KR0143860B1

KR0143860B1 - 상어연골로부터 암의 성장을 억제하는 물질 및 분리 방법

Info

Publication number: KR0143860B1
Application number: KR1019940023477A
Authority: KR
Inventors: 김민영; 김성규; 강성종
Original assignee: 김정재; 주식회사한일합섬
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 1998-07-15
Also published as: KR960010011A

Abstract

본 발명은 건조 상어연골 분말로부터 가용성 물질을 추출하고, 추출용매를 제거하여 조 추출액을 얻어, 혈관형성억제작용을 계란의 융모요막에세이로 확인하고, 이 조 추출물을 음이온 교환칼럼을 이용하여 세가지 분획으로 분리한 후 혈관 내피세포의 증식을 억제함을 확인한 후 조 추출액과 한가지의 분획이 고형암의 성장을 억제하는 것을 증명하여, 상어연골로 부터 혈관형성억제작용 및 면역 증강 작용이 있는 물질의 제조방법이다.

Description

상어연골로부터 암의 성장을 억제하는 물질 및 분리 방법

제1도는 FPLC Mono-Q 칼럼으로 상어연골 추출물을 분리한 도표이다.

제2도는 상어연골 추출물을 셀루로즈아세테이트로 전기영동시킨 것을 나타낸 사진이다.

제3도는 상어연골 추출물을 계란의 융모요막(CAM)에세이에 의해 혈관형성억제 작용을 나타낸 사진이다.

제4도는 상어연골 추출물이 고형암의 성장에 미치는 효과를 나타낸 도표이다.

제5도는 상어연골 추출물이 혈관내피세포 증식에 미치는 영향을 나타낸 도표이다.

본 발명은 상어연골 분발로부터 추출한 것으로, 단백질과 뮤코폴리사카라이드인 글라이코아미노글리칸으로 구성되어 있으며, 혈관내피세포의 증식을 억제함으로써 혈관형성을 억제하여 암의 성장을 억제하는 물질 및 그들의 분리 방법 및 사용에 관한 것이다.

암세포는 혈관을 끌어 새로 형성하는 능력이 없거나, 혈관으로 출입을 할 수 없으면 대부분의 암은 직경이 1-2mm이상을 넘게 자라지 못하고, 원발성 위치에 국소화된 채로 남아있게 된다. 따라서 암의 혈관형성은 암의 성장과 전이에 절대적으로 필요하다. 1970년대 Folkman은 혈관형성을 억제하면 암의 성장과 전이를 억제할 수 있다고 제시했다(Folkman Tyler, Cancer Invasion and Metastasis (S.B.Day ed.). Raven Press, N.Y. 1977. pp94-103).

그런 이유로 혈관형성을 일으키는 인자와 혈관형성을 억제하는 물질에 대한 많은 연구와 노력을 하여 왔고 혈관 형성을 억제한다고 알려진 물질이 몇 가지 밝혀졌다. 그 중에는 천연으로 존재하는 물질, 예를 들면 인터페론 알파, TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase), 세포밖의 매트릭스 단백질인 GP140과 라미닌 펩타이드, 혈소판인자 4들이 있으며, 기존의 약물중에서도 몇 가지가 혈관형성을 억제하는 효과가 있다고 보고되고 있다.

연골은 유일하게 혈관이 분포되어 있지 않은 조직으로서, 연골에는 혈관형성을 억제하는 성분이 함유되어 있다고 생각되어왔다. 이 연골로부터 Cartilage-derieved inhibitor (CDI)라고 불리는 단백질이 정제되어 in vitro에서 혈관 내피세포의 증식과 이동을 억제하고, 계란의 융모요막을 이용하는 CAM(chorio allantoic membrane)에세이에서 혈관형성을 억제하는 것을 보여 주었다. (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4331, 1980 ; Moses et al. Science 248, 1408-1411, 1990).

