于所有这三种受体亚型的广谱拮抗剂(例如纳洛酮)和激动剂(例如埃托啡)。伤害感受肽特异性地激动ORL1受体。具有干细胞刺激和或抑制活性的阿片制剂化合物可以用于本文描述的INPROL的每个应用。

本文使用的“干细胞刺激量”是诱导干细胞增殖的量。本文使用的“干细胞抑制量”是抑制干细胞增殖的量。在体内和活体外的所有情况下，所选择的量取决于所选择的特定INPROL或阿片制剂化合物和特定条件或应用；特别是，等摩尔剂量的INPROL多肽或片段的活性与等摩尔阿片制剂肽或小分子的活性相同。

在欲抑制干细胞的典型临床情况下，以每日制度在标准化疗或放射治疗前4-60小时，当需要抑制干细胞循环时，使用例如0.01-100mg/kg、最好为0.1-1.0mg/kg给予的INPROL，以剂量单位形式通过静脉注射或输注将INPROL给予患者。

在需要刺激干细胞循环的情况下，例如化疗或放射后促进恢复的情况下，使用干细胞刺激量的INPROL。这种剂量通常为1-500mg/kg，最好为10mg至100mg/kg。

在需要使用阿片制剂化合物抑制或刺激干细胞循环的情况下，使用与INPROL所描述的等摩尔浓度的阿片制剂化合物。

在本发明的另一实施方案中，用干细胞抑制量的INPROL预处理允许化疗药物或放射的剂量增加超过患者正常耐受的剂量。类似地，用干细胞刺激量的INPROL在化疗或放射后处理亦允许增加化疗或放射的正常耐受剂量。

造血干细胞的大部分通常为静止的(缓慢或不循环)。然而，做为对化疗诱导的造血损伤的补偿性应答，化疗后大部分干细胞进入循环，这使得它们特别易受后续剂量的细胞毒性化疗或治疗辐射的攻击。通过抑制这种干细胞的循环，INPROL处理允许或者在常规或者提高剂量下提早或更频密地给予后续剂量的细胞毒性化疗。

一些正常个体具有自动快速循环的干细胞；干细胞抑制量的INPROL可以用于这种个体，甚至在第一次剂量的放射或化疗之前给予。

在本发明的一个实施方案中，在化疗的初始剂量后约24小时至10天时给予INPROL(0.1mg至6gm/kg体重-最好为1.0-60mg/kg)。再4-60小时后，最好为24-48小时后，给予另一化疗剂量。按照治疗利益继续所述交替的化疗和INPROL的循环。按照标准临床实践中特定肿瘤类型的适合性，选择化疗药物和给药方案。可选地，在化疗或放射治疗后使用诸如G-CSF、干细胞因子或干细胞刺激量的INPROL的刺激性生长因子以进一步改善造血重建。

对于活体外应用，当需要抑制干细胞增殖时，使用0.1ng至100ng/10⁶细胞/ml、最好为2-50ng/10⁶细胞/ml的INPROL。对于需要刺激干细胞的情况，使用10ng-100μg/10⁶细胞/ml、最好为1-100μg/10⁶细胞/ml的INPROL。

在需要使用阿片制剂化合物抑制或刺激干细胞循环的情况下，使用与INPROL所描述的等摩尔浓度的阿片制剂化合物。

在本发明的另一实施方案中，将INPROL用于制备供移植的自体造血细胞的方法中。用有效量的INPROL在活体外处理造血细胞以抑制干细胞分裂，然后通过给予该骨髓培养物有效量的化疗药物或放射清除癌细胞。最好是对循环细胞具特异性的化疗药物。将如此处理的骨髓再注射入所述自体供体。可选地，用干细胞刺激量的INPROL和/或已知刺激血细胞生成的另一药物治疗该患者，以改善该患者的造血重建。这种技术使得在自体骨髓移植期间有效地清除肿瘤细胞，同时保护造血干细胞。可以以活体外或体内净化方案提供这种保护。一旦移植成功，则需要干细胞快速增殖以再生正常骨髓功能。可以通过使用刺激干细胞循环并增强骨髓功能恢复的干细胞刺激量的INPROL提供这种快速增殖。

在本发明的另一实施方案中，将INPROL用于制备供基因治疗的造血细胞的方法中。用干细胞刺激量的INPROL和/或其它刺激性细胞因子在活体外处理造血细胞以刺激细胞分裂，然后用目的基因转染(最好用例如逆转录病毒载体感染)。完成转染后，清洗细胞并用干细胞抑制量的INPROL处理，以使干细胞回复静止。将如此处理的骨髓再注射入该供体。可选地，用干细胞抑制量的INPROL在体内处理患者，以保持干细胞处于其静止形式并增强其骨髓种群恢复能力。

在本发明的另一实施方案中，将INPROL做为白血病治疗中的辅助治疗使用。例如，在白血病细胞不应答INPROL的疾病状态中，用干细胞抑制量的INPROL活体外处理所述造血细胞。通过给予INPROL防止正常干细胞的增殖。因此，在增殖中的白血病细胞用细胞周期特异性细胞毒性药物处理期间，正常干细胞群体受保护免受损伤。另外，可选地给予诸如IL-3、GM-CSF的刺激性细胞因子，以在药物或放射治疗期间诱导白血病细胞循环，而正常干细胞则用INPROL保护。该患者用化疗药物或放射治疗以消灭白血病细胞，然后将净化的骨髓移植回该患者以建立造血重建。

类似地，在治疗涉及血液细胞或淋巴细胞的严重病毒感染(例如HIV感染)的病人的本发明的另一实施方案中，用INPROL并接着用病毒物、消灭感染细胞的抗药物或除去感染细胞的基于抗体的系统，在活体外或体内处理造血细胞。在重度骨髓抑制(myeloablative)抗病毒或重度骨髓抑制化疗从该患者消灭病毒宿主细胞后，将INPROL处理的骨髓细胞输回该患者。

在本发明的另一实施方案中，用INPROL治疗涉及高增殖性干细胞的疾病。例如，牛皮癣是由皮肤高增殖性上皮细胞引起的疾病，有时用细胞毒性药物治疗。其它其中涉及干细胞增殖的前瘤形成损害亦屈服于有效量的用于抑制干细胞增殖的INPROL。患有获得性免疫缺陷综合症的患者具有导致干细胞耗尽的异常高的干细胞循环速率；这些患者亦可从用抑制干细胞循环的有效量的INPROL治疗获益。对于这些用途，适合时使用表面或透皮传递组合物(例如软膏、洗剂、凝胶或膏药)做为非肠道给药的替代。

在大多数白血病情况下，白血病祖代是分化的细胞群，它们不受INPROL影响，因此可以通过诸如上述使用INPROL的方法治疗。在白血病祖代非常原始并对INPROL抑制直接敏感的情况下，通过给予有效量的INPROL减弱白血病细胞的增殖。

在本发明的另一实施方案中，使用INPROL治疗与低增殖性干细胞相关的疾病。例如，骨髓发育不良综合症和再生障碍性贫血是由骨髓低增殖性干细胞引起的疾病。其它涉及干细胞低增殖的综合症可以使用干细胞刺激量的INPROL治疗。

通过标准技术开发针对INPROL肽或多肽的单克隆或多克隆抗体。用许多本领域已知类型的可检测标记标记这些抗体或INPROL肽或多肽。然后将该标记INPROL或抗INPROL抗体用做干细胞标记，通过直接将其给予患者做诊断目的以鉴别和分离干细胞。或者，在活体外使用这些标记肽、多肽或抗体鉴别造血细胞制备物中的干细胞，以在骨髓中清除瘤形成细胞之前将其取出。以类似的方式，使用这种标记肽、多肽或抗体分离和鉴别上皮或其它干细胞。另外，通过中和INPROL活性治疗性地使用或通过检测循环INPROL水平诊断性地使用标记或未标记的这种抗体。

使用标准技术，可以从人类基因或cDNA文库克隆INPROL，以表达重组人INPROL。例如，使用从所述纯化蛋白得到的序列信息，构建可以例如用32-P标记的寡核苷酸探针，该探针并用其筛选适当的cDNA文库(例如来自骨髓的)。或者，使用抗体或使用适当的功能检测(例如实施例2中描述的检测)筛选来自适当来源(例如骨髓)的表达文库中编码INPROL的cDNA。已经使用本领域已知方法克隆和表达了血红蛋白自身以及单独的α和β链(参见Pagnier等，Rev.Fr.Transfus.Hemobiol.35：407-15，1992；Looker等，Nature 356：258-60，1992；Methodsin Enzymology vol.231，1994)。

本发明包括DNA序列，它包括：选定非哺乳动物宿主表达“优选”的密码子的加入；提供限制性核酸内切酶酶切位点；提供有利于易于表达的载体的构建或血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的产生或纯化的另外的起始、终止或中间DNA序列。

本发明亦提供编码血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的多肽类似物或衍生物的DNA序列，这些多肽类似物或衍生物在一个或多个氨基酸残基的同一性或位置方面不同于自然发生形式(即含有比所有指定残基少的缺失类似物；替代类似物，其中一个或多个指定的残基被其它残基置换；和添加类似物，其中一个或多个氨基酸残基被加入该多肽的末端或中间部分)，并具有一些或所有自然发生形式的性质。

在一有利实施方案中，INPROL是通过基因组或cDNA克隆或通过基因合成得到的外源DNA序列的原核或真核宿主表达(例如由培养中的细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞表达)的产物。即在一有利实施方案中，INPROL是“重组INPROL”。在典型的酵母(例如酿酒酵母)或原核生物(例如大肠杆菌)宿主细胞中的表述产物不与任何哺乳动物蛋白相联系。在脊椎动物(例如非人类哺乳动物(例如COS或CHO)和鸟类)细胞中的表达产物不与任何人类蛋白相联系。根据使用的宿主，本发明的多肽可以糖基化或可以非糖基化。本发明的多肽可选地亦包括起始甲硫氨酸氨基酸残基(位于位置-1)。

本发明亦包含诸如血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的多肽类似物的其它产物。这种类似物包括血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的片段。按照已知程序，可以容易地设计和生产编码微生物表达的具有在一个或多个残基的同一性或位置方面不同与本文指定的一级序列(例如置换、末端和中间添加和缺失)的多肽的基因。或者，通过众所周知的定点诱变技术可以容易地完成cDNA和基因组基因的修饰，并用该修饰产生血红蛋白α、β、γ、δ、ε或ζ链的类似物和衍生物。这种产物具有至少一种INPROL的生物学性质，但可以在其它性质不同。做为实例，本发明的产物包括通过例如缺失缩短的α、β、γ、δ、ε或ζ链；或那些对水解更稳定的产物(并因此比自然发生的具有更显著或更持久作用)；或它们已被改变以缺失或添加一个或多个潜在O-糖基化和/或N-糖基化位点、或其一个或多个半胱氨酸残基缺失或被例如丙氨酸或丝氨酸残基置换，并更易以活性形式从微生物系统分离；或其一个或多个酪氨酸残基被苯丙氨酸置换并更易或更不易与靶蛋白或靶细胞上的受体结合。亦包括仅重复所述α、β、γ、δ、ε或ζ链内连续氨基酸序列或二级构象的一部分的肽或多肽片段，所述片段可以具有INPROL的一种性质(例如受体结合)而不具有INPROL的其它性质(例如干细胞抑制活性)。值得注意的是活性对本发明的任何一个或多个产物具有治疗实用性或其它方面的实用性不是必须的，所述其它方面例如在抑制因子拮抗作用检测中。竞争性拮抗剂可以用于干细胞抑制剂或其受体过量产生的情况中。

