JP2015006189A - キナーゼ阻害剤のプロファイリング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
、糖尿病、炎症および関節炎のような多くの疾患状態での治療的介入のための薬物としてのキナーゼ阻害剤の使用に増大しつつある興味が存在することは驚くべきでない。従って、キナーゼプロテオームに応答指令信号を送るための多数のABPPのアプローチが開発されたことは理解できる。一方法において、キナーゼ基質を蛍光標識し、そしてリン酸誘発性の蛍光変化が細胞ライセートおよび生存細胞双方でのプロテインキナーゼ活性のリアルタイム可視化を可能にする(非特許文献5)。別の方法において、ペプチド基質のリン酸化は蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定する(非特許文献6;非特許文献7)。
も喧伝されたものは遺伝子発現シグネチャの使用である。こうした場合、数種の応答体の全ゲノムの発現プロファイル(処置前)を数種の非応答体のものと比較し、そして該2群間で差別的に発現される遺伝子を使用して未知の症例の見込みを予測し得る。この方法の決定的に重要な一欠点は、それがキナーゼ阻害剤の作用機序に直接関係せず、そしてこれゆえにサンプルの応答性を評価するための間接的パラメータに頼ることである。さらに、この方法(および大部分の他の応答予測方法)は未処置サンプル中のパラメータ(この場合は遺伝子発現)のみに基づく。結果として、これらの方法は腫瘍の不均一性およびサンプルの質に非常に感受性である。
本発明の目的は、キナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルの提供方法を提供することである。
本発明は、多孔質マトリックス上に固定された基質の第一および第二のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法に関し、前記方法は後の;
(i)癌細胞株;初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株;ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階;
(ii)前記細胞ライセートを10ないし0.1マイクロメートル範囲のフィルターで濾
過して濾過した細胞ライセートを得る段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
(iv)キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階;ならびに
段階(iv)のアレイ基質応答に対する段階(iii)のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる。
、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドキナーゼ基質;配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138をもつペプチドキナーゼ基質;配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138をもつペプチドキナーゼ基質;若しくは配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138をもつペプチドキナーゼ基質のいずれかから選択される最低2ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項14若しくは15のいずれか1つに記載の使用。
前記細胞株および/若しくは腫瘍からサンプルを提供すること;
MTKI1、エルロチニブ若しくは605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
MTKI1、エルロチニブ若しくは605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体は、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定する。
0、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群は、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群;配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群;若しくは配列番号5、10,38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138をもつペプチドキナーゼ基質よりなる群で置き換え得る。
(i)正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
(ii)キナーゼ阻害剤の存在下で、段階(i)の細胞ライセートの画分と本発明の基質の第一のアレイを接触させる段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階(i)の細胞ライセート画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階;および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として前記患者の薬理学的プロファイルを得る段階(前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する)
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法に関する。
本発明は、細胞株若しくは腫瘍サンプルから調製したライセート中の小分子化合物によるチロシンキナーゼ活性の阻害の測定方法を記述する。重要なことに、本方法はキナーゼ阻害剤の関連する作用機序を直接測定し、そして、応答状態と相関するパラメータは相対尺度(すなわち、化合物の非存在および存在下でのキナーゼ活性の比)である。27細胞株で82%という全体的正確さを伴い、これらのリンペプチドプロファイルに基づき応答体細胞株を非応答体細胞株と識別し得ることが多標的キナーゼ阻害剤MTKI−1について示される。これらのペプチドをリン酸化するキナーゼは該阻害剤の作用機序に緊密に関連する。加えて、異種移植腫瘍ライセートにおいて若しくは類似のキナーゼ阻害剤についてもまた、同一ペプチドの多くが応答体を非応答体と識別し得ることが示され、この技術が患者層別化に応用可能であるはずであることを示す。
(i)未処理サンプル若しくは試験されるべき化合物で前処理したサンプルいずれかと基質のアレイを接触させること;
(ii)未処理サンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(iii)前処理したサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
(iv)段階(ii)および段階(iii)でのアレイの応答の差違として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
