JP2012046537A - 幹細胞増殖の阻害剤および刺激剤ならびにその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val(配列番号1)、およびCys−Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val−Cys(配列番号2)(ここで、2つのCys残基はジスルフィド結合を形成する)を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドの幹細胞刺激量を含む組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、自己免疫疾患、加齢、ガン、脊髄形成異常、前白血病、白血病、乾癬、後天性免疫不全症候群(AIDS)、脊髄形成異常症候群、再生不良性貧血、または過剰または過少増殖状態を含む他の疾患を有するヒトまたは動物の処置における幹細胞の細胞周期を調節するための幹細胞増殖モジュレーターの使用、ならびに鎮痛のためのこのような化合物の使用に関する。本発明はまた、化学療法剤または細胞周期内にある幹細胞に損傷を与える他の薬剤への曝露、あるいは放射線の照射を受けることが予想されるかまたは受けているヒトまたは動物の処置、ならびにエクスビボでの処置の間のそのような薬剤に対する防御の方法に関する。最後に、本発明は、自家移植および同種移植の手法あるいは遺伝子導入のための幹細胞の維持または拡大培養の改良、ならびにそのような手法の改良のためのインビボでの処置に関する。
再生系のほとんどの終期細胞は、短命であり、そして一生を通じて連続的に置き換えられなければならない。例えば、血液細胞は、多能性造血幹細胞(HSC)の自己再生集団か
ら生じる。造血幹細胞は造血細胞の亜集団である。造血細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ得る(造血細胞は、移動しないか、G-CSFのような因子によって
移動される)。造血細胞は、幹細胞集団、前駆細胞、分化細胞、補助細胞、間質細胞、および成熟血液細胞の産生に必要な環境を寄与する他の細胞を含む。造血前駆細胞は、それらの発生効力がさらに制限される幹細胞の部分集合である。前駆細胞は、1または2系統にだけ分化し得る(例えば、赤血球のみを生じるBFU-EおよびCFU-E、または顆粒球およびマクロファージを生じるCFU-GM)が、幹細胞(例えば、CFU-MIXまたはCFU-GEMM)は、複数の系統および/または他の幹細胞を生成し得る。造血幹細胞は造血系および免疫系のすべての成熟細胞の発生に必要であるので、化学療法剤または他の薬剤で処置される被験体において十分に機能的な宿主防御系を再確立するために、造血幹細胞の生存は必須である。
臨床的な実用に用いられている。しかし、広範に特徴付けられていない制御ネットワークの一部分は、幹細胞の細胞周期の状態を制御する生理学的機構である(非特許文献1;非特許文献2)。
精製は、放射線照射された多数のマウスを必要とするインビボアッセイに固有の困難さにより達成されなかった。これらの問題を克服するための試みにおいて、Pragnellおよびその共同研究者は、原始造血細胞(CFU-A)のインビトロアッセイを開発し、そして阻害活
性源としての細胞株をスクリーニングした(Grahamら、Nature 344:442-444,1990を参照)。初期の研究はマクロファージをSCIの可能な供給源として同定していたので(非特
許文献3)、マウスマクロファージ細胞株J774.2が選択された(Grahamら、Nature 344:442-444、1990)。この細胞株由来の馴化培地が精製のために、Grahamらによって用いられた。阻害ペプチドが単離され、それは、前述のサイトカインマクロファージ炎症性タンパク質1-α(MIP-1α)と同一であることが証明された。他のケモカインレセプターのように、MIP-1αのレセプターがクローニングされ、これらのMIP-1αは、G阻害性サブクラス(「Gi」)のグアニンヌクレオチド(GTP)結合タンパク質に結合する7回膜貫通ドメイン(または「G-関連」)レセプターである(Murphy,Cytokine & Growth Factor Rev.7:47-64,1996に概説される)。Giサブクラスに対する「inhibitory」の名称は、そのアデニル酸シクラーゼの阻害活性をいう。
ウシ胎児骨髄および肝臓抽出物から幹細胞阻害活性を有するテトラペプチドを単離した(Lenfantら、PNAS 86:779-782、1989)。Paukovitsら(Cancer Res.50:328-332、1990)は、ペンタペプチドを特徴付け、それはモノマー形体では阻害剤であり、そしてダイマー形体では幹細胞の細胞周期の刺激剤であるとしている。他の因子もまた、種々のインビトロ系において阻害性であることが主張されている(WrightおよびPragnell、Bailliere’s Clinical Haematology 第5巻、723〜39頁、1992(Bailliere Tinadall、Paris):MarshallおよびLord,Int Rev.Cyt.167:185-261,1996を参照)。
び幹細胞が末梢血中に出ていくプロセスは、「移動(mobilization)」と呼ばれる。(Simmonsら,Stem Cells 12(補遺1):187-202,1994;Schedingら,Stem Cells 12(補遺1):203-11,1994;Mangan,Sem.Oncology 22:202-9,1995;Moolten,Sem.Oncology 22:271-90,1995)。最近公表されたデータは、大部分の移動した前駆細胞が細胞周期中は活性でないことを示唆する(RobertsおよびMetcalf,Blood 86:1600-,1995;Donahueら,Blood 87:1644-,1996;SiegertおよびSerke,Bone Marrow Trans.17:467-1996;UchidaらBlood 89:465-72,1997)。
ダルトンである。これは、2つのα鎖および2つのβ鎖からなる。各鎖は、ヘムの単一分子(フェロプロトポルフィリンIX)(鉄含有補欠分子族)に結合する。脊椎動物α鎖およびβ鎖は、おそらく、複製し、次いで分岐した1つの単一祖先遺伝子に由来した。この2つの鎖は、それら鎖間および種々の脊椎動物間で高度の配列同一性を保持している(図16Aを参照)。ヒトにおいて、第16染色体上のα鎖クラスターは、同一のポリペプチドをコードする2つのα遺伝子(α1およびα2)、ならびに他のα様鎖をコードする遺伝子(ζ、θ)およびいくつかの非転写偽遺伝子を含有する(ヒトα鎖のcDNA配列およびアミノ酸配列については図16Bを参照)。第11染色体上のβ鎖クラスターは、1つのβ鎖遺伝子およびいくつかのβ様鎖遺伝子(δ、ε、Gγ、およびAγ)、ならびに少なくとも2つの非発現偽遺伝子からなる(ヒトβ鎖のcDNA配列およびアミノ酸配列については図16Cを参照)。
)からなる四量体を連続的に合成する。胚形成が進行するにつれて、優勢型は、2つのα鎖および2つのγ鎖で構成される胎児ヘモグロビン(Hb F)からなる。成人ヘモグロビ
ン(2つのα鎖および2つのβ鎖)は、胎児期の間に合成が開始される。誕生時には、約50%のヘモグロビンが成人型であり、そしてその移行は約6カ月齢までに完了する。成人におけるヘモグロビンの大部分(約97%)は、2つのα鎖および2つのβ鎖からなる種(Hb A)であり、少量のHb Fまたはδ鎖(Hb A2)もまた検出され得る。
に使用された(例えば、Jessenら,Methods Enz.231:347-364,1994;Lookerら,Methods Enz.231:364-374,1994;Ogdenら,Methods Enz.231:374-390,1994;Martin de Llanoら,Methods Enz.231:364-374,1994)。現在まで、組換えの方法では、単離されたヒトα鎖を高収率で発現することは可能ではない(例えば、Hoffmanら,PNAS 87:8521-25,1990;Hernanら,Biochem.31:8619-28,1992)。明らかに、単離されたアルファ鎖は安定した高次構造であるとは考えられず、E.coli内では速やかに分解される。β鎖とα鎖との同時発現は両方の発現が増加を生じた(Hoffmanら、およびHernanら、前出)。α鎖はβ鎖部分とXa因子の認識部位(NagaiおよびThorgersen,Methods Enz.231:347-364,1994)との融合タンパク質として発現されているが、これらの状態下では、不溶性封入体として発現される。
The Plasma Proteins - Structure,Function and Genetic Control(F.W.Putnam,Ed.)Vol.2,1-49頁(Academic Press,NY);HwangおよびGreer,JBC 255:3038-3041,1980)。肝臓のハプトグロビン輸送は、循環しているヘモグロビンの主要な代謝
経路である。これらはα鎖に、ハプトグロビンへの1つの結合部位(アミノ酸121-127)
があり、そしてβ鎖には2つの結合部位(アミノ酸領域11-25および131-146)がある(KazimおよびAtassi,Biochem J.197:507-510,1981;McCormickおよびAtassi,J.Prot.Chem.9:735-742,1990)。
)。ヘモグロビンα鎖はアミノ酸94-95間に酸に不安定(acid-labile)な切断部位を有する(Shaeffer,J.Biol.Chem.269-29530-29536,1994)。
細胞コロニーに対して増強活性を有することを開示した。そのようなアッセイは、CFU-MIXのような幹細胞に対して、CFU-GMおよびCFU-M前駆細胞集団に対する効果を実証する。著者らは、ヘモグロビンの単離されたα鎖およびβ鎖の両方における活性を観察した。この活性は、N-エチルマレイミドでの処理により消滅し、このことはKreglerらに、スルフヒドリル基が必要であることを示唆した。この観察は、刺激活性がトリプシン消化に対する耐性であるという事実と合わせて、KreglerらにC-末端疎水性ドメインまたは「核」領域が活性を担っていることを示唆した。Moqattashら(Acta.Haematol.92:182-186,1994)は、組換えヘモグロビンがCFU-E、BFU-EおよびCFU-GM前駆細胞の数に対して刺激効果を有することを開示し、これは、ヘミンで観察されたのと同様である。Muellerら(Blood 86:1974,1955)は、精製された成人のヘモグロビンがヘミンと同様の様式で赤血球系の前駆細胞を刺激することを開示した。
βおよびγエンドルフィンに対するプレプロオピオメラノコルチン、ダイノルフィンAお
よびBに対するプレプロダイノルフィン、βネオエンドルフィンに対するαネオエンドルフィン)よりインビボで生成される。さらに、オピエート活性を有するペプチドは、αまたはβカゼイン、小麦グルテン、ラクトアルブミン、チトクローム、またはヘモグロビンのようなタンパク質のタンパク質分解または加水分解のような非古典的な供給源、またはカエルの皮膚(デルモルフィン)またはウシ副腎髄質のような他の種から得られ得る。このようなペプチドは、古典的なエンドルフィンに対して「エキソルフィン(exorphin)」と呼ばれ、それらはまた異型オピエートペプチドとも呼ばれる(非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;Brantl,Eur.J.Pharm.106:213-14,1984;Brantlら,Eur.J.Pharm.111:293-4,1985;Brantlら,Eur.J.Pharm.125:309-10,1986;BlantlおよびNeubert,TIPS 7:6-7,1986;Glamstaら,BBRC 184:1060-6,1992;Teschemacher,Handbook Exp.Pharm.104:499-28,1993;Petrovら,Bioscience Reports 15:1-14,1995
;Karelinら,Peptides 16:693-7,1995)。Tyr-MIF-1ファミリーのような他の内因性ペプチドはまた、オピエート活性を有することが示されている(Reedら,Neurosci.and Biobehav.Rev.18:519-25,1994)。
胞は、正常マウスと比較してこれらのμレセプターノックアウトマウスではより急速に循環していた。これらの効果が、これらの動物におけるμレセプターの不在から生じる骨髄幹細胞に対する直接的または間接的効果に起因するかどうかは決定されなかった(Broxmeyerら,Blood 88:338a,1997)。
刺激性増殖因子に関する生産的な研究は、多くのこれらの因子(エリスロポエチン、G-CSF、GM-CSFなど)の臨床的な使用をもたらした。これらの因子は、化学療法および放射
線処置に関連した死亡率および罹患率を低下させた。化学療法または放射線照射を受けている患者に対するさらなる臨床的利点が、幹細胞が細胞周期に入ることをブロックし、それによって幹細胞を有毒な副作用から保護する代替のストラテジーにより実現され得る。この保護の逆は、化学または放射線処置後の、骨髄機能の迅速な回復を可能にする。
