JPS63188700A

JPS63188700A - 牛の血液又は血清から抽出せる細胞増殖促進物質及びその抽出法並びにウイルス不活化処理法

Info

Publication number: JPS63188700A
Application number: JP62019086A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Ando; 安藤　義隆; Yutaka Ando; 裕安藤
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1988-08-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔イ〕　発明の目的本発明は、牛の血液、又は血清から抽出された新規な水
溶性蛋白質、及びその抽出法、並びにウィルス不活化処
理法に関する。

（産業上の利用分野）本発明による新規な水溶性蛋白質は、分子量が７５．０
００で、細胞代謝活性化作用が顕著である。すなわち、
本発明による水溶性蛋白質は一１線維芽細砲の増殖と伸
展を促進する。よって、本発明による新規な水溶性蛋白
質は、例えば、人又は動物用医薬品として、強肝剤、胃
、十二指腸潰瘍剤、損傷修復剤等に直接、又は配合剤と
して利用できる。又、外用剤として、あるいは化粧品な
どにも、直接、又は配合して用いることができる。

又、組織培養に於ける培地添加剤としても有用である。

（従来の技術）各種基原（動物種属）の血液又は血清を出発原料となし
、これにより各種の抽出法を採用して得られるそのエキ
ス、又はその有効成分を分離して、人又は動物の医薬品
や、化粧品に用いることは古くから知られている。

又、近年、ウシ脳や、ウシ脳下垂体より、線雑芽細胞成
長因子（分子量１３．３００±１．２００、等電点９．
６）がＧｏｓｐｄａｒｏｗｉｃｚ　（Ｎａｔｕｒｅ、　
２４９゜１２３−１２７．１９７４　’）によって分離
されている。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは、血清抽出物に関する、前記の組織代謝賦
活作用、又は組織再生修復能に注目すると共に、それら
が人間や、他の動物の医薬品、又は化粧品に用いられる
ことを考慮し、株化された細胞でない、初代培養細胞に
対する作用を指標として、推定分子量が７５．０００で
、停電点が６゜０〜６．５付近である蛋白を分離するこ
とに成功した。

（細胞増殖促進作用の測定等に関する注解）細胞増殖促
進作用を表現する方法は、今日一般に知られている成長
因子でも、的確に効力を表現する方法はなかった。

本発明者らは、対照の１ｍ胞増殖率をゼロに制御するこ
とにより、目的物質の細胞増殖促進作用を定量的に表現
する方法を開発した。これは、添加する牛胎児血清（Ｆ
ＢＳ）の量を調節することにより達成した。

一方、本発明者らは、作用物質の細胞増殖促進作用を、
きまざまの株細胞で検討してきたが、それらは、形態、
機能、及び遺伝子的にも正常細胞とは異なるとされてい
る。

そこで、ここでは、正常皮膚から分離した、初代細胞で
検討することとした。以下にその方法を述べる。

皮膚の主な細胞には、表皮細胞（ケラチノサイト）、線
維芽細胞があるが、例えば、モルモット（ハートレー系
）から採取した線維芽細胞は、５％ＦＢＳを添加したイ
ーグルのＭＥＭ培地中で、盛んに分裂増殖し、その倍数
増殖時間は第１図に示すごとく、約４８時間である。

細胞増殖率の測定法は、まず、直径３．５ａｎのベトリ
ディッシュ（フーニング社製）に、１ｍ１当り４〜５　
Ｘ　１　ｏｐ個の細胞を植え、低濃度のＦＢＳを添加し
た、イーグルのＭＥＭ培地を２〜３日目ごとに交換する
。細胞数は、２〜３日目ごとにビュルケルテユルクの血
球計算盤を用いて測定する。

目的物質は蛋白量にて調整し、培地当り１０分の１の量
を、培地交換のつど添加し、対照（フントロール）には
、同量の生理食塩水のみを添加する。

〔口〕　発明の構成本発明は、牛の血液、又は血清から抽出した水溶性蛋白
質の分子量が、７５．０００である、細胞増殖促進物質
と、その抽出法、さらにその抽出操作の過程で、硫酸ア
ンモニウムの６０％飽和濃度で沈殿する沈殿物を６０℃
、１０時間加熱処理することを特徴とする、水溶性蛋白
質のウィルス不活化処理法にある。

（問題点を解決するための手段）本発明の要旨は、前記したごとくであるが、より具体的
に示すために、以下に実施例及び作用について述べる。

尚、実施例を示すに当り、本発明による基本的な要点を
示すと、次のごとくである。

（イ）抽出法における出発原料は、牛の血液、又Ｃｔ血涜を用
いる。さらに、血液は溶血したものを、前処理すること
なく用いることも出来る。又、必要によっては、豚など
の畜産動物類の血液、又は血清を用いることも出来るが
、それは、用いる対象となる動物種の、治療又は医薬的
な用途、化粧料等々の用途に応じて選択すれば良い。