따라서 연골을 이용하여 암의 성장을 억제시키는 물질을 추출하는 연구가 진행되어 소의 견갑골의 연골세포를 배양하여 혈관형성 억제물질을 추출하거나 (Moses et al. J. Cell. Biol. 119, 475-82(1992)), 소연골의 추출물을 이용하여 약제화 하려는 노력이 있어왔다.

그러나 연골세포 배양은 유효물질의 함량이 상당히 낮았고, 소연골 500g에서 약 1mg의 암억제 추출물을 얻을 수 있는 반면, 상어 연골은 같은 양의 억제물을 단 0.5g의 상어 연골에서 얻어질 수 있다고 보고되고 있으며 (Lee Langer, Science 221, 1185-1187, (1983)) 아직까지 이 억제물질의 구조는 밝혀지지 않고 있다.

대부분의 동물은 골격이 석회질로 이루어진 뼈와 연골로 되어 있는데 비해 상어의 골격을 특이하게 모두 연골로 되어 있으며, 이 연골은 약간 석회화 되어 있다. 상어는 식품이므로 독성이 전혀 없어, 이런 상어의 연골을 순수 분말로 만들어 말기 암환자에게 사용하여 효과가 입증되고 있다.

따라서 본 발명은 현재 식품으로 사용되고 있는 상어연골을 약제화 시키기 위하여 상어연골이 함유하고 있는 혈관형성 억제 작용이 있는 성분을 추출하고 음이온 교환수지를 이용하여 분리하여 고형암에 대한 향종양효과를 확인하고 혈관 내피세포의 증식을 억제함을 확인하여 그 물질등을 여러 가지 질병에 사용하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

암성장 억제물질을 100% 순수 건조 상어연골분말로부터 다음과 같은 시약을 처리하여 가용성 물질을 추출하였다. 1-6M 농도의 구아니딘크로라이드 또는 요소 또는 이 두가지의 혼합물을 20mM의 완충용액 MES나 Tris(pH 6-8)에 녹인 용액을 건조상어연골 분말에 가하고 실온에서 2일 내지 5일동안 진탕하면서 가용성 물질을 추출하였다.

추출에 사용된 시약을 제거하기 위하여 젤 여과 칼럼, 예를들면 세파덱스 G-10칼럼을 이용하던가, 투석막으로 투석한 후 제조된 것을 상어연골의 조추출액이라 명명하고, 이 조추출액으로부터 음이온교환칼럼 즉, FPLC의 모노-Q 칼럼 또는 DEAE-Sepharose 칼럼(디이에칠아미노에칠-세파로스 칼럼)등을 이용하여 NACl염으로 추출하여 세가지 분획으로 나누었다.

이렇게하여 얻은 조 추출액과 Q1,Q2 및 Q3 분획이 함유하고 있는 성분을 알아보기 위해 단백질과 탄수화물을 분석하였다. 단백질은 브래드포드(Bradford)방법으로 단백질이 존재함을 확인하고 정량하였다.

조 추출액과 Q1,Q2 및 Q3 분획에 탄수화물 존재할 경우 단백질과 결합되어 있는 프로테오글리칸의 형태로 있을 가능성이 높기 때문에, 프로테오글리칸에 있는 폴리사카라이드 체인인 글라이코아미노글리칸의 존재를 확인하기 위하여, 우선 조 추출액을 셀루로즈아세테이트 멤브레인 상에서 전기영동하였다. 그결과 조 추출액에 글라이코아미노글리칸이 존재함을 확인하였다.

이 글라이코 아미노글리칸의 종류중에서도 황산 콘드로이틴(chondroitin sulfate), 히알우론산(hyaluronic acid)과 같은 우론산(uronic acid)을 가지고 있는 뮤코폴리사카라이드의 존재를 확인하기 위해서, Bitter Muir 방법에 따라 카르바졸에세이(carbazole assay)를 한 결과 우론산(uronic acid)을 포함하는 뮤코폴리사카라이드의 존재를 확인 정량하였다.