骨髄移植(BMT)は、種々の血液疾患、自己免疫疾患および悪性疾患にとって有用な処
置である。現在の治療法は、臍帯血、胎児肝臓から、または末梢血(移動化していないか、またはG-CSFもしくはシクロホスファミドのような因子によって移動化される)から、ならびに骨髄から得られた造血細胞を含む;幹細胞は未精製、部分的に精製(例えば、CD34+集団のアフィニティー精製)、または高度に精製(例えば、CD34,CD38、またはローダミンのようなマーカーを使用する、蛍光活性化細胞選別により)され得る。造血細胞のエクスビボ操作は、現在では、原始幹細胞を移植に適した集団に拡大するために用いられている。この手順を最適化するには以下のことが必要である:(1)造血の長期の再構築を維持し得るのに十分な数の幹細胞;(2)移植片対宿主誘導Tリンパ球の涸渇、および(3)悪性細胞の残留がないこと。この手法は、幹細胞阻害剤および/または幹細胞刺激剤を含むことにより最適化され得る。
することの効果は、正常な造血細胞および特に幹細胞に対するこれらの化合物の毒性により制限される。パージ中は、正常細胞を効果的に保護する必要性がある。保護は、効果的な阻害剤を用いて、幹細胞をその細胞周期からはずすことにより与えられ得る。
末梢血幹細胞(PBSC)は、自家移植に対して骨髄よりも多くの潜在的な利点を提供する。腫瘍の保持、または以前の放射線処置により適切な骨髄採取部位を持たない患者は、さらにPBSC採集を受け得る。血液幹細胞の使用は、一般的な麻酔法および外科的手段に十分に耐えられない患者におけるそれらの必要性を排除する。血液細胞を採集するのに必要な血液成分分離技術は、効率的であり、そしてほとんどの主要な医療センターで広く利用可能である。この方法の主な制限事項は、末梢血中の幹細胞が正常な定常状態にある頻度が低いこと、および薬物または増殖因子(例えば、シクロホスファミド、G-CSF、幹細胞因子)を用いた移動手順の後では細胞周期の進行が速いことの両方である。効果的な幹細胞阻害剤は、そのような細胞を休止状態に戻すために有用であり、それによって分化の間にそれら細胞が消失することを防ぐ。
多くの疾患は、調節異常の幹細胞が、末期細胞の過剰生産を引き起こす過剰増殖状態によって特徴付けられる。このような病態は、上皮細胞の過剰生産である乾癬、および腸ポリープ出現を特徴とする胃腸管における前悪性状態,および初期幹細胞がHIVによって感
染されていないが迅速に循環し、幹細胞の消耗を生じる後天性免疫不全症候群(AIDS)を含むが、それらに限定されない。幹細胞阻害剤はこのような状態の処置に有用である。
多くの疾患は、調節異常の幹細胞が末期細胞の生産不足を引き起こす過剰増殖状態によって特徴づけられる。このような病態は、血液細胞の生産不足である脊髄形成異常症候群または再生不良性貧血、および細胞の再生および置換の欠乏が存在する加齢と関連する状態を含む。幹細胞刺激剤は、このような状態の処置に有用である。
VI.遺伝子導入
遺伝情報を造血細胞に導入する能力は、現在では、臨床的設定に利用されている。利用の容易さ、エクスビボでこの組織を操作し処理する幅広い経験のため、および血液細胞が組織に浸透する能力のため、造血細胞は遺伝子療法の有用な標的である。さらに、特定のヒトの遺伝子欠損の修正は、機能的遺伝子をヒト造血系の原始幹細胞に挿入することにより可能であり得る。
本発明は、幹細胞増殖阻害剤および/または刺激剤(INPROLおよびオピエート化合物)であるペプチドおよびポリペプチドを含む化合物、およびそれらの使用に関する。
(a)マウスコロニー形成脾臓(CFU-S)アッセイにおいて比活性(IC50)が20ng/ml以
下である(実施例4を参照のこと)、
(b)(限外濾過により)分子量が10,000ダルトンより大きく、かつ100,000ダルトンより小さい、
(c)活性がトリプシンによる分解に対して感受性である、
(d)MIP-1αまたはTGFβよりも疎水性であり、そして逆相クロマトグラフィーにより両
方から分離可能である(実施例12を参照のこと)、
(e)水溶液中で37℃、55℃または75℃で1時間加熱した後でも生物学的活性が保持され
ている、および
(f)1%塩酸のアセトン溶液を用いて沈澱させた後でも生物学的活性が保持されている。
、TGFβ、および種々のオリゴペプチド)と区別される。
以下の手順によってブタまたは他の骨髄から単離された幹細胞増殖阻害剤(実施例12を参照のこと):
(a)骨髄を抽出し、そして濾過によって粒子状物質を除去する;
(b)56℃で40分間熱処理した後、氷浴で冷却する;
(c)4℃で30分間10,000gで遠心分離することによって沈澱物を除去する;
(d)10容量の撹拌された氷冷アセトン(1容量%の濃塩酸を含む)に上清を添加し、そ
して4℃で16時間インキュベーションすることにより酸沈澱させる;
(e)4℃で30分間20,000gで遠心分離することにより沈澱物を単離し、そして冷アセトンで洗浄した後、乾燥させる;
(f)逆相クロマトグラフィーによって単離し、そして5-フルオロウラシルで前処理し、
マウスIL-3存在下でインキュベートした骨髄細胞によるコロニー形成の阻害、ならびに280nmにおける吸光度およびSDS-PAGEにより活性をモニターする。
実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖阻害剤を精製する方法であって、前記の工程を包含し、さらに以下により詳細に記載される方法。
幹細胞増殖阻害剤が、幹細胞の過剰増殖によって引き起こされる免疫抑制を改善するように作用する、ヒトまたは動物を処置する方法。
幹細胞刺激量のINPROLが、幹細胞の低増殖によって引き起こされる骨髄抑制を改善する、ヒトまたは動物を処置する方法。
前記幹細胞増殖阻害剤が、細胞傷害性薬物または放射線照射手順に曝されることによって幹細胞が増殖するように誘導された後、投与される、ヒトまたは動物を処置する方法。幹細胞は通常は休止しているが、化学療法後、細胞周期に入るように刺激される。これによって幹細胞は2回目の化学療法剤の投与に対してより感受性となる;本方法はこの処置から幹細胞を保護する。
幹細胞増殖の刺激剤(例えば、幹細胞刺激量でのINPROL)が、骨髄の再生を促進するために、幹細胞阻害量のINPROL前後に投与される、ヒトまたは動物を処置する方法。幹細胞阻害量のINPROLは、幹細胞の細胞周期への移行速度を遅らせ、そして化学療法や放射線照射から保護する;幹細胞刺激量のINPROLはこの阻害を逆転し、そして骨髄の回復を促進する。逆に、幹細胞刺激量のINPROLは骨髄の回復に使用され得るが、幹細胞阻害量のINPROLは一旦骨髄の回復が達成すると、次に幹細胞を静止状態に戻すために使用される。
前記幹細胞増殖阻害剤が、免疫応答を増大させるためにワクチン接種の前または同時にアジュバントとして投与される、ヒトまたは動物を処置する方法。
前記哺乳動物に免疫刺激的量のINPROLを投与する工程を含む、哺乳動物の免疫不全を処置する方法。
前記哺乳動物に鎮痛誘導量のINPROLを投与する工程を含む、哺乳動物の疼痛を処置する方法。
幹細胞を損傷から保護するために有効量の幹細胞増殖阻害剤を投与する工程を含む、細胞傷害性薬物または放射線処置を受けたヒトまたは動物を処置する方法。
処置後の回復を増強するために、有効な幹細胞刺激量のINPROLを投与する工程を含む、細胞傷害性薬物または放射線処置を受けたヒトまたは動物を処置する方法。
。この領域は全体的に欠失により除去され得るか、またはこの領域の1つ以上のアミノ酸が欠失され得る(「欠失」C末端ハプトグロビン結合ドメイン)。この領域またはこの領域の1つ以上のアミノ酸は、例えばポリアラニンもしくはポリグリシン、またはポリペプチドのハプトグロビンへの結合を無効にする効果を有するが、幹細胞阻害活性は維持するような他のアミノ酸に置換され得る(「置換」C末端ハプトグロビン結合ドメイン)。
モグロビンから単離されている(例えば、Brantlら、Eur.J.Pharm.、125:309-10、1986;Davisら、Peptides 10:747-51、1989;Hoffmanら,PNAS 87:8721-25,1990;Hernanら,Biochem.31:8619-28,1992;Karelinら、Bioch.Biophys.Res.Comm、202:410-5、1994;Zhaoら、Ann.N.Y.Acad.Science 750:452-8、1995;Petrovら,Bioscience Reports,15:1-14,1995;Karelinら,16:693-697,1995)。これらの論文のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。他の異型のオピエートペプチドおよび小分子もまた存在する(Zioudrouら,JBC 254:2446-9,1979;QuirionおよびWeiss,Peptides 4:445,1983;Loukasら,Biochem.22:4657,1983;Brantl,Eur.J.Pharm.106:213-14,1984;Brantlら,Eur.J.Pharm.111:293-4,1985;BrantlおよびNeubert,TIPS 7:6-7,1986;HurbyおよびGehrig,Med.Res.Rev.9:343-401,1989;Schiller,Prog.Med.Chem.28:301-40,1991;Glamstaら,BBRC 184:1060-6,1992;Teschemacher,Handbook Exp.Pharm.104:499-28,1993;Handbook of Experimental Pharmacology,A.Hertz(編)volumes 104/Iおよび104/II,1993,Springer Verlag,Berlin;Reedら,Neurosci.and Biobehav.Rev.18:519-25,1994;Karelinら,Peptides 16:693-7,1995)。これらの論文のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。本明細書中で使用されたように、「オピエート様レセプター」は、オピエート、INPROL、ヘモルフィン(hemorphins)、エキソルフィン(exorphins)、ノイセプチン(noiceptin)、Tyr-MIF-1ファミリーメンバー、アルカロイド、および/または適当量のナロキソン(naloxone)を含ませることにより拮抗されるように幹細胞増殖を阻害または刺激する他の化合物に結合するそれらの能力によって定義される(実施例29および38を参照のこと)。
合タンパク質(好都合には、これらのG阻害性サブタイプのタンパク質)を活性化し得る
化合物(例えば、マストパラン(mastoparan))とを接触させる工程を含む方法を包含する。
についてはReedら、Neurosci.Biobehav.Rev.18:519-25、1994を参照のこと)、カゼイン由来カソモルフィン(casomorphin)(Brantlら、Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.360:1211-16、1979;Loukasら、Biochem.22:4567-4573、1983;FiatおよびJolles、Mol.Cell.Biochem.87:5-30、1989)、シトクロームb由来のペプチド(シトクロフィン(cytochrophin)と称される)(Brantlら、Eur.J.Pharm.111:293-4、1985)、ヒトおよびヒト以外の種由来の種々なエキソルフィンおよびオピエートペプチド(Zioudrouら,JBC 254:2446-9,1979;Brantl,Eur.J.Pharm.106:213-14,1984;Brantlら,Eur.J.Pharm.125:309-10,1986;BrantlおよびNeubert,TIPS 7:6-7,1986;Glamstaら,BBRC 184:1060-6,1992;Teschemacher,Handbook Exp.Pharm.104:499-28,1993;Karelinら,Peptides 16:693-7,1995)、ならびにオピエートレセプターへの結合についてスクリーニングされたコンビナトリアルライブラリー由来ペプチド(概説についてはDooleyら、Peptide Research 8:124-137、1995を参照のこと))に類似の配列類似性およ
び/または生物学的活性を有する。これらの論文のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。
選択されるペプチドとを接触させる工程を含む方法を包含する。以下の配列を有するTyr-MIF-1ペプチドが特に含まれる:
a)上記哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
b)エクスビボで上記造血細胞を幹細胞刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物で処理する工程、
c)予め決定された遺伝子で上記造血細胞をトランスフェクトまたは感染する工程、
d)エクスビボで上記トランスフェクト造血細胞と幹細胞阻害量のINPROLおよび/またはオピエート化合物とを接触させる工程、
