JP2003513638A - プラスミノーゲン活性化因子の逆相ｈｐｌｃアッセイ - Google Patents
プラスミノーゲン活性化因子の逆相ｈｐｌｃアッセイInfo
- Publication number
- JP2003513638A JP2003513638A JP2001535595A JP2001535595A JP2003513638A JP 2003513638 A JP2003513638 A JP 2003513638A JP 2001535595 A JP2001535595 A JP 2001535595A JP 2001535595 A JP2001535595 A JP 2001535595A JP 2003513638 A JP2003513638 A JP 2003513638A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tpa
- cho
- human
- buffer
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims abstract description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 108010051181 TNK-tissue plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 25
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 16
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 13
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 13
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 15
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 13
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940099983 activase Drugs 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010084094 alanyl-alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- -1 flow rate Substances 0.000 description 2
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M (E,E)-sorbate Chemical compound C\C=C\C=C\C([O-])=O WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000005020 Acaciella glauca Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000288900 Desmodus rotundus Species 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 238000005740 Freeman reaction Methods 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100038297 Kallikrein-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710176219 Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101150050957 TNKS gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N phosphoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(=N)NP(O)(O)=O CCTIOCVIZPCTGO-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000003499 redwood Nutrition 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)([O-])=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC ALPWRKFXEOAUDR-GKEJWYBXSA-M 0.000 description 1
- 229940075554 sorbate Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Abstract
(57)【要約】
本方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の内在性のプラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）を、ヒトｔＰＡ又はその変異体を含むサンプルから取り出す精製法の有効性のモニタリングを示す。この方法は、サンプルをヒト野生型ｔＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を特異的に切断する能力のあるプロテアーゼと、次にそれぞれヒト野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元する効果のある量の変性／還元剤とインキュベートし；サンプルを逆相高速液体クロマトグラフィー工程にかけ、そこに存在するＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量についてクロマトグラフィー工程による溶出像を分析することを含む。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で生成される天然配列
又はその変異体として組み換えヒトｔＰＡのサンプル内に存在する、ＣＨＯ産生
ｔＰＡの量を測定するためのアッセイに関する。
又はその変異体として組み換えヒトｔＰＡのサンプル内に存在する、ＣＨＯ産生
ｔＰＡの量を測定するためのアッセイに関する。
【０００２】
（関連分野の説明）
組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、凝血の溶解を引き起こす作
用のカスケードに関連する内在性セリンプロテアーゼである（Astrup及びPermin
, Nature, 159, 681-682(1947); Camiolo等, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138
, 277-280(1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86(1987); Hoylaerts等, J
. Biol. Chem., 257, 2912-2919(1982)）。ＡＣＴＩＶＡＳＥσは、急性心筋梗
塞及び肺塞栓の管理に使用される、ヒトｔＰＡ（ｒ−ｔＰＡ）の組み換え型であ
る（Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378(1987)）。ＡＣＴＩＶＡＳＥσはまた
、現在虚血性脳卒中の治療にも認められている（Smith等, Acad. Emerqency Med
icine, 6(6), 618-25(1999); Kwiatknowski等, New Eng. J. Med., 340(23), 17
81-1787(1999)）。それは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の天然
ヒトｔＰＡに対する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現により生成される糖タンパク
である。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ＣＨＯ細胞でクローン化し、発現するヒトｔＰＡの
遺伝子操作変異体である（Keyt等, Proc. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-367
4(1994)）。ＴＮＫ−ｔＲＡ変異体を作成するために、部位特異的突然変異がヒ
トｔＰＡの３つの特定部位に導入される。それらは、Ｔｈｒ１０３をＡｓｎに（
Ｔ１０３Ｎ）、Ａｓｎ１１７をＧｌｎに（Ｎ１１７Ｑ）、及びＬｙｓ-Ｈｉｓ-Ａ
ｒｇ-Ａｒｇ２９６−２９９をＡｌａ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ａｌａに（ＫＨＲＲ２６９
−２９９ＡＡＡＡ）する。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ｔＰＡと比較して、同様のインビ
トロの生物活性、プラスミノーゲン活性因子阻害剤に対する増大した耐性及び増
加した線維素特異性があり、血漿からよりゆっくりと放出される（Keyt等, Proc
. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674(1994); Thomas等, Stroke, 25:10, 20
72-2079(1994); Benedict等, Circulation, 92:10, 3032-3040(1995); Modi等,
Thromb Haemost, 79, 134-139(1998)）。それは、現在ｒ−ｔＰＡのシングルボ
ーラス投与形態としての規制当局の許可待ちの状態である。ＣＨＯ細胞はＣＨＯ
−ＰＡと呼ばれる内在性ハムスターｔＰＡを生合成する。ＣＨＯ−ＰＡは、凝血
溶解アッセイによって決定されるようにヒトｔＰＡと同様の線維素溶解活性を有
する。ＣＨＯ−ＰＡのアミノ酸配列は、ヒトｔＰＡのものと８０％の同一性があ
る。多くの置換は、半保存的、例えば：Ａｒｇ＜−−＞Ｌｙｓ、Ｇｌｕ＜−−＞
Ａｓｐ、Ｐｈｅ＜−−＞Ｔｙｒ、Ｖａｌ＜−−＞Ａｌａ、Ｉｌｅ＜−−＞Ｌｅｕ
又はＴｈｒ＜−−＞Ｓｅｒである。ウシキモトリプシン構造に基づくヒトｔＰＡ
プロテアーゼドメインのモデルを用いることにより、実質的に全てのＣＨＯ−Ｐ
Ａの置換がタンパク質の表面に又はその近くにあることが分かる。
用のカスケードに関連する内在性セリンプロテアーゼである（Astrup及びPermin
, Nature, 159, 681-682(1947); Camiolo等, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138
, 277-280(1971); Collen, J. Biol. Chem., 33, 77-86(1987); Hoylaerts等, J
. Biol. Chem., 257, 2912-2919(1982)）。ＡＣＴＩＶＡＳＥσは、急性心筋梗
塞及び肺塞栓の管理に使用される、ヒトｔＰＡ（ｒ−ｔＰＡ）の組み換え型であ
る（Grossbard, Pharm. Res., 4, 375-378(1987)）。ＡＣＴＩＶＡＳＥσはまた
、現在虚血性脳卒中の治療にも認められている（Smith等, Acad. Emerqency Med
icine, 6(6), 618-25(1999); Kwiatknowski等, New Eng. J. Med., 340(23), 17
81-1787(1999)）。それは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の天然
ヒトｔＰＡに対する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の発現により生成される糖タンパク
である。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ＣＨＯ細胞でクローン化し、発現するヒトｔＰＡの
遺伝子操作変異体である（Keyt等, Proc. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-367
4(1994)）。ＴＮＫ−ｔＲＡ変異体を作成するために、部位特異的突然変異がヒ
トｔＰＡの３つの特定部位に導入される。それらは、Ｔｈｒ１０３をＡｓｎに（
Ｔ１０３Ｎ）、Ａｓｎ１１７をＧｌｎに（Ｎ１１７Ｑ）、及びＬｙｓ-Ｈｉｓ-Ａ
ｒｇ-Ａｒｇ２９６−２９９をＡｌａ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ａｌａに（ＫＨＲＲ２６９
−２９９ＡＡＡＡ）する。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ｔＰＡと比較して、同様のインビ
トロの生物活性、プラスミノーゲン活性因子阻害剤に対する増大した耐性及び増
加した線維素特異性があり、血漿からよりゆっくりと放出される（Keyt等, Proc
. Natl. Acad. Sci USA., 91, 3670-3674(1994); Thomas等, Stroke, 25:10, 20
72-2079(1994); Benedict等, Circulation, 92:10, 3032-3040(1995); Modi等,
Thromb Haemost, 79, 134-139(1998)）。それは、現在ｒ−ｔＰＡのシングルボ
ーラス投与形態としての規制当局の許可待ちの状態である。ＣＨＯ細胞はＣＨＯ
−ＰＡと呼ばれる内在性ハムスターｔＰＡを生合成する。ＣＨＯ−ＰＡは、凝血
溶解アッセイによって決定されるようにヒトｔＰＡと同様の線維素溶解活性を有
する。ＣＨＯ−ＰＡのアミノ酸配列は、ヒトｔＰＡのものと８０％の同一性があ
る。多くの置換は、半保存的、例えば：Ａｒｇ＜−−＞Ｌｙｓ、Ｇｌｕ＜−−＞