따라서 상어연골 조 추출액과 Q1, Q2 및 Q3 분획이 포함하고 있는 단백질과 글루쿠론산의 함량비는 Q3 분획이 단백질에 비해 글루쿠론산의 함량이 월등히 높았으며, 그에 비해 Q1 및 Q2 분획은 글루쿠론산의 함량이 상대적으로 상당히 낮았으며, Q1 분획은 글루쿠론산이 거의 없을 정도 였다.

본 발명자들은 상어연골 조 추출액이 혈관형성억제 작용이 있는가를 확인하기 위하여, 닭의 수정란을 이용하여 혈관형성에 대한 효과를 알 수 있는 융모요막(CAM: Chorio allantoic Membrane)에세이를 하였다. 즉 조 추출액중 단백질을 1μg이 함유되도록 하고, 무균상태로 하여 Thermanox 디스크(Mile Scientific사)에 떨어뜨려 말린후 수정된지 이틀지난 계란의 융모요막위에 올려놓고 37℃ 배양기에 3-4일 지난후 혈관형성이 억제됨을 확인하였다.

따라서 상어연골 조 추출액을 혈관형성 억제물질을 함유하고 있으므로, 혈관 형성을 억제함으로써 암의 성장을 막을 수 있는가를 실험하기 위하여, 이 조 추출액과 세가지의 분획중 글루쿠론산의 함량이 가장 많은 Q3 분획을 가지고 쥐의 sarcoma 180 고혈암에 대한 항종양 효과를 실험하였다.

ICR 쥐를 대상으로 sarcoma 180을 주입한 후, 조 추출액은 암세포 주입후 13일째 되는날부터 조단백질양으로 0.07mg씩 이틀간격으로 6회 주사하여 쥐 한 마리당 총 0.42mg을 복강주사하였고, Q3 분획은 암세포 주입후 11일째 되는 날부터 0.2mg(조단백질양으로)씩 이틀간격으로 4회 주사하여 쥐 한 마리당 총 0.8mg을 복강주사하였다.

종양의 성장은 암세포 주입후 19일째부터 2-3일 간격으로 종양적출전까지 밖에서 크기를 재며, 평균 종양의 부피를 추측하였고, 암세포 주입후 27일이 지난후 종양을 적출하여 종양의 평균무게를 계산하였다.

그결과 인산생리식염수만을 주사한 대조군에 비해 상어연골 조 추출액과 Q3 분획의 종양즉식 저지율은 조 추출액으로 처리한 군은 62%, 3로 처리한 군은 83% 였으며, 종양발생율도 Q3의 경우, 대조군의 88%에 비해 60%밖에 되지 않았다.

본 발명자들은 상어연골조 추출액 및 Q3 분획이 보여준 sarcoma 180 고형암에 대한 항종양 효과가 혈관형성을 억제하여 나타난 결과 외에도 암세포에 대한 직접적 독성에 의한 것인가를 알아보기 위해, sarcoma 180 세포를 배양하여, 이 배양액에 상어연골 조 추출액과 Q를 처리한 결과, 이것들은 암세포에 직접적인 영향을 주지 않았다.

고형암에 대한 항종양 효과가 혈관형성억제에 의한 것임을 확인하였으므로, 혈관형성억제 작용이 혈관내피세포에 직접적인 영향에 의한 것인가를 알아보았다. 세 개의 분획 Q1, Q2 및 Q3를 가지고 혈관내피세포의 증식에 미치는 영향을 실험한 결과 1-4μg의 단백질을 함유하는 농도에서, 이 세 개의 분획은 혈관내피세포의 증식을 억제하였다. 따라서 상어연골의 조 추출액과 Q3 뿐 아니라, Q1과 Q2 분획도 혈관내피세포의 증식을 억제하는 작용이 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 상어연골에서 추출하여 분리한 세 개의 분획 Q1, Q2 및 Q3가 함유하고 있는 단백질의 아미노산 조성을 밝히기 위해 아미노산 조성을 분석하여 실시예8에 나타난 바와 같은 결과를 얻었다. 그중 Q1 분획은 글라이신과 프로린의 함량으로 미루어 콜라겐을 함유하고 있을 가능성이 높다.

