JPH03148226A - 動物臓器由来蛋白質のウィルス不活化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔１〕発明の目的 本発明は、動物臓器から抽出された水溶性蛋白質の、ウ
ィルス不活化法に関する。

更に詳しくは、動物臓器から抽出された、種々の目的蛋
白質の有効性を損ねることなく、ウィルスの不活化を行
う方法に関する。

（産業上の利用分野） 本願発明によるウィルス不活化法は、動物由来の蛋白質
の、熱による不可逆的な変性を最小限に抑制し、目的物
質の本質的な性質を損ねることなく、細菌、及び、ウィ
ルスの不活化処理をすることができる。

したがって、医薬品、医薬部外品、化粧品、或は、各種
食品類分野において利用される、これまでに公知な、動
物由来の水溶性蛋白質、或は、その誘導体の、抽出・製
造の行程中に、利用することができ、水沫処理を組み入
れることで、安全性に優れた、水溶性蛋白質製剤化を提
供することができる。

すなわち、これまでに、長時間にわたる加熱処理が不向
きとされていた、様々な動物性蛋白質（例えば、動物血
液由来蛋白質、臓器をはじめとする組ｉｌ蛋白質等）、
或は、その誘導体を取り扱う場合の、熱処理に対する安
定化法として利用できる有用な方法である。

（従来の技術） 各種基原（動物種属）の蛋白質を出発原料となし、これ
より各種の抽出法を採用して得られた、そのエキス、又
はその有効成分を分離して、医薬品や化粧品に用いるこ
とは、古くから知られている。

その中から、例えば、動物由来の胎盤から抽出された水
溶性成分（エキス）について、その応用や製造法につい
て調査すれば、ｒ第１表」に示すごとくの公知刊行物が
ある。

「第１表Ｊ公知刊行物（日本国特許庁発行）これらで開
示される如く、古くから、胎盤中には、抗潰瘍作用、組
織代謝活性作用などをはじめ、様々な薬理学的効能を有
する成分が存在することが確認され、これら活性成分の
応用として、医薬品や化粧品分野などでは、特に注目さ
れてきた。

例えば、医薬品においては、注射剤や内服剤の形態で、
強肝剤、胃又は十二指腸潰瘍治療剤などに用いられてお
り、又、化粧品では、肌の老化防止（シワ防止）、シミ
の防止（メラニン色素生成抑制）の目的で、外用塗布剤
の形態で用いられている。

又、胎盤に限らず、この他の動物臓器や、血液由来の蛋
白質についても、同様にして、いろいろな効能効果をも
とに検索され、種々応用されている。

しかし、こうした動物由来の薬理学的有効成分を利用し
、その効能を期待しようとする背景には、病１’Ｘ菌や
ウィルス感染に伴う、様々な発病、疾患などの問題が潜
んでいることは言うまでもない。

例えば、輸血に伴う肝炎発症問題などは、その一つとし
てあげられる。

従って、特に、動物の血液、臓器等の組織や、あるいは
、これらからの成分（エキスを含む）、又は、その誘導
物質等においては、その取扱いから応用に至るまで、充
分な配慮が必要であるとされてきた。

これまでに知られている細菌やウィルス等の不活化法に
関して調査してみれば、例えば、前記したｒ第１表」中
の公知刊行物では、チメロサール、フェノール等薬物に
よる滅菌法、又、加熱処理による不活化、或は、細菌濾
過機による細菌除去法が利用されている。

しかし、目的物質の用途を考慮するとき、薬物の添加に
よる方法は、薬剤残留性の心配などにより、好ましくな
い場合があり、又、濾過によるウィルスや細菌除去法に
ついても、未だ完璧とは言い難く、従って、従来から、
目的物質を人体に用いる場合などは、安全性や、安定性
、そして経済的等の面から、加熱処理による方法が、最
も広く採用されてきた。

ところが、この方法も、従来の加熱処理の方法のままで
は完全なものではなかった。すなわち、胎盤組織や胎盤
中に含まれる血液由来の有効物質は、主として、蛋白質
や、又、その加水分解物、或は、種々のアミノ酸であり
、加熱することによって、これら有効成分の高次構造に
不可逆的な変性をきたしてしまうことである。

つまり、従来法による加熱処理では、細菌やウィルスの
不活化に留まらず、目的物質本来の有効作用まで失活化
させてしまい、本来の期待される効果が、充分に発揮出
来ないようなことが予測されることである。

そこで、本発明者らは、熱に対して不安定な、動物臓器
由来の水溶性成分をもとに、その有効作用を保持させ、
細菌やウィルスに対してのみ、不活化させることの出来
る、新たな方法の確立を課題となし、研究を開始した。