Ａｓｐ、Ｐｈｅ＜−−＞Ｔｙｒ、Ｖａｌ＜−−＞Ａｌａ、Ｉｌｅ＜−−＞Ｌｅｕ
又はＴｈｒ＜−−＞Ｓｅｒである。ウシキモトリプシン構造に基づくヒトｔＰＡ
プロテアーゼドメインのモデルを用いることにより、実質的に全てのＣＨＯ−Ｐ
Ａの置換がタンパク質の表面に又はその近くにあることが分かる。
【０００３】
ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡは全て、１７のジスルフィド
結合を有する５２７アミノ酸を含む一本鎖のポリペプチド鎖である（Nguyen及び
Carole,タンパク質及びペプチド薬の安定性及び特徴付けに関する「アルテプラ
ーゼ(Altepase)、組み換え組織プラスミノーゲン活性化因子の安定特性化及び処
方技術(Stability Characterization and Formulation Development of Altepas
e, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator)」, Y. J. Wang, R. Pearlma
n, 編, (プレナム出版：ニューヨーク, 1993), pp. 91-135）。３つのタンパク
質全てにおいて、Ａｒｇ２７５とＩｌｅ２７６の間のペプチド結合は、プロテア
ーゼ切断に特に影響されやすい。切断は２つの断片を生じる：１つはＮ末端２７
５アミノ酸からなり、もう１つはＣ末端２５２アミノ酸からなる。Ｎ末端鎖はプ
ラスミノーゲンとプロトロンビンに見られるクリングル領域と相同性のある領域
を含み、従って時にそれは「クリングル断片」と呼ばれる（Nguyen及びCarole,
上掲; de Vos等, Biochem., 31, 270-279(1992)）。
結合を有する５２７アミノ酸を含む一本鎖のポリペプチド鎖である（Nguyen及び
Carole,タンパク質及びペプチド薬の安定性及び特徴付けに関する「アルテプラ
ーゼ(Altepase)、組み換え組織プラスミノーゲン活性化因子の安定特性化及び処
方技術(Stability Characterization and Formulation Development of Altepas
e, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator)」, Y. J. Wang, R. Pearlma
n, 編, (プレナム出版：ニューヨーク, 1993), pp. 91-135）。３つのタンパク
質全てにおいて、Ａｒｇ２７５とＩｌｅ２７６の間のペプチド結合は、プロテア
ーゼ切断に特に影響されやすい。切断は２つの断片を生じる：１つはＮ末端２７
５アミノ酸からなり、もう１つはＣ末端２５２アミノ酸からなる。Ｎ末端鎖はプ
ラスミノーゲンとプロトロンビンに見られるクリングル領域と相同性のある領域
を含み、従って時にそれは「クリングル断片」と呼ばれる（Nguyen及びCarole,
上掲; de Vos等, Biochem., 31, 270-279(1992)）。
【０００４】
Ｃ末端鎖は、触媒活性部位を含み、従って、一般に「プロテアーゼ断片」と呼
ばれる（Pennica等, Nature, 301, 214-221(1983)）。切断された２つの鎖は、
Ｃｙｓ２６４とＣｙｓ３９５の間に形成される１つのジスルフィド結合によって
繋がる。切断された分子は、一般に、「１本鎖ｔＰＡ」又は無傷の形態に対して
、「２本の鎖のｔＰＡ」と呼ばれる。 ｒ−ｔＰＡは、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒによって同定されるＮ結合グ
リコシル化のための４つの潜在的な部位を含む（Nguyen及びCarole, 上掲）。こ
れらは、Ａｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４、Ａｓｎ２１８、及びＡｓｎ４４８である
。ｒ−ｔＰＡはＩ型及びＩＩ型と称される２つのグリコシル化アイソザイムとし
て存在する。Ｉ型ｒ−ｔＰＡはＡｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４、及びＡｓｎ４４８ でグリコシル化され；一方、ＩＩ型ｒ−ｔＰＡはＡｓｎ１１７とＡｓｎ４４８で
のみグリコシル化される。Ａｓｎ２１８はどちらのアイソフォームでもグリコシ
ル化されない。ＴＮＫ−ｔＰＡは、位置１１７から１０３にグリコシル化部位を
効果的に移動させるＴｈｒ１０３のＡｓｎへの、及びＡｓｎ１１７のＧｌｕへの
突然変異以外は、ｒ−ｔＰＡと同一のグリコシル化パターンを持つ（Keyt等, 上
掲）。ＣＨＯ−ＰＡのグリコシル化パターンは、十分に特徴付けされていない（
Rijken及びCollen, J. Biol.Chem., 256: 7035-7041(1981)）。
ばれる（Pennica等, Nature, 301, 214-221(1983)）。切断された２つの鎖は、
Ｃｙｓ２６４とＣｙｓ３９５の間に形成される１つのジスルフィド結合によって
繋がる。切断された分子は、一般に、「１本鎖ｔＰＡ」又は無傷の形態に対して
、「２本の鎖のｔＰＡ」と呼ばれる。 ｒ−ｔＰＡは、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒによって同定されるＮ結合グ
リコシル化のための４つの潜在的な部位を含む（Nguyen及びCarole, 上掲）。こ
れらは、Ａｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４、Ａｓｎ２１８、及びＡｓｎ４４８である
。ｒ−ｔＰＡはＩ型及びＩＩ型と称される２つのグリコシル化アイソザイムとし
て存在する。Ｉ型ｒ−ｔＰＡはＡｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４、及びＡｓｎ４４８ でグリコシル化され；一方、ＩＩ型ｒ−ｔＰＡはＡｓｎ１１７とＡｓｎ４４８で
のみグリコシル化される。Ａｓｎ２１８はどちらのアイソフォームでもグリコシ
ル化されない。ＴＮＫ−ｔＰＡは、位置１１７から１０３にグリコシル化部位を
効果的に移動させるＴｈｒ１０３のＡｓｎへの、及びＡｓｎ１１７のＧｌｕへの
突然変異以外は、ｒ−ｔＰＡと同一のグリコシル化パターンを持つ（Keyt等, 上
掲）。ＣＨＯ−ＰＡのグリコシル化パターンは、十分に特徴付けされていない（
Rijken及びCollen, J. Biol.Chem., 256: 7035-7041(1981)）。
【０００５】
ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｒ
−ｔＰＡ）の組み換え型の商標であり、急性心筋梗塞及び肺塞栓の管理に使用さ
れる。ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)ブランドｔＰＡはまた、現在、虚血性脳卒中
の治療に認可されている。それは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
の天然ヒトｔＰＡに対する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を発現させることにより生成
される（米国特許第５７５３４８６号）。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ＡＣＴＩＶＡＳＥ
(登録商標)ｒ−ｔＰＡと比較して、高い効果と低い出血の発生率を有するｒ−ｔ
ＰＡの遺伝子操作変異体である。それは、３つの部位特異的突然変異（Ｔ１０３
Ｎ、Ｎ１１７Ｑ及びＫＨＲＲ２９６−２９９ＡＡＡＡ）によって作成され、また
、ＣＨＯ細胞でクローン化され、発現される（米国特許第５６１２０２９号）。
ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−ＰＡと呼ばれる内因性ハムスターｔＰＡを生合成する。Ｃ
ＨＯ−ＰＡのアミノ酸配列は、ｒ−ｔＰＡのものと高い相同性（８０％同一性）
がある。３つの血栓溶解タンパク質全ては、主にタンパク質分解／加水分解と差
次的グリコシル化による異種アイソフォームとして存在する。
−ｔＰＡ）の組み換え型の商標であり、急性心筋梗塞及び肺塞栓の管理に使用さ
れる。ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)ブランドｔＰＡはまた、現在、虚血性脳卒中
の治療に認可されている。それは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
の天然ヒトｔＰＡに対する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を発現させることにより生成
される（米国特許第５７５３４８６号）。ＴＮＫ−ｔＰＡは、ＡＣＴＩＶＡＳＥ
(登録商標)ｒ−ｔＰＡと比較して、高い効果と低い出血の発生率を有するｒ−ｔ
ＰＡの遺伝子操作変異体である。それは、３つの部位特異的突然変異（Ｔ１０３
Ｎ、Ｎ１１７Ｑ及びＫＨＲＲ２９６−２９９ＡＡＡＡ）によって作成され、また
、ＣＨＯ細胞でクローン化され、発現される（米国特許第５６１２０２９号）。
ＣＨＯ細胞はＣＨＯ−ＰＡと呼ばれる内因性ハムスターｔＰＡを生合成する。Ｃ
ＨＯ−ＰＡのアミノ酸配列は、ｒ−ｔＰＡのものと高い相同性（８０％同一性）
がある。３つの血栓溶解タンパク質全ては、主にタンパク質分解／加水分解と差
次的グリコシル化による異種アイソフォームとして存在する。
【０００６】
ＣＨＯ−ＰＡからのヒトｔＰＡの精製方法は、米国特許第５４１１８６４号に
記載されている。この方法は、ヒトｔＰＡを含む液体を、対応する内因性ＣＨＯ
−ＰＡに特異的に結合する抗体と接触させ、ヒトｔＰＡを回収すること含んでな
る。好ましくは、接触工程は、液体を、そこに固定した抗体を有するクロマトグ
ラフィーベッドに通すことを含む。 組み換えＤＮＡ誘導タンパク質医薬の発達は、タンパク質を特徴付けするため
及び／又はタンパク質の製造の一貫性を示すために使用することができる新しい
分析方法の導入により促進されてきた。ペプチドマッピングは、アミノ酸配列を
モニターするための重要な方法であり、小から中サイズのタンパク質、例えばイ
ンシュリン及びヒト成長ホルモンにおける小さな変化を検出することができる。
非常に大きなタンパク質、例えばフィブリノーゲン（分子量３５００００）、又
は異種糖タンパク、例えば抗体（分子量１５００００）の分析は、酵素的消化に
より生成されるペプチドの並びの複雑性により妨げられる。このような複雑性に
より、単一の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離に、限定
的利用性のオンライン紫外線検出を組み合わせることになる。
記載されている。この方法は、ヒトｔＰＡを含む液体を、対応する内因性ＣＨＯ
−ＰＡに特異的に結合する抗体と接触させ、ヒトｔＰＡを回収すること含んでな
る。好ましくは、接触工程は、液体を、そこに固定した抗体を有するクロマトグ
ラフィーベッドに通すことを含む。 組み換えＤＮＡ誘導タンパク質医薬の発達は、タンパク質を特徴付けするため
及び／又はタンパク質の製造の一貫性を示すために使用することができる新しい
分析方法の導入により促進されてきた。ペプチドマッピングは、アミノ酸配列を
モニターするための重要な方法であり、小から中サイズのタンパク質、例えばイ
ンシュリン及びヒト成長ホルモンにおける小さな変化を検出することができる。
非常に大きなタンパク質、例えばフィブリノーゲン（分子量３５００００）、又
は異種糖タンパク、例えば抗体（分子量１５００００）の分析は、酵素的消化に
より生成されるペプチドの並びの複雑性により妨げられる。このような複雑性に
より、単一の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分離に、限定
的利用性のオンライン紫外線検出を組み合わせることになる。
【０００７】
市販の組み合わせＨＰＬＣ及び従来のＨＰＬＣと適合するエレクトロスプレー
イオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳ−ＭＳ）システムの出現は、ペプチドマッピング
の能力を大きく増大させた（Ling等, Anal. Chem., 63: 2909-2915(1991); Guze
tta等, Anal. Chem., 65: 2953-2962(1993)）。インソース衝突誘起解離（ＣＩ
Ｄ）と組み合わせたＬＣ−ＥＭ−ＭＳは、Ｎ及びＯ結合グリコシル化の部位を同
定するのに効果的に利用されている（Carr等, Protein Sci., 2: 183-196(1993)
; Huddleston等, Anal. Chem., 65:877-884(1993); Conboy及びHenion, J. Am.
Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814(1992)）。しかしながらこの技術でさえも、
様々なタンパク質グリコシル化及び中サイズの糖タンパクの酵素消化により引き
起こされる多くの非常に類似したペプチドから生じる不十分な解読により限定さ
れる。従って、このようなサンプルを特徴付けするために垂直選択を含む技術領
域を使用することが必要である。
イオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳ−ＭＳ）システムの出現は、ペプチドマッピング
の能力を大きく増大させた（Ling等, Anal. Chem., 63: 2909-2915(1991); Guze
tta等, Anal. Chem., 65: 2953-2962(1993)）。インソース衝突誘起解離（ＣＩ
Ｄ）と組み合わせたＬＣ−ＥＭ−ＭＳは、Ｎ及びＯ結合グリコシル化の部位を同
定するのに効果的に利用されている（Carr等, Protein Sci., 2: 183-196(1993)
; Huddleston等, Anal. Chem., 65:877-884(1993); Conboy及びHenion, J. Am.