e)上記哺乳動物に工程dの造血細胞を移植する工程、
f)必要に応じて、インビボで上記哺乳動物を幹細胞を阻害または刺激する量のINPROLおよび/またはオピエート化合物で処理する工程。
テトラペプチドであるN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドであるグルタチオン(Gly-Cys-γGlu)からなる群から選択される)を含む薬学的組成物を包含する。
項目1.C末端疎水性ドメインが置換または欠失されているヘモグロビンα鎖を含むポリペプチド。
項目2.C末端ハプトグロビン結合ドメインが置換または欠失されているヘモグロビンα鎖を含むポリペプチド。
項目3.ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97を含むポリペプチド。
項目4.(a)請求項1または2に記載のポリペプチドおよび(b)薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
項目5.ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97からなるポリペプチドおよび薬学的に受
容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
項目6.ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94からなるポリペプチドおよび薬学的に受
容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
項目7.単位投与量形態の請求項4から6に記載の薬学的組成物。
項目8.0.1mgから6gの、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペ
プチドおよびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチドからな
る群より選択される1つまたは2つの化合物を含む、請求項7に記載の薬学的組成物。
項目9.幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖阻害量の請求項1または2に記載のポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
項目10.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、お
よび配列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thrを有するペプチドからなる群より選択される、請求項
9に記載の方法。
項目11.B細胞の増殖を刺激する方法であって、造血細胞と増殖刺激量の請求項1または2に記載のポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
項目12.ガンに羅患している哺乳動物においてガンを処置する方法であって、該方法は以下の工程:
(a)放射線療法または化学療法を投与する工程、および
(b)幹細胞増殖阻害量の請求項1または2に記載のポリペプチドを投与する工程、
を包含する、方法。
項目13.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチドおよびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド
からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
項目14.前記工程aおよびbが1回以上繰り返される、請求項12に記載の方法。
項目15.前記工程aが前記工程bの後に行われる、請求項12に記載の方法。
項目16.前記工程bが前記工程aの前または後の24時間以内に行われる、請求項12に記載の方法。
項目17.哺乳動物においてガンを処置する方法であって、該方法は以下の工程:
a)該哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
b)該造血細胞を、請求項1または2に記載のポリペプチドでエクスビボで処理する工程、
c)該工程bの造血細胞を、化学療法または放射線で処理する工程、
d)該哺乳動物において骨髄切除処置を行う工程、および
e)該工程cの造血細胞を該哺乳動物に移植する工程、
を包含する、方法。
項目18.前記工程(b)におけるポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチドおよびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
項目19.幹細胞に損傷を与えるか、または破壊する薬剤に暴露された哺乳動物において幹細胞分裂を阻害する方法であって、幹細胞増殖阻害量の請求項1または2に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
項目20.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、お
よび配列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thrを有するペプチドからなる群より選択される、請求項
19に記載の方法。
項目21.前記薬剤が抗ウイルス剤である、請求項19に記載の方法。
項目22.哺乳動物造血幹細胞をエクスビボで維持する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖阻害量の請求項1または2に記載のポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
項目23.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、お
よび配列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thrを有するペプチドからなる群より選択される、請求項
22に記載の方法。
項目24.前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、胎児肝臓、および臍帯血細胞からなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
項目25.骨髄増殖性疾患もしくは自己免疫疾患または上皮幹細胞過剰増殖を、それらに羅患している哺乳動物において処置する方法であって、過剰増殖減少量の請求項1または2に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
項目26.前記骨髄増殖性疾患が脊髄形成異常症候群である、請求項25に記載の方法。項目27.化学療法または放射線から哺乳動物における正常な幹細胞を区別して保護し、そしてガン細胞を保護しない方法であって、幹細胞保護量の請求項1または2に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
項目28.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、お
よび配列Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thrを有するペプチドからなる群より選択される、請求項
27に記載の方法。
項目29.前記正常な幹細胞が細胞傷害性薬物または放射線への暴露により増殖するように誘導された後に、前記ポリペプチドが投与される、請求項27に記載の方法。
項目30.哺乳動物をワクチン接種する方法であって、ワクチン投与の前、間、または後に請求項1または2に記載のポリペプチドをアジュバントとして投与する工程を包含する、方法。
項目31.幹細胞過剰増殖により引き起こされる免疫抑制を有する哺乳動物を処置する方法であって、該哺乳動物に過剰増殖後退量の請求項1または2に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
項目32.哺乳動物において遺伝子療法を行う方法であって、該方法は以下の工程:
a)造血細胞を該哺乳動物から取り出す工程、
b)該造血細胞を予め決定された遺伝子でトランスフェクトする工程、
c)該トランスフェクトされた造血細胞と請求項1または2に記載のポリペプチドとをエクスビボで接触させる工程、および
d)該工程cの造血細胞を該哺乳動物に移植する工程、
を包含する、方法。
項目33.前記工程cにおけるポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97
の配列を有するポリペプチドおよびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有す
るポリペプチドからなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
項目34.前記工程(a)の後に、幹細胞増殖を誘導するために、前記造血細胞を少なくとも1つの刺激性サイトカインで処理する工程をさらに包含する、請求項32に記載の方法。
項目35.前記工程(d)の後に、前記哺乳動物を前記ポリペプチドでインビボで処置する工程をさらに包含する、請求項32に記載の方法。
項目36.幹細胞拡大をエクスビボで行う方法であって、造血細胞と請求項1または2に記載のポリペプチドおよび少なくとも1つの刺激性サイトカインとを接触させる工程を包含する、方法。
項目37.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、およびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチ
ドからなる群より選択される、請求項36に記載の方法。
項目38.前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、胎児肝臓、および臍帯血細胞からなる群より選択される細胞である、請求項36に記載の方法。
項目39.(a)請求項1または2に記載のポリペプチド、ならびに(b)MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、ペンタペプチドピロGlu-Glu-Asp-Cys-Lys、テトラペ
プチドN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドグルタチオン(Gly-Cys-γGlu
)からなる群より選択される少なくとも1つの阻害性化合物を含む、薬学的組成物。
項目40.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、およびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチ
ドからなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
項目41.(a)請求項1または2に記載のポリペプチド、ならびに(b)IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびflk2/flt3リガンドか
らなる群より選択される少なくとも1つの刺激性化合物を含む、薬学的組成物。
項目42.前記ポリペプチドが、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有する
ポリペプチド、およびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチ
ドからなる群より選択される、請求項41に記載の方法。
項目43.αヘモグロビンまたはその置換もしくは欠失アナログを発現させる方法であって、該αヘモグロビンまたは置換もしくは欠失アナログを、ユビキチン融合体として発現させる工程を包含する、方法。
項目44.前記発現させる工程がE.coliにおいて行われる、請求項43に記載の方法。
項目45.前記発現させる工程が、ユビキチン切断酵素を発現させる工程を包含する、請求項43に記載の方法。
項目46.ビオチン-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、(ヨード)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、および(ヨード)Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Valからなる群より選択される配列を有するペプチド
。
項目47.幹細胞増殖を刺激する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目48.前記INPROLが、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンγ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンε鎖、ヘモグロビンζ鎖、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、およびヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