另外，可以使用标准方法化学合成源自该蛋白序列的保持生物学活性的肽。本发明亦提供编码血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的肽类似物或衍生物的序列，它们在一个或多个氨基酸残基的同一性或位置方面不同于自然发生形式(即，含有比所有指定残基少的缺失类似物；替代类似物，其中一个或多个指定的残基被其它或者自然发生或者诸如D氨基酸的本领域已知的其它类似物残基置换；和添加类似物，其中一个或多个氨基酸残基被化学修饰，以增强稳定性、溶解度和/或对蛋白水解的抗性)，并具有一些或所有自然发生形式的性质。

可以通过各种方法鉴别诸如上述的肽序列。比较在检测中有活性的天然血红蛋白链(例如α链)和无活性的结构相关蛋白(例如肌红蛋白)的三维结构，可以鉴别在三维空间具有不同构象并因此是活性肽的候选区的区域。另一方法使用选择性蛋白水解，其中将蛋白水解酶用于血红蛋白链的有限度消化，产生可以通过例如反相HPLC分离并检测干细胞抑制的肽。亦可通过化学合成制备肽(例如固相合成)；可以容易地制备一系列包含目的血红蛋白链(例如α链)序列的重叠肽(例如15-mers)并在干细胞检测中测试。可以制备组合文库，其中进行多个化学合成并使选择的氨基酸位置可变，产生供筛选的大量的肽类似物(例如Dooley等，Peptide Research 8：124-137，1995)。或者，可以使用重组方法。可以使用定点诱变鉴别对特定血红蛋白链活性必需的关键残基。可以将已知为具有活性的干细胞抑制剂的链的区域(例如α链)用来自相关但无活性蛋白(例如肌红蛋白)的区置换并在干细胞检测中测试，使得可以鉴别对活性必需的区。这种被鉴别的区可以做为肽表达并在干细胞循环检测中测试活性。

来自其它物种的同源或类似INPROL形式可以用于各种兽医用途，与上述本发明的治疗实施方案类似。

干细胞抑制量的INPROL通过可逆地将循环干细胞置于不分裂或缓慢分裂“休息”状态作用于循环干细胞。当欲刺激静止干细胞进入分裂时，例如在用化疗药物或放射治疗患癌症的患者之后，可以使用干细胞刺激量的INPROL。或者，或另外，可以将集落刺激因子和其它造血刺激剂给予该受治疗者。这种因子的实例包括但不限于：M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF、巨核细胞-CSF、血小板生成素、干细胞因子或其它细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或红细胞生成素。

如下述方案例证的，通过结合了干细胞抑制活性的适当生物检测的常规化学方法，纯化或合成具有干细胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段。

在本发明的一个实施方案中，将治疗有效量的该INPROL蛋白或其治疗有效片段与药学上可接受载体混合使用。一般通过非肠道注射或输注给予该INPROL组合物。按照达到的治疗效果选择皮下、静脉内或肌内注射途径。

当系统性给予时，用于本发明的治疗组合物是无热原、非肠道可接受的水溶液形式。具有pH、等渗性、稳定性、载体蛋白等等的药学上可接受的无菌蛋白溶液在本领域技术范围之内。

本发明亦包括包含与用于INPROL疗法的合适的稀释剂、防腐剂、加溶剂、乳化剂、辅助剂和/或载体一起的治疗有效量的本发明肽或多肽产物的药用组合物。本文使用的“治疗有效量”指对给定疾病和给药制制度提供治疗效果的量。这种组合物是液体、凝胶、软膏或冻干或其它方式干燥的制剂并包括稀释剂，所述稀释剂有各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度、诸如白蛋白或明胶以防止表面吸附的添加剂、去污剂(例如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、加溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类)、填充物质或张力调节剂(例如乳糖、甘露糖)、诸如聚乙二醇的聚合物与该蛋白的共价连接、与金属离子络合、或将该材料加入到诸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的聚合化合物的颗粒状制剂中或上面、或加入脂质体、niosomes、微乳剂、微团、单层或多层小泡、生物可降解可注射微胶囊或微球体、或蛋白基质、红细胞影、原生质球、皮肤膏药或其它已知的释放或包装药物的方法。这种组合物将影响INPROL的物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控制或缓释组合物包括在亲脂贮存物(depot)(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。本发明亦包括用聚合物(例如聚羟亚烃(poloxamer)或聚乙二酰胺(poloxamine))包被的颗粒状组合物和偶联至抗组织特异性受体、配体或抗原的抗体或偶联至组织特异性受体配体的INPROL。本发明的组合物的其它实施方案对各种给药途径(包括非肠道、肺、鼻、表面(皮肤或粘膜)和口服)加入颗粒形式的保护包衣、蛋白酶抑制因子或透过增强剂。在另一实施方案中，将含有INPROL的组合物表面或通过透皮贴给药。

在一个实施方案中，本发明的组合物以剂量单位形式包装于无菌小瓶或安瓿瓶中。

本发明亦包含包括一个或多个其它因子的组合物，这种因子例如化疗药物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、顺铂、卡铂、阿霉素(doxyrubicin、依托泊甙、紫杉酚、烷化剂)、抗病毒剂(例如AZT、无环鸟苷)、TNF、细胞因子(例如白介素)、抗增殖药物、抗代谢药物和干扰DNA代谢的药物。

涉及治疗预期暴露给这种细胞毒性药物的受治疗者或治疗高增殖干细胞的方法的剂量制度由主治医师考虑各种调节药物作用的因素而确定；例如，考虑患者的病情、体重、性别和饮食、任何感染的严重性、给药时间和其它临床因素。

在受治疗者暴露给细胞毒性药物或放射之后，本发明的治疗方法可选地采用给予该受治疗者干细胞刺激量的INPROL并可选地包括一种或多种淋巴因子、集落刺激因子或其它细胞因子、红细胞生成素、白介素或生长因子，以一般地刺激受先前INPROL处理抑制的干细胞(和其后代)的生长和分裂。这种促进血细胞生成的治疗药物包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、巨核细胞-CSF、M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF或红细胞生成素。按照从这些药物在临床试验其使用在化疗或造血干细胞移植后促进造血重建的效力中得到的知识选择这些药物的剂量。可以调节这些剂量以补偿该患者的身体状况、暴露给该受治疗者的化疗药物或放射的量和类型中的变化。通过常规方法监视受治疗患者中由给予INPROL引起的干细胞抑制的逆转进程。

在治疗白血病中，同时与细胞毒性药物治疗或在辐射中同时给予抑制正常干细胞循环的INPROL和诸如IL-3或GM-CSF的白血病细胞生长刺激剂是有益的。通过这个方案，有可能在正常细胞和白血病细胞的循环状态和药物敏感性之间达到最大的差异。

实施例1：体内干细胞增殖抑制检测

为检测干细胞增殖，通过³H-胸苷“自杀”方法(Becker等，Blood 26：296-308，1965)测定细胞周期的S期中CFU-S的数量。

通过在静脉注射造血细胞8-12天后致死辐射小鼠的脾脏中形成目视可见的集落，可以检测未成熟造血祖代—脾脏中的集落形成单位(CFU-S)(Till和McCulloch，1961)。

对于标准CFU-S增殖检测，通常使用³H-胸苷“自杀”方法(Becker等，1965)。该方法基于DNA前体放射性标记的胸苷(³H-胸苷)在DNA合成中掺入细胞。在检测时处于周期的S期的CFU-S被高放射性杀伤，并因此不能在脾脏中形成集落。因此，通过注射未与³H-胸苷温育的细胞样品和与³H-胸苷温育的同样细胞形成的CFU-S数量之间的差异，显示出在原始样品中增殖CFU-S的百分比。

只要该抑制剂仅影响循环CFU-S(它们低至只占正常小鼠骨髓中的总CFU-S群体的7-10％)，则无法用来自未刺激动物的骨髓干细胞群体做抑制剂测试。

为刺激CFU-S增殖，使用了苯肼(PHZ)或亚致死辐射(Lord，1976)。

我们已开发了基于丙酸睾酮对CFU-S循环的刺激作用(Byron等，Nature 228：1204，1970)使用丙酸睾酮(TSP)的方法，该方法简化了检测且不引起任何副作用。TSP在注射后20-24小时内诱导刺激CFU-S增殖，并且该作用至少可以观察七天。

在该抑制剂纯化中用于筛选各部分的程序如下：

小鼠：在所有测试中都使用BDF₁或CBF₁小鼠品系。

通过腹膜内注射0.2ml/小鼠，用10mg/100g剂量TSP处理供体小鼠，以诱导30-35％的CFU-S进入S期。

24小时后，从股骨取骨髓以制备细胞悬液。然后将5-10×10⁶细胞/ml与不同的对照和测试部分于37℃在水浴中温育3.5小时，每组二管(一管为热的(放射性)、一管为冷的(无放射性))。

3.5小时后，以200μl/ml细胞悬液将³H-胸苷(1mCi/ml，比活18-25Ci/毫摩尔)加入每个热管中；冷管中未加。继续于37℃温育30分钟。

在30分钟温育后，通过加入10ml含有400μg/ml非放射性胸苷的冷(4℃)培养基终止该杀伤反应。彻底地清洗细胞(3次)。

将细胞再悬浮并稀释至适于注射的浓度，通常为0.3-0.5ml中的2-4×10⁴细胞/小鼠。

在注射前不迟于6小时辐射8-10只/组的受体小鼠。

在第9-12天收集受体脾脏，并在Tellesnitsky氏溶液中固定；通过目视计数统计集落。用以下公式计算在S期的细胞百分比。

$\%S=\frac{a-b}{a}\×100\%$

其中a-无³H-胸苷的CFU-S数量

其中b-有³H-胸苷的CFU-S数量

在表1中给出的INPROL测试数据证实循环干细胞用INPROL处理后变得对³H-胸苷的作用有抗性。对本实施例和以下所有实施例，术语“pINPROL”都指从猪骨髓纯化的蛋白。对于S期特异性细胞毒性药物阿糖胞苷和羟基脲观察到同样的保护(未显示数据)。如果然后用含有非放射性胸苷的冷培养基清洗所述处理的干细胞，则小鼠脾脏中存活的干细胞增殖正常地形成集落。