Soc. Mass Spectrom., 3: 804-814(1992)）。しかしながらこの技術でさえも、
様々なタンパク質グリコシル化及び中サイズの糖タンパクの酵素消化により引き
起こされる多くの非常に類似したペプチドから生じる不十分な解読により限定さ
れる。従って、このようなサンプルを特徴付けするために垂直選択を含む技術領
域を使用することが必要である。
【０００８】
高速キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＥＳ−ＭＳ、及びマトリックス
補助レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析の組み合わせの利用が、ＤＳＰＡ
α１、吸血コウモリ唾液腺に由来する１本鎖プラスミノーゲン活性化因子によっ
て例示されるような、基本的な糖タンパクサンプルの酵素消化の特徴付けを可能
にするために研究された（Apffel等, J. Chromatography A, 717: 41-60(1995)
）。これら４つの技術は、糖タンパクを調査するための高い相補性技術であると
推論された。それでもなお、著者は、このアプローチの能力を改善するためによ
り多くの研究が成される必要があり、大きな糖質異質性により高収率の濃縮工程
が要求されるであろうということを認識している。 上掲の米国特許第５４１１８６４号で報告されているように、ｔＰＡの精製方
法が実施された後にＣＨＯ−ＰＡ存在の相対及び絶対量をモニターする技術が必
要である。
補助レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析の組み合わせの利用が、ＤＳＰＡ
α１、吸血コウモリ唾液腺に由来する１本鎖プラスミノーゲン活性化因子によっ
て例示されるような、基本的な糖タンパクサンプルの酵素消化の特徴付けを可能
にするために研究された（Apffel等, J. Chromatography A, 717: 41-60(1995)
）。これら４つの技術は、糖タンパクを調査するための高い相補性技術であると
推論された。それでもなお、著者は、このアプローチの能力を改善するためによ
り多くの研究が成される必要があり、大きな糖質異質性により高収率の濃縮工程
が要求されるであろうということを認識している。 上掲の米国特許第５４１１８６４号で報告されているように、ｔＰＡの精製方
法が実施された後にＣＨＯ−ＰＡ存在の相対及び絶対量をモニターする技術が必
要である。
【０００９】
（発明の概要）
従って、３つの血栓溶解分子、ＣＨＯ−ｔＰＡ、天然配列を持つ組み換えヒト
ｔＰＡ、及びＴＮＫ−ｔＰＡの分析のために、逆相ＨＰＬＣ法がここで開発され
た。この方法は、ＣＨＯ−ＰＡからヒトｔＰＡ及び／又はＴＮＫ−ｔＰＡを分離
する能力を有するだけではなく、各分子の異なるアイソフォームを同定し、定量
することができる。 特に、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の内在性のプラ
スミノーゲン活性化因子（ＰＡ）を、ヒトｔＰＡ又はその変異体を含むサンプル
から取り除く精製法の有効性のモニタリング方法を提供し、該方法は、サンプル
をヒト野生型ｔＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を特異的に切断すること
のできるプロテアーゼと、次いでヒト野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元す
るのに有効な量の還元及び変性剤とインキュベートし；サンプルを逆相高速液体
クロマトグラフィー工程にかけ、及びそこに存在するＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量
について液体クロマトグラフィー工程による溶出像を分析することを含む。
ｔＰＡ、及びＴＮＫ−ｔＰＡの分析のために、逆相ＨＰＬＣ法がここで開発され
た。この方法は、ＣＨＯ−ＰＡからヒトｔＰＡ及び／又はＴＮＫ−ｔＰＡを分離
する能力を有するだけではなく、各分子の異なるアイソフォームを同定し、定量
することができる。 特に、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の内在性のプラ
スミノーゲン活性化因子（ＰＡ）を、ヒトｔＰＡ又はその変異体を含むサンプル
から取り除く精製法の有効性のモニタリング方法を提供し、該方法は、サンプル
をヒト野生型ｔＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を特異的に切断すること
のできるプロテアーゼと、次いでヒト野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元す
るのに有効な量の還元及び変性剤とインキュベートし；サンプルを逆相高速液体
クロマトグラフィー工程にかけ、及びそこに存在するＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量
について液体クロマトグラフィー工程による溶出像を分析することを含む。
【００１０】
（好ましい実施態様の説明）
定義
「組織プラスミノーゲン活性化因子」、及び「ｔＰＡ」という用語は、線維素
溶解活性を有し、典型的には５つのドメイン（フィンガー、成長因子、クリング
ル−１、クリングル−２、及びプロテアーゼドメイン）を持つ構造を有するが、
血栓溶解剤として機能するなら小数のドメインを有していてもよいか又はいくつ
かの繰り返される該ドメインを有していてもよく、位置１１７、１８４、及び４
４８にＮ結合グリコシル化部位を保持するヒト外因性（組織型）プラスミノーゲ
ン活性化因子を意味する。最小では、ｔＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミン
に変化させる能力のあるプロテアーゼドメインからなり、Ｎ末端領域が少なくと
も部分的にフィブリン結合をもたらすと考えられ、野生型ヒトｔＰＡのアミノ酸
位置１１７、１８４、及び４４８に対応する位置にＮ結合グリコシル化部位を保
持する。これらのグリコシル化部位の保持は、組み換え及び黒色腫由来野生型ｔ
ＰＡの可変部位の占有がそれぞれ「Ｉ型ｔＰＡ」及び「ＩＩ型ｔＰＡ」と呼ばれ
る２つの変異体の生産を引き起こすという事実に依存する。Ｉ型ｔＰＡは位置１
１７、１８４、及び４４８でＮ結合オリゴ糖を含む。ＩＩ型ｔＰＡは位置１１７
及び４４８でＮ結合オリゴ糖を含んでいた。各個体のｔＰＡのアミノ酸配列にお
ける１又は複数のアミノ酸の違いによって示されるように、天然対立遺伝子変異
が存在し、個体内に生じうることが理解される。
溶解活性を有し、典型的には５つのドメイン（フィンガー、成長因子、クリング
ル−１、クリングル−２、及びプロテアーゼドメイン）を持つ構造を有するが、
血栓溶解剤として機能するなら小数のドメインを有していてもよいか又はいくつ
かの繰り返される該ドメインを有していてもよく、位置１１７、１８４、及び４
４８にＮ結合グリコシル化部位を保持するヒト外因性（組織型）プラスミノーゲ
ン活性化因子を意味する。最小では、ｔＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミン
に変化させる能力のあるプロテアーゼドメインからなり、Ｎ末端領域が少なくと
も部分的にフィブリン結合をもたらすと考えられ、野生型ヒトｔＰＡのアミノ酸
位置１１７、１８４、及び４４８に対応する位置にＮ結合グリコシル化部位を保
持する。これらのグリコシル化部位の保持は、組み換え及び黒色腫由来野生型ｔ
ＰＡの可変部位の占有がそれぞれ「Ｉ型ｔＰＡ」及び「ＩＩ型ｔＰＡ」と呼ばれ
る２つの変異体の生産を引き起こすという事実に依存する。Ｉ型ｔＰＡは位置１
１７、１８４、及び４４８でＮ結合オリゴ糖を含む。ＩＩ型ｔＰＡは位置１１７
及び４４８でＮ結合オリゴ糖を含んでいた。各個体のｔＰＡのアミノ酸配列にお
ける１又は複数のアミノ酸の違いによって示されるように、天然対立遺伝子変異
が存在し、個体内に生じうることが理解される。
【００１１】
「野生型ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」、「野生型ヒトｔＰＡ」、「
天然ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」、及び「天然ヒトｔＰＡ」という用
語は、ここで、「ヒトｔＰＡ」を「ｈｔＰＡ」と省略してもよく、天然配列ヒト
ｔＰＡを意味し、つまり１９８８年８月２３日公開の米国特許第４７６６０７５
号に報告されるｃＤＮＡ配列によってコードされる。ｔＰＡ分子のアミノ酸部位
の数字又は位置は米国特許第４７６６０７５号に従って付けられる。 ここで使用される場合、ｔＰＡの可変ドメインという引用は、上に定義される
ような、ヒトｔＰＡの機能的に等価である部分が天然ヒトｔＰＡ配列と比較して
アミノ酸の変更を有する、野生型ヒトｔＰＡのドメイン、又は他の起源、例えば
コウモリ組織プラスミノーゲン活性化因子（ｂａｔ−ＰＡ）からの（天然又は変
異）ｔＰＡのドメインを意味する。従って、ここで使用されるように、「プロテ
アーゼドメイン」という用語は、野生型ヒトｔＰＡの成熟形態の、アミノ酸位置
２６４からアミノ酸位置５２７にわたる領域であり、天然ヒトｔＰＡ配列に比べ
てアミノ酸の変更を有するヒトｔＰＡ、又は他の起源、例えばｂａｔ−ＰＡ等由
来のｔＰＡの機能的に等価の部分を意味する。
天然ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子」、及び「天然ヒトｔＰＡ」という用
語は、ここで、「ヒトｔＰＡ」を「ｈｔＰＡ」と省略してもよく、天然配列ヒト
ｔＰＡを意味し、つまり１９８８年８月２３日公開の米国特許第４７６６０７５
号に報告されるｃＤＮＡ配列によってコードされる。ｔＰＡ分子のアミノ酸部位
の数字又は位置は米国特許第４７６６０７５号に従って付けられる。 ここで使用される場合、ｔＰＡの可変ドメインという引用は、上に定義される
ような、ヒトｔＰＡの機能的に等価である部分が天然ヒトｔＰＡ配列と比較して
アミノ酸の変更を有する、野生型ヒトｔＰＡのドメイン、又は他の起源、例えば
コウモリ組織プラスミノーゲン活性化因子（ｂａｔ−ＰＡ）からの（天然又は変
異）ｔＰＡのドメインを意味する。従って、ここで使用されるように、「プロテ
アーゼドメイン」という用語は、野生型ヒトｔＰＡの成熟形態の、アミノ酸位置
２６４からアミノ酸位置５２７にわたる領域であり、天然ヒトｔＰＡ配列に比べ
てアミノ酸の変更を有するヒトｔＰＡ、又は他の起源、例えばｂａｔ−ＰＡ等由
来のｔＰＡの機能的に等価の部分を意味する。
【００１２】
ここで使用される場合、「ｔＰＡ変異体」は、存在するアミノ酸への一又は複
数のアミノ酸の変化又は修飾によって天然ｔＰＡとは異なる分子を意味する。こ
こでＴＮＫ−ｔＰＡは好ましい変異体である。所望の配列変異に影響する天然分
子の適したアミノ酸の変化又は挿入の修飾は、例えば、部位特異的突然変異又は
関連したタンパク質をコードするＤＮＡへの適した配列のライゲーションのよう
な、当該分野で知られるあらゆる方法によってなされる。 ここで使用される場合、「ＴＮＫ−ｔＰＡ」は、野生型ｔＰＡのＴｈｒ１０３
がＡｓｎに変化し（Ｔ１０３Ｎ）、野生型ｔＰＡのＡｓｎ１１７がＧｌｎに変化
し（Ｎ１１７Ｑ）、さらに野生型ｔＰＡのＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ２９
６−２９９がＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに変化した（ＫＨＲＲ２９６−２
９９ＡＡＡＡ）、ｔＰＡ分子を意味する。このようなＴＮＫはさらに、米国特許
第５６１２０２９号に記載されている。
数のアミノ酸の変化又は修飾によって天然ｔＰＡとは異なる分子を意味する。こ
こでＴＮＫ−ｔＰＡは好ましい変異体である。所望の配列変異に影響する天然分
子の適したアミノ酸の変化又は挿入の修飾は、例えば、部位特異的突然変異又は
関連したタンパク質をコードするＤＮＡへの適した配列のライゲーションのよう
な、当該分野で知られるあらゆる方法によってなされる。 ここで使用される場合、「ＴＮＫ−ｔＰＡ」は、野生型ｔＰＡのＴｈｒ１０３
がＡｓｎに変化し（Ｔ１０３Ｎ）、野生型ｔＰＡのＡｓｎ１１７がＧｌｎに変化
し（Ｎ１１７Ｑ）、さらに野生型ｔＰＡのＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ２９
６−２９９がＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに変化した（ＫＨＲＲ２９６−２
９９ＡＡＡＡ）、ｔＰＡ分子を意味する。このようなＴＮＫはさらに、米国特許
第５６１２０２９号に記載されている。
【００１３】
「チャイニーズハムスター卵巣細胞」又は「ＣＨＯ細胞」という用語は、例え
ば１９８９年８月２９日に公開のＥＰ１１７１５９；米国特許第４７６６０７５
号；同４８５３３３０号；同５１８５２５９号；Lubiniecki等, 動物細胞生物学
とバイオプロセスの技術の進歩(Advances in Animal Cell Biology and Technol
ogy for Bioprocesses)、Spier等,編(1989), pp. 442-451に記載されているよう
なチャイニーズハムスター卵巣、並びに例えばＣＨＯ／−ＤＨＦＲ（Urlaub及び
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)）、ＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ
Ｂ１１（Simonsen及びLevinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495-2499(
1983); Urlaub及びChasin, 上掲）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３
月１５日公開のＥＰ３０７２４７）等のＣＨＯ誘導体から誘導される細胞又は細
胞株を意味する。好ましい宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１及びｄｐ１２
．ＣＨＯ細胞である。
ば１９８９年８月２９日に公開のＥＰ１１７１５９；米国特許第４７６６０７５
号；同４８５３３３０号；同５１８５２５９号；Lubiniecki等, 動物細胞生物学
とバイオプロセスの技術の進歩(Advances in Animal Cell Biology and Technol
ogy for Bioprocesses)、Spier等,編(1989), pp. 442-451に記載されているよう
なチャイニーズハムスター卵巣、並びに例えばＣＨＯ／−ＤＨＦＲ（Urlaub及び
Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)）、ＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ
Ｂ１１（Simonsen及びLevinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495-2499(
1983); Urlaub及びChasin, 上掲）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３
月１５日公開のＥＰ３０７２４７）等のＣＨＯ誘導体から誘導される細胞又は細
胞株を意味する。好ましい宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１及びｄｐ１２
．ＣＨＯ細胞である。
【００１４】
ｔＰＡの大量生産のために開発されたＣＨＯ細胞は、Wiebe等による、大量動
物細胞培養技術（Large Scale Mammalian Cell Culture Technology）、Lubinie