項目49.前記INPROLが、以下の配列:
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
(ここで、2つのCys残基はジスルフィド結合を形成する)、
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala、
Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp、
Leu-Val-Val-Tyr-Pro、
Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln、
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe、
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg、
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln、および
Tyr-Pro-Trp-Thr、
からなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
項目50.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
項目51.幹細胞増殖を刺激する方法であって、造血細胞とオピエートレセプターに結合し得る化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目52.前記化合物がμサブクラスのオピエートレセプターに対する選択性を有する、請求項51に記載の方法。
項目53.幹細胞増殖を刺激または阻害する方法であって、造血細胞とノシセプチンレセプターに結合し得る化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目54.幹細胞増殖を刺激または阻害する方法であって、造血細胞とG阻害性サブクラスのGTP結合タンパク質を活性化し得る化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目55.幹細胞増殖を刺激または阻害する方法であって、造血細胞と古典的μ、κ、もしくはδオピエートレセプターまたはORL1を含まないオピエート様レセプターに結合し得る化合物とを接触させる工程を包含し、ここで該レセプターは(a)幹細胞刺激および/または阻害特性を有し、そして(b)ナロキソンにより拮抗可能な該幹細胞刺激および/または阻害能力を有する、方法。
項目56.前記オピエート様レセプターが、1μM未満またはそれに等しい解離定数(Kd
)で、ペプチドPhe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Valに結合する能力
を有する、請求項55に記載の方法。
項目57.前記解離定数が10nM未満またはそれに等しい、請求項55に記載の方法。
項目58.INPROLに対するレセプターを同定する方法であって、レセプター結合アッセイにおいて該レセプターを含む物質とINPROLとを接触させる工程を包含する、方法。
項目59.前記INPROLが、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンγ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンε鎖、ヘモグロビンζ鎖、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
ビオチン-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
(ヨード)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
(ヨード)Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys、および
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala、
からなる群より選択される、請求項58に記載の方法。
項目60.INPROLに対するレセプターを同定する方法であって、アデニル酸シクラーゼアッセイにおいて該レセプターを含む物質とINPROLとを接触させる工程を包含する、方法。項目61.前記INPROLが、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンγ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンε鎖、ヘモグロビンζ鎖、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
ビオチン-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
(ヨード)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
(ヨード)Phe-Pro-His-(ヨード)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys、および
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala、
からなる群より選択される、請求項60に記載の方法。
項目62.ガンを羅患している哺乳動物においてガンを処置する方法であって、該方法は以下の工程:
(a)放射線療法および/または化学療法を投与する工程、および
(b)幹細胞増殖刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物を投与する工程、
を包含する、方法。
項目63.前記工程aおよびbが1回以上繰り返される、請求項62に記載の方法。
項目64.前記工程aが前記工程bの前に行われる、請求項62に記載の方法。
項目65.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項62に記載の化合物。
項目66.幹細胞に損傷を与えるかまたは破壊する薬剤に暴露された哺乳動物において幹細胞分裂を刺激する方法であって、幹細胞増殖刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物を投与する工程を包含する、方法。
項目67.前記薬剤が抗ウイルス剤または抗腫瘍剤である、請求項66に記載の方法。
項目68.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
項目69.哺乳動物造血幹細胞をエクスビボで維持する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目70.前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、胎児肝臓、および臍帯血細胞からなる群より選択される、請求項69に記載の方法。
項目71.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項69に記載の方法。
項目72.骨髄増殖性疾患、造血幹細胞過剰増殖または上皮幹細胞過剰増殖を、それらを羅患している哺乳動物において処置する方法であって、刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物を投与する工程を包含する、方法。
項目73.前記骨髄増殖性疾患が脊髄形成異常症候群または再生不良性貧血である、請求項72に記載の方法。
項目74.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項72に記載の方法。
項目75.幹細胞消耗を処置または予防する方法であって、幹細胞増殖阻害量のINPROLおよび/またはオピエート化合物を投与する工程を包含する、方法。
項目76.前記幹細胞消耗が後天性免疫不全症候群によるものである、請求項75に記載の方法。
項目77.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項75に記載の方法。
項目78.化学療法または放射線から哺乳動物における正常な幹細胞を区別して保護する方法であって、幹細胞保護量のオピエート化合物を投与する工程を包含する、方法。
項目79.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項78に記載の方法。
項目80.哺乳動物において遺伝子療法を行う方法であって、該方法は以下の工程:
a)該哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
b)該造血細胞を、幹細胞刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物でエクスビボで処理する工程、
c)該造血細胞を予め決定された遺伝子でトランスフェクトまたは感染する工程、
d)該トランスフェクトされた造血細胞と、幹細胞阻害量のINPROLおよび/またはオピエート化合物とをエクスビボで接触させる工程、
e)該工程dの造血細胞を該哺乳動物に移植する工程、
f)必要に応じて、該哺乳動物を幹細胞阻害量または刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物でインビボで処置する工程、
を包含する、方法。
項目81.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項80に記載の方法。
項目82.幹細胞拡大をエクスビボで行う方法であって、造血細胞と幹細胞刺激量のINPROLおよび/またはオピエート化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
項目83.前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、胎児肝臓、および臍帯血細胞からなる群より選択される細胞である、請求項80に記載の方法。
項目84.前記オピエート化合物が、モルヒネ、エトルフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルフォン、オキシモルフォン、レボルファノール、レバロルファン、コデイン、ハイドロコドン、オキシコドン、ナロルフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブタノルファノール、ナルブフィン、メペリジン、アルファプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、DAMGO、DALDA、およびノシセプチンからなる群より選択される、請求項80に記載の方法。
項目85.(a)オピエート化合物、ならびに(b)MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、ペンタペプチドピロGlu-Glu-Asp-Cys-Lys、テトラペプチドN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドグルタチオン(Gly-Cys-γGlu)からなる群より選択される少なくとも1つの阻害性化合物を含む、薬学的組成物。
項目86.a)オピエート化合物、ならびに(b)IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびflk2/flt3リガンドからなる群より選択される
少なくとも1つの刺激性化合物を含む、薬学的組成物。
項目87.哺乳動物において疼痛を処置する方法であって、鎮痛誘導量のINPROLを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
項目88.前記INPROLが、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンγ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンε鎖、ヘモグロビンζ鎖、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ara-Gln-Val-Cys、および
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala、
からなる群より選択される、請求項87に記載の方法。
項目89.哺乳動物における免疫不全を処置する方法であって、免疫刺激量のINPROLを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
項目90.前記INPROLが、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンγ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンε鎖、ヘモグロビンζ鎖、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-97の配列を有するポリペプチド、ヒトαヘモグロビン鎖のアミノ酸1-94の配列を有するポリペプチド、
