JPS63188697A - 牛脾臓由来の細胞増殖促進物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔イ〕　発明の目的 本発明は、牛の脾臓から抽出きれた、新規な水溶性蛋白
質、及びその抽出法、並びにウィルス不活化処理法に関
する。

（産業上の利用分野） 本発明による新規な水溶性蛋白質は、分子量が４１．０
００で、細胞代謝活性化作用が顕著である。すなわち、
本発明による水溶性蛋白質は、繊維芽細胞の増殖と伸展
を促進する。よって、本発明による新規な水溶性蛋白質
は、例えば、動物用又は人体用医薬品として、強肝剤、
胃、十二指腸潰瘍剤、損傷修復剤等に、直接又は配合剤
として利用できる。又、外用剤として、あるいは、化粧
品などに直接、又は配合して用いることが出来る。又、
組織培養に於ける培地添加剤としても有用である。

（従来の技術） 各種基ｗ、（動物種属）の脾臓を出発原料となし、これ
により各種の抽出法を採用して得られるそのエキス、又
はその有効成分を分離して、人又はその他の動物の医薬
品や、化粧品に用いることは古くから知られている。

脾臓からの細胞増殖促進作用物質について、その応用や
、抽出法について調査すれば、例えば、次に示す公知刊
行物が公開されている。

公知刊行物二日本国特許庁発行 特開昭６０−２３１６１２：ウシ脾臓中に含まれる成長
因子及びその単離方法 上記の刊行物中には、牛の脾臓中に含まれる分子量約１
６，０００〜１８，０００、等電点９．５〜１０．５の
性質を有する蛋白質が開示されている。又、近年ウシ脳
やウシ脳下垂体より線維芽細胞成長因子（分子量１３．
３００±１．２００、等電点９．６）がＧｏｓｐｄａｒ
ｏｗｉｃｚ　（Ｎａｔｕｒｅ、　２４９．１２３−１２
７、１９７４　）によって分離されている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、膵臓抽出物に関する前記の組織代用賦活
作用、又は組織再生修復能に注目すると共に、それらが
動物の医１薬品又は化粧品に用いられることを考慮し、
株化きれた細胞でない、初代培養細胞に対する作用を指
標として、推定分子量４１．０．００で、等電点６．０
〜６．５付近である蛋白の分離に成功した。

（細胞増殖促進作用の測定等に関する注解）細胞増殖促
進作用を表現する方法は、今日一般に知られている成長
因子でも、的確に効力を表現する方法はなかった。

本発明者らは、対照の細胞増殖率をゼロに制御すること
により、目的物質の細胞増殖促進作用を定量的に表現す
る方法を開発した。これは、添加する牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）の量を調節することにより達成した。

一方、本発明者らは、作用物質の細胞増殖促進作用を、
諮まざまの株細胞で検討してきたが、それらは、形態、
機能、及び遺伝子的にも正常細胞とは異なるとされてい
る。

そこで、ここでは、正常皮膚から分離した初代細胞で検
討することとした。以下にその方法を述べる。

皮膚の主な細胞には、表皮細胞（ケラチノサイト）、繊
維芽細胞があるが、例えば、モルモット（ハートレー系
）から採取した腺維芽細胞は、５％ＦＢＳを添加したイ
ーグルのＭＥＭ培地中で、盛んに分裂増殖し、その倍数
増殖時間は第１図に示すごとく、約４８時間である。

細胞増殖率の測定法は、まず、直径３．５ｃｍのベトリ
ディッシュ（フーニング社製）に、ｌｌｌ１１当り４〜
５　Ｘ　１０＋個の細胞を植え、低濃度のＦＢＳを添加
した、イーグルのＭＥＭ培地を２〜３日目ごとに交換す
る。細胞数は、２〜３日目ごとにビュルケルチュルクの
血球計算盤を用いて測定する。

目的物質は蛋白量にて調整し、培地当り１０分の１の量
を、培地交換のつど添加し、対照（コントロール）には
、同量の生理食塩水のみを添加する。

〔口〕　発明の構成 本発明は、牛のＮＨｌから抽出した水溶性蛋白質の分子
量が、４１．０００である細胞増殖促進物質と、その抽
出法、さらにその抽出操作の過程で、硫酸アンモニウム
の６０％飽和濃度で沈殿する沈殿物を６０℃、１０時間
加熱処理することを特徴とする、水溶性蒼白質のウィル
ス不活化処理法にある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の要旨は、前記したごとくであるが、より具体的
に示すために、以下に実施例及び作用について述べる。

尚、実施例を示すに当り、本発明による基本的な要点を
示すと、次のごとくである。

（イ　　） 抽出法における出発原料は、牛の脾臓を用いる。又、必
要によっては、豚などの畜産動物類の脾臓を用いること
も出来るが、それは、用いる対象となる動物種の、治療
又は医薬的な用途、化粧料等々の用途に応じて選択すれ
ば良い。