び133をもつペプチドよりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなり、より具体的には、基質のアレイは配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドよりなる。
該ヒトタンパク質のSwissProtエントリ名_完全長タンパク質内の該ペプチドの開始位置_完全長タンパク質内の終止位置_リン酸化され得るチロシン若しくはセリンの位置
(i)キナーゼ阻害剤の存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること;
(ii)キナーゼ阻害剤の非存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)段階(i)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(iii)および段階(iv)でのアレイの応答の差違として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
ド状金または着色硝子若しくはプラスチック(例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)製ビーズのような比色標識を包含する。こうした標識の使用を教示する特許は、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;同第4,275,149号;および同第4,366,241号を包含する。
(i)キナーゼ阻害剤の存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること;
(ii)キナーゼ阻害剤の非存在下でサンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)段階(i)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(iv)でのアレイ基質応答に対する段階(iii)でのアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
−サンプルはいずれかの生物学的サンプル(上記)から得ることができる細胞ライセート、とりわけ、癌細胞株;異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製した細胞ライセートよりなる。
−基質のアレイは、キナーゼ基質、とりわけペプチドキナーゼ基質よりなり、より具体的には表1のペプチドキナーゼ基質の最低2、6、12、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130若しくは140ペプチドを含んでなる。なおさら
なる一態様において、基質のアレイは、配列番号4、19、24、69、113、114、136および138をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138をもつペプチドよりなる群、若しくは配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138をもつペプチドよりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなる。あるいは、基質のアレイは、キナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表2のペプチドキナーゼ基質よりなり、最も具体的には表2のペプチドキナーゼ基質の最低2、6、12、16、20、24、28、32、36、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、180、200、220若しくは240ペプチドを使用する。なおさらなる一態様において、基質のアレイ基質のアレイは配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138をもつペプチドよりなる。
−基質のアレイの応答は抗体、とりわけ蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して;最も具体的には商業的に入手可能なPY20−FITC抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察されており、従って、特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して行う。
−サンプルは多孔質マトリックス上でのインキュベーション前に、すなわち段階(i)および(ii)双方でのサンプルとの基質アレイの接触の前に濾過する。サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア(anopore)若しくはテフロン(teflon)から作成されたフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば10ないし0.1マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機0.2マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例に提供されるところのアノポア(anopore)0.2マイクロメートルフィルターを使用して。
−段階(i)で使用される細胞ライセートはキナーゼ阻害剤とプレインキュベートする。細胞ライセートの好ましいプレインキュベーション方法は試験されるべき特定の化合物および使用される細胞ライセートの型に依存するであろうことが認識されるであろう。最適の方法は慣習的方法を使用して当業者により容易に決定し得るが、しかし典型的には、適切な緩衝液、例えばリン酸およびプロテアーゼ阻害剤を含有するM−PER緩衝液(PIERCE)中で試験されるべき化合物と細胞ライセートを30分〜60分の範囲の期間インキュベートすることよりなるとみられる。
(i)癌細胞株;異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製した細胞ライセートを得;
(ii)10ないし0.1マイクロメートル範囲のフィルターで細胞ライセートを濾過し;
(iii)前記細胞ライセートの画分を試験されるべきキナーゼ阻害剤とインキュベート
し;
(iv)試験されるべきキナーゼ阻害剤の存在下で、段階(iii)のインキュベートした画分と基質のアレイを接触させ;
(v)試験されるべきキナーゼの非存在下で、キナーゼ阻害剤とインキュベートしなかった細胞ライセートの画分と基質のアレイを接触させ;
(vi)段階(iv)での前記アレイの応答を測定し;
(vii)段階(v)での前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)でのアレイ基質応答に対する段階(iv)でのアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなる。