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val、
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ara-Gln-Val-Cys、および
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala、
からなる群より選択される、請求項89に記載の方法。
INPROLは、幹細胞の分裂を可逆的に阻害または刺激する。特定の理論に縛られることを望まないが、幹細胞阻害剤および刺激剤は、幹細胞が細胞周期を通って移行する割合に影響を与えることによってそれらの効果を発揮すると考えられる。特に、INPROLは、使用量に依存して造血幹細胞の細胞分裂を一時的に阻害または刺激することに効果的である。幹細胞増殖を阻害または刺激し得る化合物を臨床的に使用する能力は、例えば化学療法、幹細胞移植または遺伝子療法プロトコルの間の、造血幹細胞の細胞周期進行の精巧な制御を可能にする。従って、本発明の方法は、ガン細胞もしくはウイルスに感染した細胞を破壊するために用いられる化学療法剤もしくは放射線によって引き起こされる損傷から幹細胞を保護することによって、またはそのような損傷後の回復を刺激することによって、患者の造血系、骨髄系および免疫系に対する化学療法の望ましくない副作用を軽減することに用いられ得る。本発明の一つの実施態様では、INPROLは、化学療法剤が疾患細胞に作用している間の幹細胞分裂を阻害するのに十分な用量で患者に投与される。化学療法剤がその機能を発揮した後、INPROLによって阻害された幹細胞は、さらなる処置を受けずに分裂細胞に戻る。造血再生を高めることが所望されるならば、刺激性成長因子、サイトカインまたは幹細胞刺激量のINPROLがさらに用いられ得る。
を阻害することが望ましい場合は、標準的化学療法または放射線照射処置の4〜60時間前に投与することを用いて、投与量単位形態で静脈注射または点滴により日毎のレジメで患者に投与される。
たり0.1ng〜100ng、好都合には106細胞/ml当たり2〜50ngのINPROLが用いられる。幹細胞の刺激が所望される場合では、106細胞/ml当たり10ng〜100μg、好都合には106細胞/ml当たり1〜100μgのINPROLが用いられる。
にかかった患者を処置するための本発明の別の実施態様においては、造血細胞はエクスビボまたはインビボでINPROLにより処理され、その後抗ウイルス剤、感染細胞を破壊する薬物、または感染細胞を排除するための抗体に基づく系により処理される。患者からウイルス性宿主細胞を根絶するための骨髄切除(myeloablative)抗ウイルスまたは骨髄切除化学療法の後、INPROL処理した骨髄は患者に戻される。
好ましい」コドンの取り込み;制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の供給;および付加的な開始、末端、または中間のDNA配列の供給、これらの配列は、容易に発現され
るベクターの構築、あるいはヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および/またはζ鎖の生成または精製を容易にする。
は誘導体は、1つ以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して天然に存在する形態と異なり(すなわち、欠失アナログ、記載の全残基より少ない残基を含有する;置換アナログ、記載の1つ以上の残基が他の残基により置換される;および付加アナログ、1つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間部分に付加される)、かつ天然に存在する形態の一部または全ての特性を共有する。
)または他の情況(例えば、阻害剤拮抗作用のアッセイ)における有用性を有するために、活性は必要でないことは注目すべきことである。競合的アンタゴニストは、幹細胞阻害剤またはそのレセプターの過剰生産の場合において有用である。
ロール、ポリエチレングリコール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、増量物または張度改変剤(例えば、ラクトース、マンニトール)を含み、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)のタンパク質への共有結合、金属イオンとの複合体化、あるいは物質のポリマー性化合物(例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、水性ゲルなど)の粒状調製物中または上への取り込み、またはリポソーム、ニオソーム(niosome)、マイク
ロエマルジョン、ミセル、単ラメラ小胞または多重ラメラ小胞、生分解性注入マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、またはタンパク質マトリックス、赤血球影、スフェロプラスト、皮膚パッチ、または薬剤を放出またはパッケージングする他の公知の方法中への取り込みを含む。このような組成物は、INPROLの物理的状態、溶解度、安定度、インビボ放出速度、およびインビボ消失速度に影響を及ぼす。徐放性組成物または持続放出性組成物は、親油性デポ剤(例えば、脂肪酸、ワックス、オイル)中の処方物を包含する。ポリマー(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)で被覆された粒状組成物および組織特異的レセプター、リガンド、または抗原に対する抗体に結合されたINPROL、あるいは組織特異的レセプターのリガンドに結合されたINPROLもまた、本発明により包含される。本発明の組成物の他の実施態様は、種々の投与経路のために、粒状形態の保護コーティング、プロテアーゼ阻害性因子、または浸透増強剤を取り込む。この投与経路としては、非経口投与、経肺投与、鼻内投与、局所(皮膚または粘膜)投与、および経口投与が挙げられる。別の実施態様では、INPROLを含有する組成物は、局所的にまたは経皮パッチを介して投与される。
ドキソルビシン(doxyrubicin)、エトポシド、タキソール、アルキル化剤)、抗ウイル
ス剤(例えば、AZT、アシクロビル)、TNF、サイトカイン(例えば、インターロイキン)、抗増殖薬、代謝拮抗物質、およびDNA代謝に干渉する薬物)を含む組成物もまた包含す
る。
幹細胞増殖の検出のために、細胞周期のS期にあるCFU-Sの数を3H-チミジン「自殺(suicide)」法(Beckerら、Blood 26:296-308、1965)により測定した。
たマウスの脾臓において肉眼で見えるコロニーを形成させることにより、インビボで、造血細胞の静脈注射の8〜12日後に検出され得る(Till & McCulloch、1961)。
マウス:全ての試験を通じてBDF1またはCBF1マウス種を用いた。
射によって、10mg/100gの用量のTSPで処理した。
の冷培地(4℃)を添加することにより、死滅反応を停止させる。細胞を十分に洗浄する(3回)。
ここで、b--3H-チミジンを有するCFU-Sの数表1に示されるINPROLの試験データは、INPROLでの処理の後に細胞周期の進行している幹細胞が3H-チミジンの作用に対して耐性になることを示している。実施例1および以下の
実施例の全てについて、用語「pINPROL」は、ブタ骨髄由来の精製タンパク質をいう。同じ保護が、S期特異的細胞障害性薬物であるシトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素にも見られる(データは示していない)。次いで、処理された幹細胞を放射能活性のないチミジンを含む冷培地で洗浄した場合、生き残った幹細胞はマウス脾臓内で増殖して、正常にコロニーを形成する。
骨髄細胞との4時間のインキュベーションの間に
pINPROLがCFU-S増殖に及ぼす阻害活性
以下の試験系(Lordら、The Inhibitors of Hematopoiesis 227〜239頁、1987)を用いて、INPROLの直接的効果を示した。多系統(multilineage)因子(IL-3)依存性幹細胞株であるFDCP mix A4(A4)を、コロニー刺激性IL-3の供給源として、20%ウマ血清および10%WEHI-3馴化培地を補充したIMDM培地中で維持した。
インビボで注射されたINPROLの効果の研究は、INPROLがCFU-Sの細胞周期への加入を効果的にブロックし得、これによりそれらの細胞をさらなる処理の細胞障害効果から保護し、その臨床使用への可能性を示すことを示した。
ロン-プロピオネートの注射を用いた。
薬剤5-フルオロウラシル(5-FU)は、骨髄およびリンパ球の区画(compartment)中の
細胞数を劇的に減少させる。それは通常、細胞周期特異的であり、細胞周期のS期の間または前にヌクレオチドアナログをDNA内に取り込むことは細胞死となるので、増殖細胞を
迅速に標的とすると考えられている。マウスの骨髄の長期生存および免疫造血再構築は、5-FUの1回の用量では影響を受けない;しかし、多能性造血幹細胞(PHSC)は最初の投薬後約3〜5日間という短い期間に第2回目の5-FUの投薬に対して攻撃されやすくなるということが示された(Harrisonら、Blood 78:1237〜1240、1991)。PHSCは、通常、5-FUの1回の投薬に対して細胞周期が遅すぎて効果的ではなく、そして第1回目の5-FU処理の結果起こる刺激により刺激されて迅速に細胞周期に入ることが説明され得る。本発明者らは、PHSCは、INPROLにより遅い細胞周期状態に戻り得、これにより2回目の5-FU処理から保護され得るということを提案した。
を生理食塩水中で10μg/mlの濃度に調製した。各処理マウスは、実験0日目に尾部静脈を介して体重10g当たり2mgの5-FUを受けた;24時間後、マウスにpINPROL(10μg/体重100g)を腹腔内注射し、そして3日目に第2回目の5-FUの用量を注射した。生存研究は、各々30匹のマウスからなる実験グループ(pINPROL処理)およびコントロールグループにおいて、マウスの死亡をモニターすることにより行った。生存曲線を図8に示す。
この実験の目的は、インビトロでのマウス骨髄細胞に対するpINPROLおよびMIP-1αでプレインキュベーションした場合の阻害効果を比較することであった。
インビボ:大腿骨から骨髄を採取する48時間前に、6〜15週齢のBDF1マウスに200mg/kgの5-FUを腹腔内に注射する。
に総容量2mlとして、37℃および5%CO2で4時間インキュベーションする。次いで、細
胞を2回洗浄し、そして再計数した。それらを以下の最終条件下でメチルセルロースにプレートする:
0.8% メチルセルロース
25% ウマ血清
20ng/ml 組換え型マウスIL3
L-グルタミン添加
5×105細胞/ml
IMDM培地
プレートを11日間、37℃および湿度100%中5%CO2で、インキュベーションした。50細胞より多いコロニーを計数した。
マウス再構築幹細胞および初期前駆体を評価するインビトロアッセイは、高増殖性潜在コロニー(HPP-PFC)アッセイである;他の関連アッセイ、例えばCFU-A、CFU-GM、CFU-E
およびCFU-GEMMは、次第に制限された前駆細胞の集団を検出する(M.Moore、Blood 177:2122-2128、1991)。この例は、pINPROLでの細胞の前処理が、それらの増殖を阻害するのに対し、MIP-1αは、これらの実験条件下では阻害しないということを示す。
シル(200mg/kg腹腔内)で処置した。細胞を遠心分離により洗浄し、そして添加剤のない培地(コントロール)、pINPROL(25ng/ml)またはMIP-1α(200ng/ml)を含む培地のい
ずれかにおいて、106〜5×106/mlの密度で4時間インキュベーションした。インキュベ
ーション後、細胞を洗浄し、そして30%FCSならびに5637細胞株およびWEHI-3B細胞株由来の組合せ馴化培地(7.5%の各馴化培地、Sharpら、1991の推奨による)を有する寒天(0.3%)にプレートした。プレート濃度は、60mmの皿に5×104細胞/mlであった。14日目にコロニー数を計数し、そして結果を以下に示す。
合には、ほとんどの未成熟な前駆体の増殖を阻害しなかった。pINPROLは、これらの条件
下で増殖を効果的に阻害し、生物学的活性という点から見るとpINPROLとMIP-1αとの間には基本的な違いがあることを示している。
骨髄形成不全は、放射線ガン療法の一次的制限毒性(primary limiting toxicity)
である。いくつかの増殖因子(例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン)は、放射線
誘導性骨髄形成不全からの回復を促進し得るということが示されてきた。幹細胞増殖の阻害剤の使用による保護という概念は、血液学的な損傷に上手く対処することにおける異なった補足的なアプローチである。初期に開発された処置手順(実施例3、4)に従い、致死量の放射線を照射されたマウスのモデルを確立した。9Gyのコバルト60を受けたマウスは10〜14日後に死亡し始め;30日目までには死亡率は約50%となる、ということは当該分野では公知である。この致死用量を、それを各4.5Gyずつの連続する2回の適用に分けて
