JPS63188698A

JPS63188698A - 牛胸腺由来の細胞増殖促進物質

Info

Publication number: JPS63188698A
Application number: JP62019084A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Ando; 安藤　義隆; Yutaka Ando; 裕安藤
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1988-08-04
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: JPH0720996B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔イ〕　発明の目的本発明は、牛の胸腺から抽出された、新規な水溶性蛋白
質、及びその抽出法、並びにウィルス不活化処理法に関
する。

（産業上の利用分野）本発明による新規な水溶性蛋白質は、分子量が４６．０
００で、細胞代謝活性化作用が顕著である。すなわち、
本発明による水溶性蛋白質は、線維芽細砲の増殖と伸展
を促進する。よって、本発明による新規な水溶性蛋白質
は、例えば、動物用又は、人体用の医薬品として、強肝
剤、胃、十二指腸潰瘍剤、増傷修復剤等に直接又は配合
剤として利用できる。又、外用剤として、あるいは化粧
品などにも、直接、又は配合して用いることが出来る。

又、組織培養に於ける培地添加剤としても有用である。

（従来の技術）各種基原（動物種属）の臓器を出発原料となし、これに
より各種の抽出法を採用して得られる、そのエキス、又
はその有効成分を分離して、人又は、その他の動物の医
薬品や、化粧品に用いることは古くから知られている。

又、近年ウシ脳や、ウシ脳下垂体より、繊維芽細胞成長
因子（分子量１３．３００±１．２００、等電点９．６
）がＧｏｓｐｄａｒｏｗｉｃｚ　（Ｎａｔｕｒｅ、２４
９．１２３−１２７．１９７４　）によって分離されて
いる。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは、各種臓器由来の抽出物に関する前記の組
織代謝賦活作用、又は組織再生修復能に注目すると共に
、それらが医薬品、又は化粧品に用いられることを考慮
し、株化された細胞でない、初代培養細胞に対する作用
を指標として、推定分子量４６．０００で、等電点６．
０〜６．５付近である、蛋白の分離することに成功した
。

（細胞増殖促進作用の測定等に関する注解）細胞増殖促
進作用を表現する方法は、今日一般に知られている成長
因子でも、的確に効力を表現する方法はなかった。

本発明者らは、対照の細胞増殖率をゼロに制御すること
により、目的物質の細胞増殖促進作用を定量的に表現す
る方法を開発した。これは、添加する牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）の量を調節することにより達成した。

一方、本発明者らは、作用物質の細胞増殖促進作用を、
さまざまの株細胞で検討してきたが、それらは、・形態
、機能、及び遺伝子的にも正常細胞とは異なるとされて
いる。

そこで、ここでは、正常皮膚から分離した初代細胞で検
討することとした。以下にその方法を述べる。

皮膚の主な細胞には、表皮細胞（ケラチノサイト）、繊
維芽細胞があるが、例えば、モルモット（ハートレー系
）から採取した繊維芽細胞は、５％ＦＢＳを添加したイ
ーグルのＭＥＭ培地中で、盛んに分裂増殖し、その倍数
増殖時間は第１図に示すごとく、約４８時間である。

細胞増殖率の測定法は、まず、直径３．５０のペトリデ
ィッシュ（フーニング社製）に、１誠当り４〜５　Ｘ　
１０′ｆ個の細胞を植え、低濃度のＦＢＳを添加した、
イーグルのＭＥＭ培地を２〜３日目ごとに交換する。細
胞数は、２〜３日目ごとにピュルケルチュルクの血球計
算盤を用いて測定する。

目的物質は蛋白量にて調整し、培地当り１０分の１の量
を、培地交換のつど添加し、対照（：Ｉントロール）に
は、同量の生理食塩水のみを添加する。

〔口〕　発明の構成本発明は、牛の胸腺から抽出した水溶性蛋白質の分子量
が、４６．０００である細胞増殖促進物質と、その抽出
法、さらにその抽出操作の過程で、硫酸アンモニウムの
６０％飽和濃度で沈殿する沈殿物を６０℃、１０時間加
熱処理することを特徴とする、水溶性蛋白質のウイルス
不活化処理法にある。

（問題点を解決するための手段）本発明の要旨は、前記したごとくであるが、より具体的
に示すために、以下に実施例及び作用について述べる。

尚、実施例を示すに当り、本発明による基本的な要点を
示すと、次のごとくである。

（イ　　）抽出法における出発原料は、牛の胸腺を用いる。又、必
要によっては、豚などの畜産動物類の胸腺を用いること
も出来るが、それは、用いる対象となる動物種の、治療
又は医薬的な用途、化粧料等々の用途に応じて、任意に
選択すれば良い。