（作用の測定等に関する注解） 本発明者らは、課題を解決するための処理法を確立する
ため、その対象基質として、胎盤から抽出された繊維芽
細胞増殖作用を有する水溶性蛋白質を用い、様々な加熱
法をもとに処理を行い、基質本来の持つ作用への影響を
指標として、評価を行った。

評価法については、より適正、且つ、正確に行うため、
その手段として、まず第１点目に、できるだけ生体にお
ける正常細胞機能モデルに近い条件下で評価を行うこと
、又、第２点目として、加熱処理による目的物質への影
響について、その本質的活性能の変化を定量的に求める
方向で検討した。以下に、その方法について詳しく述べ
る。

皮膚の細胞には、表皮細胞、繊維芽細胞があるが、例え
ば、モルモット（ハートレー系、雌）から採取した繊維
芽細胞は、５％牛脂児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグ
ルＭＥＭ培地中では、盛んに分裂増殖し、そのイき数増
殖時間は、ｒ第１図」に示すごとく、約４８時間である
ことが確認された。

そして、この細胞は、採取後、約１年間で株化すること
である。

そこで、本発明者らは、出来るだけ生体の正常機能モデ
ルに近い条件として、採取後、６力月までに増殖継代し
た細胞を、冷凍保存し、加熱処理に対する基質の安定化
方法を検討する・ため、順次使用することにした。

一方、培！！環境については、使用する牛胎児血清（Ｆ
ＢＳ）による細胞増殖促進作用への影響を、その濃度変
化から調査し、培養中、細胞を死滅化させることなく、
又、細胞増殖を認めない最善の条件を満たす最少量を基
準とした。

具体的に、系中に添加するＦＢＳの添加量と、それによ
る繊維芽細胞増殖との関係を示せば、第２図のごとくで
ある。

ここで示されるように、添加するＦＢＳが系中の１％量
の時では、９日間の培養で、繊維芽細胞の増殖を認めな
かった。したがって、コントロールとして、この条件を
基準とした。

その方法は、まず、直径３．５ｃｍのベトリディッシュ
（コーニング社製）に、１ｍＬ当り４〜５　ｘ　１０４
個の細胞浮遊液を分注し、低濃度のＦＢＳを添加（細胞
が死滅することがなく、増殖率がゼロ付近となる量）シ
た、イーグルＭ　Ｅ　Ｍ培地を２〜３日毎に交換する。

そして、細胞数を、２〜３日目毎にビュルケルチュルク
の血球計算盤を用いて測定する。

尚、この隙、同時に蛋白量、核ａｍを測定しても良い。

測定に使用する目的物質は、その蛋白量にて調整（溶液
）し、培地当り１０分の１量を、培地交換の都度添加し
、対照（コントロール）には、同量の生理食塩水のみを
添加する。

〔口〕発明の構成 本発明は、動物臓器から、種々の目的で抽出された水溶
性蛋白質に対して、その本質的な活性の低下を最小限に
抑制する、細菌やウィルス不活化法をもってなる。

（問題点を解決するための手段） 基質に存在する細菌やウィルスを、加熱処理によって失
活させる条件は、その対象となる細菌やウィルスの１１
類や試験環境によって異なる。

したがって、最も耐熱性の大きいものを指標菌として、
これらを死滅させる温度・時間を殺菌条件とするのが原
則とされている。しかし、前述したごとく、加熱するこ
とによって、基質そのものの持つ特質を損ねてしまって
は、何もならないのである。

本発明者らは、動物臓器やこれらに含まれる血液などか
ら抽出した、水溶性蛋白質をもとに、これらの薬理的効
能を失活させることなく、細菌やウィルスを不活化する
加熱処理法を、種々検討してきた。以下に、その実施例
を示し、更に詳しく述べる。

（実施例１：基質の調整） （１）人胎盤由来Ｉ！Ｉ維芽細胞増殖促進作用蛋白質人
の正常分娩後の胎盤を細切し、低温下にてホモジナイザ
ーなどでホモジネートした後、これに対して水又は緩衝
液、例えば、塩化ナトリウム含有の低イオン濃度リン酸
緩衝液を添加して、撹拌し、６時間から１昼夜放置する
。

次に、これを遠心分離して上澄液を分取し、この上澄液
に対し、飽！ａ濃度の４０％量となるように、硫酸アン
モニウムを添加した後、再度、遠心分離によって上澄液
を回収する。

次いで、この回収した上澄液に、飽和濃度の６０℃濃度
となるように、再び、硫酸アンモニウムを添加し、これ
によって発生する沈澱物を回収する。

沈澱物は、少量の水又は生理食塩水などに溶解した後、
脱塩操作を行う。脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、
透析などの方法があるが、そのいずれを採用しても良い
が、ここでは、透析チューブに入れて、充分量の生理食
塩水などに、１昼夜以上透析する方法により、水溶性蛋
白質を含む液体を得た。