、投薬の間は3日間の間隔を置いて、本発明者らのモデルに用いた。予備データは、そのモデルの生存曲線が、9Gyによる1回の放射線照射で知られた生存曲線と非常に近いことを示した;さらに、CFU-S増殖に関する試験は、第1回目の放射線照射の24時間後に35〜50%のCFU-Sが増殖するように誘導されることを示した。このような細胞は、第2回目の投薬の前に送達される幹細胞阻害剤により保護され得る。
その24時間後に、1つのグループにはpINPROL(2μg/マウス、腹腔内)を投与し、別
のコントロールグループには生理食塩水を注射した。そして第2回目の放射線の照射用量(4.5Gy)を3日目に与えた。
固形腫瘍により特徴付けられるガンを含むいかなるガンの処置にも臨床的に有意義であり、このような処置は、放射線照射の2回続けた投与の間に有効用量のINPROLを送達することによりガンを有する患者に投与し、それによってガンの処置に用いられる放射線の照射線量をより多くすることができる。この様式は化学療法剤にも広げることが可能なはずである。
骨髄移植は、いくつかの白血病(CML、AML、およびその他)にとっては唯一知られた治療的な療法である。輸注のための自己BMTのエクスビボ調整により、白血病細胞の混入の
ない正常幹細胞の潜在的な自己供給源が提供され、そしてレシピエントの造血系を再生させて(repopulate)、積極的で効果的な療法を可能にする。
、正常な造血を保持する
長期骨髄培養物(LTBMC)をToksozら(Blood 55;931-936、1980)に従って確立し、そして白血病細胞株L1210を2週間LTBMCと共培養した。正常前駆細胞および白血病前駆細胞の同時増殖は、これらのLTBMC/L1210の混合培養物内で起こり、それは白血病患者の骨髄内と同様の状況である。正常なコロニー形成単位CFUと白血病CFUとの間の区別は、WEHI-3(マウスIL-3産生細胞株)由来の馴化培地の存在下または非存在下での寒天コロニーとしてそれらを増殖させることにより可能であった。正常細胞は、IL-3非存在下で、アポトーシスを受けるのに対し、白血病細胞はIL-3非存在下でコロニーを形成し得る。LTBMC-L1210組成物由来の懸濁細胞は、プレートされた50,000細胞当たり、IL-3存在下で約150個のコロニー(正常造血クローン)を生じ、IL-3なしで増殖した場合は70コロニー(白血病クローン)を生じた。
MRAは、致死量の放射線を照射されたマウスの骨髄を再生する細胞の能力であり、30日
間の放射線防御を付与する能力を伴っていて、骨髄抑制動物を救う潜在能力の直接的なインビボ測定である(Visserら、Blood Cells 14:369〜384、1988)。
激されたドナー由来の骨髄の移植により回復した。レシピエントの1グループは培地で(コントロール−グループA)、そして別のグループ(グループB)は25ng/mlのpINPROLで、4時間プレインキュベーションされた骨髄細胞により回復した。両グループの細胞を洗浄し、そしてマウス1匹当たり30,000個の細胞を放射線照射された動物に移植した。生存データを示す(図11)。3つの実験の合計を、コントロールを100%に正規化して示す。30日目までに、pINPROLによるインキュベーションにより、マウスの生存をコントロールグループの36.5%から61.8%まで増加させた。
改善するメカニズムの1つであり得る。この仮説を試験するため、Visserら(前出)に従ってMRAを測定した。簡潔に記載すると、ドナーBDF1マウスをテストステロンで前処理し、それらの骨髄を培地またはpINPROLで4時間プレインキュベーションし、そして放射線照射された動物に注射した。13日目に、レシピエントの大腿骨由来の骨髄細胞を、20%ウマ血清、および10%WEHI-CMの存在下で、3つの異なる濃度(0.01、0.05、0.1当量の大腿骨)で寒天に接種した。7日目のコロニー数は、その時点のレシピエントの骨髄中のコロニー形成細胞がドナーの未成熟幹細胞の前駆細胞である限り、MRAを表す。
、コントロールグループ(B)の場合より多い。
CFU-Sの過剰増殖は、細胞障害性薬物または放射線照射からの回復中に見られるだけで
なく、正常な加齢の結果としても見られ、そして骨髄異形成症候群(MDS)の主要な特徴
であると考えられている。それは、顆粒球経路に沿った分化が減少する一方で、赤血球分化が広まるような分化障害を伴う。
をINPROLとともにインキュベーションすることにより、異なるタイプのコロニーの数または比率は変化しなかった。テストステロンプロピオネート(TSP)で前処理されたBDF1ドナーは、以前に観察したように(実施例1、3、4)、CFU-S増殖における同じ増加、赤血球前駆細胞数(BFU-Eコロニー)におけるわずかな増加、およびGM-CFUにおける減少を示し、それはINPROLとのインキュベーションにより完全に妨げられた。さらに、異常に高いレベルのCFU-S増殖は、細胞周期のS期に10%のCFU-Sに戻った。CFU-Sの過剰増殖は、例えばBalb/cマウス(表4)のようにウイルス性白血病誘発を受けやすいある種のマウス系統の特徴であることが知られており、そしてより高齢の動物においても観察され得る(表4)。TSP処理したBDF1マウスに見られた分化方向の決定付けられた(committed)前駆細胞と同じ再分布が、Balb/cおよびより高齢(23〜25ヶ月齢)のBDF1において観察され、それは一般に異常に高いレベルのCFU-Sの増殖を有する。CFU-Sの増殖および分化の両方の修正は、INPROLとのインキュベーションによって誘導された。臨床的により関連したことに、研究によって、INPROLのインビボ注射(2μg/マウス)がCFU-Sの増殖ならびに赤血球(BFU-E)とGM-コロニーとの比率の両方に影響することが示された(表4)。
分化方向の決定付けられた前駆細胞BFU-EおよびCFU-GMへの
CFU-Sの分化に対するINPROLの効果
増殖CFU-Sを高い比率で含む骨髄細胞とINPROLとのインキュベーションは、CFU-Sの周期を変えるだけでなく、それらの分化を、優勢な赤血球の分化から顆粒球およびリンパ球の前駆細胞へと切り換える。INPROLのこの特性は、細胞障害性の化学療法または放射線療法の免疫抑制的な副作用および過剰増殖幹細胞障害および加齢に伴う免疫抑制のために重要である。
れたリンパ球長期培養(LLTC)由来の未成熟前駆体の前B前駆細胞への分化に対するINPROLの直接的な効果を示し、これはIL-7を含むメチルセルロース中のコロニー形成によって測定される。
慢性骨髄性白血病(CML)は、造血幹細胞の致死的な悪性疾患である。慢性期にあるCMLを単一薬剤による化学療法、組み合わせ化学療法、脾摘出、または脾臓への放射線照射を用いて処置することは、臨床的徴候および症状を制御し得るが、生存を有意に伸ばすことはない。CMLが慢性状態から促進状態に進むと、標準的な療法は効果的でない。現在では
、骨髄移植(BMT)がCMLに対する唯一の既知の治療的療法である。血縁でないドナーのBMTを用いる治療は、組織不適合性の問題により困難である。適格なCML患者の40%未満にしか適切に適合する血縁のドナーがいない;従って自己移植が好ましい。長期培養(LTC)において増殖するPh陽性患者由来の非白血病(Ph-陰性)骨髄前駆細胞を選択する能力とともに、輸注のための自己BMTのエクスビボ調整は、正常幹細胞の自己供給源がCMLの積極的で効果的な治療を行い得る可能性を示唆する。
能力を有する細胞として定義され得る。本発明者らは、C.Eaves & A.Eavesによって開
発されたヒトLTC系を、幹細胞数の定量用およびそれらの治療的使用のための操作手段の
両方で用いた。これは、予め確立され、放射線照射されたヒト骨髄接着層上に細胞を接種することを包含し;次いでこれらの培養物を5週間維持する。エンドポイント(end point)は、この期間の終わりに採取された培養物の総クローン原性細胞内容物(接着および非接着)である。このような条件下で生じたクローン原性細胞は、最初に添加された前駆細胞(長期培養開始細胞(LTC-IC))の数と直線関係にある;個々のヒトLTC-ICから生じた平均は、1個のLTC-ICにつき4クローン原性前駆細胞である。CMLの患者由来の骨髄が同様の条件下に置かれた場合、白血病性(Ph陽性)クローン原性細胞は迅速に衰退することが以前に示されていた。CML患者の残った正常LTC-ICの定量を用いることにより、培養自己移植片の移植により支持される集中治療から利益を得やすい細胞を選択することが可能である(Phillipsら、Bone Marrow Transplantation 8:477〜487、1991)。
性細胞(LTC-IC)の数に対するINPROLの効果を試験した。
、またはなしで4時間プレインキュベーションし、洗浄し、そしてLTC-IC系に5週間置き、LTC-ICのコントロール数を測定した。実験のために、別の平行培養を10日間確立した。10日間増殖させた培養物からの接着細胞および非接着細胞の混合物を、pINPROLとともに、またはなしでプレインキュベーションし、そしてさらに8週間予め確立したフィーダー上に置いた。各実験培養物由来のLTC-ICの数は、接着細胞および非接着細胞の両方を適当な増殖因子(Terry Fox Laboratories、Vancouver、Canada)を有するメチルセルロー
ス中にプレートし、そして得られた全コロニー形成細胞の数を計数することにより概算した。この手順を用いて得られたLTC-IC値は、下記の式を用いた全クローン原性細胞(CFC
)内容物の評価に由来した:
#LTC-IC=#CFC/4。
骨髄はブタの肋骨から単離した。ブタの胴体から肋骨を分離して筋繊維および脂肪を除き、細片に刻んで骨髄をBiophyzpribor社製の水圧プレスによって抽出した。骨髄細胞を
、遠心機K-70中で2,000rpmで20分間遠心分離することにより分離する。次いで、引き続き抽出上清をAmicon USAメンブレンXM-100、PM30、PM-50により連続的に限外濾過にかける。電気泳動による分析によると、この生成物の主要な成分はアルブミンである(図1参照)。
画分の骨髄抽出物およびタンパク質成分を、精製の各段階で、0.1%ドデシル硫酸ナト
リウムを含む10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。7%までのドデシル硫酸ナトリウムおよび0.5〜1%までのメルカプトエタノールをサンプルに添加し、そし
てそのサンプルをゲルにロードする前に70℃で5分間インキュベーションした。
:5:1の混合物中の0.25%クーマシーCBBC250で20℃で1時間染色し、そして7%酢酸
を数回交換して洗浄した。生成物の活性を造血幹細胞(CFU-S)増殖の阻害方法により評
価した。この方法を以下に詳細に述べる。
活性を、表5の結果に基づいて選択された飽和度40〜80%で25%の硫安を用いて沈澱させることにより精製した。
変化%=Sa%−Sb%
ここで、Sa%は、コントロールのS%であり、
Sb%は、試験画分とのインキュベーション後のS%である。
び280nmで行った。最も高い活性を示した画分5を単離した。
トニトリル勾配を用いて溶出した。
最初の単離
新鮮なブタの胴体から採取した肋骨から筋繊維および脂肪を除き、次いでこれを刻んで細かくし、リン酸緩化衝生理食塩水に1:1(重量/容量)の比率で浸漬する。得られた混
合物を水圧プレスで粉砕し、固体骨物質から骨髄を分離する。
ペレットを、5%アセトニトリル(MeCN)および0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含むHPLC溶出緩衝液Aに溶かし、最終タンパク質濃度を8〜10mg/mlとする。この溶液(0.5〜0.6ml)を、PolisilODS-300(10mcm)が充填され、そして同じ緩衝液Aにより平衡化された250×4.6mmのHPLCカラムにロードする。
以下のプログラムに従って行う。
0 0
4 0
5 25
25 90
。
。次いで、カラムを開始時の状態に戻すため再び平衡化し、そして次の部分のタンパク質溶液をカラムにロードし得る。代表的なクロマトグラムを表5に示す。
パク質物質を含む画分を回収し、分離したピークをプールして、30℃でロータリーエバポレーターにかけて乾燥させる。得られた残渣を蒸留水に溶解し、生物活性試験およびSDS-PAGE(14%ゲル、還元条件)によりアッセイする。活性物質を含むピークは、緩衝液Bが70%と80%との間に溶出され、SDS-PAGEによってアッセイされたように、16kDの主要なタンパク質バンドおよび速く移動するタンパク質の痕跡を含む。
pINPROLを、図5に示すように調製した(すなわち、pINPROL調製物1(実施例12Bを参照のこと))。物質をSDS-PAGEにかけ、そして標準的な技法を用いてニトロセルロースに移した。物質を、標準的な技術を用いて120AオンラインPTH-AA分析器を有するABI 477Aタンパク質シーケンサーを使用して、N末端配列分析に供した。以下のN末端配列が得られた:
VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....