cki編, (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 147-160に記載されているよう
に、ＭＣＢ／ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）システムに低温で保存されている
。ヒトｔＰＡをコードするＤＮＡを形質移入したＤＨＦＲ＋ ＣＨＯ−Ｋ１細胞
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア
（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＬ６１で利用可能である。他のｔＰＡ産
生ＣＨＯ細胞株のサンプル（ＣＨＯ細胞株１−１５１５）は、ＡＴＣＣ寄託番号
ＣＲＬ９６０６で寄託されている。後者の細胞株は、５０ｐｇ／細胞／日に近い
ヒトｔＰＡレベルで生じると報告された。 ここで使用される場合の「ＣＨＯプラスミノーゲン活性化因子」又は「ＣＨＯ
−ＰＡ」は、ＣＨＯ細胞によって内因的に産生されるプラスミノーゲン活性化因
子を意味する。ＣＨＯ細胞によって発現されるこの内因性ＰＡは、ヒト野生型ｔ
ＰＡとは僅かに異なる（約８０％同一性）配列を有する。ＣＨＯ−ＰＡは組織型
ＰＡではない。
物細胞培養技術（Large Scale Mammalian Cell Culture Technology）、Lubinie
cki編, (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 147-160に記載されているよう
に、ＭＣＢ／ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）システムに低温で保存されている
。ヒトｔＰＡをコードするＤＮＡを形質移入したＤＨＦＲ＋ ＣＨＯ−Ｋ１細胞
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア
（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託番号ＣＣＬ６１で利用可能である。他のｔＰＡ産
生ＣＨＯ細胞株のサンプル（ＣＨＯ細胞株１−１５１５）は、ＡＴＣＣ寄託番号
ＣＲＬ９６０６で寄託されている。後者の細胞株は、５０ｐｇ／細胞／日に近い
ヒトｔＰＡレベルで生じると報告された。 ここで使用される場合の「ＣＨＯプラスミノーゲン活性化因子」又は「ＣＨＯ
−ＰＡ」は、ＣＨＯ細胞によって内因的に産生されるプラスミノーゲン活性化因
子を意味する。ＣＨＯ細胞によって発現されるこの内因性ＰＡは、ヒト野生型ｔ
ＰＡとは僅かに異なる（約８０％同一性）配列を有する。ＣＨＯ−ＰＡは組織型
ＰＡではない。
【００１５】
ここで使用する場合、「プロテアーゼ」は、特異的にヒト野生型ｔＰＡのＡｒ
ｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を切断する能力のある酵素を意味する。例としては
、プラスミン（又はプラスミンに変化するプラスミノーゲン）、組織カリクレイ
ン、又はＸａ因子、並びにこの特定の、限られたタンパク質分解に影響すること
のできるあらゆるトリプシン様プロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、さ
らにIchinosi等, FEBS Letters, 175: 412-418(1984)に記載されている。ここで
好ましいものは、プラスミン／プラスミノーゲンである。 ここで使用される場合、「変性／還元剤」又は「変性剤及び還元剤」は、ヒト
野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元する変性剤及び還元剤の組み合わせを意
味する。好ましくは、変性剤はクオニジン(quanidine)又は尿素であり、還元剤
はジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はｈ２−マルカプトエタノールである。
ｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を切断する能力のある酵素を意味する。例としては
、プラスミン（又はプラスミンに変化するプラスミノーゲン）、組織カリクレイ
ン、又はＸａ因子、並びにこの特定の、限られたタンパク質分解に影響すること
のできるあらゆるトリプシン様プロテアーゼを含む。適したプロテアーゼは、さ
らにIchinosi等, FEBS Letters, 175: 412-418(1984)に記載されている。ここで
好ましいものは、プラスミン／プラスミノーゲンである。 ここで使用される場合、「変性／還元剤」又は「変性剤及び還元剤」は、ヒト
野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元する変性剤及び還元剤の組み合わせを意
味する。好ましくは、変性剤はクオニジン(quanidine)又は尿素であり、還元剤
はジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はｈ２−マルカプトエタノールである。
【００１６】
（発明の実施の形態）
組み換え生産の後、ｔＰＡ又はｔＰＡ変異体は、ＣＨＯ培地から、分泌タンパ
ク質として、又は分泌シグナルなしに直接発現される場合は宿主細胞ライセート
からのどちらかで回収される。タンパク質と実質的に同質である調製物を得るた
めに、ｔＰＡ又はその変異体を宿主細胞タンパク質から精製することが必要であ
る。第１段階としては、微粒状細胞片を取り除くために、培地又はライセートを
遠心分離又は濾過する。 次いで、ヒトｔＰＡ又はその変異体を、免疫親和性又は例えば米国特許第５４
１１８６４号に記載されているようなイオン交換カラムでの分画；エタノール沈
殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂によるクロマ
トグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；又
は例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル電気泳動のような技術によって、
ＣＨＯ−ＰＡのような夾雑物に相当する内在性タンパク質から精製する。フッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）のようなｔＰＡ活性を妨げないプロテア
ーゼ阻害剤もまた、精製の間にタンパク質分解を阻害するのに利用されてもよく
、外因性の汚染物質の発達を抑制するために抗生物質が含まれてもよい。当業者
は、天然ｔＰＡに適した精製方法が組み換え細胞培地で発現したｔＰＡ又はその
変異体の特性を変化させる修飾を要求しうることを理解しているであろう。
ク質として、又は分泌シグナルなしに直接発現される場合は宿主細胞ライセート
からのどちらかで回収される。タンパク質と実質的に同質である調製物を得るた
めに、ｔＰＡ又はその変異体を宿主細胞タンパク質から精製することが必要であ
る。第１段階としては、微粒状細胞片を取り除くために、培地又はライセートを
遠心分離又は濾過する。 次いで、ヒトｔＰＡ又はその変異体を、免疫親和性又は例えば米国特許第５４
１１８６４号に記載されているようなイオン交換カラムでの分画；エタノール沈
殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂によるクロマ
トグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；又
は例えばセファデックスＧ−７５を用いたゲル電気泳動のような技術によって、
ＣＨＯ−ＰＡのような夾雑物に相当する内在性タンパク質から精製する。フッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）のようなｔＰＡ活性を妨げないプロテア
ーゼ阻害剤もまた、精製の間にタンパク質分解を阻害するのに利用されてもよく
、外因性の汚染物質の発達を抑制するために抗生物質が含まれてもよい。当業者
は、天然ｔＰＡに適した精製方法が組み換え細胞培地で発現したｔＰＡ又はその
変異体の特性を変化させる修飾を要求しうることを理解しているであろう。
【００１７】
好ましい実施態様において、ｔＰＡ変異体が生成される場合には、それが分泌
され、上清を抗ｔＰＡヤギポリクローナルＡ６抗体と結合したガラスビーズのＰ
ＢＳ条件付カラムに通し、カラムをバッファーで平衡化し、次いでｔＰＡ変異体
を溶出させる。 ここで本発明は、そのような精製システムから得られたＣＨＯ細胞で生成させ
るヒトｔＰＡの少なくとも１つの形態を含むサンプルでの、天然ＣＨＯ−ＰＡの
レベルのモニタリング（認定又は定量を含む）に関する。該方法は、特異的にＡ
ｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を切断する能力のあるプロテアーゼと共にサンプ
ルをインキュベートすることを含む。これに続いて、ヒト野生型ｔＰＡのジスル
フィド結合の還元に影響させるのに適切な相対又は絶対量の変性又は還元剤の組
み合わせと共にプロテアーゼ処理したサンプルのインキュベーションを行う。変
性又は還元剤での処理が酵素活性の喪失を引き起こすので、プロテアーゼとのイ
ンキュベーションは初めに行う。
され、上清を抗ｔＰＡヤギポリクローナルＡ６抗体と結合したガラスビーズのＰ
ＢＳ条件付カラムに通し、カラムをバッファーで平衡化し、次いでｔＰＡ変異体
を溶出させる。 ここで本発明は、そのような精製システムから得られたＣＨＯ細胞で生成させ
るヒトｔＰＡの少なくとも１つの形態を含むサンプルでの、天然ＣＨＯ−ＰＡの
レベルのモニタリング（認定又は定量を含む）に関する。該方法は、特異的にＡ
ｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を切断する能力のあるプロテアーゼと共にサンプ
ルをインキュベートすることを含む。これに続いて、ヒト野生型ｔＰＡのジスル
フィド結合の還元に影響させるのに適切な相対又は絶対量の変性又は還元剤の組
み合わせと共にプロテアーゼ処理したサンプルのインキュベーションを行う。変
性又は還元剤での処理が酵素活性の喪失を引き起こすので、プロテアーゼとのイ
ンキュベーションは初めに行う。
【００１８】
インキュベーションの後、サンプルは逆相高速液体クロマトグラフィー工程が
行われ、ＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量を分析するクロマトグラフィー工程からの溶
出像がそこに現れる。好ましくは、プロテアーゼは、活性形態、プラスミンに変
化するプラスミノーゲンであり、ヒトｔＰＡは天然配列ｔＰＡであり、ｔＰＡ変
異体はＴＮＫ−ｔＰＡである。 連続したプロテアーゼとのインキュベーションに続いて、典型的には変性／還
元剤が約３０−４０℃、より好ましくは約３６−３８℃、より好ましくは約３７
℃の温度で約１５分間、より好ましくは約２０−４０分間行われる。 また、好ましくはインキュベーションの前に、サンプルを消化バッファーで希
釈し、それは好ましくは約７から８のｐＨを有し、より好ましくはｐＨ７．４−
７．６のリン酸バッファーであり、またより好ましくはアルギニンを含んでいる
。
行われ、ＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量を分析するクロマトグラフィー工程からの溶
出像がそこに現れる。好ましくは、プロテアーゼは、活性形態、プラスミンに変
化するプラスミノーゲンであり、ヒトｔＰＡは天然配列ｔＰＡであり、ｔＰＡ変
異体はＴＮＫ−ｔＰＡである。 連続したプロテアーゼとのインキュベーションに続いて、典型的には変性／還
元剤が約３０−４０℃、より好ましくは約３６−３８℃、より好ましくは約３７
℃の温度で約１５分間、より好ましくは約２０−４０分間行われる。 また、好ましくはインキュベーションの前に、サンプルを消化バッファーで希
釈し、それは好ましくは約７から８のｐＨを有し、より好ましくはｐＨ７．４−
７．６のリン酸バッファーであり、またより好ましくはアルギニンを含んでいる
。
【００１９】
サンプルが入れられるあらゆる適したＨＰＬＣカラムが、調製又は分析スケー
ルを含む本発明の目的のために利用できる。カラムは、典型的にサンプルの注入
の少なくとも約１５分前に平衡化される。カラムサイズ、カラム基質、流速、希
釈バッファー、勾配の型、注入量、及びカラムの粒子サイズは、検定するサンプ
ルの大きさ、溶離液組成及び勾配のタイプ、及び識別するｔＰＡの形態を含む様
々な要因に依存する。 投入される溶媒は、あらゆる溶媒であってよいが、好ましくはアセトニトリル
含有溶媒、例えば水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
好ましくは、カラムは、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、Ｖｙｄａｃ、又はＢａｋｅｒ Ｃ−
１８カラムであり、約４−４０μｍ、より好ましくは約５−１５μｍの粒径と、
約１００−４０００Å、より好ましくは約１５０−３５０Åの孔径を有する媒体
で満たされる。また、好ましくは、媒体はＣ４、Ｃ８、又はＣ１８アルキル基を
有し、もっとも好ましくはＣ８シリカ媒体である。好ましくは、溶出を、６０−
１００分を超える勾配形式、好ましくは直線勾配の、アセトニトリルを含む溶媒
、例えば水、アセトニトリル、及びＴＦＡで行い、溶媒においてアセトニトリル
の相対量は増加する。他の好ましい実施態様は、約０．２５％アセトニトリル／
分の軽度勾配ランプが使用される。
ルを含む本発明の目的のために利用できる。カラムは、典型的にサンプルの注入
の少なくとも約１５分前に平衡化される。カラムサイズ、カラム基質、流速、希
釈バッファー、勾配の型、注入量、及びカラムの粒子サイズは、検定するサンプ
ルの大きさ、溶離液組成及び勾配のタイプ、及び識別するｔＰＡの形態を含む様
々な要因に依存する。 投入される溶媒は、あらゆる溶媒であってよいが、好ましくはアセトニトリル
含有溶媒、例えば水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
好ましくは、カラムは、Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、Ｖｙｄａｃ、又はＢａｋｅｒ Ｃ−
１８カラムであり、約４−４０μｍ、より好ましくは約５−１５μｍの粒径と、
約１００−４０００Å、より好ましくは約１５０−３５０Åの孔径を有する媒体
で満たされる。また、好ましくは、媒体はＣ４、Ｃ８、又はＣ１８アルキル基を
有し、もっとも好ましくはＣ８シリカ媒体である。好ましくは、溶出を、６０−
１００分を超える勾配形式、好ましくは直線勾配の、アセトニトリルを含む溶媒
、例えば水、アセトニトリル、及びＴＦＡで行い、溶媒においてアセトニトリル
の相対量は増加する。他の好ましい実施態様は、約０．２５％アセトニトリル／
分の軽度勾配ランプが使用される。
【００２０】
ここでの純度の分析によって、使用した技術がＣＨＯ−ＰＡをうまく取り出せ
るということが示された場合、他のあらゆる夾雑物を取り除くことが必要なので
、更なる精製工程を実施することができる。該技術がＣＨＯ−ＰＡを適したレベ
ルにまでうまく取り出せなかった場合、異なる精製スキームを利用し、スキーム
がどのような影響を及ぼすかを決定するために、ここでの工程を繰り返す。 最後の精製の後、ｔＰＡ又はその変異体を、製薬的に利用できる組成物を調製
する既知の方法に従って処方することができ、そのためにｔＰＡ産物は製薬的に
許容可能な担体と混合して合成される。このような処方は、容量及び使用と同様
、文献によく記載されている。例えば、ｔＰＡ又はその変異体は、心血管疾患又
はコンディション及び脳卒中に苦しむ患者に非経口で投与されるのに適している
。 次の実施例は、本発明を実施するために現在知られているうちの１つの実施態
様を例示することを意図したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されな