−基質のアレイは、キナーゼ基質、とりわけペプチドキナーゼ基質よりなり、より具体的には表1のペプチドキナーゼ基質の最低2、6、12、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130若しくは140ペプチドを含んでなる。なおさらなる一態様において、基質のアレイは、配列番号4、19、24、69、113、114、136および138をもつペプチドよりなる群;15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138よりなる群、15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133よりなる群、若しくは5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなる。あるいは、基質のアレイは、キナーゼ基質、より具体的にはペプチドキナーゼ基質、なおより具体的には表2のペプチドキナーゼ基質よりなり、最も具体的には表2のペプチドキナーゼ基質の最低2、6、12、16、20、24、28、32、36、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、180、200、220若しくは240ペプチドを使用する。なおさらなる一態様において、基質のアレイは、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138をもつペプチドよりなる。
−基質のアレイの応答は、抗体、とりわけ蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して;最も具体的には商業的に入手可能なPY20−FITC抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察されており、従って、特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して行う。
−サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア(anopore)若しくはテフロン(teflon)から作成されたフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば10ないし0.1マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機0.2マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例で提供されるところのアノポア(anopore)0.2マイクロメートルフィルターを使用して。
での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍との応答体の識別を可能にするため。
ZはNHを表し;
Yは−C3-9アルキル−、−C1-5アルキル−NR13−C1-5アルキル−、−C1-5アルキル−NR14−CO−C1-5アルキル−、−C1-3アルキル−NH−CO−Het20−、若しくは−Het22−CH2−CO−NH−C1-3アルキル−を表し;
X1はO若しくは−O−C1-2アルキル−を表し;
X2は直接結合、−C1-2アルキル−、O、−O−C1-2アルキル−、NR12若しくはNR12−C1-2アルキル−を表し;
R1は水素、シアノ、ハロ若しくはヒドロキシ、好ましくはハロを表し;
R2は水素、シアノ、ハロ若しくはヒドロキシを表し;
R3は水素を表し;
R4はC1-4アルキルオキシ−を表し;
R12は水素若しくはC1-4アルキル−を表し;
R13は水素若しくはC1-4アルキルを表し;
R14は水素若しくはC1-4アルキルを表し;
Het20はピロリジニル、ピペラジニル若しくはピペリジニルを表し;および
Het22はピロリジニル、ピペラジニル若しくはピペリジニルを表す]
での処置に対して。
4,6−エタンジイリデンピリミド[4,5−b][6,1,12]ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、17−ブロモ−8,9,10,11,12,13,14,19−オクタヒドロ−20−メトキシ−13−メチル−(MTKI1);またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩
−ハロはフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードに包括的なものであり;
−C1-2アルキルはメチル若しくはエチルを定義し;
−C1-3アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピルなどのような1から3個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し;
−C1-4アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、1−メチルエチル、2−メチルプロピル、2,2−ジメチルエチルなどのような1から4個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖の飽和炭化水素基を定義し;
−C1-5アルキルは、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、1−メチルブチル、2,2−ジメチルプロピル、2,2−ジメチルエチルなどのような1から5個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し;
−C3-9アルキルは、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルなどのような3から9個までの炭素原子を有する直鎖および分枝状鎖飽和炭化水素基を定義し;
−C1-4アルキルオキシは、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、1−メチルエチルオキシ、2−メチルプロピルオキシなどのような直鎖若しくは分枝状飽和炭化水素基を定義し;
−「CO」という用語はカルボニル基を指す。
物などである。
(i)前記細胞株および/若しくは腫瘍からサンプルを得ること;
(ii)MTKI1の存在下に基質のアレイを前記サンプルと接触させること;
(iii)MTKI1の非存在下に基質のアレイを前記サンプルと接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号4、19、24、69、113、114、136および138をもつペプチドよりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体は配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドから選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される。