タンパク質データベースのコンピューターサーチは、この配列がブタヘモグロビンのβ鎖のN末端配列と同一性を有することを明らかにする(図16Cを参照のこと)。
図15Cにおいて示されるように、図5に示される第2の主要なピークを回収することにより精製したタンパク質(すなわち、pINPROL調製物2)は、分子量約15Kおよび30Kに対応する2つの主要なバンド、ならびに幾つかのマイナーバンドを生じた。SDS-PAGEゲルを、標準的な技術を用いてニトロセルロースに移し、そして個々のバンドを切り出して、実施例13Aに記載のように、N末端配列決定分析に供した。15kDのバンドについては以下のN末端配列が得られた:
VLSAADKANVKAAWGKVGGQ......
30kDのバンドを、制限タンパク質分解消化に供し、そして以下の内部の配列を得た:
**FPHFNLSHGSDQVK....。
pINPROLとブタヘモグロビンとをさらに比較するために、2回結晶化したブタヘモグロ
ビンをSigma Chemical Companyから入手し、そして実施例12Bにおいて図15について記載したように、逆相HPLCに供した。図17において示され得るように、完全なヘモグロビンのHPLCクロマトグラムは、pINPROL調製物1について示されるクロマトグラムに類似する。さらに、直接比較において、図17Aにおいて示されるpINPROL調製物2(すなわち、図5の第2のピークに由来する)は、ブタヘモグロビンの第2の2つのピークの調製物(図17B)に重複することが見られ、主要ピークについての保持時間はそれぞれ52.51分および52.25分であった。ヘムが、この場合、49.153分で、ヘモグロビンにおける第1の主要ピークと共移動(co-migrate)することに注意すべきである;それゆえ、ヘムはpINPROL調製物1の成分であるが、調製物2の成分ではない。このことは、ヘムの存在について診断する波長575nmでのこのpINPROL調製物の吸光の欠失により確認される。
ヘモグロビンβ鎖がINPROL活性を有することを確認するために、実施例1に記載したテストステロン処理したマウス由来の骨髄を用いた自殺アッセイを、実施例12Bにおけるように精製した物質を使用して実施例1に記載の方法論を用いて行った。表8に示すように、正常なマウスの骨髄細胞の15%が、テストステロン処理動物の36%とは対照的に死滅された。予想されたように、このことはテストロン処理が、細胞周期における細胞のパーセントを増加させる(したがって、細胞がより死滅されやすくする、例えば、実施例1)ことを示している。より際だった対照において、40ng/mlでpINPROLまたは精製ヘモグロビンβ鎖のいずれかとともにインキュベーションしたテストステロン処理した動物由来の細胞は、細胞周期における細胞のパーセントが、36%から0%および7%に、それぞれ、劇的に減少することを示した。200ngのより高い用量は、両方のタンパク質についてほとんど効果がなかった。ポジティブコントロールとして、以前に特徴付けられた幹細胞阻害剤MIP-1αは、13%に細胞周期の進行を減少させた。
において、マウス幹細胞FDCP-MIX株の増殖を阻害する。図20は精製ヘモグロビンα鎖およびβ鎖が、2ng/ml未満で示される阻害を伴いつつ、このアッセイにおいて両方とも活性であることを示している。
精製したブタヘモグロビン鎖のインビボでの作用能力を試験するために、BDF1マウスに実施例1に記載のようにテストステロンプロピオネートを用いて注射した。24時間後、マウスに、pINPROL、ブタヘモグロビンα鎖(図21のように末梢血赤血球から精製した)、
ブタヘモグロビンβ鎖(図21のように末梢赤血球から精製した)のいずれか500ng、ある
いは等容量のキャリアを静脈内投与した。48時間後、各マウス由来の骨髄を採取し、そしてCFU-MIXアッセイを実施例14に記載のように行った。表10において示されるように、pINPROL、ブタα鎖およびブタβ鎖は、細胞周期におけるCFU-MIXのパーセントを基底レベルまで減少させ、全てインビボで活性であった。
ヒトヘモグロビンを、Sigma Chemical Corporationから入手するか、あるいは成人ヒト末梢血または臍帯血から標準的な手段により単離した。個々の鎖を、ブタα鎖およびβ鎖について上述したのと同様の様式で逆相HPLCにより単離した(B.MasalaおよびL.Manca
,Methods in Enzymology、第231巻、21〜44頁、1994を参照のこと)。精製α、β、γ、およびδ鎖を得た。ビオチン化したα鎖およびβ鎖について、1mgの成人ヒトヘモグロビンを、37μgのNHS LC ビオチン(Pierce)を用いて処理し、そして上記のように逆相クロマトグラフィーにより鎖を分離した。
ある
精製ヒトα鎖、α-βダイマー、またはヘモグロビンを実施例15に記載のようにインビ
ボアッセイで試験した。表14に示したように、これらのそれぞれは濃度500ng/マウスで活性であった。
ブタ骨髄由来の精製INPROLが、ヒト前駆細胞における細胞周期の進行に影響する能力を調べるために、臍帯血細胞を得た。Ficoll上で分離した後に得られた総単核細胞画分または抗CD34親和性カラム(CellPro Inc.)上での分画後に得られたCD34+画分のいずれかを使用した。初期の幹細胞が細胞周期にあることを確認するために細胞を、インターロイキン3(IL-3)および幹細胞因子(SCF)(各100ng/ml)の存在下でインビトロにおいて48時間インキュベーションした。このプレインキュベーション後、細胞周期の進行アッセイを、CFU-GEMM(CFU-MIXの代わりに)をプレート後18日目に計数した以外は、実施例14に記載のようにマウスについて行った。表15において示すように、ブタINPROLは、大多数の単核細胞またはCD34+画分のいずれかにおいて、CFU-GEMMの細胞周期の進行を阻害した。
ヒト臍帯血単核細胞を得、そしてIL-3およびSCF中でインキュベーションし、そして実
施例18に記載のように細胞周期の進行アッセイに使用した。表16に示すように、骨髄から精製したブタINPROLおよび末梢血から精製したヒトαヘモグロビンは、このアッセイにおいて活性であった。
活性なペプチド配列を同定するために、ミオグロビンの3次元構造(本アッセイにおいて不活性である)を、コンピューターモデリングプログラムを用いて成人ヒトヘモグロビンに存在するα鎖のネイティブな3次元構造に重ね合わせた。2つのペプチド(アミノ酸43〜55および64〜82で表される、これらは3次元空間においてミオグロビンと構造的に異なる領域である)を、CFU-MIX細胞周期の進行アッセイにおいて活性を有するとして同定した。ネイティブなα鎖において見出されるループをより近接に近づけるために、ペプチド43〜55の環状誘導体(c43〜55)(ジスルフィド結合を利用)をまた合成し、そして活性であることが見出された。
記載のように行った。表17〜19に示すように、これらのペプチドは全てこのアッセイにおいて活性である。
ヒトαヘモグロビン鎖は、アミノ酸94位と95位(Asp-Pro)との間に蟻酸切断部位を有する。切断を、精製ヒトα鎖(実施例16と同様)を70%蟻酸中1mg/mlの濃度で37℃で72時間インキュベートすることにより得た。1-94フラグメントを未切断α鎖から精製し、そして95-141フラグメントを実施例16のような逆相HPLCにより精製した;その後、分画をSDS-PAGEを用いて行った(実施例22と同様)。精製1-94タンパク質フラグメントの同一性を、エレクトロスプレーイオン化質量分析により確認した。
を実施例14と同様に使用する:
ペプチド43-55(「p13」)およびc43-55(「p15」)(実施例20と同様)の遺伝子を、
最適E.coliコドン使用頻度(AnderssenおよびKurland,Micro.Reviews 54:198-210,1990)に従って対応するオリゴヌクレオチドをアニールすることにより合成した。インタクトなヒトαヘモグロビン鎖(「p141」)の遺伝子を、1セットのオリゴを設計して、ヒト骨髄cDNAプール(Clontech,Palo Alto,CA)からPCR増幅することにより得た。1-97フラグメント(「p1-97」)の遺伝子を、適切なサブクローニング後のp141遺伝子を含むプラスミドのPCR増幅により得た。
号;同第5,196,321号;および同第5,391,490号、ならびにPCT WO 91/17245を参照のこと)。宿主株E.coli DH5αFIQ(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)を、適切に合成した遺伝子(上記)を含むユビキチン発現ベクターpDSUbで形質転換した。pDSUbは、ヒトユビキチンを発現するpDS78/RBSIIの誘導体である(図22A)(Hochuliら、Biotechnology 6:1321-5,1988)。Loetscherら(JBC 266:11213-11220,1991)は、ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)配列をHochuliプラスミドから切り出し、そしてプラスミドを再連結することによりpDS78/RBSIIを改変した(図22B)。合成ユビキチン遺伝子を、細菌発現に最適なコドン使用頻度を有するヒトユビキチンをコードするリン酸化合成オリゴヌクレオチドの対様アニーリングにより構築した。次いで、pDSUbを、組み立てたオリゴヌクレオチドからなる合成ユビキチン遺伝子を、誘導体化pDS78/RBSII のKlenow平滑化BamHI-BglI消化物に挿入することにより構築した。得られたプラスミドpDSUb(図22C)は、E.coliにおいて高レベルでユビキチンを発現することが示された。
は30℃で2日後に現れる。形質転換体を、挿入部位を横切るPCRによりスクリーニングし
た。次いで、正確なサイズの挿入物を含むコロニーを、SDS-PAGEにより適切なサイズの融合タンパク質の発現についてスクリーニングした(以下を参照のこと)。ユビキチン融合体を、lacリプレッサーを滴定し(titrate)、それをpDSUbのプロモーターから除去するIPTGの添加により過剰発現させた(DH5αF’IQは、10μg/mlネオマイシンで選択されるF’因子上にアップレギュレートされたlaqIq遺伝子を含む)。
を調製し、そしてジデオキシ法によりSequenase Version 2.0キット(United States
Biochemical.)を用いて配列決定した。次いで、ポジティブクローンを凍結し、そして-80℃でグリセロール中に保存した。ポジティブクローンを、アンピシリン(100μg/ml)、ネオマイシン(10μg/ml)、および1%グルコースを含むLBプレート上で30℃で維持した。それらを10継代まで一週間毎に画線培養し(streak)、その後、新たな画線培養物を、連続培養のために凍結した種バイアルから採取して、株が本物であることを保証した。
衝液トリシン系を用いて泳動させた。陽極(下部)緩衝液は0.2M Tris(pH9.0)であっ
た。陰極(上部)緩衝液は、0.1M Tris、0.1Mトリシン、0.1%SDS(pH8.25)であった。市販の分子量マーカー「Multi-Mark」(Novex)を使用した。標準として使用したウシユ
ビキチンをSigmaから購入した。ゲルを、色素マーカーがゲルの下部に達するまで4mAの
定電流で泳動させた。ゲルを、酢酸:メタノール(10%:40%)中の0.25%のCoomassie
Blue R250(Sigma)で染色し、そして色素のない同じ溶液で脱染した。