い。ここで挙げた全ての公開及び特許文献は出典明示によりここに取り込まれる
。
るということが示された場合、他のあらゆる夾雑物を取り除くことが必要なので
、更なる精製工程を実施することができる。該技術がＣＨＯ−ＰＡを適したレベ
ルにまでうまく取り出せなかった場合、異なる精製スキームを利用し、スキーム
がどのような影響を及ぼすかを決定するために、ここでの工程を繰り返す。 最後の精製の後、ｔＰＡ又はその変異体を、製薬的に利用できる組成物を調製
する既知の方法に従って処方することができ、そのためにｔＰＡ産物は製薬的に
許容可能な担体と混合して合成される。このような処方は、容量及び使用と同様
、文献によく記載されている。例えば、ｔＰＡ又はその変異体は、心血管疾患又
はコンディション及び脳卒中に苦しむ患者に非経口で投与されるのに適している
。 次の実施例は、本発明を実施するために現在知られているうちの１つの実施態
様を例示することを意図したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されな
い。ここで挙げた全ての公開及び特許文献は出典明示によりここに取り込まれる
。
【００２１】
（実施例１）
材料
ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)（ｒ−ｔＰＡ）とＴＮＫ−ｔＰＡを、ジェネンテ
ック社（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）から、ＣＨＯ細胞から精製した形態で
入手した。また、例えば、ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)ｒ−ｔＰＡに関する米国
特許第４７６６０７５号と同第７５３４８６号及びＴＮＫ−ｔＰＡに関する米国
特許第５６１２０２９号を参照。 ＣＨＯ−ＰＡに対するモノクローナル抗体＃３５４は米国特許第５４１１８６
４号に記載されているようにして作成した。概略すると、メスのＢａｌｂ／ｃマ
ウスを、ヒトｔ−ＰＡを欠く宿主細胞から精製したＣＨＯプラスミノーゲン活性
化因子に実質的に富むタンパク質溶液で、１２週間免疫化した。各約３０μｇを
５回注射した。初期注入は、完全フロインドアジュバントで乳化し、皮下部分に
投与した。１．５週間後に行われた２回目の注入は、不完全フロインドアジュバ
ントで乳化し、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。残り３回の注入は、３
、６及び１２週目に行い、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１箇所の腹腔内部分に
投与した。
ック社（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）から、ＣＨＯ細胞から精製した形態で
入手した。また、例えば、ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)ｒ−ｔＰＡに関する米国
特許第４７６６０７５号と同第７５３４８６号及びＴＮＫ−ｔＰＡに関する米国
特許第５６１２０２９号を参照。 ＣＨＯ−ＰＡに対するモノクローナル抗体＃３５４は米国特許第５４１１８６
４号に記載されているようにして作成した。概略すると、メスのＢａｌｂ／ｃマ
ウスを、ヒトｔ−ＰＡを欠く宿主細胞から精製したＣＨＯプラスミノーゲン活性
化因子に実質的に富むタンパク質溶液で、１２週間免疫化した。各約３０μｇを
５回注射した。初期注入は、完全フロインドアジュバントで乳化し、皮下部分に
投与した。１．５週間後に行われた２回目の注入は、不完全フロインドアジュバ
ントで乳化し、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。残り３回の注入は、３
、６及び１２週目に行い、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１箇所の腹腔内部分に
投与した。
【００２２】
免疫化したマウスの脾臓を、１３週目に取り出し、脾臓細胞をFazekas等, J.
Immunol. Methods, 35: 1(1980)及びLane, J. Immunol. Methods 81:223(1985)
の一般的な方法を用いて、マウス骨髄腫細胞株ＮＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と
融合した。融合細胞を、各９６ウェルある１０のマイクロタイタープレートに分
配した。各ウェルを、２つのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）での異な
る反応性を用いて、特定の抗体生産をスクリーニングした。１つのＥＬＩＳＡは
特にＣＨＯ−ＰＡに対する抗体を検出し、２つ目は組み換えヒトｔＰＡと架橋反
応した抗体を検出した。 全ウェルの約５％が、ＣＨＯ−ＰＡのみと反応し、３％がＣＨＯ−ＰＡ及びヒ
トｔ−ＰＡと反応した。
Immunol. Methods, 35: 1(1980)及びLane, J. Immunol. Methods 81:223(1985)
の一般的な方法を用いて、マウス骨髄腫細胞株ＮＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と
融合した。融合細胞を、各９６ウェルある１０のマイクロタイタープレートに分
配した。各ウェルを、２つのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）での異な
る反応性を用いて、特定の抗体生産をスクリーニングした。１つのＥＬＩＳＡは
特にＣＨＯ−ＰＡに対する抗体を検出し、２つ目は組み換えヒトｔＰＡと架橋反
応した抗体を検出した。 全ウェルの約５％が、ＣＨＯ−ＰＡのみと反応し、３％がＣＨＯ−ＰＡ及びヒ
トｔ−ＰＡと反応した。
【００２３】
ＣＨＯ−ＰＡ特異抗体を含むウェルからのハイブリドーマ細胞を増大させ、限
界希釈によりクローン化した（Oi及びHerzenberg, 細胞免疫学による選別方法(S
elected Methods in Cellular Immunology)、Mishell及びShiigi, 編(W. H. Fre
eman 及びCo., 1980)の「免疫グロブリン産生ハイブリッド細胞株(Immunoglobin
-Producing Hybrid Cell Lines)」, p. 351-372）。大量の特定のモノクローナ
ル抗体をハイブリドーマ細胞の細胞培養により、又はマウスにハイブリドーマ細
胞の注入して腹水癌をそこに生じさせることにより作成した。ＭＡｂ３５４は、
免疫化した場合に１つのカラム通過において約１００倍以上ＣＨＯ−ＰＡレベル
が低下した１つの派生抗体であり、いくつかの異なる免疫化学及び過酷な洗浄条
件に対して安定である。 ＭＡｂ３５４は、下に述べる工程で精製され、全工程は室温で実施された。濃
縮は次のようにして実施した：ＭＡｂハイブリドーマ懸濁培養産物液（ＨＦ）を
０．２μｍのフィルターで濾過した。培養液を限外濾過又はイオン交換樹脂での
クロマトグラフィーにより濃縮した。
界希釈によりクローン化した（Oi及びHerzenberg, 細胞免疫学による選別方法(S
elected Methods in Cellular Immunology)、Mishell及びShiigi, 編(W. H. Fre
eman 及びCo., 1980)の「免疫グロブリン産生ハイブリッド細胞株(Immunoglobin
-Producing Hybrid Cell Lines)」, p. 351-372）。大量の特定のモノクローナ
ル抗体をハイブリドーマ細胞の細胞培養により、又はマウスにハイブリドーマ細
胞の注入して腹水癌をそこに生じさせることにより作成した。ＭＡｂ３５４は、
免疫化した場合に１つのカラム通過において約１００倍以上ＣＨＯ−ＰＡレベル
が低下した１つの派生抗体であり、いくつかの異なる免疫化学及び過酷な洗浄条
件に対して安定である。 ＭＡｂ３５４は、下に述べる工程で精製され、全工程は室温で実施された。濃
縮は次のようにして実施した：ＭＡｂハイブリドーマ懸濁培養産物液（ＨＦ）を
０．２μｍのフィルターで濾過した。培養液を限外濾過又はイオン交換樹脂での
クロマトグラフィーにより濃縮した。
【００２４】
親和性精製は次のようにして実施された：チメロサールを約０．０２％まで、
濃縮したＭＡｂ ＨＦ溶液に添加した。溶液を、３．０Ｍのグリシンの添加に続
いて結晶ＮａＣｌを添加することにより、約１．５Ｍのグリシン、３．０ＭのＮ
ａＣｌ、ｐＨ９．０に調節した。タンパク質ＡはＡｂ結合が弱いので、ＮａＣｌ
及びグリシンの添加が疎水的相互作用を増大させ、Ａｂ結合を促進する。溶液を
濾過によって浄化した。浄化した濃縮ＭＡｂ ＨＦをアガロースに固定したタン
パク質Ａのカラムに入れた。結合したＭＡｂを、おおよそ１．５Ｍのグリシン、
３．０ＭのＮａＣｌ、０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０の組成物を有する、カ
ラムを平衡化するために使用したバッファーで洗浄した。ＭＡｂを０．１Ｍのク
エン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０のバッファーで溶出した
。タンパク質Ａカラムを３．０ＭのＮａＳＣＮ、０．０３ＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８
．５で洗浄することにより再生し、再平衡化した。溶出したＭＡｂのピークを２
８０ｎｍの吸光プロフィールに従って得た。クエン酸で溶出したＭＡｂのピーク
は、おおよその組成物：１．５ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０のバッファー
中で得ることにより直ちに中和された。使用後、タンパク質Ａカラムは中身を取
り出し、２−８℃の密封容器で約０．０２％のチメロサールを保存バッファーと
して保存した。
濃縮したＭＡｂ ＨＦ溶液に添加した。溶液を、３．０Ｍのグリシンの添加に続
いて結晶ＮａＣｌを添加することにより、約１．５Ｍのグリシン、３．０ＭのＮ
ａＣｌ、ｐＨ９．０に調節した。タンパク質ＡはＡｂ結合が弱いので、ＮａＣｌ
及びグリシンの添加が疎水的相互作用を増大させ、Ａｂ結合を促進する。溶液を
濾過によって浄化した。浄化した濃縮ＭＡｂ ＨＦをアガロースに固定したタン
パク質Ａのカラムに入れた。結合したＭＡｂを、おおよそ１．５Ｍのグリシン、
３．０ＭのＮａＣｌ、０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０の組成物を有する、カ
ラムを平衡化するために使用したバッファーで洗浄した。ＭＡｂを０．１Ｍのク
エン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０のバッファーで溶出した
。タンパク質Ａカラムを３．０ＭのＮａＳＣＮ、０．０３ＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８
．５で洗浄することにより再生し、再平衡化した。溶出したＭＡｂのピークを２
８０ｎｍの吸光プロフィールに従って得た。クエン酸で溶出したＭＡｂのピーク
は、おおよその組成物：１．５ＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０のバッファー
中で得ることにより直ちに中和された。使用後、タンパク質Ａカラムは中身を取
り出し、２−８℃の密封容器で約０．０２％のチメロサールを保存バッファーと
して保存した。
【００２５】
次いで３５４ＭＡｂをダイアフィルトレーションによってバッファー交換した
。ダイアフィルトレーションは、導電率とｐＨが０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．０
５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーの値と同じになるまで続ける。 続いて、ＭＡｂをＤＥＡＥ−ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ(商品名)アガロース基質を含
む陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに入れ、０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．
０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーで洗浄した。ＭＡｂはおおよその組
成物：０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファー
で溶出した。溶出したＭＡｂのピークを２８０ｎｍの吸光プロフィールに従って
得た。 ＭＡｂは濾過（０．２μｍ）して消毒した密閉容器に入れ、−４０℃以下で保
存した。 プラスミノーゲンをＦｌｕｋａ（スイス）から入手した。ＨＰＬＣ−グレード
アセトニトリルをＢｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（マスキーゴン、ＭＩ）から
、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をＰｉｅｒｃｅ（ロックフォード、ＩＬ）から入
手した。ＨＰＬＣ溶離液の水及びサンプル溶液は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミルフ
ォード、ＭＡ）のＭＩＬＬＩ−Ｑ(商品名)で精製した。他の全ての化学薬品は、
Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）の試薬グレードのものであった。
。ダイアフィルトレーションは、導電率とｐＨが０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．０
５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーの値と同じになるまで続ける。 続いて、ＭＡｂをＤＥＡＥ−ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ(商品名)アガロース基質を含
む陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに入れ、０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．
０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファーで洗浄した。ＭＡｂはおおよその組
成物：０．０３ＭのＴＲＩＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５のバッファー
で溶出した。溶出したＭＡｂのピークを２８０ｎｍの吸光プロフィールに従って
得た。 ＭＡｂは濾過（０．２μｍ）して消毒した密閉容器に入れ、−４０℃以下で保
存した。 プラスミノーゲンをＦｌｕｋａ（スイス）から入手した。ＨＰＬＣ−グレード
アセトニトリルをＢｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（マスキーゴン、ＭＩ）から
、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をＰｉｅｒｃｅ（ロックフォード、ＩＬ）から入
手した。ＨＰＬＣ溶離液の水及びサンプル溶液は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミルフ
ォード、ＭＡ）のＭＩＬＬＩ−Ｑ(商品名)で精製した。他の全ての化学薬品は、
Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）の試薬グレードのものであった。
【００２６】
方法
ＣＨＯ−ＰＡの精製
ＣＨＯ−ＰＡを、親和性クロマトグラフィーに続いて免疫吸着することにより