−基質のアレイは、マトリックス、より具体的には、例えば限定されるものでないが、例えばPCT特許公開第WO 01/19517号に記述されるような当該技術分野で公知であるところの配向された貫通型チャンネルを有するいずれかの素材を挙げることができる多孔質マトリックス上に固定され、そして典型的には金属酸化物、ガラス、酸化ケイ素若しくはセルロースから作成される。特定の一態様において、多孔質素材は、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化スズ、酸化アルミニウム、酸化チタンおよびタリウムよりなる群から選択される金属酸化物から作成され;より具体的な一態様において金属酸化物は酸化アルミニウムよりなり;
−サンプルは、原則として例えば血液、尿、唾液、組織生検若しくは剖検材料のようないずれかの生物学的サンプル、およびその後とりわけそれらの細胞ライセートであり得るが、しかし、典型的には、癌細胞株;初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株、;ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から調製した細胞ライセートよりなるとみられる。本発明の一態様において、細胞ライセートは、癌細胞株;異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製し;
−基質のアレイは配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドよりなる群から選択される最低3、4、5、6若しくは7ペプチドを含んでなり;とりわけ、基質のアレイは配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドを含んでなり;より具体的には、基質のアレイは配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドよりなり;
−基質のアレイの応答は検出可能なシグナルを使用して測定し、前記シグナルは基質のアレイとサンプルの相互作用から生じる。上で挙げられたとおり、基質のアレイとのサンプルの相互作用の測定において、シグナルは検出可能に標識された基質の物理若しくは化学特性の変化の結果、または、間接的に、基質に結合することが可能な検出可能に標識された分子と基質の相互作用の結果のいずれかである。なおさらなる一態様において、基質のアレイの応答は、抗体、具体的には蛍光標識した抗体、より具体的には蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して、最も具体的には商業的に入手可能なPY20−FITC抗体を使用して測定する。サンプル中のアゾール若しくはアジドのような抗真菌化合物の存在がアレイ応答に影響し得ることが観察され、従って特定の一態様において、基質のアレイの応答は、上の態様のいずれにおいても、抗真菌剤を含まない溶液中で、とりわけアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定する。
−応答体は、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133をもつペプチドから選択されるペプチドの最低3種に対する応答における阻害(最低<0.80の比)として同定される。
−サンプルの画分を基質のアレイへのその適用前にMTKI1とプレインキュベートする付加的な一段階。
−サンプルを基質のアレイへのそれらの適用前に濾過する付加的な一段階。サンプルの濾過は、例えば限定されるものでないが再生セルロース、セルロースエステル、ナイロン、ポリプロピレン、ガラス、アノポア(anopore)若しくはテフロン(teflon)から作成されるフィルターメンブレンを挙げることができる技術既知の手順を使用して行い、典型的には、濾過範囲は多孔質マトリックスの配向された貫通型チャンネルに一致すべきであり、そして例えば10ないし0.1マイクロメートル範囲にある。とりわけ、無機0.2マイクロメートルフィルターを使用して、より具体的には下の実施例で提供されるところのアノポア(anopore)0.2マイクロメートルフィルターを使用して。
材料および方法:
薬物応答の予測および化合物の区別でのPAMCHIPの使用。
チロシンペプチドPAMCHIP96を使用するPAMGENE技術は、96ウェルプレートの3次元多孔質ウェルにスポットした144種のチロシンペプチドのリン酸化の動的検出を可能にする(www.pamgene.com)。この技術を使用して、精製したキナーゼの活性およびそれらに対するキナーゼ阻害剤の影響を測定し得る。ホスホチロシンペプチドは、蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体の混合物を使用して検出する。ペプチドのリン酸化は、蛍光抗体に結合したリンペプチドのCCDカメラ検出を可能にするためのポンピング機構(pumping mechanism)によりアッセイの間の数秒間反応混合物を除去することの可能性によりリアルタイムで追跡し得る。これらの連続的
データ点(定量化スポット画像)が各個々のペプチドの反応速度曲線を生成し、そして各個々のペプチドに関連する初期速度および終点の計算を見込む。
必要な場合は化合物で処理した、T175フラスコ中適切な培地中で培養した細胞は、70〜90%培養密度で収集する。
100mgの凍結腫瘍若しくは組織ブロックまたは切片を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(HALT、PIERCE)を含有する1mlのM−PER緩衝液(PIERCE)に溶解する。該懸濁液はULTRA−TURRAXブレンダー(IKA werke)を使用して混合しそして12 000×gで10分間2回遠心分離する。上清ライセートを0.2マイクロメートルフィルター(Anotop 0.2μmアノポア(anopore)フィルター;Whatmann)を通して濾過する。ライセートを液体窒素中で急速凍結しかつ−80℃で保存する。
PAMCHIP実験の直前に総タンパク質含量をライセート中で定量し、そしてライセートをM−PERホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(HALT、PIERCE)を含む総容量200μl中1mg/mlに希釈する。10μgの全ライセート(10μlに対応する)をPAMCHIP96のウェルあたりに使用することができる。
ExAlpha Biologicals、アジドを含まない調製物)。2倍濃縮したキナーゼ緩衝液を氷上で冷却して調製し、DMSO若しくは化合物を適切なように添加し、そして該溶液を(化合物で処理した)氷冷ライセートに1:1添加し、そして直ちにチロシンペプチドPAMCHIP96に適用する。アッセイは標準手順に従いPAMSTATION96で実施する。すなわち、プレートの負荷後に溶液をウェルに1回ポンピングし、最初の曝露を読み取り(150m秒)、そしてその後動的読み取りプログラム(5分ごとに150m秒間読み取る)を60分間実施する。ライセートを各条件について6個の技術的複製物で実験し;複製物はチップの垂直ストリップ効果を回避するために常に相互の隣に水平に適用する。
処理。