                             表1

   在与骨髓细胞4小时温育中pINPROL对CFU-S增殖的抑制活性

组别	-3H-TdR	+3H-TdR	3H-TdR杀伤的CFU-S百分比
未温育	22.2±2.0*	13.7±2.4*	38.3±1.7
与培养基温育4小时	18.7±3.0*	11.4±1.3*	43.1±1.4
与pINPROL温育4小时	21.2±2.3*	20.7±2.6*	2.1±0.08

^*CFU-S/2×10⁴细胞

实施例2：体外干细胞增殖抑制检测

使用以下测试系统(Lord等，The Inhibitors of Hematopoiesis第227-239页，1987)显示了INPROL的直接作用。将多谱系因子(IL-3)依赖性干细胞系FDCP mix A4(A4)保持于添加了20％马血清和做为集落刺激IL-3源的10％WEHI-3-条件培养基的IMDM培养基中。

使用氚标记胸苷掺入检测测定增殖：将A4细胞(含有20％马血清和50％WEHI-3 CM的100μl中有5×10⁴)于37℃在5％CO₂中培养16小时。

在开始时加入pINPROL或粗BME(部分IV)。然后将氚标记胸苷(50μl中的(³H-Tdr)3.7KBq，740GBq/毫摩尔)加入每个组中再温育3小时。通过收获细胞测定增殖水平并用以下公式计算抑制百分比

在梯度剂量的正常骨髓提取物或pINPROL的存在下生长的FDCP mix-A4(FDCPmix-A4)细胞的氚标记胸苷(³H-Tdr)的掺入描绘于图6。可见纯化的pINPROL组合物的活性至少比原材料高1,000倍。暴露时间(16小时)是有效抑制的重要因子，并显示了pINPROL对该A4细胞系干细胞的直接作用。

实施例3：通过INPROL体内注射剂量抑制CFU-S增殖和该作用的持 续时间

体内注射INPROL的效应研究揭示，INPROL可以有效地阻断募集CFU-S进入循环，由此保护那些细胞免受进一步治疗的细胞毒性作用，显示出其临床应用潜力。

该实验方案有二个目标：检查体内注射时INPROL对CFU-S的作用并确定与循环干细胞有关的INPROL活性的有效期。

为刺激干细胞增殖，基于上述实施例1中提及的作用，使用丙酸睾酮注射。

在第0天用TSP(10mg/100g)注射小鼠BDF1；24小时后每个实验组的小鼠(4只小鼠/组)接受剂量为0μg、5μg、10μg和15μg/小鼠的单次腹膜内注射pINPROL。

pINPROL注射后24小时，处死小鼠并通过实施例1中描述的检测测定循环CFU-S的百分比。与未处理小鼠的7％相比，TSP注射诱导了约50％CFU-S进入循环。低达2μg/小鼠的pINPROL剂量可以抑制TSP诱导的增殖降至正常水平。

关于该作用评价的持续时间，将一组小鼠(21只小鼠/组)仅用TSP注射，而另一组用TSP和pINPROL(TSP后24小时)注射。通过从每组中取三个供体并按照所述方法(参见实施例1)测定其骨髓中CFU-S循环状态，在一周内每24小时测定CFU-S循环。图7中给出的数据显示，虽然TSP的持续时间至少为7天，但INPROL的单次注射可以在不超过48-72小时内将CFU-S置于静止并保持它们置于循环之外。因为用于癌症和白血病化疗的大多数化疗药物具有相对短的体内半衰期，一般短于24小时，因此根据得到的数据，该INPROL作用的保持时间长于象阿糖胞苷或羟基脲的化疗药物在体内有活性的有效期。更重要地是，对于在第一次(对干细胞无损伤)和第二次(损伤CFU-S)治疗之间具有较长间隔(大于24小时小于96小时)的化疗和放射治疗，在化疗药物或放射的二次使用之间的间隔相间单次注射INPROL应是足够的。对于几次重复周期的细胞毒性疗法或放射，可以基于该INPROL作用的时间使用同样的策略。

实施例4：用5-FU处理后被刺激快速循环的大多数原始造血干细胞被 INPROL保护免受第二次5-FU暴露影响

药物5-氟尿嘧啶(5-FU)显著地降低骨髓和淋巴腔隙中的细胞数量。一般认为它是细胞周期特异性、导向快速增殖细胞，因为在细胞周期的S期之中或之前将该核苷酸类似物掺入DNA导致细胞死亡。小鼠骨髓的长期存活和免疫造血重建不受单剂量5-FU影响；然而，已证实(Harrison等，Blood 78：1237-1240，1991)多能造血干细胞(PHSC)在首次剂量后约3-5天的短时间内变得易受第二剂5-FU攻击。可以解释为PHSC的正常循环太慢，以至于使单剂量5-FU无效，并且被首次5-FU处理产生的刺激物刺激进入快速循环。我们已建议PHSC可以被INPROL回复至慢循环状态，并由此被保护免受第二次5-FU处理影响。

这些实验中使用的小鼠是BDF1雄性小鼠。以10μg/ml的浓度制备在生理盐水中的5-FU(Sigma)贮液。每只受处理的小鼠在实验的第0天通过尾静脉接受2mg 5FU/10g体重；24小时后用pINPROL(10μg/100g体重)腹膜内注射小鼠，并在第3天时注射第二剂的5-FU。通过观察各有30只小鼠的实验组(用pINPROL处理)和对照组的小鼠死亡进行存活研究。存活曲线示于图8。

实施例5：在骨髓细胞中用INPROL对比MIP-1α预温育的效果

本实验的目的是比较体外用pINPROL和MIP-1α预温育对小鼠骨髓的抑制效果。

使用以下程序：

体内：在从股骨收集骨髓48小时之前，用200mg/kg 5FU腹膜内注射6-15周龄的BDF1小鼠。

体外：计数单细胞混合悬浮液并将总体积2ml的5×10⁶细胞与有或无pINPROL或MIP-1α、与5％马血清、添加了L-谷氨酰胺的IMDM培养基于37℃和5％CO₂温育4小时。然后将该细胞清洗二次并再计数。将其于以下终条件中的甲基纤维素中铺平板：

0.8％甲基纤维素

25％马血清

20ng/ml重组鼠IL3

添加的L-谷氨酰胺

5×10⁵细胞/ml

IMDM培养基

将平板于37℃和5％CO₂和100％湿度中培养11天。计数多于50个细胞的集落。

                       表2

组别                集落数           对照百分比

对照                  31.0               100％

pINPROL               21.25              68.5％

MIP-1α                                35.25              114％

实施例6：pINPROL抑制HPP-CFC增殖

一种评价鼠重建干细胞和早前体的体外检测是高增殖潜能集落(HPP-PFC)检测；例如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的其它相关检测检测进行性受限制的祖代群体(M.Moore，Blood177：2122-2128，1991)。本实施例显示用pINPROL预处理细胞抑制其增殖，而MIP-1α在这些实验条件下未能抑制其增殖。

在检测其骨髓HPP-CFC数前用5-氟尿嘧啶(200mg/kg腹膜内)处理BDF1小鼠。通过离心清洗细胞，以10⁶-5×10⁶/ml的密度在或者未加药物(对照)、加pINPROL(25ng/ml)或MIP-1α(200ng/ml)的培养基中培养4小时。培养后，清洗细胞并铺平板于含有30％FCS和来自5637和WEHI-3B细胞系的混合条件培养基(如Sharp等，1991推荐，每种条件培养基各7.5％的琼脂(0.3％)。铺平板浓度为60mm平皿中5×10⁴细胞/ml。在第14天时计数集落，结果示于以下。

                       表3

组别                HPP-CFU                对照百分比

对照                  15.5±1.2               100％

pINPROL               8.3±0.7                53.5％

MIP-1α                               15.8±0.9               101％

根据这些结果，当仅在预温育期存在时，MIP-1α不抑制最不成熟前体的增殖。pINPROL在这些条件下有效地抑制增殖，表明pINPROL和MIP-1α之间在生物学活性方面的基本差异。

实施例7：INPROL疗法对从放射诱导骨髓发育不全恢复的影响

骨髓发育不全是放射癌症疗法的主要限制性毒性。已证实某些生长因子(例如G-CSF、GM-CSF、红细胞生成素)可以加速从放射诱导骨髓发育不全的恢复。通过使用干细胞增殖抑制剂保护的概念是应付造血损伤的不同和补充的方法。为遵循先前发展的治疗方法(实施例3、4)，建立了小鼠致死辐射模型。本领域已知接受9Gy钴60的小鼠在10-14天后开始死亡；至第30天，死亡率约为50％。通过将其分为二个相继的4.5Gy应用并且二次剂量间隔3天，将该致死剂量用于我们的模型。初步的数据显示，该模型中的存活曲线与用单次9Gy辐射的存活曲线非常接近；另外对CFU-S增殖的测试显示，在第一次辐射后24小时时，35-50％的CFU-S被诱导增殖。通过在第二次剂量之前提供的干细胞抑制剂保护这种细胞。

为检查这种可能性，使小鼠(50只小鼠/组)在第0天接受4.5Gy。24小时后，一组接受pINPROL(2μg/小鼠，腹膜内)，另一对照组用盐水注射。在第3天时给予第二次放射剂量(4.5Gy)。

图9显示在单剂量pINPROL后存活增加。该模型的条件与治疗包括那些特征为实体瘤的任何癌症临床上相关；通过在二次连续放射剂量之间提供有效剂量的INPROL，可以将这种治疗给予患有癌症的患者，由此允许使用更大剂量的放射以治疗该癌症。亦可能将该用药程式延伸至化疗药物。

实施例8：INPROL用于自体骨髓移植的用途

骨髓移植对几种白血病(CML、AML和其它)是唯一已知的治疗性疗法。活体外调节自体BMT用于输注将提供潜在的不含白血病污染的正常干细胞自体源，并可以种群恢复该受体的造血系统以允许攻击性的和有效的疗法。

1.研究INPROL在用AraC净化期间保持正常血细胞发生的 作用的长期骨髓培养物L1210白血病模型

按照Toksoz等(Blood 55：931-936，1980)建立长期骨髓培养物(LTBMC)，并通过在二周内共培养将白血病细胞系L1210用于所述LTBMC。在这些联合LTBMC/L1210培养物中发生正常和白血病祖代的同时生长，与白血病患者骨髓中的情况类似。通过将其做为琼脂集落在有或无来自WEHI-3(产生鼠IL-3的细胞系)的条件化培养基的情况下生长可以区别正常集落形成单位CFU和白血病CFU。在不存在IL-3时，正常细胞经历细胞凋亡，而白血病细胞可以在不存在IL-3时形成集落。来自LTBMC-L1210组合物的悬浮细胞的约每50,000个铺平板细胞在存在IL-3的情况下产生约150个集落(正常造血克隆)，而在不存在IL-3生长时产生约70个集落(白血病克隆)。