（ロ）実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易な方法を
示すも、その抽出工程における操作のポイントは、熱を
加えないこと、有機溶媒による抽出操作は避けること０
強酸、強アルカリ分解、各種の蛋白分解酵素を用いない
ことが必要である。

すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活性を失活
させるからである。これにしたがえば、遠心分離法、塩
析分画法、ゲル濾過法、凍結乾燥法などの、従来の生体
成分を抽出する、さまざまの組み合わせの方法によって
得ることが出来る。

［実施例−１］牛の胸腺を洗浄の前処理なしに細切し、低温下にてホモ
ジナイザー等でホモジナイズする。これに対して、水又
は塩化ナトリウム溶液、又は、第１表に示すごとくの公
知な緩衝液を添加して攪拌し、６時間〜一昼夜放置した
後、遠心分離して上清液を得る０次に、この上清液に対
して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウム
を添加後、遠心分離して、その上清液を採取し、次に、
この上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
再び硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して沈殿物を
回収する。

沈殿物は、少量の水又は生理食塩水等に溶解した後、脱
塩操作を行う。

脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法が
あるが、そのいづれの方法を採用しても良い、ここでは
、例えば透析チューブに入れて、充分量の生理食塩水等
に、一昼夜以上透析する方法により、牛の胸腺を出発原
料とする、４６．０００の分子量を有する、水溶性蛋白
質を含む液体を得た。

［実施例−２］実施例−１で得られた上述の抽出物は、その用途を考慮
するとき、ウィルスの不活化について、充分な配慮が必
要である０例えば、肝炎ウィルスを不活化するには、６
０℃、１０時間の加熱市寄りが有効ときれている。実施
例−１で得られた液体を、６０℃、１０時間の加熱処理
を行ったところ、細胞増殖促進作用が、１００％失活す
ることがわかった。

そこで本発明者らは、本物質の有する細胞増殖促進作用
が持続し、ウィルスのみ不活化するための手段として、
長時間の高熱処理に対する安定化法について検討した。

その手段として、例えばグルツース、マンノース等の単
糖類、ショ糖、マルトース等の２糖類などを添加して加
熱処理を行い、検討を加えたが、同様に失活することが
わかった０本発明者らは、溶解した状態では、目的物質
の有する、蛋白の高次構造に不可逆的な変性をきたし、
これによって失活したと考えると共に、これに対する手
段として、次に高濃度塩類溶液中等で、沈殿させた状態
で加熱することによって、変性を抑制することが可能で
はないかとの発想のもとに、実施例−３で示すごとくの
新規な加熱処理方法を完成した。

［実施例−３コ実施例−１の工程中で、６０％飽和の濃度になるように
、再び硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して回収し
たところの沈殿物か、実施例−１で得られた液体を凍結
乾燥し、これを６０％硫酸アンモニウム飽和溶液に懸濁
したもの、又はその沈殿物を分取し、６０℃、１０時間
の加熱処理を施した。

この方法によれば、ウィルスの不活化がなると共に、細
胞に対する増殖促進作用が、８０〜９０％残存すること
がわかった。

尚、実施例−３によれば、６０℃、１０時間を前提に行
ったときのものであるが、この温度と時間の関係につい
ては、特にこだわることはなく、例えば、目的とするウ
ィルスにより、処理時間を変えたり、温度は、きらに高
くすることにより、処理時間を短縮することも出来る。

［実施例−４］ここでは、前記実施例−１又は３で得られた蛋白質は、
本発明が目的とする、細胞に対して直接代謝活性化作用
を有する抽出物であり、そのまま従来の胸腺エキスと同
様な利用が出来るが、さらに必要によっては、ゲル濾過
、イオンクロマト等を組み合わせ、分画することによっ
て精製する。

ゲル濾過に用いられる担体としては、セファデックス、
アガロース、セファクリル等があげられるが、例えばセ
ファクリルを例にして示せば、次のごとくの処理操作に
よって、牛の胸腺から得られた、水溶性蛋白質について
分画することが出来る。

〔１〕樹脂：セファクリル　Ｓ−２００スーパーフアイ
ンカラムサイズ：２６Ｘ９５６＋１１１１溶媒：　０．１
Ｍ−０，０５Ｎ　）リス塩酸バッファーｐＨ８，０流速：　３，３ｄ／ｃ＋ｎ”／ｈ上記（１）によって得られた活性フラクションを、さら
にイオン交換樹脂によって分画する。イオン交換に用い
られる担体としては、セファデックス、セファロース、
セファクリル等の陽、陰イオン交換体等があげられるが
、例えばＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを例にして
分画する。