第３図中、イは、この操作によって得られた成分の、繊
維芽細胞増殖促進作用を示す。

（２）牛胎盤由来繊維芽細胞増殖促進作用蛋白質牛の正
常分娩後の胎盤を細切し、低温下にてホモジナイザーな
どでホモジネートした後、これに対して水又は緩衝液、
例えば、塩化ナトリウム含有の低イオン濃度リン酸緩衝
液を添加して、撹拌し、６時間から１昼夜放置する。

次に、これを遠心分離して上澄液を分取し、この上澄液
に対し、飽和濃度の２０％量となるように、硫酸アンモ
ニウムを添加した後、再度、遠心分離によって上澄液を
回収する。

次いで、この回収した上澄液に、飽和濃度の６０％量と
なるように、再び、硫潴アンモニウムを添加し、これに
よって発生する沈澱物を回収する。

沈澱物は、少量の水又は生理食塩水などに溶解した後、
脱塩操作を行う。脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、
透析などの方法があるが、そのいずれを採用しても良い
が、ここでは、人胎盤と同様、１昼夜以上透析する方法
により、水溶性蛋白質を含む液体を得た。

第４図中、イは、この操作によって得られた成分の、繊
維芽細胞増殖促進作用を示す。

〔実施例２：加熱処理法〕 次に、実施例１の（１）、及び（２）で得られた、人、
及び、牛の胎盤由来の細胞増殖促進作用の高い抽出物を
もとに、その有効作用を損なうことなく、細菌やウィル
スの不活化を行う方法を検討した。

これまでに−膜内に知られている、加熱処理に関する方
法としては、熱殺菌の場合では、病原菌のみを殺菌の対
象として、６０〜６５℃、３０分という条件が採用され
ている。又、前述した、肝炎ウィルスの不活化の場合で
は、６０℃、１０時間の加熱処理が有効であることが知
られている。

そこで、本発明者らは、対象基質の安全性からみて、よ
り苛酷にして、且つ、確実な条件として、後者の加熱温
度と処理時間を採用して、開発に当、たった。

まず、はじめに、実施例１の（１）及び（２）で得られ
た抽出物に対して、６０℃、１０時間の加熱処理を行っ
たところ、肝炎ウィルス不活化には有効であっても、基
質本来の作用である、細胞増殖促進能については、１０
０％失活してしまうことがわかった。

すなわち、いろいろと条件を変え、加熱処理を行った結
果、人及び牛の胎盤より抽出された、水溶性蛋白質は、
６０℃、３０分間で細胞増殖促進作用が完全に失活して
しまうことがわかったのである。

本発明者らは、該物質の有する細胞増殖作用が持続し、
肝炎ウィルスのみ不活化するための手段として、長時間
高温下での処理に耐えられる安定化法について、更に、
研究を進めた。

その手段として、例えば、特定の酵素の場合、加熱に対
する安定性は、グルコース、マンノース等の単ｗｉ類、
ショ糖、マルトース等の２ｍ類等を添加し加熱処理を行
うと、加熱に対して安定化されることが知られているの
で、これに習って検討を加えてみた。しかし、この手段
を用いても、何ら良い結果を得るに至らず、前記したと
同様に、基質本来の細胞増殖能は失活してしまうことが
わかったのである。

そこで、本発明者らは、溶解した状態で６０℃の加熱処
理を行うと、この処理によって対象基質蛋白の高次構造
に不可逆的な変性をきたし、これによって失活したもの
と推定すると共に、これに対応する手段として、次に高
濃度塩類溶液中等で、予め蛋白の構造を変化させ、沈澱
させた状態で加熱することによって、蛋白の不可逆的な
変性を最小限に抑制することが可能ではないか、との発
想のもどに、実施例３で示すごとくの新規な加熱処理方
法を完成するに至ったのである。

この方法は、当然さまざまの従来の公知な血液及Ｔｊｂ
ｉ器由来の成分の、熱安定化法としても利用可能な、便
利な方法である。

〔実施例３：本願発明の加熱処理法〕 実施例１の（１〉、及び、（２）で得られた抽出物を凍
結乾燥し、これを６０％硫酸ナトリウム飽和溶液に懸濁
したもの、又はその沈濃物を分取し、６０℃、１０時間
の加熱処理を施した。

この方法によれば、肝炎ウィルスの不活化がなされると
共に、細胞に対する増殖促進作用が８０〜９０％残存す
ることがわかった。

第３図中の口、及び、第４図中の口は、実施例３による
加熱処理後の目的物質の細胞増殖作用について、実施例
１の（１）、及び、（２）で得られた未加熱処理の成分
と対比して測定した結果を示す。

つまり、加熱処理に対して、細胞増殖作用を失活させな
いための手段が、実施例３で示した方法である。

尚、実施例２〜３は、血清及び各種臓器由来の蛋白質製
剤における、公知な肝炎ウィルスの不活化法をもとに、
６０℃、１０時間を前提に行ったときのものであるが、
特に、実施例３において、その行程中で採用した、高濃
度塩類溶液による沈澱又は懸濁化法によれば、温度をさ
らに高くすることで、処理時間を短縮することも可能で
ある。

したがって、本発明による方法によれば、種々の動物由
来の加熱処理に対して、失活するような薬理活性成分の
細菌やウィルスの不活化法として、又、熱安定化法とし
て有利である。

〔ハ〕発明の効果 すなわち、本発明の効果は、動物臓器や血液から得られ
る、種々の水溶性の蛋白質に対して、それらのもつ薬理
的効果を、はとんど失活させることなく、細菌やウィル
スに対してのみ、選択的に不活化させることを可能にし
た、大変、便利な方法であることを上げることができる
。

したがって、水沫を利用することで、これまでに、公知
な動物臓器や血液由来の蛋白質、その加水分解物、或は
、それらの誘導物質に対して、加熱処理を行うことが可
能となり、細菌やウィルスの不活化のみならず、これら
の抽出物の取扱における、加熱処理に対する安定化法と
しても応用することができること。しかも、この加熱処
理されたものは、目的となす薬理的有効作用が失活され
ることなく、安定に保持されることである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モルモット（ハートレー系、雌）から採取し
た繊維芽細胞を、培養液中５％量の牛胎児血清（ＦＢＳ
）を添加したイーグルＭＥＭ培地中で培養した時の、細
胞数の変化を示したものである。 第２図は、繊維芽細胞増殖に及ぼす、培養液中の、牛胎
児血清（ＦＢＳ）濃度の影響について示したものである
。 第３図は、人の胎盤から抽出された水溶性蛋白質の、熱
処理する前と熱処理した後の、細胞増殖促進作用を示し
たものである。図中イは、熱処理する前の抽出物の添加
による、細胞増殖作用、口は、熱処理した後の抽出物の
添加による細胞増殖作用、又、ハは対照群（生理食塩水
添加群）の細胞増殖作用である。 第４図は、牛の胎盤から抽出された水溶性蛋白質の、熱
処理する前と熱処理した後の、細胞増殖促進作用を示し
たものである。図中イは、熱処理する前の抽出物の添加
による、細胞増殖作用、口は、熱処理した後の抽出物の
添加による細胞増殖作用、又、ハは対照群（生理食塩水
添加群）の細胞増殖作用である。 第５図は、実施例１の（１）で得られた、人の胎盤から
抽出された、繊維芽細胞増殖促進作用を有する水溶性蛋
白質の、セファデックスＧ−２００を用いたゲル濾過に
よる流出曲線である。 （条件） 樹　　脂：セファデックスＧ−２００ カラムサイズ’：３０　　　　Ｘ　　　　８５０　　　
　ｍｍ溶　　媒：　０．０１１４リン酸バツフアー（０
，１４Ｍ　ＮａＣ１含　ｐＨ７，４）流　　　　速：４
ｃｍ／ｈｒ 第６図は、実施例１の（２）で得られた、牛の胎盤から
抽出された、繊維芽細胞増殖促進作用を有する水溶性蛋
白質の、セファデックスＧ−２００を用いたゲル濾過に
よる流出曲線である。 （条件） 樹　　脂：セファデックスＧ−２００ カラムサイズ’：３１　　　　ｘ　　　　３７０　　　
　ｍｍ溶　　媒：　０．０１Ｍリン酸バッファー（１１
，１４Ｍ　ＮａＣ１含　ｐＨ７，４）流　　速：２ｃｍ
／ｈｒ 第７図は、本発明で用いた、人及び牛の胎盤から抽出さ
れた水溶性蛋白質の、分子量を測定するため、分子量既
知物質である下記の４物質について、セファデックスＧ
−２００によるゲル濾過を行い、Ｋａｙ値と分子量の検
ｍ線を作成したものである。 分子量既知物質（標準物質） Ａ、７Ｊｌ／ドラーゼ（分子ｆｆｉ　　１５８，０００
　）Ｂ、牛血清７　）Ｌｔブミン（分子＠６７．０００
）Ｃ１α−キモトリプシノーゲンＡ （分子量　２５，０００）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１） 動物臓器から抽出された水溶性蛋白質を、塩析処理によ
   って沈澱させ、この沈澱物に対して加熱処理することを
   特徴とする、ウィルス不活化法。
2. （２） 動物臓器から抽出された水溶性蛋白質が、人胎盤由来の
   成分である、特許請求の範囲第１項記載のウィルス不活
   化法。
3. （３） 動物臓器から抽出された水溶性蛋白質が、牛胎盤由来の
   成分である、特許請求の範囲第１項記載のウィルス不活
   化法。