（ロ） 実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易な方法を
示すも、その抽出工程における操作のポイントは、熱を
加えないこと、有機溶媒による抽出操作は避けること０
強酸、強アルカリ分解、各種の蛋白分解酵素を用いない
ことが必要である。

すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活性を失活
きせるからである。これにしたがえば、遠心分離法、塩
析分画法、ゲル濾過法、凍結乾燥法などの、従来の生体
成分を抽出する、さま？まの組み合わせの方法によって
得ることが出来る。

［実施例−１］ 牛の脾臓を洗浄の前処理なしに細切し、低温下にてホモ
ジナイザー等でホモジナイズする。これに対して、水又
は塩化ナトリウム溶液、又は、第１表に示すごとくの公
知な緩衝液を添加して攪拌し、６時間〜一昼夜放置した
後、遠心分離して上清液を得る０次に、この上清液に対
して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウム
を添加後、遠心分離して、その上清液を採取し、次に、
この上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
再び硫酸アンモニウムｉ添力ｒＪｊ、遠心分離して沈殿
物を回収する。

沈殿物は、少量の水又は生理食塩水等に溶解した後、脱
塩操作を行う。

脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法が
あるが、そのいづれの方法を採用しても良い、ここでは
、例えば透析チューブに入れて、充分量の生理食塩水等
に、一昼夜以上透析する方法により、牛の膵臓を出発原
料とする、４１．０００の分子量を有する、水溶性蛋白
質を含む液体を得た。

［実施例−２］ 実施例−１で得られた上述の抽出物は、その用途を考慮
するとき、ウィルスの不活化について、充分な配慮が必
要である０例えば、肝炎ウィルスを不活化するには、６
０℃、１０時間の加熱処理が有効とされている。しかし
、実施例−１で得られた液体を、６０°Ｃ１１０時間の
加熱処理を行うたところ、細胞増殖促進作用が、１００
％失活することがわかった。

そこで本発明者らは、本物質の有するｍ胞増殖促進作用
が持続し、ウィルスのみ不活化するための手段として、
長時間の高熱処理に対する安定化法について検討した。

その手段として、例えばグルコース、マンノース’Ｉｆ
　（７）　ＩＩｌ、１ｌｌｉ　Ｍ、シＢｖ１、？　ル）
　−７，等１７）２１℃Ｍｔｔどを添加して加熱処理を
行い、検討を加えたが、同様に失活することがわかった
６本発明者らは、溶解した状態では、目的物質の有する
、蛋白の高次構造に不可逆的な変性をき起し、これによ
って失活したと誓えると共に、これに対する手段として
、次に高濃度塩類溶液中等士、沈殿させた状態で加熱す
ることによって、変性を抑制することが可能ではないか
との発想のもとに、実施例−３で示すごとくの新規な加
熱処理方法を完成した。

［実施例−３］ 実施例−１の工程中で、６０％飽和の濃度になるように
、再び硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して回収し
たところの沈殿物か、実施例−１で得られた液体を凍結
乾燥し、これを６０％硫酸アンモニウム飽和溶液に懸濁
したもの、又はその沈殿物を分取し、６０℃、１０時間
の加熱処理を施した。

この方法によれば、ウィルスの不活化がなると共に、細
胞に対する増殖促進作用が、８０〜９０％残存すること
がわかった。

尚、実施例−３によれば、６０℃、１０時間を前提に行
ったときのものであるが、この温度と時間の関係につい
ては、特にこだわることはなく、例えば、目的とするウ
ィルスにより、処理時間を変えたり、温度は、さらに高
くすることにより、処理時間を短縮することも出来る。

［実施例−４コ ここでは、前記実施例−１又は３で得られた蛋白質は、
本発明が目的とする、細胞に対して直接代謝活性化作用
を有する抽出物であり、そのまま、従来の抽出法による
脾臓エキスと、同様な利用が出来るが、さらに必要によ
っては、ゲル濾過、イオンクロマト等を組み合わせ、分
画することによって精製する。

ゲル濾過に用いられる担体としては、セファデックス、
アガロース、セファクリル等があげられるが、例えばセ
ファクリルを例にして示せば、次のごとくの処理操作に
よって、牛の脾臓かも得られた、水溶性蛋白質について
分画することが出来る。

〔１〕樹脂：セファクリル　Ｓ−２００スーパーフアイ
ン カラムサイズ：２６Ｘ９５６＋ｍ＋ 溶媒：　０．ＩＭ−０，０５Ｎ　）リス塩酸バッファー
ｐＨ８，０ 流速：　３　、３　ｍｌｌ　／　ｃｌｌｌ　”／　ｈ上
記〔１〕によって得られた活性フラクシヨンを、さらに
イオン交換樹脂によって分画する。イオン交−に用いら
れる担体としては、セファデックス、セファロース、セ
ファクリル等の陽、陰イ丈ン交換体等があげられるが、
例えばＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを例にして分
画する。