〔２〕樹脂：　ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ溶媒
：　０．１Ｍ−０，０５Ｎ　トリス塩酸バッファーｐＨ
８，０溶出条件：ＮａＣｌｆｉ度　０→０．３Ｍ上記〔２〕に
よって得られた、活性フラクションを、さらにセファク
リルＳ−２００でゲル濾過し、これによって得られる活
性フラクションを分取して、分子量４６．０００の水溶
性蛋白質を得る。又、さらにこの精製化法においては、
実施例１によって得られるものでは、肝炎ウィルスは不
活化されていないので、ここで得られた分子量４６．０
００の水溶性蛋白質に対しては、６０％硫酸アンモニウ
ム飽和溶液中に入れて沈殿キせ、この沈殿物を加熱処理
することによって、ウィルスは不活化出来ると共に、目
的となす、細胞代謝活性化作用は、安定に保持される。

ｒ第１表、　％！施施工１用いることの出来る主な緩衝
液と、特製化（実施例４）で用いるイオン交換体の使用
関係〔ハ〕　発明の効果本発明は、牛の胸腺かも得られた、新規な水溶性の蛋白
質にある。そして、この蛋白質は、直接に細胞の代謝活
性化作用が高いことにある。

従来の公知な抽出エキス、又は抽出物質は、その工程中
で、有機溶媒、強酸、強アルカリ、蛋白分解酵素が用い
られてきたが、その結果は、これらの薬剤によって、従
来の多くの臓器由来の抽出エキスでは、そのエキス中に
、細胞増殖作用物質が失活された状態のエキス、又は抽
出物となっていたことである０、もちろん、加熱処理に
よっても、失活きれてしまっていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において用いた細胞の５％ＦＢＳ濃度
における増殖曲線を示したものである。第２図は、牛の胸腺から抽出された水溶性蛋白質の本発
明において用いた細胞への増殖促進作用を示したもので
ある０図中イは添加量１μｇ　／　ｍｌｌにおける増殖
曲線、口は添加量０．１μｇ　／　ｒｄにおける増殖曲
線、ハは対照群の増殖曲線である。第３図は、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂによる溶
出曲線である。第４図は、ブルーデキストラン二図中Ａ、及び牛血清ア
ルブミン（分子１６７．０００　）：図中Ｂ、α−キモ
トリプシノーゲンＡ（分子量２５゜０００）：図中Ｃを
マーカー蛋白質として、セファクリルＳ−２００スーパ
ーフアインを用いて、ゲル濾過した溶出曲線。第５図は、第４図に示した溶は円曲線に対応する蛋白の
、分子量とＫａｖ値による標準曲線を示したものである
。第６図は、牛の胸腺から抽出された水溶性蛋白質の、Ｄ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂで分画された活性フラ
クシヨンの、セファクリルＳ−２００スーパーフアイン
を用いた、ゲル濾過による、溶出曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）牛の胸腺から抽出された水溶性蛋白質の、推定分子量が
４６，０００、等電点が６．０〜６．５付近であること
を特徴とする、細胞増殖促進物質。
（２）出発原料は牛の胸腺を用い、これを細切し、低温下でホ
モジネートした後、水又は塩化ナトリウム溶液又は、各
種公知な緩衝液を添加して、６時間〜一昼夜放置した後
、遠心分離して得られる上清液を分取し、次に上清液に
対して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウ
ムを添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し、さ
らに上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
硫酸アンモニウムを添加し、これによって沈殿する沈殿
物を、ゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせるこ
とによって精製された水溶性蛋白質の推定分子量が、４
６，０００であり、等電点が６．０〜６．５付近にある
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の、細
胞増殖促進物質の製造法。
（３）出発原料は牛の胸腺を用い、これを細切し、低温下でホ
モジネートした後、水又は塩化ナトリウム溶液又は、各
種公知な緩衝液を添加して、６時間〜一昼夜放置した後
、遠心分離して得られる上清液を分取し、次に上清液に
対して４０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウ
ムを添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し、さ
らに上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、
硫酸アンモニウムを添加し、これによって沈殿する沈殿
物を、６０℃、１０時間加熱処理するか、又は沈殿物を
さらにゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせるこ
とによって精製されたところの水溶性蛋白質を、硫酸ア
ンモニウムの６０％飽和の濃度にした溶液中に加えて沈
殿させ、この沈殿物を６０℃、１０時間加熱処理するこ
とにを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の、細胞
増殖促進物質の活性が安定な、ウィルス不活化処理法。