상어연골 분획이 함유하고있는 콜라겐과 글라이코아미노글리칸은 암세포전이에 관계되는 단백분해효소의 기질이 될 수 있으며, 특히 글라이코아미노글리칸은 암세포가 기저막이나 기질에 부착하는 것을 억제하여 전이억제 작용을 가지고 있다.

또한 상어연골의 조 추출액 및 각 분획 Q1, Q2 및 Q3의 혈관형성억제 작용이 아　는 단백질과 글라이코아미노글리칸의 뮤코폴리사카라이드가 통합되어 면역체계를 증감시키는 작용이 더하여져 다음과 같은 질병에 사용될 수 있다. 상어연골의 조 추출액 및 각 분획은 혈관형성억제 작용이 있으므로, 특히 혈관형성이 많이 되는 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 중추신경계암, 췌장암에 더욱 효과가 있으리라 기대되며, 이들 추출물의 용도는 항암제, 전이억제제 및 그밖의 과다한 혈관 형성으로 인한 질병, 즉 류마치스성 관절염, 골성 관절염, 당뇨병성 망막증, 건선, 혈관증, 세정맥의 변형, 동맥경화성 반점, 각막이식에 의한 혈관형성, 과립성 화상, 혈우병성 관절, 카포시 육종, 녹내장의 신생혈관형성에 사용할 수 있으며, 황반의 퇴행변성, 장염 및

망막염증에도 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하겠다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

[실시예1] 상어연골로부터 암성장 억제물질의 추출

상어 연골은 100% 순수 건조 상어연골파우더(cartilade, cartilage Technologies, Inc. U.S.A)를 사용하여 다음과 같이 처리하여 가용성 물질을 추출하였다.

추출시약으로는 1-6M 농도의 구아니딘 클로라이드 또는 요소 또는 두가지의 복합물을 20mM MES나 Tris(pH 6.0-8.0)에 녹인 용액 50ml를 10g의 건조 상어연골파우더에 가하고 실온에서 2-5일 동안 진탕하면서 추출하였다. 이 액을 10,000 x g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후 20mM tris(pH 8.0)로 평형화된 세파덱스 G-10 칼럼 (2.6 x 30cm)에 주입하던가, 투석막(Spectra Por 분자량 Cut off 6,000-8,000)에 넣고 4 에서 20mM Tris(pH 8.0)용액으로 투석시켜 구아니딘 클로라이드나 요소를 제거한다.

이 용액을 상어연골의 조 추출액이라 명명하고, 이 조 추출액을 20mM Tris(pH 8.0)으로 평형화된 음이온 교환수지, 예를들면 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography, Pharmacia사)의 모노-Q칼럼이나 DEAE-sepharose 칼럼에 주입하고 평형 완충용액으로 세척한다음 0.15M NaCl, 0.5M NaCl 그리고 2M NaCl을 함유하는 평형 완충용액으로 음이온 교환칼럼에 결합한 물질들을 차례로 용출하여 세가지의 분획을 얻었다. (제1도)

각각의 분획은 증류수로 평형화된 세파덱스 G-10(2.6 X 30cm)에 주입하여 용출하거나, 투석막을 이용하여 증류수에 투석하여 NaCl을 제거하여, 각각의 분획을 Q1,Q2 및 Q3라고 하였다. 이들 각 분획을 동결건조 시켜 보관하였다.

[실시예2] 상어연골조추출액 중 글라이코아미노글리칸 성분의 확인

상어연골 조 추출액에 단백질과 탄수화물이 결합되어 있는 프로테오글리칸이 존재하는가를 확인하기 위해, 프로테오글리칸에 있는 폴리사카라이드체인인 글라이코아미노글리칸 성분을 분석하였다. 상어연골 조 추출액에 셀루로즈 아세테이트 멘브레인 상에서 Sartorius사의 키트로 전기영동하였다. 이때 완충용액은 0.1M 피리딘-0.5M 포름산(pH 3.0)을 사용하였으며, 멤브레인 넓이 1cm당 0.5mA의 일정한 전류가 흐르도록 하여 1시간 동안 전기 영동한 후, 멤브레인을 0.5%(W/V) 톨루이딘 블루(toluidine blue)를 15%(V/V)에탄올에 녹인 용액으로 염색하고 물과 메탄올로 탈색한 결과 제2도에서 보는바와 같이 글라이코아미노글리칸이 존재함을 확인하였다.

[실시예3] 각 분획의 단백질 및 탄수화물의 정량

상어 연골의 조추출액 및 각각의 분획이 함유하고있는 단백질은 브래드포드(Bradford)방법(Bradford, Anal.Biochem. 72, 248-254(1978)으로 확인하고 정량하였고 소의 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하였다. 상어연골이 함유하고 있는 글라이코아미노글리칸 종류 중에서 콘드로이틴 설페이트, 히알우론산과 같은 우론산의 존재를 확인하고 정량하기 위해서 비터뮈르(Bitter Muir)방법(Anal. Biochem. 4, 330-334(1962))에 따라 카르바졸 에세이(Carbazole assay)를 하였다.

즉 샘플 또는 표준품(D-클루쿠론산 락톤)250μl를 시약 보레이트 술프르산 1.5ml에 조심스롭게 가한 후 10분간 방치한 후 가볍게 섞은 다음, 끓는 물에서 10분간 가열한 후 냉각시키고 차가운 카르바졸(Carbazole)용액(125mg을 100ml 무수 ㅓ에탄올에 녹인 것)50μl를 가한 후 섞는다.

끓는 물에 15분간 가열한 후 식혔다가 525nm에서 흡광도를 재어 표준품의 흡광도와 비교하여 정량하였다. 상어 연골의 조 추출액(모노-Q칼럼전의액) 및 각 분획의 단백질 및 글루쿠론산의 양은 표1과 같다.

조 추출액과 Q1, Q2 및 Q3 분획이 포함하고 있는 단백질과 글루쿠론산의 함량의 비는 Q3 분획이 단백질에 비해 글루쿠론산의 함량이 월등히 높았으며, 그에비해 Q1 및 Q2 분획은 글루쿠론산의 함량이 상대적으로 상당히 낮았고, Q1분획은 글루쿠론산이 거의 없을정도였다.

[실시예4] 수정란의 융모요막(CAM)에세이

상어연골 조 추출액의 혈관형성억제 작용을 in vivo 로 확인하기 위해 CAM 에세이를 시행하였다. 닭의 수정란을 37℃ 배양기에서 이틀간 키운후 알부민을 18게이지 바늘의 주사기로 뽑아내어 융모 요막이 아래로 내려 앉도록 한다. 3일째 겉 껍질의 일부분을 떼어낸후, 조 추출액중 1μg의 단백질을 물에 녹여, 여과기로 여과하여 무균상태로 한 것을 Thermanox 디스크(Miles scientifi사)에 떨어 뜨려 말린 후 수정란의 융모요막위에 올려 놓고 수분증발을 막기위해 테이프로 막아놓는다. 3-4일이 지난후 테이프를 떼어내고 디스크를 올려놓은 부분과 다른 부분의 융모 요막의 혈관형성을 비교한다.