ＣＨＯ細胞培養液から単離した。ＢｉｏＳｅｐｒａ（パリ、フランス）のリジン
ハイパーＤレジンを親和性クロマトグラフィーに使用し、リジンはプラスミノー
ゲン活性化因子のクリングル２領域に結合する（Cleary等, Biochem. 28, 1884-
1890(1989)）。免疫吸着をＣＨＯ−ＰＡ特異的モノクローナル抗体＃３５４（Ｍ
Ａｂ＃３５４）を用いることにより実施した。ＭＡｂ＃３５４を製造元（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカッタウェイ、ＮＪ）の使用説明に従って
、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ(商品名)ゲルに結合させた。ＣＮＢｒ活性
化セファロース４Ｂゲル１ｍｌにつき約１０ｍｇのＭＡｂ＃３５４を結合させた
。結合の後、ＭＡｂ＃３５４セファロース４Ｂ(商品名)カラムに詰めた。
ＣＨＯ細胞培養液から単離した。ＢｉｏＳｅｐｒａ（パリ、フランス）のリジン
ハイパーＤレジンを親和性クロマトグラフィーに使用し、リジンはプラスミノー
ゲン活性化因子のクリングル２領域に結合する（Cleary等, Biochem. 28, 1884-
1890(1989)）。免疫吸着をＣＨＯ−ＰＡ特異的モノクローナル抗体＃３５４（Ｍ
Ａｂ＃３５４）を用いることにより実施した。ＭＡｂ＃３５４を製造元（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカッタウェイ、ＮＪ）の使用説明に従って
、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ(商品名)ゲルに結合させた。ＣＮＢｒ活性
化セファロース４Ｂゲル１ｍｌにつき約１０ｍｇのＭＡｂ＃３５４を結合させた
。結合の後、ＭＡｂ＃３５４セファロース４Ｂ(商品名)カラムに詰めた。
【００２７】
分泌ＣＨＯ−ＰＡを含むＣＨＯ細胞培養液を、ｐＨ７．５の５０ｍＭのリン酸
ナトリウムと０．０１％のＰＯＲＹＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)洗浄剤を含む
平衡バッファーで先に平衡化しておいたリジン親和性カラムに通した。通した後
、リジン親和性カラムを３回洗浄した：最初は平衡バッファー、続いてｐＨ８．
０の４０ｍＭのＴＲＩＳ、８００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００８％のＰＯＲＹ
ＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)を含むバッファー、最後に平衡バッファー。次い
でＣＨＯ−ＰＡをｐＨ７．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＬ−
アルギニン、及び０．０１％のＰＯＬＴＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)を含むバ
ッファーでリジン親和性カラムから抽出した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、８ｇ
／ＬのＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、１．４４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４及び
０．２４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で平衡化した後、ＭＡｂ＃３５４
−セファロース(商品名)４Ｂカラムにリジン親和性カラム溶出プールを通した。
通した後、カラムをｐＨ７．４の９．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ
、及び５％のプロピレングリコール（ｖ／ｖ）を含むバッファーで洗浄した。結
合したＣＨＯ−ＰＡをｐＨ２．５の０．２ＭのグリシンＨＣｌでカラムから溶出
した。溶出を２８０ｎｍで分光光度的にモニターし、ＣＨＯ−ＰＡ−含有分画を
０．１４の容量の１．５Ｍアルギニン-リン酸（ｐＨ８．０）で回収後直ちに中
和した。溶出したＣＨＯ−ＰＡの識別と純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸配
列分析により確認した。
ナトリウムと０．０１％のＰＯＲＹＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)洗浄剤を含む
平衡バッファーで先に平衡化しておいたリジン親和性カラムに通した。通した後
、リジン親和性カラムを３回洗浄した：最初は平衡バッファー、続いてｐＨ８．
０の４０ｍＭのＴＲＩＳ、８００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００８％のＰＯＲＹ
ＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)を含むバッファー、最後に平衡バッファー。次い
でＣＨＯ−ＰＡをｐＨ７．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＬ−
アルギニン、及び０．０１％のＰＯＬＴＳＯＲＢＡＴＥ ８０(商品名)を含むバ
ッファーでリジン親和性カラムから抽出した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、８ｇ
／ＬのＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、１．４４ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４及び
０．２４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で平衡化した後、ＭＡｂ＃３５４
−セファロース(商品名)４Ｂカラムにリジン親和性カラム溶出プールを通した。
通した後、カラムをｐＨ７．４の９．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＣｌ
、及び５％のプロピレングリコール（ｖ／ｖ）を含むバッファーで洗浄した。結
合したＣＨＯ−ＰＡをｐＨ２．５の０．２ＭのグリシンＨＣｌでカラムから溶出
した。溶出を２８０ｎｍで分光光度的にモニターし、ＣＨＯ−ＰＡ−含有分画を
０．１４の容量の１．５Ｍアルギニン-リン酸（ｐＨ８．０）で回収後直ちに中
和した。溶出したＣＨＯ−ＰＡの識別と純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸配
列分析により確認した。
【００２８】
ＤＴＴ／尿素処理
プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液を変性バッファー（ｐＨ８．４の８Ｍ
の尿素、０．５ＭのＴＲＩＳ、及び３．２ｍＭのＥＤＴＡ）で１：１（ｖ／ｖ）
に希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１Ｍの保存液から最終濃度２０ｍ
Ｍまで添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
の尿素、０．５ＭのＴＲＩＳ、及び３．２ｍＭのＥＤＴＡ）で１：１（ｖ／ｖ）
に希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１Ｍの保存液から最終濃度２０ｍ
Ｍまで添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【００２９】
プラスミン処理
プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液を変性バッファー（ｐＨ７．５の１２
５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのアルギニン、及び０．０１％のＮａＮ３ ）で１：３（ｖ／ｖ）に希釈した。１００分の１（ｗ／ｗ）のプラスミノーゲン
を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭのアルギニン、及び０．０１％のＮａＮ３ ）で１：３（ｖ／ｖ）に希釈した。１００分の１（ｗ／ｗ）のプラスミノーゲン
を添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３０】
プラスミノーゲン活性化因子の逆相ＨＰＬＣアッセイ
４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５−μｍの粒径、３００Å孔の樹脂、Ｚｏｒｂａｘ
ＳＢ−Ｃ８カラム（Ｍａｃ−Ｍｏｄ、チャッズフォード、ＰＡ）でのＨｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０(商品名)ＨＰＬＣシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ
Ｐａｃｋａｒｄ、アボンデール、ＰＡ）でアッセイを実施した。カラムをサンプ
ル注入の少なくとも１５分前に平衡化した。開始溶離液組成物は、水／アセトニ
トリル／ＴＦＡが７０／３０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）であった。開始から５分後
、直線勾配を８０分（図１及び２）、さらに５０／５０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）
の水／アセトニトリル／ＴＦＡで６０分（図３）実施した。勾配の直後、カラム
を１００／０．１（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／ＴＦＡで１０分間再生した。次
いで組成物を５分で開始状態に戻し、システムを次の注入のために再平衡化した
。注入量は２５０ｍＬで、流速は１ｍＬ／分であった。クロマトグラフィーを４
０℃で処理した。蛍光をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０４６Ａ(商品名)
プログラマブル蛍光検出器（Ｅｘ＝２７５ｎｍ及びＥｍ＝３４０ｎｍ）で測定し
た。クロマトグラムを記録し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＣＨＥＭＳＴ
ＡＴＩＯＮ(商品名)ソフトウェアで分析した。
ＳＢ−Ｃ８カラム（Ｍａｃ−Ｍｏｄ、チャッズフォード、ＰＡ）でのＨｅｗｌ
ｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０９０(商品名)ＨＰＬＣシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ
Ｐａｃｋａｒｄ、アボンデール、ＰＡ）でアッセイを実施した。カラムをサンプ
ル注入の少なくとも１５分前に平衡化した。開始溶離液組成物は、水／アセトニ
トリル／ＴＦＡが７０／３０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）であった。開始から５分後
、直線勾配を８０分（図１及び２）、さらに５０／５０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）
の水／アセトニトリル／ＴＦＡで６０分（図３）実施した。勾配の直後、カラム
を１００／０．１（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／ＴＦＡで１０分間再生した。次
いで組成物を５分で開始状態に戻し、システムを次の注入のために再平衡化した
。注入量は２５０ｍＬで、流速は１ｍＬ／分であった。クロマトグラフィーを４
０℃で処理した。蛍光をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ １０４６Ａ(商品名)
プログラマブル蛍光検出器（Ｅｘ＝２７５ｎｍ及びＥｍ＝３４０ｎｍ）で測定し
た。クロマトグラムを記録し、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＣＨＥＭＳＴ
ＡＴＩＯＮ(商品名)ソフトウェアで分析した。
【００３１】
結果と考察
高い配列相同性のために、ＡＣＴＩＶＡＳＥ(登録商標)（ｒ−ｔＰＡ）、ＴＮ
Ｋ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡは、非常に類似した生化学的／生物物理学的特性
を有する。これら３つのプラスミノーゲン活性化因子を互いに他のものから分離
することができ、又はｔＰＡをＣＨＯ−ＰＡから又はＴＮＫ−ｔＰＡをＣＨＯ−
ＰＡから分離することができる分析及び調製の方法は、回収方法の開発に、さら
に臨床研究及び工業生産のためのそれぞれの分子の純度を評価するのに必要とさ
れる。ここでの説明は、これらの目的を達成するシンプルな逆相ＨＰＬＣ法であ
る。
Ｋ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡは、非常に類似した生化学的／生物物理学的特性
を有する。これら３つのプラスミノーゲン活性化因子を互いに他のものから分離
することができ、又はｔＰＡをＣＨＯ−ＰＡから又はＴＮＫ−ｔＰＡをＣＨＯ−
ＰＡから分離することができる分析及び調製の方法は、回収方法の開発に、さら
に臨床研究及び工業生産のためのそれぞれの分子の純度を評価するのに必要とさ
れる。ここでの説明は、これらの目的を達成するシンプルな逆相ＨＰＬＣ法であ
る。
【００３２】
０．２５％アセトニトリル／分の軽度勾配ランプ及びプロテアーゼ又は変性／
還元剤無しで、逆相ＨＰＬＣは、ｒ−ｔＰＡの天然形態を天然ＣＨＯ−ＰＡから
分離することはできない（図１）。しかしながら、ＴＮＫ−ｔＰＡの天然形態は
これらの条件下で天然ｒ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡの両方から非常にうまく分離
される。次に、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を変性させるためにＤＴ
Ｔ／尿素処理を実施する。３つのタンパク質全てにおいて、Ａｒｇ２７５とＩｌ
ｅ２７６の間のペプチド結合がプロテアーゼ切断に対して非常に影響されやすい
。時間が経つと、この感受性は溶液中のｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨ
Ｏ−ＰＡの間の異質性を引き起こす。少量の１本鎖形態がプロテアーゼ切断によ
り２本の鎖の形態に変化する。ＤＴＴ／尿素処理は、共に分子の２本の鎖の形態
を支持しているＣｙｓ２６４とＣｙｓ３９５の間のジスルフィド結合を還元し、
その結果、分子を２つの断片（クリングル断片とプロテアーゼ断片）に分離する
。
還元剤無しで、逆相ＨＰＬＣは、ｒ−ｔＰＡの天然形態を天然ＣＨＯ−ＰＡから
分離することはできない（図１）。しかしながら、ＴＮＫ−ｔＰＡの天然形態は
これらの条件下で天然ｒ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡの両方から非常にうまく分離
される。次に、ジスルフィド結合を還元し、タンパク質を変性させるためにＤＴ
Ｔ／尿素処理を実施する。３つのタンパク質全てにおいて、Ａｒｇ２７５とＩｌ
ｅ２７６の間のペプチド結合がプロテアーゼ切断に対して非常に影響されやすい
。時間が経つと、この感受性は溶液中のｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨ
Ｏ−ＰＡの間の異質性を引き起こす。少量の１本鎖形態がプロテアーゼ切断によ
り２本の鎖の形態に変化する。ＤＴＴ／尿素処理は、共に分子の２本の鎖の形態
を支持しているＣｙｓ２６４とＣｙｓ３９５の間のジスルフィド結合を還元し、
その結果、分子を２つの断片（クリングル断片とプロテアーゼ断片）に分離する
。
【００３３】