（ロ）実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易な方法を
示すも、その抽出工程における操作のポイントは、熱を
加えないこと、有機溶媒による抽出操作は避けること０
強酸、強アルカリ分解、各種の蛋白分解酵素を用いない
ことが必要である。

すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活性を失活
させるからである。これにしたがえば、遠心分離法、塩
析分画法、ゲル濾過法、凍結乾燥法などの、従来の生体
成分を抽出する、さまざまの組み合わせの方法によって
得ることが出来る。

［実施例−１］牛の血液、又は血清に対して、まず、２０％飽和の濃度
になるように、硫酸アンモニウムを添加後、遠心分離し
て、その上清液を採取し、次に、この上清液に対して、
６０％飽和の濃度になるように、再び硫酸アンモニウム
を添加し、遠心分離して沈殿物を回収する。

沈殿物は、少量の水、又は生理食塩水等に溶解した後、
脱塩操作を行う。

脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法が
あるが、そのいづれの方法を採用しても良い、ここでは
、例えば透析チューブに入れて、充分量の生理食塩水等
に、−昼夜以上透析する方法により、牛の血液、又は血
清を出発原料とする、７５．０００の分子量を有する、
水溶性蛋白質を含む液体を得た。

尚、上記実施例−１では、出発原料として、血清、又は
血液を用いたが、血液を用いるに当っては、溶血した血
液を用いることも出来る。

［実施例−２］実施例−１で得られた上述の抽出物は、その用途を考慮
するとき、ウィルスの不活化について、充分な配慮が必
要である０例えば、肝炎ウィルスを不活化するには、６
０℃、１０時間の加熱処理が有効とされている。しかし
、実施例−１で得られた液体を、６０℃、１０時間の加
熱処理を行ったところ、細胞増殖促進作用が、１００％
失活することがわかった。

そこで本発明者らは、本物質の有する、細胞増殖促進作
用が持続し、ウィルスのみ不活化するための手段として
、長時間の高熱処理に対する、安定化法について検討し
た。

その手段として、例えばグルツース、マンノース等の単
糖類、ショ糖、マルトース等の２糖類などを添加して加
熱処理を行い、検討を加えたが、同様に失活することが
わかった０本発明者らは、溶解した状態では、目的物質
である蛋白の、高次構造に不可逆的な変性をきたし、こ
れによって失活したと考えると共に、これに対する手段
として、次に高濃度塩Ｍ溶液中等で、沈殿させた状態で
加熱することによって、変性を抑制することが可能では
ないかとの発想のもと仁、実施例−３で示すごとくの新
規な加熱処理方法を完成した。

［実施例−３］実施例−１の工程中で、６０％飽和の濃度になるように
、再び硫酸アンモニウムを添加し、遠心分離して回収し
たところの沈殿物か、実施例−１で得られた液体を凍結
乾燥し、これを６０％硫酸アンモニウム飽和溶液に懸濁
したもの、又はその沈殿物を分取し、６０℃、１０時間
の加熱処理を施した。

この方法によれば、ウィルスの不活化がなると共に、細
胞に対する増殖促進作用が、８０〜９０％残存すること
がわかった。

尚、実施例−３によれば、６０℃、１０時間を前提に行
ったときのものであるが、この温度と時間の関係につい
ては、特にこだわることはなく、例えば、目的とするウ
ィルスにより、処理時間を変えたり、温度は、さらに高
くすることにより、処理時間を短縮することも出来る。

［実施例−４］ここでは、前記実施例−１又は３で得られた蛋白質は、
本発明が目的とする、細胞に対して直接代謝活性化作用
を有する抽出物であり、そのまま、従来のエキスと同様
にして、使用出来るが、さらに必要によっては、ゲル濾
過、イオンクロマト等を組み合わせ、分画することによ
って精製する。ゲル濾過に用いられる担体としては、セ
ファデックス、アガロース、セファクリル等があげられ
るが、例えばセファクリルを例にして示せば、次のごと
くの処理操作によって、牛の血液、又は血清から得られ
た、水溶性蛋白質について分画することが出来る。