대조군으로는 증류수를 떨어뜨린 디스크를 융모요막에 올려놓는다. 상어연골 주추출액은 수정란의 융모요막에세이 결과 혈관형성 억제 작용이 있음을 확인하였다(제3도)

[실시예5] Sarcoma 180 고형암에 대한 효과

4주 된 ICR 쥐를 서울대학교 실험동물 사육장에서 공급받아 사용하였으며 몸무게가 20-25g 정도의 수컷을 실험대상으로 하였다. 생쥐의 사르코마(Sarcoma) 180은 서울대 약대로부터 분양받아 ICR쥐의 복강내에서 7일 간격으로 계대 배양한 것을 복수로부터 취하여 생리식염수로 세척한 후 1 x 10⁶cells/ml가 되도록 희석시킨 후 쥐 한 마리당 사르코마(Sarcoma)180세포 0.1ml씩(1 x 10⁶cells)를 우측 서혜부의 피하에 주입하였다.

암세포를 주입하고 13일째 되는날부터 상어연골 조추출액을 조단백질양으로서 쥐 한 마리당 0.07mg씩 이틀간격으로 6회 주사하여 총 0.42mg을 복강 주사 하였다. 상어연골 분획(Q3)은 암세포 주입후 11일째 되는 날부터 0.2mg(조단백질양으로)씩 이틀 간격으로 4회 주사하여 쥐 하마리당 총 0.8mg을 복강 주사 하였다.

대조군에는 인산 생리 식염수를 시료 투여군과 같은 간격으로 투여하였다. 조추출액과 분획 Q1, Q2 및 Q3는 모두 인산 생리 식염수에 용해 시켰으며 투여전 0.8μmdml 여과막으로 여과하여 사용하였다.

제4도는 종양의 크기를 암세포 주입 후 19일째부터 2-3일 간격으로 종양의 적출전까지 밖에서 재어 대조군과 시료 투여군의 평균을 낸 것이다. 평균종양의 부피는 다음과 같이 계산하였다.

a x b²x 0.4

여기서 a는 종양크기에서 가장 긴 직경, b는 가장 짧은 직경을 나타낸다. 암세포 주입 후 27일째에 종양을 적출하여 대조군과 시료군의 종양 무게의 평균값을 구하였다. 이때 종양이 생기지 않은 것은 계산에 넣지 않았으며 종양이 생긴 것 만의 무게를 재어 평균을 내었다. 시료군과 대조군을 배교하여 종양 증식 저지율(Inhibition ratio : I.R.)을 아래의 식으로 구하였다.

I.R. (%) = (1-T/C) x 100

T는 시료투여군의 평균종양 무게를, C는 대조군의 평균 종양 무게를 나타낸다. 표2는 상어연골의 사르코아 180 고형암에 대한 효과를 보여준다.

표2에서와 같이 상어연골 조추출액으로 처리한 군은 대조군에 비해 62%의 종양 증식 저지율을 보였다. Q3로 처리한 군은 83%의 종양 증식 저지율을 보였으며 종양 발생율도 대조군에 비해 60%밖에 되지 않았다. 따라서 상어연골 추출액은 사르코바 180 고형암에 탁월한 효과를 나타냈다.

[실시예6] 암세포에 대한 직접적인 세포독성실험

사르코마 180 세포를 1 x 10⁵cell/ml로 조정한 다음 96웰 마이크로플레이트(Falcn. USA)에 웰(well)당 100μl씩 넣고 상어연골 조 추출액과 분획(Q3)을 희석하여 웰당 1μgd을 가하여 최종부피가 200μl가 되도록 하고 37 , 5% co2 배양기에서 48시간 배양하였다.

MTT(3-(4,5-데메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라 졸리움브로마이드) 시약 5mg/ml을 넣은 PBS를 20μl씩 가하여 4시간 동안 배양한 후, 상층액 100μl를 제거하고 0.04N HC1-isopropanol 100μl를 첨가하여 하룻밤 방치 시킨 후 560nm에서 자동 ELISA 판독기(Molecular Devices Corp. USA)로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 조사한 결과 상어연골 추출액 및 분획(Q3)은 사르코마 180에 대한 직접적인 독성이 없었다.