净化的程序如下：第0天时，将所有的悬浮细胞和培养基(10ml/烧瓶)从含有LTBMC-L1210的烧瓶中取出，并用2ml含有200μg阿糖胞苷(AraC)的培养基(Tsyrlova等，载于 Leukemia：Advances in Biology and  Therapy第35卷，1988)置换；培养24小时后，清洗烧瓶并用2ml新鲜的单独培养基(对照组)或含有25ng/ml的pINPROL置换4小时。在这次预培养后，将细胞再次与100μg/烧瓶的AraC于37℃温育3小时。各组有4只烧瓶。将LTBMC-L1210清洗三次，并用新鲜LTBC培养基置换；将其如前保持3-4周以进行再生研究。

数据示于图10。在仅用AraC处理的对照培养物中未见细胞生长，而在INPROL保护的烧瓶中血细胞发生的再生由于来自粘附层的祖代的增殖而更快速地发生。另外，实验组的细胞当铺平板于琼脂中时仅在IL-3存在的情况下生长，产生约100CFU/50,000细胞；在至少四周内未观察到白血病细胞生长。因此，用有效剂量的AraC与INPROL联合活体外处理骨髓，可以清除癌症细胞，而干细胞受到保护。应可以将此用药程式延伸至其它形式的化疗或放射治疗。

2.通过体外INPROL处理增强骨髓种群恢复能力(MRA)和30天 的放射保护

MRA(细胞种群恢复致死辐射小鼠骨髓的能力)以及赋予放射保护30天的能力是拯救骨髓抑制动物的潜力的体内直接测量(Visser等，Blood Cells 14：369-384，1988)。

为进行放射保护研究，将BDF1小鼠用9.5Gy辐射，并通过移植睾酮刺激供体骨髓恢复。一组受体用与培养基(对照-A组)、另一组(B组)与25ng/ml pINPROL预温育4小时的骨髓细胞恢复。清洗这二组中的细胞，并将30,000细胞/小鼠移植入辐射动物中。显示了存活数据(图11)。用对照归一化至100％，描绘了三个实验的总和。在第30天时，pINPROL培养使小鼠的存活率从对照组的36.5％增加至61.8％

通过用INPROL预培养诱导的MRA增加可能是改善放射保护的机理之一。为检查该假设，按照Visser等所述(在所引的书中)测定MRA。简言之，将供体BDF1小鼠用睾酮预处理，将其骨髓用培养基或pINPROL预培养4小时，并注射入辐射动物中。在第13天，将来自受体股骨的骨髓细胞以三个不同浓度(相等于0.01，0.05，0.1个股骨)在有20％马血清和10％WEHI-CM的存在下铺平板于琼脂中。第7天的集落数代表MRA，只要在此时受体骨髓的集落形成细胞是供体未成熟干细胞的祖代。

如图12所见，用INPROL预培养的细胞群体的MRA高于对照组(B)。

实施例9：INPROL对干细胞的抗高增殖作用可以改变其分化异常

不仅在从细胞毒性药物或辐射恢复期间，而且做为正常衰老的结果都观察到CFU-S高增殖，据认为它是骨髓发育不良综合症(MDS)的主要特征。它伴随着分化异常，例如红细胞类分化占主导，而沿粒细胞路径的分化减少。

将骨髓细胞与25ng/ml pINPROL或培养基(对照)于37℃培养4小时，然后清洗细胞并铺平板于含有20％马血清、2U/ml红细胞生成素和10％WEHI-CM的琼脂中。在第7天计数BFU-E和GM-CFU的数量。表4中提供的数据系从三个实验的概括-每组每个点取4只动物；铺了四个平板。

如表4明显所示，用INPROL培养完整幼龄动物(8-12周龄的BDF1)的正常骨髓(NBM)，不改变不同类型集落的数量或比例。用丙酸睾酮(TSP)预处理的BDF₁供体显示出与以前(实施例1、3、4)观察的相同的CFU-S增殖的增加、红细胞类祖代数量(BFU-E集落)略有增加、GM-CFU减少，这通过用INPROL培养完全取消。另外，CFU-S增殖的异常高水平被回复至细胞周期S期的10％CFU-S。已知CFU-S高增殖是一些易感病毒性白血病诱导的小鼠品系的特征，例如Balb/c小鼠(表4)，也可以在较老动物中观察到(表4)。在均具有异常高水平CFU-S增殖的Balb/c和较老(23-25月龄)的BDF1中观察到在TSP处理的BDF1中观察到的相同的定型祖代的再分布。通过用INPROL培养诱导了CFU-S增殖和分化的更正。对临床更相关的是，该研究表明体内注射INPROL(2μg/小鼠)影响CFU-S的增殖和红细胞类(BFU-E)和GM集落的比例(表4)。

                               表4

           INPROL对CFU-S分化为定型祖代BFU-E和CFU-GM的影响

骨髓供体	pINPROL	3HTdR杀伤的CFU-S百分比	BFU-E	CFU-GM
幼龄BDF1	-+	12.0±0.315.0±1.3	28.33±1.9122.00±3.74	46.22±3.4447.70±3.72
老龄BDF1	-+	47.1±1.911.4±0.7	43.75±1.5415.25±1.45	24.0±1.3344.0±7.63
TSP刺激的BDF1	-+	53.2±1.67.2±0.4	32.67±2.4412.00±1.83	15.71±2.2835.50±1.4
Balb/C	-+	57.0±1.923.0±2.4	47.60±2.9624.86±2.53	33.57±3.4570.60±4.96

实施例10：INPROL的免疫刺激活性

已观察到用INPROL培养含有高比例增殖CFU-S的骨髓细胞不仅改变CFU-S的循环，而且改变其分化，将占优势的红细胞类分化转为利于粒细胞和淋巴类祖代。由于细胞毒性化疗或放疗的免疫抑制副作用、以及伴随高增殖干细胞紊乱和衰老的免疫抑制，INPROL的这种性质是重要的。

本实施例显示INPROL对来自按照Wittlock和Witte(Ann.Rev.Immun.3：213-35，1985)建立的淋巴长期培养物(LLTC)的未成熟前体分化成为前B祖代的直接作用，通过在含有IL-7的甲基纤维素中形成集落来测定。

如所述建立LLTC，每周二次用新鲜LLTC培养基(Terry Fox Labs.，Vancouver，Canada)饲养。每周收获未粘附细胞一次，洗去各种因子并用25ng/ml pINPROL或仅用培养基做为对照培养4小时。培养后，清洗细胞并以10⁵细胞/ml的浓度铺平板于含有30％FCS和10ng/ml IL-7的甲基纤维素中。三周的数据示于图13。对照中大前B集落的数量有变化，并随时间增加，但是用INPROL预培养总是刺激集落生长超过对照水平的4-8倍。这证实了INPROL的免疫刺激性质，该性质可以用于更正免疫缺陷状态和增强例如对接种疫苗所需的免疫应答。

实施例11：INPROL提高干细胞—来自患有CML患者的长期培养物 起始细胞的种群恢复能力

慢性髓细胞性白血病(myeloid leukemia)(CML)是造血干细胞的致死恶性疾病。用单药物化疗、联合化疗、脾切除术或脾辐射治疗慢性期的CML可以控制临床病症和症状，但不能显著地延长存活。当CML从慢性期发展进入加速期时，标准疗法无效。目前，骨髓移植(BMT)是CML的唯一有疗效的疗法。由于组织不相容性问题，用不相关供体BMT的疗法是困难的。少于40％其它方面合格的CML患者有合适匹配相关供体；因此最好用自体移植。用于输注的自体BMT在活体外调节与选择在长期培养物(LTC)中生长的来自Ph阳性患者非白血病(Ph阴性)骨髓祖代的能力，提示正常干细胞自体源允许攻击性和有效的CML疗法的潜力。

在BMT方面，可以将造血干细胞定义为具有长期产生成熟血细胞能力的干细胞。我们已使用由C.Eaves和A.Eaves开发的人类LTC系统，以定量测定干细胞数量和做为操作它们供治疗用途的工具。这涉及将细胞接种入预建立的辐射人类骨髓粘附层；然后将这些培养物保持5周。结束点是在该时间终点收获的该培养物的总克隆生成细胞含量(粘附+不粘附)。在这些条件下克隆生成细胞产量与初始加入的祖代(长期培养物起始细胞(LTC-IC))数量线性相关；单个人LTC-IC的平均产量是4个克隆生成祖代/LTC-IC。先前已表明，当将患有CML患者的骨髓置于类似条件时，白血病(Ph阳性)克隆生成细胞快速减少。通过使用残留正常LTC-IC的定量，有可能在患有CML的患者中选择那些可能从由移植培养的自体移植物支持的加强疗法受益的患者(Phillips等，Bone Marrow Transplantation 8：477-487，1991)。

使用了以下程序以检查INPROL对从患有CML患者的外周血建立的骨髓移植细胞中克隆生成细胞(LTC-IC)数量的作用。

做为长期培养物在预辐射基质上起始培养。使用健康供体的外周血做为对照。用或不用pINPROL(25ng/ml)预培养来自CML患者的外周血细胞4小时，清洗细胞并置于该LTC-IC系统中5周，以测定LTC-IC的对照数量。对于实验，建立其它的平行培养物10天。将生长10天的培养物的粘附和不粘附细胞的混合物用或不用pINPROL预培养，再置于预建立的饲养层(feeder)上8周。通过将粘附和不粘附细胞铺平板于含有适当生长因子的甲基纤维素(Terry Fox Laboratories，Vancouver，Canada)上，并计数产生的集落形成细胞总数，估计各个实验培养物的LTC-IC数量。使用以下公式从总克隆生成细胞(CFC)含量的评价推导使用这个程序得到的LTC-IC值：

                  #LTC-IC＝#CFC/4

图14提供的数据显示，在从健康供体骨髓起始的培养的前10天期间没有LTC-IC损失，培养5周后仍有约30％的投入LTC-IC数量存在。在所述10天内，CML患者的LTC-IC数量剧烈下降至约8％并在进一步的培养期间未恢复，而用INPROL预培养细胞将LTC-IC水平增加至起始数量的30％并在8周内保持。

通过这些初始数据预测的INPROL临床相关应用包括将其用于选择性增加新鲜或培养的骨髓移植物的正常干细胞含量的策略、增强体内调集残留正常干细胞的策略和将新遗传物质转移入人类骨髓干细胞以进一步移植入患者的方案。

实施例12A：从骨髓制备物分离干细胞增殖的免疫活性抑制剂的方法

从猪肋骨分离骨髓。分离猪尸体的肋骨并去除肌肉纤维和脂肪，将肋骨切成块，用Biophyzpribor制造的水压机提取骨髓。通过在K-70离心机中以2,000rpm离心20分钟分离骨髓细胞。然后通过AmiconUSA膜XM-100、PM30、PM-50对提取上清液连续进行超滤。根据电泳分析结果，该产物的主要组分是白蛋白(参见图1)。

生化纯化

在纯化的每个步骤，通过在含有0.1％十二烷基磺酸钠的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析骨髓提取物和各部分的蛋白组分。将最多7％的十二烷基磺酸钠和最多0.5-1％的巯基乙醇加入样品中，该样品在上胶前在70℃温育5分钟。