〔１〕樹脂：セファクリル　Ｓ−２００スーパーフアイ
ンカラムサイズ：２６Ｘ９５６ｗ１１溶媒：　０．ＩＭ−０，０５Ｎ　トリス塩酸バッファー
ｐＨ８，０流速：　３．３　ｒｎＱ／ｃｌＴｌ”／　ｈ上記〔１〕
によって得られた活性フラクションを、さらにイオン交
換樹脂によって分画する。イオン交換に用いられる担体
としては、セファデックス、セファロース、セファクリ
ル等の陽、陰イオン交換体等があげられるが、例えばＤ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを例にして分画する。

〔２〕樹脂：ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ溶媒：
　Ｏ，１Ｍ−０，０５Ｎ　トリス塩酸バッファーｐ　Ｈ
８，０溶出条件：ＮａＣ’ｌ濃度　０−０．３Ｍ上記〔２〕に
よって得られた活性フラクシヨンを、さらにセファクリ
ルＳ−２００でゲル濾過し、これによって得られる活性
フラクションを分取して、分子量７５．０００の水溶性
蛋白質を得る。又、きらにこの精製化法においては、実
施例１によって得られるものでは、肝炎ウィルスは不活
化されていないので、ここで得られた分子量７５．００
０の水溶性蛋白質に対しては、６０％硫酸アンモニウム
飽和溶液中に入れて沈殿許せ、この沈殿物を加熱処理す
ることによって、ウィルスは不活化出来ると共に、目的
となす、細胞代謝活性化作用は、安定に保持される。

１第１表、　実施例１で用いることの出来る主な緩衝液
と、精製化（実施例４）で用いるイオン交換体の使用関
係〔ハ〕　発明の効果本発明は、牛の血液、又は血清から得られた、新規な水
溶性の蛋白質にある。そして、この蛋白質は、直接に細
胞の代謝活性化作用が高いこと（こある。

従来の公知な抽出エキス、又は抽出物質は、その工程中
で、有機溶媒、強酸、強アルカリ、蛋白分解酵素が用い
られてきたが、その結果は、これらの薬剤によって、従
来の抽出エキス、又は抽出物中には、細胞増殖作用物質
が失活きれた状態で得られていたことである。もちろん
、加熱処理によっても、失活されてしまっていた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において用いた細胞の５％ＦＢＳｆｉ
度における増殖曲線を示したものである。第２図は、本発明に係る牛の血清から抽出された水溶性
蛋白の、本発明において用いたｍ胞への細胞増殖促進作
用を示したものである０図中、イは添加量１μｓ　／　
ｍにおける増殖曲線、口は添加量０．１μｇ／ｎｉｌに
おける増殖曲線、ハは対照群の増殖曲線である。第３図は、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂによる溶
出曲線である。第４図は、ブルーデキストラン二図中Ａ５及び牛血清ア
ルブミン（分子量６７゜０００）：図中Ｂ４Ｃ−キモト
リプシノーゲンＡ（分子量２５゜０００）：図中Ｃをマ
ーカー蛋白質として、セファクリルＳ−２００スーパー
フアインを用いて、ゲル濾過した溶出曲線。第５図は、第４図に示した溶出曲線に対応する蛋白の、
分子量とＫａｖ値による漂準曲線を示したものである。第６図は、牛の血清から抽出された水溶性蛋白質の、Ｄ
ＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂで分画された活性フラ
クションの、セファクリルＳ−２００スーパーフアイン
を用いた、ゲル濾過による、溶出曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）牛の血液又は血清から抽出された水溶性蛋白質の、推定
分子量が７５，０００、等電点が６．０〜６．５付近で
あることを特徴とする、細胞増殖促進物質。
（２）出発原料は、牛の血液、又は血清を用い、その出発原料
に対して、２０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモ
ニウムを添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し
、さらに上清液に対して、６０％飽和の濃度になるよう
に、硫酸アンモニウムを添加し、これによって沈殿する
沈殿物を、ゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせ
ることによって精製された、水溶性蛋白質の推定分子量
が７５，０００であり、等電点が６．０〜６．５付近に
あることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の
、細胞増殖促進物質の製造法。
（３）出発原料は牛の血液、又は血清を用い、出発原料に対し
、２０％飽和の濃度になるように、硫酸アンモニウムを
添加し、遠心分離して得られる上清液を分取し、さらに
上清液に対して、６０％飽和の濃度になるように、硫酸
アンモニウムを添加し、これによって沈殿する沈殿物を
、６０℃、１０時間加熱処理するか、又は沈殿物をさら
にゲル濾過、イオン交換クロマトを組み合わせることに
よって精製されたところの水溶性蛋白質を、硫酸アンモ
ニウムの６０％飽和の濃度にした溶液中に加えて沈殿さ
せ、この沈殿物を６０℃、１０時間加熱処理することに
を特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の、細胞増殖
促進物質の活性が安定な、ウィルス不活化処理法。