図２は、同じ勾配ランプで逆相ＨＰＬＣが、ＤＴＴ／尿素処理の後に３つの血
栓溶解分子の１本鎖形態をそれぞれ他のものから分離することが可能であったこ
とを示す。３つ全てのタンパク質は、初めに溶出する２本の鎖の形態、２回目に
溶出する１本鎖形態のクリングル断片、及び最後に溶出する２本の鎖のプロテア
ーゼ断片と同様の溶出プロフィールを持つ。また、３つのプラスミノーゲン活性
化因子のそれぞれのプロテアーゼ断片は、それぞれ他者からうまく分離されるが
、３つの分子のクリングル断片はうまく分離されない。続いて、この方法はプラ
スミノーゲン活性化因子の２本の鎖の形態への１本鎖形態の断片化の検出及び定
量に使用することができる。
栓溶解分子の１本鎖形態をそれぞれ他のものから分離することが可能であったこ
とを示す。３つ全てのタンパク質は、初めに溶出する２本の鎖の形態、２回目に
溶出する１本鎖形態のクリングル断片、及び最後に溶出する２本の鎖のプロテア
ーゼ断片と同様の溶出プロフィールを持つ。また、３つのプラスミノーゲン活性
化因子のそれぞれのプロテアーゼ断片は、それぞれ他者からうまく分離されるが
、３つの分子のクリングル断片はうまく分離されない。続いて、この方法はプラ
スミノーゲン活性化因子の２本の鎖の形態への１本鎖形態の断片化の検出及び定
量に使用することができる。
【００３４】
ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡプロフィールに見られる異質
性（図２）は、ｒｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡの混合物の各々の分
子を定量しようとする場合に特に、これらの分子の定量化を非常に難しくする。
タンパク質分解に関連する異種を排除するために、全ての１本鎖形態をプラスミ
ノーゲンとインキュベートすることにより２本の鎖の形態に変化させる。プラス
ミノーゲンは天然線溶系のプラスミノーゲン活性化因子の基質である。ｒ−ｔＰ
Ａ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡは全て、プラスミノーゲンのＡｒｇ５６ ０ −Ｖａｌ５６１ペプチド結合を切断する酵素活性を有する。このような切断は
、プラスミノーゲンをその活性形態、プラスミンに変化させる。プラスミンは、
低い特異性を有するセリンプロテアーゼであり、ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、
及びＣＨＯ−ＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６ペプチド結合を切断する能力が
ある。その結果、プラスミノーゲンとのインキュベーションは、３つのプラスミ
ノーゲン活性化因子の１本鎖形態を２本の鎖の形態に変化させる。
性（図２）は、ｒｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡの混合物の各々の分
子を定量しようとする場合に特に、これらの分子の定量化を非常に難しくする。
タンパク質分解に関連する異種を排除するために、全ての１本鎖形態をプラスミ
ノーゲンとインキュベートすることにより２本の鎖の形態に変化させる。プラス
ミノーゲンは天然線溶系のプラスミノーゲン活性化因子の基質である。ｒ−ｔＰ
Ａ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、及びＣＨＯ−ＰＡは全て、プラスミノーゲンのＡｒｇ５６ ０ −Ｖａｌ５６１ペプチド結合を切断する酵素活性を有する。このような切断は
、プラスミノーゲンをその活性形態、プラスミンに変化させる。プラスミンは、
低い特異性を有するセリンプロテアーゼであり、ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ、
及びＣＨＯ−ＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６ペプチド結合を切断する能力が
ある。その結果、プラスミノーゲンとのインキュベーションは、３つのプラスミ
ノーゲン活性化因子の１本鎖形態を２本の鎖の形態に変化させる。
【００３５】
プラスミン処理に続いて、ジスルフィド結合を還元するためにサンプルをＤＴ
Ｔ／尿素で処理し、こうして分子の２本の鎖の形態を２つの別々の断片に分離し
た。図３はプラスミン及びＤＴＴ／尿素処理プラスミノーゲン活性化因子の逆相
ＨＰＬＣプロフィールを示す。３つのタンパク質の各プロテアーゼ断片をそれぞ
れ他者からうまく分離したが、３つの分子のクリングル断片は分離されなかった
。従って、プロテアーゼ断片を、各プラスミン活性化因子のインテグレーション
と定量化に使用した。ｒ−ｔＰＡとＴＮＫ−ｔＰＡの両方について、Ｉ型及びＩ
Ｉ型のアイソザイムのクリングル断片をうまく分離した。その結果、この方法は
また、ｒ−ｔＰＡとＴＮＫ−ｔＰＡの両方のＩ型とＩＩ型の割合を定量化するの
に利用できる。 この逆相ＨＰＬＣ法の利用性は、工業的な方法の発展を大きく促進する。それ
は製品の完全性を考慮した製品の質（つまり１本鎖のパーセンテージ）において
異なる発酵状態の影響及びＩ型とＩＩ型のアイソザイムの比率を評価するために
利用される。それはまた、精製方法の発達を助け、生産バッチの間の一貫性を確
実にするために利用される。これらの全ての利用法は、新しい医薬の発展におけ
る分析的及び工業的方法の重要な役割を担うことを例示している。
Ｔ／尿素で処理し、こうして分子の２本の鎖の形態を２つの別々の断片に分離し
た。図３はプラスミン及びＤＴＴ／尿素処理プラスミノーゲン活性化因子の逆相
ＨＰＬＣプロフィールを示す。３つのタンパク質の各プロテアーゼ断片をそれぞ
れ他者からうまく分離したが、３つの分子のクリングル断片は分離されなかった
。従って、プロテアーゼ断片を、各プラスミン活性化因子のインテグレーション
と定量化に使用した。ｒ−ｔＰＡとＴＮＫ−ｔＰＡの両方について、Ｉ型及びＩ
Ｉ型のアイソザイムのクリングル断片をうまく分離した。その結果、この方法は
また、ｒ−ｔＰＡとＴＮＫ−ｔＰＡの両方のＩ型とＩＩ型の割合を定量化するの
に利用できる。 この逆相ＨＰＬＣ法の利用性は、工業的な方法の発展を大きく促進する。それ
は製品の完全性を考慮した製品の質（つまり１本鎖のパーセンテージ）において
異なる発酵状態の影響及びＩ型とＩＩ型のアイソザイムの比率を評価するために
利用される。それはまた、精製方法の発達を助け、生産バッチの間の一貫性を確
実にするために利用される。これらの全ての利用法は、新しい医薬の発展におけ
る分析的及び工業的方法の重要な役割を担うことを例示している。
【図１】 天然ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡの逆相ＨＰＬ
Ｃ分析を示す。
Ｃ分析を示す。
【図２】 ＤＴＴ／尿素処理ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ及びＣＨＯ−ＰＡ
の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。プラスミノーゲン活性化因子は、クロマトグラフィ
ーの前にＤＴＴ／尿素で処理した。
の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。プラスミノーゲン活性化因子は、クロマトグラフィ
ーの前にＤＴＴ／尿素で処理した。
【図３】 プラスミンとＤＴＴ／尿素処理ｒ−ｔＰＡ、ＴＮＫ−ｔＰＡ及び
ＣＨＯ−ＰＡの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。プラスミノーゲン活性化因子は、クロ
マトグラフィーの前にプラスミン処理に続いてＤＴＴ／尿素処理を行った。
ＣＨＯ−ＰＡの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。プラスミノーゲン活性化因子は、クロ
マトグラフィーの前にプラスミン処理に続いてＤＴＴ／尿素処理を行った。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｅ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 シュー，ユアン
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94065，
レッドウッド シティー， シーストーム
ドライブ 511
Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ08 QQ36 QQ97 QR16
QR41 QR49 QR64 QS11 QS17
QX02
Claims (11)
- 【請求項１】 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の内在性のプラ
スミノーゲン活性化因子（ＰＡ）を、ヒトｔＰＡ又はその変異体を含むサンプル
から取り除く精製法の有効性のモニタリング方法であって、サンプルをヒト野生
型ｔＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６結合を特異的に切断することのできるプ
ロテアーゼと、次いでヒト野生型ｔＰＡのジスルフィド結合を還元するのに有効
な量の還元及び変性剤と共にインキュベートし；サンプルを逆相高速液体クロマ
トグラフィー工程にかけ、そこに存在するＣＨＯ細胞内在性ＰＡの量について液
体クロマトグラフィー工程による溶出像を分析することを含む方法。 - 【請求項２】 プロテアーゼがプラスミノーゲンである、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 ヒトｔＰＡが天然配列ｔＰＡである、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項４】 ｔＰＡ変異体がＴＮＫ−ｔＰＡである、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】 インキュベーションの前に、サンプルを消化バッファーに希
釈させる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 バッファーが約７から８のｐＨを有する、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】 バッファーがリン酸バッファーである、請求項６に記載の方
法。 - 【請求項８】 バッファーがさらにアルギニンを含む、請求項７に記載の方
法。 - 【請求項９】 変性剤が尿素とグアニジンを含む、請求項１に記載の方法。
- 【請求項１０】 還元剤がジチオトレイトール又は２−メルカプトエタノー
ルを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 クロマトグラフィー工程が、アセトニトリルを勾配型に含
む溶媒での溶出により実施される、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16360799P | 1999-11-04 | 1999-11-04 | |
| US60/163,607 | 1999-11-04 | ||
| PCT/US2000/030252 WO2001032915A2 (en) | 1999-11-04 | 2000-11-01 | Reversed-phase hplc assay for plasminogen activators |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003513638A true JP2003513638A (ja) | 2003-04-15 |
| JP4659320B2 JP4659320B2 (ja) | 2011-03-30 |
Family
ID=22590762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001535595A Expired - Lifetime JP4659320B2 (ja) | 1999-11-04 | 2000-11-01 | プラスミノーゲン活性化因子の逆相ｈｐｌｃアッセイ |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6593097B1 (ja) |
| EP (1) | EP1226269B1 (ja) |
| JP (1) | JP4659320B2 (ja) |
| KR (1) | KR100649043B1 (ja) |
| CN (1) | CN1167808C (ja) |
| AT (1) | ATE243263T1 (ja) |
| AU (1) | AU781023B2 (ja) |
| BR (1) | BRPI0015283B8 (ja) |
| CA (1) | CA2384756C (ja) |
| CZ (1) | CZ302023B6 (ja) |
| DE (1) | DE60003449T2 (ja) |
| DK (1) | DK1226269T3 (ja) |
| ES (1) | ES2200973T3 (ja) |
| HK (1) | HK1046158B (ja) |
| HU (1) | HU226202B1 (ja) |
| IL (1) | IL149006A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA02004401A (ja) |
| NO (1) | NO329876B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ518187A (ja) |
| PL (1) | PL204011B1 (ja) |
| PT (1) | PT1226269E (ja) |
| SI (1) | SI1226269T1 (ja) |
| WO (1) | WO2001032915A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200202687B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015006189A (ja) * | 2006-10-27 | 2015-01-15 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎａａｍｌｏｚｅ Ｖｅｎｎｏｏｔｓｃｈａｐ | キナーゼ阻害剤のプロファイリング方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE391789T1 (de) | 1999-12-10 | 2008-04-15 | Invitrogen Corp | Verwendung einer vielzahl von rekombinationsstellen mit einzigartiger spezifität beim rekombinatorischen klonen |
| AU2715302A (en) | 2000-12-08 | 2002-06-18 | Invitrogen Corp | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US6972327B1 (en) * | 2001-05-08 | 2005-12-06 | Immunex Corporation | Regeneration of chromatography material |
| EP1885488B1 (en) * | 2005-05-24 | 2015-07-08 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Regeneration of a chromatography matrix |
| KR100701265B1 (ko) * | 2006-01-16 | 2007-04-02 | 대한민국 | 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 |