データ(スポット画像)はEVOLVE PAMGRIDソフトウェア(PAMGENE)を使用してさらに定量化しかつペプチド同一性と結び付ける。定量化データをその後、アッセイの最初の30分に適用したVinip2曲線当てはめアルゴリズムを使用するCurveFitHTソフトウェア(PAMGENE)を使用して曲線に当てはめ;初期速度を最初の動的時間点読み取りで得る。全部のその後のデータ解析は、ソフトウェアパッケージOmnivizおよびR(Ihaka,R.とGentlemen,R.(1996)R:a languate for data analysis and graphics.J.Comput.Graph.Stat.、5、299−314)を使用して初期速度(Vini)で行った。
0.1以下のViniを0.1により置き換えた後、正規化を扱うため全部のViniをlog2変換した。その後、Viniの化合物に誘発される低下が応答するおよび応答しない腫瘍の間で有意に異なったかどうかを検定した。この検定は、技術的変動(すなわち複製物間の変動)および生物学的変動(すなわち多様な応答するおよび応答しない細胞株若しくは腫瘍間の変動)双方の組み込みを可能にする混合モデル(Littell,R.C.、Milliken,G.A.、Stroup,W.W.、Wolfinger,R.D.1996.SAS system for mixed models.ノースカロライナ州カリー;SAS Institute Inc.)を使用し、各ペプチドについて個別に行った。ViniおよびViniに対する処理効果の細胞株若しくは腫瘍間の変動を、応答状態に入れ子にした(nested)細胞株若しくは腫瘍あたりの無作為の妨害および無作為の化合物効果ごとにそれぞれモデル化した。応答するおよび応答しない細胞株若しくは腫瘍の間のViniの化合物に誘発される低下の差違を、化合物処理と応答状態(双方とも固定効果としてモデル化した)の間の交互作用により検定した。この交互作用の検定のp値は疑陽性発見比率(False Discovery Rate)手順(Benjamini,Y.とHochberg,Y.1995.Controlling the False Discovery Rate:A Practical
and Powerful Approach to Multiple Testing.J.Roy.Stat.Soc.B、57(1):289−300)を使用して多重検定について補正して、いわゆるq値をもたらした。
Pamchipペプチドアレイが多標的キナーゼ阻害剤MTKIに対する細胞株の応答を予測するための有用なツールであるかどうかを試験した。MTKIは、広範に変動するIC50でin vitroである範囲の細胞株の増殖を阻害する。多彩な癌細胞型を表すこれら27種の細胞株から調製したライセートを、各条件につき6複製物で5μM MTKIの非存在若しくは存在下でペプチドアレイ上でプロファイリングした。このパネル中
で、13細胞株は応答体細胞株(IC50<3μM;細胞株は実施例1で増大するIC50に従って配列する)と定義された一方、14細胞株は「非応答体」細胞株(IC50>10μM)と分類される。中間細胞株、および高度に変動するIC50測定値を伴う細胞株は解析から省いた。該実験は変異体EGFR L858Rを過剰発現する高度に応答性のH3255肺癌細胞株を包含した。この変異体バリアントは、EGFRの活性コンホメーションに結合するATP競合化合物であるMTKIに高度に応答性である(エルロチニブおよびゲフィニチブに類似)。従って、ライセートキナーゼ活性のMTKIにより誘導される最も顕著な変化をこの高度に応答性の細胞株について観察し得る。
NR=MTKIに対する非応答体
応答体は最少で4ペプチドが比<0.8(太字で示される)を有する場合に予測される
全体的な予測の正確さ::82%(22/27)
感度(実際の応答体の数に対する予測された応答体の数):78%(10/13)
特異度(実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数):86%(12/14)
類似のアプローチが応答体および非応答体腫瘍の分類を見込むかどうかを探求するため、上と同一の戦略を12種の異なる異種移植腫瘍に適用し、それらはヒト癌細胞株からヌード免疫無防備状態マウスで皮下に増殖させた。これらの腫瘍は6種の応答性腫瘍および6種の非応答性腫瘍に分割し得る。応答性腫瘍は、H3255、A431およびH322腫瘍の突然の腫瘍退縮からDU145、SUM149およびBT474の腫瘍増殖の強力な阻害までの範囲にわたるin vivoでのMTKIに対するそれらの応答性に従って配置する。非応答性腫瘍(H460およびH441、HT29、PC3、SKOV3、H
1703)は全部in vivoでMTKIに非応答性である。均質化した凍結腫瘍ブロックからライセートを作成し、そして前のとおり5μM MTKIの非存在若しくは存在下で分析した。全体に、大部分のペプチドのリン酸化速度は、対応する細胞株に比較して腫瘍ライセート中で有意により速かった。にもかかわらず、ペプチドリン酸化プロファイルの阻害は、リン酸化の阻害がMTKIに対する腫瘍の応答性と相関したペプチドのサブセットが存在することを示した。統計学的検定をこのデータ組に適用し(27細胞株についての前と同様)、そして応答体と非応答体を最良に識別する21ペプチドを表4AおよびBに示す。この組に使用したカットオフp値は0.1である。応答体と非応答体腫瘍を識別するためのこれらのペプチドのp値は、腫瘍の数(12)が実施例1の細胞株の数(27)よりはるかにより小さいために細胞株について得られたものより有意により小さいことに注意されたい。この腫瘍シグネチャ組のペプチドの7種が16ペプチドの細胞株シグネチャ組(実施例1)でもまた見出され、同一の活性のいくつかの阻害がin vitroでの増殖の阻害と比較してin vivoの腫瘍増殖を低下させるのに決定的に重要であることを示すが、しかしまたin vivoの情況での他のキナーゼの重要性も示すことに注意されたい。重要なことに、多くのシグネチャペプチドについて、阻害の程度はMTKIに対する腫瘍の応答性と相関した。
NR=MTKIに対する非応答体
応答体は最少で7ペプチドが比<0.8(太字で示される)を有する場合に予測される。全体的な予測の正確さ:9/12(75%)
感度(実際の応答体の数に対する予測された応答体の数):4/6(67%)
特異度(実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数):5/6(83%)
異種移植腫瘍ライセートについてと同一のアプローチをヒト組織(Proteogenexから購入した凍結組織)に適用した。急速凍結肺腫瘍および正常のマッチさせた組織を試験した。全部のサンプルが確実なシグナルを生じたこと、および異なる腫瘍がMTKI1処理に対する異なる応答をもたらしたことが見出され、この技術が一般に凍結ヒト組織に応用可能でありかつMTKI1若しくは他のチロシンキナーゼ阻害剤に対する腫瘍(および他組織)の応答を予測しうることを示唆する。
PAMCHIPSは化合物をプロファイリングおよび区別するのにもまた使用し得る。5種のチロシンキナーゼ阻害剤(左から右へ:DMSO、ラパチニブ/Tykerb、MTKI1/MTKI、ゲフィニチブ/イレッサ(Iressa)、エルロチニブ/タルセバ(Tarceva)、ZD6474(ザクチマ(zactima))は応答性細胞株NCI−H3255から調製したライセート中で異なる阻害プロファイルをもたらす。同様に、化合物を区別するためにより少なく応答性の細胞株からプロファイルが生成されている。結果を図1に表す。
標準の140ペプチドアレイの特異度および従って応答体と非応答体を識別するペプチド組の能力を向上させるため、256ペプチドの新規組を選択した。以下の戦略を使用した。すなわち、第一にホスホチロシンペプチドを質量分析(Cell Signalling Technologiesと共同で)により2種の癌細胞株DU145およびNCI−N87のライセートで同定した。これは937種のリンペプチドを生じ、それらの多くは以前に決して記述されなかった。とりわけ興味深い63種のペプチド、すなわち既知の自己リン酸化部位若しくは該937ペプチド中で実際より少なく見積もられたチロシンキナーゼの他の基質を追加した。これら1000ペプチドの全部をその後SPOT方法論(JPT、独国ベルリンによる迅速な費用効率のよいペプチド合成手順)を使用して合成し、そして7種の異なる144ペプチドアレイにスポットした。これらのアレイをMTKIの非存在および存在下で32種の異なる細胞株および腫瘍のライセートとインキュベートした。(a)ライセートの最低1種での検出可能性、(b)ライセート全体での差別的リン酸化速度、および(c)多様なライセート中でのMTKIによる差別的阻害に基づき、これらのペプチドから194ペプチドを選択した。加えて、以前の実験で有用と見出された標準の140ペプチドアレイから62ペプチドを追加した(実施例1ないし4でのもののような)。選択した256ペプチドをその後JPTにより標準的高品質手順を使用して合成し(特注合成)、そしてPamgeneにより単一アレイとしてスポットした。この新たなアレイ(256ペプチド)を使用して、MTKIの非存在若しくは存在下で前のとおり12種の異種移植腫瘍ライセートをプロファイリングした。前と同一の混合モデル統計学的解析を使用して、非応答体に対し応答体腫瘍を識別するペプチドを選択した。そ
の解析の結果を表5に示す(P値<0.1を伴う28ペプチド)。MTKIによるこれらのペプチドの多くの阻害の倍数(fold inhibition)は、140ペプチドアレイから選択されるペプチドに比較してより高く(実施例2を参照されたい)、これらのペプチドが実際にある種のMTKI標的キナーゼに対しより選択的であることを示す。最も重要には、予測の正確さは該140ペプチド組由来のペプチド組に比較して大きく改善され、上述されたペプチド選択戦略の有用性を具体的に説明する。
NR=MTKIに対する非応答体
応答体は最少で14ペプチドが比<0.7(太字で示される)を有する場合に予測される。
全体的正確さ:100%
タルセバ(Tarceva)(エルロチニブ;OSI pharmaceuticals)のようなMTKIに関係する他のEGFR阻害剤もまたこの応答予測方法論に従うかどうかを試験するため、9細胞株をMTKI若しくはタルセバ(Tarceva)(双方の場合で5μM)の存在下でプロファイリングした。小さな差違がMTKIおよびタルセバ(Tarceva)プロファイルで検出可能である(例えば、MTKIはタルセバ(Tarceva)に比較してEGFR l858Rに対するより低いIC50と一致してH3255に対しわずかにより強力であり;MTKIは、MTKIがタルセバ(Tarceva)より良好な阻害剤であるHer2により主に駆動される細胞株N87に対してもまたより強力であり;他方、タルセバ(Tarceva)は未知の理由からMTKIに比較してGTL16ライセートで付加的な活性を有する)とは言え、全体としてMTKIとタルセバ(Tarceva)の間で阻害パターンに顕著な類似が存在する(図3を参照されたい)。以前に得られたMTKI予測ペプチドの値を表6AないしCに具体的に説明する。これらのペプチドに基づき、タルセバ(Tarceva)に対する応答もまたMTKIについてと同一の正確さを伴い(ならびにH2009およびMOLT4の場合は同一の誤った予測を伴い)予測し得る。これらの結果は、MTKIに対する応答と相関する16ペプチドがありそうにはタルセバ(Tarceva)(エルロチニブ)若しくはイレッサ(Iressa)(ゲフィニチブ;AstraZeneca)のような他のEGFR阻害剤に対する応答もまた予測することを具体的に説明する。
MTKI:正確さ:78%(7/9);感度:86%(6/7);特異度:50%(1/2)
タルセバ(Tarceva):正確さ:78%(7/9);感度:86%(6/7);特異度:50%(1/2)
Pamgeneからの現在利用可能な140種のチロシンペプチドのアレイが上述されたもの以外のキナーゼ活性もまた検出することができるかどうかを検査するため、別の化合物を同じ方法論を使用してプロファイリングし:;これはcMET受容体チロシンキナーゼの完璧に選択的な阻害剤であり(US2007 0203136 A1を参照されたい)、そして式:
NR=cMETに対する非応答体
応答体は最少で7ペプチドが比<0.8(太字で示される)を有する場合に予測される。全体的な予測の正確さ:12/13(92%)
感度(実際の応答体の数に対する予測された応答体の数):6/6(100%)
特異度(実際の非応答体の数に対する予測された非応答体の数):7/8(88%)
(i)癌細胞株;初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株;ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階;
(ii)前記細胞ライセートを10ないし0.1マイクロメートル範囲のフィルターで濾過して濾過した細胞ライセートを得る段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
(iv)キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階;ならびに
段階(iv)のアレイ基質応答に対する段階(iii)のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる、上記方法。
(vi)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(vii)MTKI1の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(viii)MTKI1の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(ix)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(x)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。
(ii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。
答における阻害(最低<0.80の比)として同定される、23.に記載の方法。