以20Y cm该凝胶进行电泳5小时。然后将该凝胶在乙醇∶水∶乙酸为5∶5∶1的混合物中的0.25％考马斯CBBC250中于20℃染色1小时并用几遍7％乙酸清洗。通过抑制造血干细胞(CFU-S)增殖的方法评价该产物的活性。以下详细介绍该方法。

阶段1. 用硫酸铵沉淀纯化

通过用25％的硫酸铵以40-80％的饱和度沉淀纯化所述活性，根据表5中的结果选择该饱和度。

                                        表5

饱和度(％)      0-40           40-60          60-80         80-100

活性(％)        37.2-35.4      37.2-1.8       37.2-12.8     37.2-26.1

                ＝1.8％        ＝35.4％       ＝24.4％      ＝11.1％

按照纯化的水平和等于起始产物的2×10^-2mg的剂量，确定各步纯化后检测使用的该制备物的量。通过以下公式确定活性：

％变化＝％Sa-％Sb

其中％Sa是对照的％S

％Sb是用检测部分培养后的％S。

将该部分脱盐以在每次活性检测之前和每个后续纯化步骤之前将硫酸铵的浓度降低20倍。

阶段2.将阶段1的不纯抑制剂在脱盐后使用离子交换层析(此处为DEAE 23纤维素)上样和分部分离，然后用乙酸钠缓冲液(pH 6.0)梯度洗脱。

抑制剂的活性部分在3-5mM之间洗脱出。

该柱的体积为1ml，洗脱速度是4ml/小时。通过层析Millicrome在230和280nm进行检测。在5mM乙酸钠缓冲液中分离并洗脱出表现出最高活性的部分1(参见图2)(参见表6)。

                                    表6

部分       1           2            3           4            5

活性       46.3-0      46.3-14.1    46.3-42.1   46.3-19.6    46.3-45.1

           ＝46.3％    ＝32.2％     ＝4.2％     ＝26.7％     ＝1.2％

电泳数据表明主要的蛋白污染物-白蛋白(参见图3)被从该部分中除去，导致再纯化四倍。

阶段3.将阶段2的部分纯化的抑制剂直接上G-75 Sephadex柱。

该柱的体积是20ml(20×1)，洗脱速率是2ml/小时。洗脱缓冲液是50mM NaCl、10mM Tris-HCl，pH7.5。在层析Millichrome上以230和280nm进行检测。分离具有最高活性的部分5。

                                   表7

部分          1             2            3           4          5

活性          42.2-19.1     42.2-35.2    42.2-21.5   42.2-38.8  42.2-0

              ＝23.1％      ＝7.0％      ＝20.7％    ＝3.4％    ＝42.2％

阶段4.在Ultrasfera基质上使用Pro-REC柱进行反相层析(Pharmacia FPLC系统)。使用乙腈梯度中的0.1％三氟乙酸洗脱蛋白。

分子量为16-17kD的产物的均一性等于90％，如分析丙烯酰胺/十二烷基磺酸钠凝胶所示(参见图6)。结果呈于图4。在部分5测定到活性。该产物的最终收率为5％。结果，纯化后分子量为16kD的蛋白的总量是650ng/ml起始产物。在纯化过程中将该产物于70℃温育几分钟，但未检测到生物学活性损失。

实施例12B： 分离大量INPROL的替代方法

起始分离

将新鲜猪尸体的肋骨除去肌肉纤维和脂肪，然后切成块，并以1∶1的比例(重量/体积)浸泡于磷酸缓冲盐水中。用水压机压榨得到的混合物，以从固体骨材料分离骨髓。

收集骨髓细胞悬浮液并通过四层干酪包布滤去固体颗粒。将滤液于56℃温育40分钟，然后在冰浴中冷却至4℃。通过于10,000g于4℃离心30分钟除去得到的沉淀并将其废弃。

在30分钟内将该澄清的上清液滴加到10倍体积的含有1％(体积)浓盐酸的搅拌的冰冻丙酮中。将得到混合物保持于4℃16小时，以使沉淀形成完全。然后通过于4℃以20,000g离心30分钟沉淀该沉淀物。用冷丙酮洗涤该沉淀并干燥。

HPLC纯化

将该沉淀溶解于含有5％乙腈(MeCN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的HPLC洗脱缓冲液A中，使最终蛋白浓度为8-10mg/ml。将该溶液(0.5-0.6ml)上样至用Polisil ODS-300(10mcm)装柱并用同样的缓冲液A平衡的250×4.6mm HPLC柱。

按照以下程序，以1ml/分钟的流速用缓冲液A中的缓冲液B(90％MeCN、0.1％TFA)梯度完成洗脱：

  时间，分钟                           B％

      0                                0

      4                                0

      5                                25

      25                               90

在再平衡之前，使用另一100％B的5分钟的步骤清洗该柱。然后再次平衡该柱，使其回复至起始状态，可以将下一部分蛋白溶液上样。典型的层析图谱示于图5。

在分离期间，于280nm监视该柱流出液以检测蛋白峰。收集含有该蛋白材料的部分，将分离的峰合并并于30℃旋转蒸发至干燥。将得到的残留物溶解于蒸馏水并通过生物活性测试和通过SDS-PAGE(14％凝胶，还原条件)检测。含有该活性材料的峰在70-80％缓冲液B之间洗脱，并如SDS-PAGE所检测含有16kD的蛋白主带和微量快速移动蛋白。

通过仅收集第二个HPLC主峰得到的材料的分析示于图15(A和C)。本文将含有这二个峰(例如图5)的材料称为pINPROL制备物1，那些仅由第二个峰组成的材料称为pINPROL制备物2。将500μg的该活性、纯化的pINPROL制备物2上样至C4反相柱(Vydac)，并使用0.1％三氟乙酸中的595％乙腈线性梯度洗脱。该材料于53％乙腈时做为单峰洗脱(图15A)。然而，当将250μg MIP-1α(R&D Systems)在相同条件下层析时，它于43.9％乙腈洗脱(图15B-注意在14％乙腈之前的早峰是假象，系由检测器中的气泡引起)。因此，自然发生的INPROL在这些条件下比MIP-1α更具疏水性。已知在这些条件下，TGFβ于比pINPROL观察到的低的浓度下洗脱(Miyazono等，J.Biol.Chem.263：6407-15，1988)。

该洗脱pINPROL材料的凝胶示于图15C。泳道1是粗材料，泳道2是分子量标准参照物，泳道3是该纯化材料。有二个主带，一个位于约14kD，一个位于约35kD。据信该35kD带是该14kD带的多体形式。

实施例13A： 活性INPROL制备物含有血红蛋白β链

如图5中所示制备pINPROL(即，pINPROL制备物1(参见实施例12B))。使用标准技术将该材料在SDS-PAGE上电泳并转移至硝酸纤维素上。采用标准技术，使用ABI 477A蛋白测序仪与120A联机PTH-AA分析仪对该材料进行N末端序列分析。得到以下N末端序列：

VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....

蛋白数据库的计算机检索发现，该序列与猪血红蛋白β链的N末端序列具有相同性(参看图16C)。

实施例13B： 活性INPROL制备物含有血红蛋白α链

如图15C中所示，通过收集示于图5中的第二个主峰纯化的蛋白(即，pINPROL制备物2)产生对应于分子量约15K和30K的二个主带以及几个小带。使用标准技术将SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素，并切下各个条带并如实施例13A中所述进行N末端序列分析。对所述15kD条带得到以下N末端序列：

VLSAADKANVKAAWGKVGGQ.....

对所述30kD条带进行有限的蛋白水解消化并得到以下内部序列：^**FPHFNLSHGSDQVK....

第一个序列显示与猪血红蛋白α链的N末端序列有相同性，而第二个序列显示与猪血红蛋白α链的第43-56残基有相同性(参见图16C有关人、鼠和猪α和β血红蛋白链的序列比较)。这些条带以及一些小条带的重复测序一致地产生所述α珠蛋白序列的部分。因此在图15C中观察到的各个条带代表猪血红蛋白α链的或者片段或者团聚体。

实施例13C： 猪INPROL的进一步表征

为进一步比较pINPROL与猪血红蛋白，从Sigma ChemicalCompany得到二度结晶的猪血红蛋白，并如实施例12B中为图15所述进行反相HPLC。如图17中可见，完整血红蛋白的HPLC层析谱与pINPROL制备物1的类似。另外，在直接比较中，可见图17A中显示的pINPROL制备物2(即，源自图5的第二个峰)与猪血红蛋白(图17B)的第二个双峰重叠，其主峰的保留时间分别为52.51和52.25分钟。应注意血红素与血红蛋白中的第一个主峰共迁移，在此处的保留时间为49.153分钟；因此血红素是pINPROL制备物1的组分，但不是制备物2的组分。通过该pINPROL制备物缺少于575nm(诊断血红素存在的波长)的吸收而证实这点。

猪血红蛋白α和β链的推测分子量分别为15038道尔顿和16034道尔顿。正如在图18中的SDS-PAGE层析谱所见，第一个双峰由高分子量链组成，第二个双峰由低分子量链组成。因此第一个双峰看起来代表血红蛋白β链，第二个双峰代表血红蛋白α链。

使用小洗脱梯度进行了猪血红蛋白的另一分离(图21)。这些峰的N末端分析证明第一个峰是猪α链，第二个峰是猪β链。生物检测结果确认这二个分离的血红蛋白链均具有生物学活性(例如实施例14和15)。

为进一步比较pINPROL制备物2和血红蛋白β链，进行了双向电泳(图19)。做为第一向，使用2％pH 4-8安佛林在玻璃管中进行等电聚焦9600伏特小时。使用原肌球蛋白(MW 33kD，pI 5.2)做为内部标准；其位置用箭头在最终2D凝胶上标记。将该管凝胶在缓冲液中平衡，并密封于12.5％丙烯酰胺平板胶顶部的积层凝胶顶部。以12.5mA/凝胶进行SDS平板凝胶电泳4小时。对该凝胶进行银染和干燥。

所述双向电泳图案的比较显示，在HPLC纯化的血红蛋白β链与pINPROL制备物2之间只有一或二个小点不同。使用抗猪血红蛋白抗体和或者单向或者双向电泳的Western分析确认在该制备物中存在β血红蛋白。因此按照实施例12B制备的活性pINPROL制备物2基本上是猪血红蛋白β链。

实施例14： 血红蛋白α链、血红蛋白β或完整血红蛋白表现出干细胞 抑制活性

为确认血红蛋白β链具有INPROL活性，使用实施例1中描述的方法、使用如实施例12B中纯化的材料、使用睾酮处理的小鼠骨髓进行了自杀检测。如表8中所示，15％的正常小鼠骨髓细胞被杀伤，与之相比，睾酮处理的动物中36％被杀伤。同预期一样，这表明睾酮处理增加了在循环中的细胞百分比(因此使得它们对杀伤更加敏感-例如，实施例1)。与之鲜明对照的是，用浓度为40ng/ml或者pINPROL或者纯化的血红蛋白β链温育的睾酮处理动物的细胞，显示出分别将循环中的细胞的百分比从36％显著降低至0％和7％。对这二种蛋白而言更高的200ng剂量的效果较差。做为阳性对照，先前表征化的干细胞抑制剂MIP-1α将循环降至13％。

使用循环状态的CFU-MIX而不是CFU-S可以在体外进行类似的检测。如上述CFU-S检测进行该检测，除了用阿糖胞苷(Ara C，30微克/ml)取代高剂量氚标记胸苷做为周期特异性毒性药物(参见B.I.Lord载于 Haemopoiesis-A Practical Approach，N.G.Testa和G.Molineux(编辑)，IRL Press 1993；Pragnell等，载于 Culture of Hematopoietic Cells，R.I.Freshney，I.B.Pragnell和M.G.Freshney(编辑)，Wiley Liss 1994)和使用具有高内源循环速率的小鼠品系(Balb/c)取代睾酮处理的BDF1小鼠。如表9中所示，高度纯化的猪β链或高度纯化的猪α链在该检测中均有活性。注意在该检测中，用pINPROL处理的细胞的循环水平有时有负数，表明在Ara C处理的库中比在未处理的库中有更多的集落。

如实施例2中所述，pINPROL在氚标记胸苷摄入检测中抑制鼠干细胞系FDCP-MIX的增殖。图20证实，纯化的血红蛋白α或β链在该检测中均有活性，在小于2ng/ml下观察到抑制。

前述提供了证据表明猪血红蛋白β链表现出INPROL活性。其它数据(例如表9、图20)证实，分离的α链以及完整的血红蛋白作为干细胞抑制剂亦有活性。活性制备物亦包括α和β链的混合物(例如图5)。

有关分离的α珠蛋白和/或分离的β珠蛋白具有活性的观察表明，本文描述的活性不需要完整的三维血红蛋白结构。α和β链的片段作为干细胞抑制剂和刺激剂亦有活性。

                           表8

处理                                    杀伤％

NBM¹                                    15

TPBM²                                   36

pINPROL 200ng/ml                         23

40ng/ml                                  0

Hbg³ 200ng/ml                           25

40ng/ml                                  7

MIP-1α 200ng/ml                           13

¹NBM＝正常骨髓

²TPBM＝睾酮处理小鼠的骨髓

³Hbg＝C4反相纯化的血红蛋白β链(源自2次结晶的猪血红蛋白)

                         表9

处理                                       ％杀死

对照¹                                      43

猪α链²                                    -4

猪β链²                                    -14

¹对照-Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml(如图21中纯化)

实施例15： 纯化的INPROL、纯化的猪α血红蛋白或纯化的猪β血红 蛋白在体内有活性

为测试纯化的猪血红蛋白链在体内作用的能力，如实施例1所述用丙酸睾酮注射BDF1小鼠。24小时后，小鼠静脉内接受500ng或者pINPROL、猪血红蛋白α链(如图21中纯化自外周血细胞)、猪β链(如图21中纯化自外周血细胞)或者等体积的载体。48小时后，从每只小鼠收集骨髓，并如实施例14所述进行CFU-MIX检测。如表10中显示，pINPROL、猪α链和猪β链在体内均有活性，将循环中的CFU-MIX百分比降至基础水平。

                       表10

处理                                        杀伤％

对照¹                                       45

pINPROL²                                    5

猪α链²                                     5

猪β链²                                     -5

基础³                                       4

¹对照-睾酮处理BDF1小鼠骨髓

²100ng/ml

³基础-未处理BDF1小鼠骨髓

实施例16： 纯化的人血红蛋白α链、生物素酰基化人血红蛋白α链、 生物素酰基化人血红蛋白β链、人血红蛋白γ链和人血红蛋白δ链均在 体外表现出干细胞抑制活性

或者从Sigma Chemical Corporation或者通过标准方法从成人外周血或脐带血分离得到人血红蛋白。以与上述分离猪α和β链的类似方式，通过反相HPLC分离各个链(参见B.Masala和L.Manca，酶学方法第231卷第21-44页，1994)。得到纯化的α、β、γ和δ链。对于生物素酰基化α和β链，用37μg NHS LC生物素(Pierce)处理1mg成人血红蛋白，并如上述通过反相层析分离这些链。

如表11、12和13中所示，纯化的人α、生物素酰基化人α、生物素酰基化人β、人γ和人δ血红蛋白链在该CFU-MIX循环检测中均有活性。

                         表11

处理                                    杀伤％

对照¹                                   49

人α链²                                 -1

人β链²                                 41

人γ链²                                 -63

¹对照-Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

                         表12

处理                                    杀伤％

对照¹                                   47

人γ链²                                 12

人δ链²                                 -4

¹对照-Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

                        表13

处理                                       杀伤％

对照¹                                         68

人α链²                                       19

生物素酰基化α链²                             7

人β链²                                       55

生物素酰基化β链²                             25

¹对照-Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

实施例17： 纯化的人α链、α-β二聚体或血红蛋白在体内有活性

在如实施例15中描述的体内检测中测试纯化的人α链、α-β二聚体或血红蛋白。如表14中所示，它们在浓度为500ng/小鼠时均有活性。

                         表14

处理                                        杀伤％

对照¹                                        49

人α链                                        -22

人α-β二聚体                                 14

人血红蛋白                                    -31

¹对照-睾酮处理的BDF1小鼠骨髓

实施例18： 猪INPROL在体外对人单核细胞或CD34 ⁺ 脐带血细胞有活 性

为调查从猪骨髓纯化的INPROL对人祖代细胞循环的影响，得到了脐带血细胞。使用或者在Ficoll上分离后得到的总单核细胞部分、或者在抗CD34亲和柱(CellPro Inc.)分级分离得到的CD34⁺部分。在存在白介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)(各100ng/ml)的情况下，将细胞在体外温育48小时以确保早干细胞处于循环。在该预温育后，如实施例14中关于小鼠的描述进行循环检测，除了在铺平板后18天时计数CFU-GEMM(而不是CFU-MIX)。如表15中所示，猪INPROL抑制或者在总单核细胞中的或者在该CD34+部分中的CFU-GEMM循环。

                         表15

处理                                 杀伤％

单核细胞

        对照                          93

        pINPROL¹                     16

CD34⁺细胞

        对照                          41

        pINPROL¹                     21

¹100ng/ml

实施例19： 纯化的人α血红蛋白对人CFU-GEMM有活性

如实施例18中所述得到人脐带血单核细胞并在IL-3和SCF中温育，并用于循环检测。如表16中所示，纯化自骨髓的猪INPROL和纯化自外周血的人α血红蛋白均在该检测中有活性。

                         表16

处理                                   杀伤％

对照                                    100

pINPROL¹                               -6

人α链¹                                -23

¹100ng/ml

实施例20： 从人α血红蛋白和从人β血红蛋白序列得到的肽有活性

为鉴别活性肽序列，使用计算机模型程序，将肌红蛋白(它在本检测中无活性)的三维结构重叠(superimpose)于存在于成人血红蛋白中的α链的天然三维结构之上。鉴别了在该CFU-MIX循环检测中有活性的二个肽(代表氨基酸43-55和64-82，它们是在三维空间与肌红蛋白结构不同的区)。为更接近在天然α链中发现的环，亦合成了该43-55肽的环衍生物(c43-55)(利用一个二硫键)并发现它有活性。

这些肽的序列如下：

43-55 Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val

(“肽43-55”)

c(43-55)Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys

(其中二个Cys残基由二硫键连接)(“环肽43-55”)

64-82 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-

Ala(“肽64-82”)

测试了二个hemorphin序列即hemorphin 10(所述β链序列的氨基酸32-41)和heomrphin 7(氨基酸33-40)，并发现它们有活性。

这些序列如下：

Hemorphin 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe

Hemorphin 7     Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg

为测试这些序列的活性，如实施例14中所述进行CFU-MIX循环检测。如表17-19中所示，这些肽在该检测中均有活性。

                         表17

处理                                       杀伤％

对照                                          47

pINPROL¹                                     0

肽(43-55)

        100ng/ml                              2

        10ng/ml                               18

        1ng/ml                                l1

¹100ng/ml

                         表18

处理                                       杀伤％

对照                                          43

肽(43-55)¹                                   5

肽(64-82)¹                                   9

Hemorphin 10¹                                1

Hemorphin 7¹                                 0

¹所有的肽均在100ng/ml下测试

                         表19

处理                                       杀伤％

对照                                          47

环肽(43-55)¹                                 0

¹在100ng/ml下测试

实施例21： 通过甲酸切割从人α血红蛋白得到的肽片段具有活性

人α血红蛋白链在氨基酸位置94和95(Asp-Pro)之间有甲酸切割位点。通过将纯化的人α链(如实施例16中)以1mg/ml的浓度在70％甲酸中于37℃保温72小时得到切割。如实施例16通过反相HPLC，从未切割的α链和所述95-141片段纯化所述1-94片段；使用SDS-PAGE(如实施例22中)进行分级分离。通过电喷电离质谱法确认所述纯化的1-94蛋白片段的身份。

为评价该片段的干细胞抑制活性，如在实施例14中使用CFU-MIX循环检测：

                         表20

处理                                   杀伤％

对照¹                                    50

人α²                                    12

1-94片段³                                0

¹Balb/c骨髓

²纯化的、非重组人α红蛋白，如在实施例16中(100ng/ml)

³纯化的甲酸切割的蛋白，如在本实施例中(100ng/ml)

实施例22： 血红蛋白α链、多肽1-141、多肽1-97、肽43-55和肽c(43-55) 在大肠杆菌中做为遍在蛋白融合物表达

按照最佳大肠杆菌密码子使用，通过退火相应的寡核苷酸合成肽43-55(“p13”)和c45-55(“p15”)(如在实施例20中)的基因(Anderssen和Kurland，Micro.Reviews 54：198-210，1990)。通过设计一套寡聚物，以从人骨髓cDNA库(Clontech，Palo Alto，CA)PCR扩增而得到完整人α血红蛋白链(“p141”)的基因。在适当亚克隆后，通过PCR扩增含有该p141基因的质粒得到该1-97片段(“p1-97”)的基因

将上述基因做为遍在蛋白融合蛋白表达(参见美国专利5,132,213；5,196,321和5,391,490和PCT WO 91/17245)。宿主菌株大肠杆菌DH5αF’IQ(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)用含有适当合成的基因(上述)的遍在蛋白表达载体pDSUb转化。pDSUb是表达人遍在蛋白的pDS78/RBSII(图22A)(Hochuli等，Biotechnology 6：1321-5，1988)的衍生物。Loetshcer等(JBC 266：11213-11220，1991)通过从所述Hochuli质粒切除氯霉素乙酰转移酶(CAT)序列并再连接该质粒(图22B)修饰了pDS27/RBSII。通过成对退火具有为细菌表达而优化的密码子使用、编码人遍在蛋白的激酶化(kinased)合成寡核苷酸，构建合成的遍在蛋白基因。然后通过将该含有装配寡核苷酸的合成遍在蛋白基因插入该衍生的pDS78/RBSII的Klenow平端化Bam Hl-Bgl II消化物构建pDSUb。得到的质粒pDSUb(图22C)显示在大肠杆菌中以高水平表达遍在蛋白。

在定向克隆中，通过将Afl II-Pst I消化的编码所述p97或p141蛋白的PCR产物和融合连接插入已用Afl II和Pst I消化的pDSUb，构建含有p97的质粒和含有p141的质粒。类似地，通过将激酶化的和退火的带有适当粘性末端并编码该肽的寡核苷酸和融合连接插入Afl II-Pst I消化的pDSUb，构建含有p13的质粒和含有p15的质粒。

用100μg/ml氨苄青霉素、5μg/ml新霉素选择转化体，于30℃二天后菌落出现。通过跨越该插入位点的PCR筛选转化体。然后通过SDS-PAGE筛选含有正确尺寸插入片段的菌落表达适当尺寸的融合蛋白(参见以下)。通过加入滴定lac阻抑物的IPTG、将其从pDSUb启动子中除去，过量表达遍在蛋白融合物(DH5αF’IQ在F’因子含有一向上调节的lacI^q基因，用10μg/ml新霉素选择的)。

从表现过量表达的诱导的遍在蛋白融合蛋白的克隆制备质粒DNA，使用测序酶2.0版本药盒(United States Biochemical.)通过双脱氧方法进行测序。然后将阳性克隆冷冻并在甘油中储存于-80℃。将阳性克隆在30℃保持于含有氨苄青霉素(100μg/ml)、新霉素(10μg/ml)和1％葡萄糖的LB平板上。每周将其划线接种直至10次传代，然后从冷冻种子小瓶中取出新鲜划线物进行连续培养，以确保菌株可靠性。

为得到用于检测的蛋白，将250ml摇瓶中的100ml起始培养物通过在含有氨苄青霉素(100μg/ml)、新霉素(10μg/ml)和1％葡萄糖的2xYT培养基中过夜培养(16-20小时)由单菌落生长。将摇瓶培养物在New Brunswick环境振荡培养箱中保持于30℃和250rpm。次日早晨将该培养物用培养基稀释至1升。于OD₆₀₀＝0.5通过加入IPTG至1mM(终稀释度)诱导细胞，并于OD₆₀₀＝0.8通过离心收获细胞。将收获的细胞再悬浮于低渗裂解缓冲液(100μl 50mM Tris，pH 10.0)中。然后通过对该悬浮液进行三周期的冷冻-融化(用干冰-乙醇浴进行冷冻，于60℃融化)裂解所述细菌细胞。然后对该悬浮液进行超声处理10分钟，并于12,000g离心10分钟。将得到的上清液命名为“S1”。将细胞沉淀再悬浮于50mM Tris，pH10和2x SDS麦黄酮上样缓冲液(Novex，San Diego，CA)(1∶1)。然后将该混合物于95℃加热15分钟，并于12,000g离心10分钟。将以这种方式可以再溶解的沉淀部分称为“P1”。将得自剩余沉淀的沉淀部分称为“P2”。如对P1那样，将P2再悬浮于上样缓冲液。通过SDS-PAGE分析来自S1、P1和P2的样品。

用10-20％tricine凝胶(Novex)在小凝胶装置中使用二个tricine缓冲液系统进行SDS-PAGE凝胶电泳。阳极(底部)缓冲液是0.2M Tris，pH9.0。阴极(顶部)缓冲液是0.1M Tris、0.1M麦黄酮、0.1％SDS，pH8.25。使用市售分子量标准参照物“Multi-Mark”(Novex)。从Sigma购买做为标准的牛遍在蛋白。以4mA的恒定电流进行凝胶电泳，直至染料标记到达凝胶底部。用含0.25％考马斯蓝R250(Sigma)的乙酸∶甲醇(10％∶40％)将凝胶染色，并在缺乏该染料的同样溶液中脱色。

在细菌裂解液离心后的沉淀(P1和P2)中发现大多数(＞70％)完整的p141-遍在蛋白融合蛋白。与之鲜明对照，在可溶性部分(S1)中发现大多数(＞70％)p97-遍在蛋白融合蛋白。这证实除去C末端疏水性区产生具有改进溶解度特性的产物。类似地，p13和p15肽亦包含于可溶性部分中。

在用于转化宿主菌株BL21/DE3的pRSET(Invitrogen，San Diego，CA)中表达UCH-L3遍在蛋白酶(ubiquinase)(Recksteiner，M.(编辑)Ubiquitin，Plenum Press(纽约)1988；Wilkinson等，Science 246：670-73，1989)。UCH-L3是在遍在蛋白C末端延伸处切割的遍在蛋白特异性蛋白酶。通过35％(w/v)酸铵沉淀，从细菌裂解液中将其部分纯化。通过SDS-PAGE检测25.5kD条带的存在，监视使用的硫酸铵的准确百分比。将上清液对50mM Tris，pH7.4透析，并对遍在蛋白肽融合物底物检测。将活性上清液分成等份并冷冻于-20℃。典型的反应混合物含有3μl裂解液、1μl 1M DTT、1μl UCH-L3(如上述)和5μl反应缓冲液(50mM Tris，pH7.4)。于室温进行反应20分钟。对于大规模消化，将300μl裂解液与100μl 1M DTT、20μl UCH-L3和580μl反应缓冲液混合。

如实施例16中通过反相HPLC进一步纯化包含于可溶性(S1)部分中的肽或蛋白；通过SDS-PAGE监测部分，并通过电喷电离质谱法确认其身份(参见下述)。如上述用UCH-L3酶促消化所纯化的肽或蛋白，产生非遍在蛋白化(non-ubiquinated)终产物。然后通过反相HPLC再纯化该酶切物质。纯化后进行SDS-PAGE，并通过电喷电离质谱法确认终产物的身份。

如上述用UCH-L3体外酶切的替代方法是在与表达所需遍在蛋白融合物的同一细菌中共表达遍在蛋白切割酶。为此目的，使用表达ubiquinase UBP1的载体(pJT184)(Tobias和Varshavsky，JBC 266：12021-12028，1991)。共表达p97遍在蛋白融合物和UBP1的细菌在体内表现出完全消化该融合蛋白；共表达p141遍在蛋白融合物和UBP1的细菌表现出部分(约70％)消化该融合蛋白。通过如上述硫酸铵沉淀接着用反相HPCL纯化该体内消化的p97蛋白。

为确认所述表达和纯化的多肽的身份，使用配有四极分析仪的VG Biotech BIO-Q仪器进行电喷电离质谱法。使用肌红蛋白校正该仪器。用纯化的p97得到的主要组分是分子量为10,339道尔顿的单峰；这可与计算分子量10,347很好地相匹配，确认了该重组p97片段的身份。

实施例23： 重组p1-97保持干细胞抑制活性

为评价重组p1-97的生物活性，如实施例18使用CFU-GEMM循环检测：

                         表21

处理                                     杀伤％

对照¹                                     62

人α²                                     11

p97³                                      0

¹人骨髓单核细胞

²纯化的非重组人α血红蛋白，如在实施例16中(100ng/ml)

³纯化的重组p97，如在实施例22中(100ng/ml)

实施例24： 人α血红蛋白和肽43-55在睾酮或5-氟尿嘧啶(5FU)处理的 小鼠中体内抑制CFU-MIX循环

为评价肽43-55在体内的干细胞抑制活性，如实施例1中所述用丙酸睾酮或用5FU预处理B6D2 F₁小鼠。具体地说，在第0天将丙酸睾酮(100mg/kg体重)腹膜内注射。或者，用5FU(200μg/kg体重)于0天注射小鼠。

24小时后(第1天)，静脉注射各种剂量的肽43-55或载体。在第2天收获骨髓并如实施例14进行CFU-MIX循环检测。具体地说，杀死小鼠，并从股骨制备单细胞骨髓悬浮液。清洗细胞一次，并在Fischer培养基中将浓度调整为5×10⁶细胞/ml。对于每个测试条件，将一毫升细胞加入二个聚丙烯管中的每个。将所述管在无(“对照”)或有(“实验”)适当浓度测试物质的情况下于37℃温育3小时。在温育结束时，将30μg/ml阿糖胞苷(“Ara C”(Sigma))加入一半的管中，并将相同体积的Fischer培养基加入另一半管中。将这些管于37℃再温育1小时，然后将其置于冰上并用冷Fischer培养基清洗二次。

将细胞在Fischer培养基中再调整至5×10⁴-10⁶/ml，并将0.5ml细胞悬浮液加入5ml Methocult M3430甲基纤维素培养基(Stem CellTechnologies，Vancouver，British Columbia)中。用涡旋混合器剧烈混合该混合物，并将1ml分配入5个35mm平皿中的每个。然后将这些35mm平皿与一敞开的含有无菌水的35mm平皿一起置于盖住的150mm平皿中。于37℃培养7天后使用倒置显微镜计数CFU-MIX集落。

按照以下公式，用培养基处理的与用Ara C处理的管的集落数量之差代表在该条件下循环中细胞的百分比：

$\%S=\frac{a-b}{a}\×100\%$

其中a＝仅用培养基温育的管中的CFU-MIX数量

b＝用Ara C温育的管中的CFU-MIX数量

                       表22

处理                                    杀伤％

对照                                       35

人α链(500ng)²                            13

肽43-55(0.5ng)²                           0

¹睾酮预处理的动物

²每20g小鼠静脉注射的量

                         表23 ¹

处理                                        杀伤％

对照                                          62

人α链(500ng)²                               0

肽43-55(0.5ng)²                              3

环肽43-55(0.5ng)²                            14

¹5FU预处理的动物

²每20g小鼠静脉注射的量

实施例25： 当于N末端Phe(Phe ₄₃)生物素酰基化或于Phe ₄₃ 或Phe ₄₆ 碘 化时肽43-55做为干细胞抑制剂有活性

通过固相肽合成技术(American Peptide Co.，Sunnyvale，CA)合成肽43-55。合成肽类似物使碘位于Phe₄₃或Phe₄₆的对位。通过将生物素的COOH利用C₄碳接头与Phe₄₃的N末端NH₂连接，合成生物素酰基化肽43-55。

                          表24

处理                                         杀伤％

对照                                             31

肽43-55(1ng/ml)                                  8

生物素酰基化肽43-55(1ng/ml)                      15

实施例26： 吗啡于体外抑制鼠CFU-MIX循环

如在实施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循环检测中测试吗啡：

                         表25

处理                                       杀伤％

对照                                         44

人α链(100ng/ml)                             0

吗啡(10^-7M)                                 10

    (10^-9M)                                 15

    (10^-11M)                                32

实施例27： 阿片制剂肽DAMGO和DALDA于体外抑制鼠CFU-MIX 循环

如在实施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循环检测中测试DAMGO和DALDA：

                         表26

处理                                       杀伤％

对照                                         33

DAMGO(10^-5M)                                15

     (10^-7M)                                0

     (10^-9M)                                38

DALDA(10^-5M)                                47

     (10^-7M)                                0

     (10^-9M)                                34

实施例28： 伤害感受肽于体外抑制鼠CFU-MIX循环

如在实施例24中使用Balb/c小鼠骨髓在CFU-MIX循环检测中测试伤害感受肽：

                        表27

处理                                      杀伤％

对照                                        31

肽43-55(1ng/ml)                             8

伤害感受肽(10^-7M)                          6

          (10^-9M)                          0

实施例29： 纳洛酮拮抗人α和δ血红蛋白链、Hemorphin10和肽43-55 的抑制活性

如在实施例24中进行CFU-MIX循环检测。检测测试物质自身或在纳洛酮(10^-5-10^-7M)的存在下检测测试物质。在这些浓度下纳洛酮自身对该检测无影响。

                           表28

处理                                         杀伤％

对照                                           38

纳洛酮¹                                       36

人α(100ng/ml)                                 0

     ”+纳洛酮¹                               52

肽43-55(10ng/ml)                               6

     ”+纳洛酮¹                               50

Hemorphin 10(100ng/ml)                         0

     ”+纳洛酮¹                               36

¹在10^-5M终浓度下使用

                         表29

处理                                       杀伤％

对照                                         32

人δ(100ng/ml)                               10

  ”+纳洛酮¹                                31

¹在10^-7M终浓度下使用

实施例30： 低浓度纳洛酮抑制鼠CFU-MIX循环

如实施例24进行CFU-MIX检测。

                         表30

处理                                       杀伤％

对照                                         38

人α(100ng/ml)                               0

纳洛酮(10^-10M)                              0

实施例31： μ阿片制剂受体拮抗剂CTOP拮抗人血红蛋白α链、肽43-55 和肽64-82的抑制活性

CTOP(H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH₂，在Cys₂和Pen₇之间有二硫键)是μ阿片制剂受体特异性拮抗剂生长抑素的类似物。检测测试物质自身或在CTOP(10^-7M)的存在下检测测试物质。CTOP自身在该浓度对该检测无影响，但却拮抗由α血红蛋白或肽43-55引起的细胞周期抑制。

                         表31

处理                                      杀伤％

对照                                         42

CTOP¹                                       36

人α(100ng/ml)                               0

”+CTOP¹                                    20

肽43-55(10ng/ml)                             8

”+CTOP¹                                    21

¹在10^-7M终浓度下使用

实施例32： 用人α链预处理增加了晚形成圆石形成细胞(Cobblestone- Forming Cell)的数量

如Ploemacher和同事所述(Ploemacher等，Blood 74：2755-63，1989；van der Sluijs等，Exp.Hematol.18：893-6，1990；Ploemacher等，Blood78：2527-33，1991；Ploemacher等，J.Tiss.Cult.Meth.13：63-68，1991；Down和Ploemacher，Exp.Hematol.21：213-21，1993)进行圆石检测。圆石检测测定在单层基质细胞内细胞组(或“圆石”)的出现。非常原始的干细胞在软琼脂中不形成集落，但在存在基质单层时形成圆石。将形成圆石的细胞称为“圆石区形成细胞”(CAFC)。更加分化的(例如GM-CFC)祖代形成瞬时圆石，所述圆石在培养的前几周内出现然后消失，而更加原始的干细胞(例如长期种群恢复细胞)形成的圆石仅在培养4-5周后出现。因此，在培养第7-14天时形成的CAFC富含CFU-GM，在第28-35天时形成的CAFC富含CFU-MIX，在第28-35天时形成的CAFC富含长期种群恢复细胞。

如在实施例24中用丙酸睾酮处理B6D2F1小鼠。次日取出骨髓，并用或不用人α血红蛋白链(100ng/10⁶细胞)温育4小时，然后将其铺平板于圆石检测中。使用的检测包括在96孔板中限制性稀释长期骨髓培养物(LTBMC)。通过让FBMD-1鼠基质细胞系(Breems等，Leukemia11：142-50，1997)生长直至连合制备该培养物；将具有汇合单层的96孔平板(96-well plates plates with confluent monolayer)储存于33℃直至检测。将鼠骨髓细胞制备为单细胞悬浮液，并将0.2ml LTBMC培养基(Stem Cell Technologies，Vancouver)中的以下稀释度的细胞铺于每个孔中：27,000；9000；3000；1000；333。每种条件的每个稀释度铺20个孔并分布于二个板上。

如前述(Ploemacher等，Blood 78：2527-33，1991；Ploemacher等，J.Tiss.Cult.Meth.13：63-68，1991；Breems等，Leukemia 8：1095-104，1994)计算圆石区形成细胞(CAFC)的频率。结果示于图23中。用人α血红蛋白链预温育循环干细胞将晚形成CAFC的比例提高约5倍。用α链处理非循环干细胞无任何效果。

实施例33： 人α血红蛋白和肽43-55、环形43-55和64-82抑制人脐 带血CFU-GEMM循环

如在实施例19中进行人脐带血CFU-GEMM循环检测。具体地说，从人脐带血细胞分离单核细胞，并在添加了10％FBS、100ng/ml药盒配体和100ng/ml人IL-3的IMDM组织培养基中调整至2-4×10⁴细胞/ml。将所述细胞于37℃培养48小时。

培养后，清洗细胞并以10⁶细胞/ml的浓度再悬浮于无血清IMDM。将1ml细胞加入每种条件的二个聚丙烯管中的每个，并如实施例24中对小鼠骨髓那样进行循环检测。用Ara C温育后，用冷IMDM清洗细胞并调整至每0.5ml IMDM 10,000-20,000细胞，并与5ml MethocultH4433(Stem Cell Technologies)混合。或者，使用Methocult H4435甲基纤维素培养基(Stem Cell Technologies)，其中细胞浓度调整至每0.5mlIMDM 2500-5000细胞。将细胞如实施例24中铺平板，并于第14-18天记录CFU-GEMM集落。

                         表32

处理                                        杀伤％

对照                                          52

人α(100ng/ml)                                0

肽43-55(1ng/ml)                               20

       (10ng)                                 12

       (100ng)                                5

环肽43-55(1ng/ml)                             32

         (10ng)                               0

         (100ng)                              11

肽64-82(1ng/ml)                               21

       (10ng)                                 20

       (100ng)                                39

实施例34： 人a血红蛋白和肽43-55抑制成人骨髓CFU-GEMM循环

使用CellPro柱，从人骨髓纯化后从Poietic Technologies(Gaithersburg，MD)得到CD34⁺干细胞。将细胞用药盒配体和IL-3温育48小时，并用于实施例26中的CFU-GEMM循环检测。

                             表33

处理                                       杀伤％

对照                                         47

人α链(ng/ml)                                0

肽43-55(ng/ml)                               0

实施例35： 动员的人外周血中的CFU-GEMM积极地循环并可以被人 α血红蛋白、肽43-55、DAMGO或吗啡抑制

按照标准方案，从正在进行用环磷酰胺和G-CSF外周干细胞动员的乳腺癌患者得到外周血。用Ficoll Hypaque除去红细胞(用IMDM将细胞1∶1稀释，并将20ml铺层于16ml Ficoll顶部，于800g离心30分钟；从界面移出单核细胞并在IMDM中清洗二次)。在一种情况下，将单核细胞于检测前冷冻储存于液氮中。如在实施例26中将单核细胞铺平板以进行CFU-GEMM循环检测，除了每个平皿铺2.5-5×10⁵细胞。

                         表34

处理                                     杀伤％

对照(患者#1)                               48

人α链(100ng/ml)                            0

                         表35

处理                                     杀伤％

对照(患者#2)¹                             67

人α链(ng/ml)                              2

肽43-55(10ng/ml)                           0

吗啡(10^-7M)                               24

”(10^-9M)                                 0

DAMGO(10^-7M)                              15

”   (10^-9M)                                 0

                         表36

处理                                     杀伤％

对照(患者#3)¹                             29

肽43-55(0.1ng/ml)                          23

      ”(1.0ng/ml)                         0

      ”(10ng/ml)                          15

¹来自检测前冷冻储存的细胞

实施例36： 高剂量人α或β血红蛋白、肌红蛋白、肽1-97、肽43-55、 肽64-82、伤害感受肽或DALDA刺激静止鼠干细胞循环

检测μg/ml剂量的血红蛋白链、肌红蛋白和肽对静止干细胞的刺激。从如实施例24中的CFU-MIX循环检测中测试的未处理B6D2F₁得到骨髓。从未处理B6D2F1小鼠分离的干细胞一般缓慢循环，除非受刺激(例如被丙酸睾酮刺激(参见实施例1)或诸如5FU的化疗(参见实施例4))进入周期。

                         表37

处理                                       杀伤％

对照                                         3

人α链(1μg/ml)                              0

(10μg/ml)                                   24

(100μg/ml)                                  40

                         表38

处理                                       杀伤％

对照                                         9

人β链(μg/ml)                               55

人肌红蛋白(μg/ml)                           30

                     表39

处理                                   杀伤％

对照                                     3

人α链(100μg/ml)                        41

DALDA(10^-5M)                            24

     (10^-3M)                            41

DALDE(10^-5M)                            0

     (10^-3M)                            0

                     表40

处理                                   杀伤％

对照                                     0

人α链(100μg/ml)                        30

肽43-55(10μg/ml)                        26

                     表41

处理                                   杀伤％

对照                                     16

肽1-97(10μg/ml)                         62

”    (10μg/ml)                            41

                     表42

处理                                   杀伤％

对照                                     4

肽64-82(1μg/ml)                         25

伤害感受肽(10^-5M)                       36

实施例37： 静脉注射高剂量人α血红蛋白刺激静止鼠干细胞循环

将人α血红蛋白静脉注射入未处理B6D2F₁小鼠。24小时后，杀死小鼠，从股骨收集骨髓，并如实施例24中进行CFU-MIX检测。

                          表43

处理                                  杀伤％

对照(未处理)                            0

培养基(注射对照)                        0

人α链(150μg/小鼠)                     48

实施例38： 纳洛酮拮抗高剂量人α血红蛋白、肽43-55的干细胞刺激 活性

                          表44

处理                                  杀伤％

对照                                    6

人α链(100ng/ml)                        48

”+纳洛酮¹                             0

¹于10-7M终浓度下使用

                          ***

虽然已用推荐实施方案描述了本发明，但应该理解，本领域技术人员会想到变化和修改。因此，所附权利要求书覆盖要求保护的本发明范围内的所有这种相等的变化。

Claims (4)

1.具有人α血红蛋白链氨基酸1-97序列的多肽。

2.药用组合物，它包含由人α血红蛋白链氨基酸1-97组成的多肽和药学上可接受的载体。

3.如权利要求2中的药用组合物，其为单位剂量形式。

4.如权利要求3中的药用组合物，其中单位剂量是0.1mg至6g具有人α血红蛋白链氨基酸1-97序列的多肽。

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