質転換するために使用されたpRSET(Invitrogen,San Diego,CA)において発現させた
。UCH-L3は、ユビキチンC末端伸長を切断するユビキチン特異的プロテアーゼである。これを、35%(w/v)硫酸アンモニウム沈殿により細菌溶解物から部分的に精製した。使用
した硫酸アンモニウムの正確な割合を、25.5kDバンドの存在についてSDS-PAGEによりモニターした。上清を50mM Tris(pH7.4)に対して透析し、そしてユビキチンペプチド融合基質に対してアッセイした。活性な上清を等分し、そして-20℃で凍結した。代表的な反応混合物は、3μlの溶解物、1μlの1M DTT、1μlのUCH-L3(上記)、および5μlの反応緩衝液(50mM Tris(pH7.4))を含む。反応を室温で20分間行った。大規模な化については、300μlの溶解物を、100μlの1M DTT、20μl UCH-L3、および580μl反応緩衝液と混合した。
組換えp1-97の生物活性を評価するために、GFU-GEMM細胞周期進行アッセイを実施例18と同様に使用した:
ペプチド43-55のインビボでの幹細胞阻害活性を評価するために、B6D2 F1マウスを、
実施例1に記載のテストステロンプロピオネートまたは5FUで前処理した。詳細には、テ
ストステロンプロピオネート(100mg/kg体重)を、マウスに0日目にi.p.注射した。あるいは、5FU(200μg/kg体重)を、マウスに0日目に注射した。
骨髄を2日目に採集し、そしてCFU-MIX細胞周期進行アッセイを、実施例14と同様に行った。詳細には、マウスを屠殺し、そして単一細胞骨髄懸濁物を大腿骨から調製した。細胞を1回洗浄し、そして濃度をFischer培地で5×106細胞/mlに調節した。各試験条件のために、1ミリリットルの細胞を、2つのポリプロピレンチューブのそれぞれに添加した。チューブを、適切な濃度の試験基質を共なわずに(「コントロール」)または共に(「実験」)で37℃で3時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、30μg/mlのシトシンアラビノシド(「Ara C」(Sigma))を、チューブの半分まで添加し、そして同じ容量のFischer培地をもう1つのチューブに添加した。チューブをさらに1時間37℃でインキュベートし、その後それらを氷上に置き、そして冷Fischer培地で2回洗浄した。
のMethocult M3430メチルセルロース培地(Stem Cell Technologies,Vancouver,British Columbia)に添加した。混合物を、ボルテックスしながら力強く混合し、そして1mlを5つの35mmディッシュのそれぞれに分配した。35mmディッシュを、順に、滅菌水を含むふたのない35mmディッシュと共に、ふた付きの150mmディッシュに入れた。CFU-MIXコロニーを、37℃でのインキュベーションの7日後に倒立顕微鏡を用いて数えた。
ペプチド43-55を、固相ペプチド合成技術(American Peptide Co.,Sunnyvale,CA)により合成した。ペプチドアナログを、Phe43またはPhe46のパラ位でヨウ素を用いて合成した。ビオチン化ペプチド43-55を、C4炭素リンカーを有するビオチンのCOOHを、Phe43のN末端NH2に連結することにより合成した。
モルヒネを、実施例24と同様にBalb/cマウス由来の骨髄を用いてCFU-MIX細胞周期進行
アッセイにおいて試験した。
インビトロで阻害する
DAMGOおよびDALDAを、実施例24と同様にBalb/cマウス由来の骨髄を用いてCFU-MIX細胞
周期進行アッセイにおいて試験した。
ノシセプチンを、実施例24と同様にBalb/cマウス由来の骨髄を用いてCFU-MIX細胞周期進行アッセイにおいて試験した。
CFU-MIX細胞周期進行アッセイを実施例24と同様に行う。試験基質を、それ自身でまた
はナロキソン(10-5、10-7M)の存在下でアッセイした。ナロキソン自身は、これらの濃
度でアッセイに効果を生じなかった。
CFU-MIXアッセイを実施例24と同様に行った。
CTOP(H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2、Cys2とPen7との間にジスルフィ
ドを有する)は、μオピエートレセプター特異的アンタゴニストであるソマトスタチンのアナログである。試験基質を、それ自身またはCTOP(10-7M)の存在下でアッセイした。CTOP自身は、この濃度でアッセイでの影響を有さないが、αヘモグロビンまたはペプチド43-55により引き起こされる細胞周期阻害と拮抗する。
の数を増加させる
コブルストーンアッセイを、Ploemacherおよびその同僚(Ploemacherら、Blood 74:2755-63,1989;van der Sluijsら、Exp.Hematol.18:893-6,1990;Ploemacherら、Blood 78:2527-33,1991;Ploemacherら、J.Tiss.Cult.Meth.13:63-68,1991;DownおよびPloemacher,Exp.Hematol.21:213-21,1993)により記載されたように行った。コブルストーンアッセイは、ストロマ細胞の単層内に細胞群(または「コブルストーン」)の出現を測定する。非常に初期の幹細胞は、軟寒天においてコロニーを形成しないが、ストロマ単層の存在下でコブルストーンを形成する。コブルストーンを形成する細胞は、「コブルストーン領域形成細胞」(CAFC)と呼ばれる。より分化した(例えば、GM-CFC)前駆体は、培養の最初の数週間以内に出現し、そして消滅する一過的なコブルストーンを形成するが、より初期の幹細胞(例えば、長期再増殖細胞)は、4〜5週間の培養後のみに出現するコブルストーンを形成する。従って、培養の7〜14日目に形成するCAFCはCFU-GMに富み、28〜35日目に形成するCAFCはCFU-MIXに富み、そして28〜35日目に形成するCAFCは長期再増殖細胞に富む。
した。使用したアッセイは、96ウェルプレートにおける限界希釈長期骨髄培養(LTBMC)
からなる。培養物を、FBMD-1マウスストロマ細胞株(Breemsら、Leukemia 11:142-50,1997)をコンフルエントになるまで増殖させることにより調製した;コンフルエントな単
層を有する96ウェルプレートを、アッセイまで33℃で保存した。マウス骨髄細胞を単細胞懸濁物として調製し、そして以下の細胞希釈物:27,000;9000;3000;1000;333を、0.2mlのLTBMC培地(Stem Cell Technologies,Vancouver)にウェルあたりプレーティングした。20ウェルを、条件あたり各希釈についてプレーティングし、そして2プレート以上に分配した。
;Breemsら、Leukemia 8:1095-104,1994)計算した。結果を実施例23に示す。細胞周期進行幹細胞のヒトαヘモグロビン鎖とのプレインキュベーションは、約5倍まで後期形成CAFCの比を増大させた。非細胞周期進行細胞のα鎖での処理は効果がなかった。
ヒト臍帯血CFU-GEMMの細胞周期進行を阻害する
ヒト臍帯血CFU-GEMM細胞周期進行アッセイを、実施例19と同様に行った。詳細には、単核細胞を、ヒト臍帯血細胞から単離し、そして10%FBS、100ng/mlキットリガンド、およ
び100ng/mlヒトIL-3を補充したIMDM組織培養培地で2〜4×104細胞/mlに調節した。細胞を37℃で48時間インキュベートした。
CD34+幹細胞を、CellProカラムの手段によるヒト骨髄からの精製の後、Poietic Technologies(Gaithersburg,MD)から得た。細胞を、キットリガンドおよびIL-3と48時間インキュベートし、そして実施例26におけるCFU-GEMM細胞周期進行アッセイにおいて使用した。
モグロビン、ペプチド43-55、DAMGO、またはモルヒネにより阻害可能である
末梢血を、標準的プロトコルに従ったシクロフォスファミドおよびG-CSFでの末梢幹細
胞移動を受けている乳ガン患者から得た。赤血球をFicoll Hypaqueで除去した(細胞をIMDMで1:1に希釈し、そして20mlを16mlのFicollの上部に重層し、そして800gで30分間遠心分離した;単核細胞を中間層(interphase)から取り出し、そしてIMDM中で2回洗浄した)。1つの場合、単核細胞を、アッセイ前に液体窒素中で凍結保存した。単核細胞を、2.5〜5×105細胞をディッシュあたりにプレーティングした以外は、実施例26と同様にCFU-GEMM細胞周期進行アッセイのためにプレーティングした。
1μg/ml用量のヘモグロビン鎖、ミオグロビン、およびペプチドを、静止幹細胞の刺激についてアッセイした。骨髄を、実施例24と同様のCFU-MIX細胞周期進行アッセイにおいて試験した未処理B6D2F1から得た。未処理B6D2F1マウスから単離した幹細胞は、(例えば、テストステロンプロピオネート(実施例1を参照のこと)または5FUのような化学療法(実施例4を参照のこと)により)刺激されるまで、通常ゆっくりと細胞周期進行して、周期に入る。
ヒトαヘモグロビンを、未処理B6D2F1マウスにi.v.注射した。24時間後、マウスを屠殺し、骨髄を大腿骨から回収し、そしてCFU-MIXアッセイを実施例24と同様に行った。
性と拮抗する
本発明は好ましい実施態様によって記載されたが、変化および改変は当業者に考えられることが理解される。従って、添付の請求の範囲は、請求される本発明の範囲内にある全てのこのような等価な変化を含むことが意図される。
Claims (5)
- 幹細胞増殖を刺激するための組成物であって、以下の配列:
Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val(配列番号1)、および
Cys−Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val−Cys(配列番号2)(ここで、2つのCys残基はジスルフィド結合を形成する)、
を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドの幹細胞刺激量を含む、組成物。 - 前記ペプチドは、Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val(配列番号1)である、請求項1に記載の組成物。
- 幹細胞に損傷を与えるかまたは破壊する薬剤に暴露された哺乳動物において幹細胞分裂を刺激するための組成物であって、以下の配列:
Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val(配列番号1)、および
Cys−Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val−Cys(配列番号2)(ここで、2つのCys残基はジスルフィド結合を形成する)、
を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドの幹細胞増殖刺激量を含む、組成物。 - 前記ペプチドは、Phe−Pro−His−Phe−Asp−Leu−Ser−His−Gly−Ser−Ala−Gln−Val(配列番号1)である、請求項3に記載の組成物。
- 前記薬剤が抗ウイルス剤または抗腫瘍剤である、請求項3または4に記載の組成物。
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