(ii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。
42、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、26.に記載の方法。
(i)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(ii)605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。
33.に記載の基質のアレイ。
(i)正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
(ii)キナーゼ阻害剤の存在下で、段階(i)の細胞ライセートの画分と33.ないし38.のいずれかに記載の基質の第一のアレイを接触させる段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階(i)の細胞ライセートの画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階;および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として患者の薬理学的プロファイルを得る段階(前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する)
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法。
Claims (47)
- 多孔質マトリックス上に固定された基質の第一および第二のアレイを使用するキナーゼ阻害剤の薬理学的プロファイルを得る方法であって、前記方法が以下の段階;
(i)癌細胞株;初代および不死化組織細胞株を包含する細胞株;ヒト以外の動物モデルの生検および患者生検から細胞ライセートを調製する段階;
(ii)前記細胞ライセートを10ないし0.1マイクロメートル範囲のフィルターで濾過して濾過した細胞ライセートを得る段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第一の画分と基質の前記第一のアレイを接触させる段階、および前記第一のアレイの応答を測定する段階
(iv)キナーゼ阻害剤の非存在下で、前記濾過した細胞ライセートの第二の画分と基質の前記第二のアレイを接触させる段階、および前記第二のアレイの応答を測定する段階;ならびに
段階(iv)のアレイ基質応答に対する段階(iii)のアレイ基質応答の比として薬理学的プロファイルを得る段階
を含んでなる、上記方法。 - 前記基質がホルモン受容体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ハプテンおよびアプタマーよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記基質がキナーゼ基質である、請求項1に記載の方法。
- 前記基質がペプチドキナーゼ基質である、請求項1に記載の方法。
- 前記基質が配列番号1ないし337のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2種のペプチドキナーゼ基質である、請求項1に記載の方法。
- 前記基質が配列番号15、16、22、34、62、83、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項5に記載の方法。
- 前記基質が配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項5に記載の方法。
- 前記基質が配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項5に記載の方法。
- 前記基質が配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項5に記載の方法。
- 細胞ライセートが、癌細胞株;異種移植腫瘍、若しくは腫瘍および正常組織を包含する癌患者生検から調製される、先行する請求項1ないし9のいずれかに記載の方法。
- 基質のアレイの応答が検出可能なシグナルを使用して測定され、前記シグナルが基質のアレイとのサンプルの相互作用から生じる、先行する請求項1ないし10のいずれかに記載の方法。
- サンプルに対する基質のアレイの応答が検出可能に標識した抗体を使用して測定される、請求項1ないし11のいずれか1つに記載の方法。
- 基質のアレイの応答が蛍光標識した抗ホスホチロシン抗体を使用して測定される、請求項12に記載の方法。
- キナーゼ阻害剤について細胞、組織、器官若しくは温血動物の処理における応答体と非応答体の識別を可能にするための先行する請求項のいずれか1つに記載の方法により決定される薬理学的プロファイルの使用。
- 試験されるべきキナーゼ阻害剤がMIKI1、605およびエルロチニブよりなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 薬理学的プロファイルが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質から選択される最低2ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項14若しくは15のいずれか1つに記載の使用。
- 薬理学的プロファイルが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質から選択される最低2ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項14若しくは15のいずれか1つに記載の使用。
- 薬理学的プロファイルが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質から選択される最低2ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項14若しくは15のいずれか1つに記載の使用。
- 薬理学的プロファイルが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質から選択される最低2ペプチドを含んでなる基質のアレイを使用して決定される、請求項14若しくは15のいずれか1つに記載の使用。
- 4,6−エタンジイリデンピリミド[4,5−b][6,1,12]ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、17−ブロモ−8,9,10,11,12,13,14,19−オクタヒドロ−20−メトキシ−13−メチル−(MTKI 1);またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が;
(vi)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(vii)MTKI1の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(viii)MTKI1の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(ix)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(x)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、