[실시예7] 혈관내피 세포 증식에 미치는 영향

KCTC에서 구입한 소의 폐동맥 내피세포(CAPE : Calf pulmonary Aortal endothelial cell )를 96웰 배양 플레이트에 웰당 5 x 10³/ MEM, 10% F B S 미디아 150μl씩 넣은후 24시간 배양하고 배지를 제거한 후 HBSS로 세척한다. 여기에 배지 100μl와 같은 배지에 희석한 각각의 분획 Q1,Q2 및 Q3를 100μl씩 웰에 넣고 48시간동안 배양하였다.

배지 제거 후 HBSS 200ml로 한번 세척하고 내피세포의 Acid phosphatase활성을 측정하기 위해 0.1M 소디움아세테이트(pH5.5), 0.1% 트리톤 X-100 및 10mM 파라나이트로페닐 포스페이트가 함유된 용액 100μl를 가하고 배양기에서 37 에서 1시간 30분동안 배양하였다.

대조군에는 콘드로이틴설페이트를 넣었다. 배양후 ELISA 판독기로 각각의 분획 Q1,Q2 및 Q3는 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과 제3도에서 보는 바와 같이 소의 폐동맥 내피세포의 증식을 현저히 억제하였다. 따라서 상어연골의 분획 Q3의 고형 암성장억제 효과는 암에 대한 직접적인 독성이 아니라 혈관 내피세포의 성장을 억제함으로써 혈관형성이 억제되어 암성장이 억제되었다고 볼 수 있다.

[실시예8] 각 분획 단백질의 아미노산 조성 분석

FPLC의 모노 Q칼럼 크로마토그래피로 분리한 세 개의 분획 Q1,Q2 및 Q3가 함유하고 있는 단백질의 아미노산 조성을 확인하기 위하여 다음과 같은 처리를 하였다. 세 개의 시료 각각 10μl를 취하여 6N HCl를 가하고 115 에서 24시간 동안 가수분해 시키고 PITC로 유도체를 만든 후 0.22μm로 여과 시킨 후 HPLC(millipore사)의 pico Tag(TM)칼럼을 사용하여 분리하였다. 이때 완충용액 A는 1.4mN NaHAc/0.1%, TFA/6% CH₃CN(pH 5.9)를 사용하였으며, B는 60% CH₃CN을 사용하여 0-100%까지의 리니어 그라디언트를 용출하였다. 각각의 피크는 표준품과 비교하여 확인하였다. 각 분획의 아미노산 조성 분석 결과는 다음과 같다(표 3,4,5). 이중 Q1 분획이 함유하고 있는 단백질의 종류는 글라이신과 프로린의 함량으로 미루어보아 콜라겐임을 알수 있었다.

Claims

건조 상어연골 분말을 구아니딘 클로라이드, 요소 또는 이들의 혼합물이 용해된 MES나 Tris 완충용액을 추출용매로 하여, 진탕 추출하고 추출용매를 제거하여 조추출물을 얻고, 조추출물을 음이온 교환수지를 이용하여 0.51M 염화나트륨을 함유하는 평형환충액으로 용출시킨 후 염화나트륨을 제거한 분획(Q1), 0.5M 염화나트륨을 함유하는 평형완충액으로 용출시킨 후 염화나트륨을 제거한 분획(Q2), 2M 염화나트륨을 함유하는 평형완충액으로 용출시킨 후 염화나트륨을 제거한 분획(Q3)을 수득함을 특징으로하는 상어연골에서 암성장 억제물질의 추출 방법.
제3항에 있어서, 음이온 교환수지로는 FPLC의 모노-Q 칼럼이나 DEAE-세파로오스 칼럼을 이용함을 특징으로 하는 상어연골에서 암성장 억제물질의 추출방법.