| CN101511387A (zh) * | 2006-09-08 | 2009-08-19 | 惠氏公司 | 使用亲和色谱法纯化蛋白质的精氨酸洗涤液 |
| CN101539550B (zh) * | 2009-04-28 | 2012-05-23 | 李绍平 | 用于多糖的定性与定量分析方法 |
| EP3592858A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | Universität des Saarlandes | Means and methods for lignin pyrolysis |
| CN108333281A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-07-27 | 吉林大学 | 一种测定重组人粒细胞集落刺激因子二硫键组成的方法 |
| CN108918749B (zh) * | 2018-07-17 | 2020-05-05 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种蛇毒纤溶酶的反相hplc检测方法 |
| CN114426962A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-05-03 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | t-PA纯化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03500842A (ja) * | 1987-11-05 | 1991-02-28 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 組換えタンパク質を対応の宿主細胞タンパク質から精製する方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI831484L (fi) | 1982-05-05 | 1983-11-06 | Genentech Inc | Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad |
| US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| US5120535A (en) * | 1986-11-26 | 1992-06-09 | Oncogen | Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity |
| GB8919803D0 (en) * | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Ciba Geigy | Pharmaceutical compositions |
| DE10199044I2 (de) | 1992-06-03 | 2006-02-09 | Genentech Inc | Varianten des Gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter Therapeutischer wirkung |
| US5753702A (en) * | 1996-05-22 | 1998-05-19 | University Of Vermont | Arachidonic acid metabolite, 16-hete |
-
2000
- 2000-11-01 US US09/703,695 patent/US6593097B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 DK DK00978343T patent/DK1226269T3/da active
- 2000-11-01 WO PCT/US2000/030252 patent/WO2001032915A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-01 PL PL355389A patent/PL204011B1/pl unknown
- 2000-11-01 IL IL14900600A patent/IL149006A0/xx active IP Right Grant
- 2000-11-01 KR KR1020027005727A patent/KR100649043B1/ko active IP Right Grant
- 2000-11-01 CN CNB008153434A patent/CN1167808C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 JP JP2001535595A patent/JP4659320B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 BR BRPI0015283 patent/BRPI0015283B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 MX MXPA02004401A patent/MXPA02004401A/es active IP Right Grant
- 2000-11-01 CA CA2384756A patent/CA2384756C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 HU HU0202973A patent/HU226202B1/hu unknown
- 2000-11-01 PT PT00978343T patent/PT1226269E/pt unknown
- 2000-11-01 AT AT00978343T patent/ATE243263T1/de active
- 2000-11-01 DE DE60003449T patent/DE60003449T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 ES ES00978343T patent/ES2200973T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 NZ NZ518187A patent/NZ518187A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 CZ CZ20021196A patent/CZ302023B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-11-01 EP EP00978343A patent/EP1226269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-01 SI SI200030178T patent/SI1226269T1/xx unknown
- 2000-11-01 AU AU15816/01A patent/AU781023B2/en not_active Expired
-
2002
- 2002-04-05 ZA ZA200202687A patent/ZA200202687B/en unknown
- 2002-05-03 NO NO20022122A patent/NO329876B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-10-28 HK HK02107782.5A patent/HK1046158B/zh unknown
-
2003
- 2003-05-21 US US10/443,701 patent/US6828118B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03500842A (ja) * | 1987-11-05 | 1991-02-28 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | 組換えタンパク質を対応の宿主細胞タンパク質から精製する方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN7010002749, Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９４） ｖｏｌ．１８， ｐ．１１−３６ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015006189A (ja) * | 2006-10-27 | 2015-01-15 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎａａｍｌｏｚｅ Ｖｅｎｎｏｏｔｓｃｈａｐ | キナーゼ阻害剤のプロファイリング方法 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| White et al. | The isolation and characterization of plasminogen activators (urokinase) from human urine | |
| Kurachi et al. | Activation of human factor XI (plasma thromboplastin antecedent) by factor XIIa (activated Hageman factor) | |
| EP1841863B1 (en) | Method for purification of factor vii | |
| Winkler et al. | Purification and characterization of recombinant single-chain urokinase produced in Escherichia coli | |
| JP4659320B2 (ja) | プラスミノーゲン活性化因子の逆相ｈｐｌｃアッセイ | |
| Holvoet et al. | Characterization of functional domains in human tissue‐type plasminogen activator with the use of monoclonal antibodies | |
| EP0245100B1 (en) | Purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator | |
| Nguyen et al. | Stability characterization and formulation development of alteplase, a recombinant tissue plasminogen activator | |
| JPH08112095A (ja) | 組換えｉｘ因子から組換えプロｉｘ因子の分離方法 | |
| Mazar et al. | Domain analysis of urokinase plasminogen activator (u-PA): Preparation and characterization of intact A-chain molecules | |
| EP0139447B1 (en) | A process for preparing urokinase zymogen | |
| Marcotte et al. | Characterization of a metalloprotease which cleaves with high site-specificity the Glu (143)-Leu (144) bond of urokinase | |
| CN107460182A (zh) | 一种制备活化猪血浆凝血因子x的方法 | |
| Dawson et al. | Substitution of arginine 719 for glutamic acid in human plasminogen substantially reduces its affinity for streptokinase | |
| Pohl et al. | Tissue plasminogen activator mutants lacking the growth factor domain and the first kringle domain: I: DNA Constructions, Expression in Mammalian Cells, Protein Structure, Fibrin Affinity and Enzymatic Properties | |
| JPH0736755B2 (ja) | プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体含有組成物 | |
| Dewerchin et al. | Characterisation of conjugates of thrombin-treated single chain urokinase-type plasminogen activator with a monoclonal antibody specific for crosslinked fibrin | |
| WO1989009820A1 (en) | PURIFIED TYPE I AND TYPE II tPA | |
| Wilczyńska et al. | The Conformation Changes of the Finger Domain of Tissue Type Plasminogen Activator during the Activator-lnhibitor Reaction | |
| JPH0759191B2 (ja) | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 | |
| Kentzer et al. | Characterization of plasmin digested peptide maps for recombinant high molecular weight urokinase and pro-Urokinase. Its use for the estimation of low molecular weight urokinase in pro-UK/HMW-UK | |
| JPH04218368A (ja) | プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体の製造法 | |
| JPH0377900A (ja) | 血漿因子、その精製方法およびそれを有効成分として含有する血栓溶解剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071029 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100921 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101026 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101207 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101227 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140107 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4659320 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |