JPH0720995B2

JPH0720995B2 - 牛脾臓由来の細胞増殖促進物質

Info

Publication number: JPH0720995B2
Application number: JP62019083A
Authority: JP
Inventors: 義隆安藤; 裕安藤
Original assignee: 一丸フアルコス株式会社
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1987-01-29
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: JPS63188697A

Description

【発明の詳細な説明】〔１〕発明の目的本発明は、牛の脾臓から抽出された新規な細胞増殖促進
物質に関する。

更に詳しくは、牛の脾臓から抽出、分画された分子量が
41,000付近、等電点6.0〜6.5付近の水溶性蛋白質からな
る優れた細胞増殖促進物質に関するものである。

（産業上の利用分野）本発明による牛脾臓由来の水溶性蛋白質は、繊維芽細胞
の増殖と伸展を促進する作用を有し、更には、他の細胞
の増殖促進・賦活、あるいは組織への賦活作用が期待で
きる。

したがって、例えば、人又は動物用医薬品（強肝剤、
胃、十二指腸潰瘍剤、損傷修復剤等）として、又はそれ
ら製剤への配合用剤として有用である。また、外用剤や
化粧料などに応用することもできる。

その他、組織培養における培地添加剤などとしても使用
することができる。

（従来の技術）各種基原（動物種属）の脾臓を原料となし、これより様
々な抽出法を採用して得られたエキス、或は、分離され
た有効成分を、人又はその他の動物の医薬品や化粧品に
適用する手段は古くから知られている。

個体の老化あるいはこれにともなって起こる各種の疾患
などは、分裂し得るすべての細胞の老化（分裂速度や細
胞機能の低下）と相関しており、細胞レベルでの老化防
止を目的として、細胞賦活剤の探索が数多く行われるよ
うになってきている。細胞賦活剤の一つに細胞成長因子
があり、既に種々の因子が確認されている。ウシ脳やウ
シ脳下垂体の抽出物から分離された繊維芽細胞増殖因子
（分子量13,000±1,200,等電点9.6）もその一例である
［Gospodarowiczら,NATURE,249,p.123-127（1974）］。
また、牛の脾臓由来の繊維芽細胞増殖作用を有する因子
については、例えば、特開昭61-233694号には、牛の脾
臓中に含まれる分子量約16,000〜18,000、等電点9.5〜1
0.5の蛋白質が繊維芽細胞の成長に関して活性的作用を
有する旨が開示されている。

この細胞レベルでの老化の研究においては、繊維芽細胞
の老化が、すべての細胞に普遍的に存在する分裂加齢を
機序を解析するための老化のモデルとして捕らえられ、
培養系繊維芽細胞を用いることによって解明されつつあ
る［細胞,11（14）,p.17-27（1979）］。

一方、繊維芽細胞は、動物個体内のほとんどすべての組
織中に存在し、Ｉ型,III型コラーゲン、フイブロネクチ
ンやヒアルロン酸などの細胞間物質（細胞外マトリック
ス）を産生して、皮膚など上皮の支持組織を構築してお
り、近年では、表皮細胞の研究において、その培養系
に、繊維芽細胞とコラーゲンなどの細胞外、マトリック
ス成分とを導入したものが、皮膚モデルとして応用され
ている［日本形成外科学会会誌,4,p.403-411（198
4）］。

更に、繊維芽細胞の生産する細胞外マトリックス成分
や、繊維芽細胞−上皮細胞間の相互作用によって、上皮
細胞の増殖が促進されること［生体の科学,33,5,p.381-
388（1982）］や、表皮細胞の増殖性には真皮の繊維芽
細胞が関与していることも報告されている［Science,23
0,p.669-672（1985）］。

（発明が解決しようとする課題）今日一般に知られている細胞増殖促進物質についてその
効力の評価法を考察してみると、それらは、必ずしも的
確な評価法、基準によって見出されたものとは言い難
い。

そこで本発明者らは、脾臓抽出物に関する前記の細胞増
殖促進作用に注目すると共に、それらが人又は動物用の
医薬品や化粧品に用いられることを考慮し、次のことを
基準として、より信頼性の高い細胞増殖促進物質の検索
を開始した。

（１）生体細胞に最も近いモデルを再現するため、評価
にあたっては株化されていない初代の培養細胞を使用す
る。

（２）他の因子による影響を極力抑え、目的物質自体の
絶対的作用を求めるという目的と、同時に細胞に対する
毒性を確認する意味で、ブランクの培養環境を、細胞が
死滅することなく増殖率がゼロとなるように制御し、目
的物質の評価にあたる。（細胞増殖促進作用の測定等に
関する注解）上記の基準を満たす評価法の確立にあたっては、まず、
使用する細胞の種類について検討し、次に、細胞を培養
する環境において、添加する牛胎児血清（FBS）の量の
調節を試みた。

研究初期段階において、本発明者らは様々な株細胞を用
いて検討してみたが、やはり、従来、細胞レベルの研究
には、ほとんど繊維芽細胞が用いられていること、更
に、組織において繊維芽細胞の増殖を活性化すること
は、他の細胞の増殖促進・賦活、ひいては組織の賦活・
代謝活性化につながるのではないかとの考え方から、繊
維芽細胞の初代細胞を使用することが最も的確であると
いう結論に至った。

すなわち、例えば、モルモットの皮膚から無菌的に繊維
芽細胞を分離し、一定、期間継代した変異していない細
胞を対象となし、目的物質の細胞増殖能を評価するので
ある。

以下に、その方法について詳しく述べる。

モルモット（ハートレー系、雌）の皮膚から採取した繊
維芽細胞は、５％牛胎児血清（FBS）を添加したイーグ
ルMEM培地中で盛んに分裂増殖し、その倍数増殖時間は
第１図に示すごとく約48時間であることが確認された。

そしてこの細胞は、採取後、約１年間で株化するのであ
る。

そこで、目的物質の細胞増殖能の評価のためには、採取
後、６カ月までに増殖継代した細胞を冷凍保存すること
により、目的物質の分離、及び熱処理に対する安定化方
法などの検討のために、順次使用することにした。

次に、細胞の培養環境については、添加する牛胎児血清
（FBS）濃度の細胞増殖促進作用への影響を検討し、培
養中、細胞を死滅させることなく、細胞増殖を認めない
最善の条件を満たす最少量を基準とした。

具体的に、系中に添加するFBSの量と、それによる繊維
芽細胞増殖との関係を示せが、第１図のごとくである。

ここで示されるように、添加するFBS濃度が系中の１％
量の時では、９日間の培養で、繊維芽細胞の増殖を認め
なかった。

したがって、コントロール（ブランク）として、この条
件を基準とした。

その方法は、まず、直径3.5cmのペトリディッシュ（コ
ーニング社製）に、1mL当り４〜５×10⁴個の細胞浮遊液
を分注し、低濃度のFBSを添加（細胞が死滅することが
なく、増殖率がゼロ付近となる量）した、イーグルMEM
培地を２〜３日毎に交換する。

そして、細胞数を、２〜３日目毎にビュルケルチュルク
の血球計算盤を用いて測定する。

測定に使用する目的物質は、その蛋白量にて調整（溶
液）し、培地当り10分の１量を、培地交換の都度添加
し、対照（コントロール）には、同量の生理食塩水のみ
を添加する。

そしてこれらの評価法に基づいて検討した結果、牛の脾
臓由来の水溶性蛋白質に細胞増殖促進物質が含まれるこ
とを確認し、さらに追求を試みて、推定分子量、41,000
付近、等電点6.0〜6.5付近の細胞増殖促進物質を分画し
た。

〔２〕発明の構成本発明は、牛の脾臓から抽出された、推定分子量41,000
付近、等電点6.0〜6.5付近である水溶性蛋白質からなる
細胞増殖促進物質をもって構成する。

（問題点を解決するための手段）本発明の要旨は、前述した如くであるが、より具体的に
示すために、以下に実施例及び作用についてを記す。

尚、実施例を示すに当たり、本発明による基本的な要点
を示すと次の如くである。

（イ）抽出法におけるその出発原料は、牛の脾臓を用い
る。又、必要によっては、豚等の家畜動物の脾臓を用い
ることもできるが、それは治療又は医薬的な用途、化粧
料等々の用途として、その対象となる動物種に応じ選択
すればよい。

（ロ）実施例では、特定した抽出条件下で、最も簡易な
方法を示すも、その抽出行程における操作のポイントは
熱を加えないこと。有機溶媒による抽出操作は避けるこ
と。強酸、強アルカリ、各種の蛋白質分解酵素を用いな
いことが必要である。

すなわち、これらの処理操作は、目的物質の活性を失活
させてしまうので用いてはならないのである。

これに従えば、遠心分離法、塩析分画法、ゲル濾過法、
透析法、低温又は真空濃縮法、凍結乾燥法などの、従来
の生体成分を抽出する様々な方法を組合せることは何等
差し支えない。

（実施例１）牛の脾臓を前処理なしに細切し、低温下にてホモジナイ
ザー等でホモジネートする。これに対して、水又塩化ナ
トリウム溶液、或は、第１表に示すような緩衝液を添加
して攪拌し、６時間から一昼夜放置した後、遠心分離し
て上澄液を得る。

次にこの上澄液に対して、飽和濃度の40％になるように
硫酸アンモニウムを添加後、遠心分離してその上澄液を
回収し、更にこの上澄液に対し、飽和濃度の60％になる
ように硫酸アンモニウムを再添加し、これによって発生
する沈澱物を回収する。

尚、沈澱物は、少量の水又は生理食塩水などに溶解した
後、脱塩操作を行う。

脱塩操作には、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法が
あるが、ここでは透析チューブに入れて十分量の生理食
塩水などに、一昼夜以上透析する方法により行った。

（実施例２）実施例１で得られた細胞増殖促進作用の高い抽出物は、
その用途を考慮するとき、ウィルスの不活化について充
分な配慮が必要である。

例えば、肝炎ウイルスを不活化するには60℃、10時間の
加熱処理が有効とされている。

そこで、実施例１で得られた液体を凍結乾燥したものに
ついて、水又は食塩水に溶解させた後、60℃、10時間の
加熱処理を行ってみたところ、ウィルス不活化には有効
であったが、それは同時に細胞増殖促進能も100％失活
させてしまうことがわかった。

本発明者らは、本物質の有する細胞増殖作用が接続し、
なお且つ肝炎ウィルスのみ不活化するための手段とし
て、長時間高温下での処理に耐えられる安定化法につい
て次に検討した。

その手段として、例えばグルコース、マンノース等の単
糖類、ショ糖、マルトース等の二糖類等を添加し加熱処
理を行い検討を加えたが、この操作でも同様に失活して
しまうことがわかった。

それは、溶解した状態で60℃の加熱処理を行うと、この
処理によって目的物質（蛋白質）の高次構造に不可逆的
な変性をきたし、これによって失活したものと推定さ
れ、これに対応する手段として、高濃度塩類溶液中等で
予め蛋白の構造を変化させ、沈澱させた状態で加熱する
ことによって、蛋白の不可逆的な変性を最小限に抑制す
ることが可能ではないかとの発想のもとに、実施例３で
示すごとくの加熱処理方法を行ってみたところ、偶然に
も非常に良い結果を得ることができた。

（実施例３）実施例１で得られた液体を凍結乾燥し、これを再度、飽
和濃度に対し60％に調整した硫酸アルモニウム溶液に懸
濁したもの、又はその沈澱物を、60℃、10時間の加熱処
理を施した。

この方法によれば、肝炎ウィルスの不活化がなされると
共に、細胞に対する増殖促進作用が80〜90％残存するこ
とがわかった。

第２図は、実施例３による処理後の目的物質の細胞増殖
作用を測定した結果を示す。

尚、実施例２〜３は、血清及び各種臓器由来の蛋白質製
剤における、公知な肝炎ウィルスの不活化法をもとに、
60℃、10時間を前提に行ったときのものであるが、この
温度と時間の関係については特に拘るものではなく、温
度をさらに高くすることにより、処理時間を短縮するこ
とは可能である。

（実施例４）実施例１又は３で得られた蛋白質は、細胞に対して、直
接、代謝活性化作用を有する抽出物であり、そのまま、
従来の脾臓抽出エキスと同様に利用することができる
が、本発明者らは、有効成分を更に追求するため、次の
ような分画を試みた。

まず、実施例１又は３で得られた沈澱物についてゲル濾
過を試み、経時的に流出する各フラクションの成分につ
いて検討してみた。

ゲル濾過に用いられる担体としては、セファデックス、
アガロース、セファクリル等があげられるが、ここで
は、セファクリルを用い行うことにした。

樹脂：セファクリルS-200スーパーファインカラムサイズ:26×956mm 溶媒:0.01M-0.05Nトリス塩酸バッファー（pH8.0）流速:3.3mL/cm²/hr 上記の条件によって得られた各フラクションから活性フ
ラクションを分画し、次にこれをさらにイオンクロマト
によって分画・精製した。

イオン交換に用いられる担体としては、セファデック
ス、セファロース、セファクリル等の陽、陰イオン交換
体があげられるが、ここではDEAE-セファロースCL-6Bを
用いた。

樹脂:DEAE-セファロースCL-6B 溶媒:0.01M-0.05Nトリス塩酸バッファー（pH8.0）溶出:NaCl濃度０→0.3M 第３図は、そのO.D.280における溶出曲線である。同様
にして活性フラクションを分画し、再度、セファクリル
S-200スーパーファインでゲル濾過を行って、O.D.280に
おける流出曲線よりその活性物質の分子量を推定した。

分子量の推定は、予め、マーカーとしてブルーデキスト
ラン、牛血清アルブミン（MW67,000）、α−キモトリプ
シノーゲンＡ（MW25,000）のセファクリスS-200スーパ
ーファインのゲル濾過を行い、O.D.280における流出曲
線を求め（第４図）、マーカーの分子量とKav値から標
準曲線（第５図）を作成しておき、これを利用した。

〔３〕発明の効果本発明は、牛の脾臓から得られた新規な水溶性の蛋白質
にある。そして、この蛋白質は直接細胞に働きかけ、細
胞の増殖を促進させる。

従来の公知な抽出エキス、又は抽出物質は、その行程中
で、有機溶媒、強酸、強アルカリ、蛋白分解酵素などの
薬剤が用いられてきたが、その結果、これらの薬剤によ
って脾臓中に含まれている細胞増殖促進物質が失活して
いた。

本発明においては、その原因を追求すべく検討から、抽
出の際に用いられる薬剤や、これまで行われてきた加熱
処理法によって、有効物質が失活してしまうことを見い
出すとともに、これらの薬剤を用いない抽出法、改良さ
れた加熱処理法、信頼性の高い新規な評価法の確立によ
って、牛脾臓由来の新規で優れた細胞増殖促進物質を提
供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モルモット（ハートレー系、雌）から採取し
た繊維芽細胞を、牛胎児血清（FBS）を添加したイーグ
ルMEM培地中で培養した時の細胞数の変化を示したも
の。第２図は、本発明による牛脾臓由来の水溶性蛋白質の、
細胞増殖促進作用を示したもの。尚、図中イは、添加量
１μg/mLにおける細胞増殖作用、ロは添加量0.1μg/mL
における細胞増殖作用、ハは対照群（生理食塩水添加
群）の細胞増殖作用を示す。第３図は、DEAE-セファロースCL-6Bを用いたイオンクロ
マトによる流出曲線。第４図は、本発明による細胞増殖促進物質の分子量推定
に当り、マーカーとして使用した下記物質の、セファク
リルS-200スーパーファインを用いたゲル濾過によるO.
D.280における溶出曲線を示す。 A:ブルーデキストラン B:牛血清アルブミン（MW67,000） C:α−キモトリプシノーゲンＡ（MW25,000）第５図は、第４図から、マーカー物質の分子量とKav値
によって作成した標準曲線を示す。第６図は、本発明による牛脾臓由来の細胞増殖促進物質
をセファクリルS-200スーパーファインを用いてゲル濾
過した。O.D.280における流出曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 1/30 // Ａ６１Ｋ 35/28 ＡＤＴ 7431−4Ｃ 38/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 9282−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】牛の脾臓から抽出された、推定分子量41,0
00付近、等電点6.0〜6.5付近の水溶性蛋白質からなる細
胞増殖促進物質。