〔２〕樹脂：ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ溶媒：
　０．１Ｍ−０，０５Ｎ　）リス塩酸バッファーｐＨ８
，０ 溶出条件：　ＮａＣ１濃度　０−０．３Ｍ活性フラクシ
ョンを、さらにセファクリルＳ−２００でゲル濾過し、
これによって得られる活性フラクションを分取して、分
子量４１．０００の水溶性蛋白質を得る。又、きらにこ
の精製化法においては、実施例１によって得られるもの
では、肝炎ウィルスは不活化されていないので、ここで
得られた分子量４１．０００の水溶性蛋白質に対しては
、６０％硫酸アンモニウム飽和溶液中に入れて沈殿きせ
、この沈殿物喰加熱処理することによって、ウィルスは
不活化が出来ると共に、目的となす、細胞代謝活性化作
用は、安定に保持される。

「第１表」　実施例１で用いることの出来る主な緩衝液
と、精製化（実施例４）で用いるイオン交換体の使用関
係（ハ〕　発明の効果 本発明は、牛の脾臓から得られた新規な水溶性の蛋白質
にある。そして、この蛋白質は、直接に細胞の代謝活性
化作用が高いことにある。

従来の公知な抽出エキス、又は抽出物質は、その工程中
で、有機溶媒、強酸、強アルカリ、蛋白分解酵素が用い
られてきたが、その結果は、これらの薬剤によって、従
来のエキス中には、牌臓中に含まれていた、細胞増殖作
用物質が失活されていたことである。もちろん、加熱処
理によっても、失活されてしまっていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において用いた細胞の５％ＦＢＳ濃度
における増殖曲線を示したものである。 第２図は、牛の脾臓から抽出された水溶性蛋白質の本発
明において用いた細胞への増殖促進作用を示したもので
ある１図中イは添加量１７１　ｇ　／　ｒｄｌにおける
増殖曲線、口は添加量０．１μｇ／−における増殖曲線
、ハは対照群の増殖曲線である。 第３図は、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂによる溶
出曲線である。 第４図は、ブルーデキストラン二図中Ａ１及び牛血清ア
ルブミン（分子量６７．０００）：図中Ｂ１α−キモト
リプシノーゲンＡ（分子量２５゜０００）：図中Ｃをマ
ーカー蛋白質として、セファクリルＳ−２００スーパー
フアインヲ用いて、ゲル濾過した溶出曲線。 第５図は、第４図に示した溶出曲線に対応する蛋白の、
分子量とＫａＶ値による標準曲線を示したものである。 第６図は、牛の脾臓から抽出された、水溶性蛋白質の、
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−ＢＢで分画きれた活性フ
ラクションの、セファクリルＳ−２００スーパーフアイ
ンを用いた、ゲル濾過による、溶出曲線である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１） 牛の脾臓から抽出された水溶性蛋白質の、推定分子量が
   ４１，０００、等電点が６．０〜６．５付近にあること
   を特徴とする、細胞増殖促進物質。
2. （２） 出発原料は牛の脾臓を用い、これを細切し、低温下でホ
   モジネートした後、水又は塩化ナトリウム溶液又は、各
   種公知な緩衝液を添加して、６時間〜一昼夜放置した後
   、遠心分離して得られる上清液を分取し、次に上清液に
   対して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウ
   ムを添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し、さ
   らに上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
   硫酸アンモニウムを添加し、これによって沈殿する沈殿
   物を、ゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせるこ
   とによって精製された水溶性蛋白質の推定分子量が、４
   １，０００であり、等電点が６．０〜６．５付近にある
   ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の、細
   胞増殖促進物質の製造法。
3. （３） 出発原料は牛の脾臓を用い、これを細切し、低温下でホ
   モジネートした後、水又は塩化ナトリウム溶液又は、各
   種公知な緩衝液を添加して、６時間〜一昼夜放置した後
   、遠心分離して得られる上清液を分取し、次に上清液に
   対して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウ
   ムを添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し、さ
   らに上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
   硫酸アンモニウムを添加し、これによって沈殿する沈殿
   物を、６０℃、１０時間加熱処理するか、又は沈殿物を
   さらにゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせるこ
   とによって精製されたところの水溶性蛋白質を、硫酸ア
   ンモニウムの６０％飽和の濃度にした溶液中に加えて沈
   殿させ、この沈殿物を６０℃、１０時間加熱処理するこ
   とにを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の、細胞
   増殖促進物質の活性が安定な、ウィルス不活化処理法。