87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。 - 応答体が、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(最低<0.80の比)として同定される、請求項20に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低3ペプチドを含んでなる、請求項20に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項20に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項20に記載の方法。
- 4,6−エタンジイリデンピリミド[4,5−b][6,1,12]ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、17−ブロモ−8,9,10,11,12,13,14,19−オクタヒドロ−20−メトキシ−13−メチル−(MTKI 1)、エルロチニブ若しくは605;またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が;(i)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(ii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。 - 応答体が、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(最低<0.80の比)として同定される、請求項25に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低3ペプチドを含んでなる、請求項25に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項25に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項25に記載の方法。
- 4,6−エタンジイリデンピリミド[4,5−b][6,1,12]ベンズオキサジアザシクロペンタデシン、17−ブロモ−8,9,10,11,12,13,14,19−オクタヒドロ−20−メトキシ−13−メチル−(MTKI 1)、エルロチニブ若しくは605、またはそれらの製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が;(i)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(ii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)MTKI1、エルロチニブ若しくは605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。 - 応答体が、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(最低<0.80の比)として同定される、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低3ペプチドを含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項30に記載の方法。
- 6−{ジフルオロ−[6−(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−b]ピリダジン−3−イル]−メチル}−キノリン(化合物605)またはその製薬学的に許容できる酸若しくは塩基付加塩での処理に対する非応答体細胞株および腫瘍からの応答体の識別を可能にする方法であって、前記方法が;
(i)前記細胞株および/若しくは腫瘍からのサンプルを提供すること;
(ii)605の存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iii)605の非存在下で前記サンプルと基質のアレイを接触させること;
(iv)段階(ii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;
(v)段階(iii)でのサンプルに対する前記アレイの応答を測定し;ならびに
段階(v)に対する段階(iv)でのアレイの応答の比として薬理学的プロファイルを得る
を含んでなり;基質のアレイが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低2ペプチドを含んでなることを特徴とし;ならびに、応答体が、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(比<1.0)として同定される、上記方法。 - 応答体が、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドの最低2種に対する応答における阻害(最低<0.80の比)として同定される、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択される最低3ペプチドを含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイが、配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項30に記載の方法。
- 基質のアレイの応答が抗真菌剤を含まない溶液中で、具体的にはアジドを含まない溶液を使用して抗体を使用して測定される、請求項1ないし13、20ないし39のいずれかに記載の方法。
- 配列番号1ないし337のペプチドキナーゼ基質よりなる群から選択されるペプチドを含んでなる基質のアレイであるが、但し、前記アレイが配列番号1〜140のペプチドキナーゼ基質よりならない、上記アレイ。
- 配列番号1ないし337のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項41に記載の基質のアレイ。
- 配列番号15、16、22、34、62、83、86、87、100、105、108、110、113、125、129および133のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項41に記載の基質のアレイ。
- 配列番号15、16、21、23、38、42、53、62、69、77、83、86、91、94、103、112、114、129、133、136および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項41に記載の基質のアレイ。
- 配列番号142、2、163、173、177、190、161、197、207、208、213、241、73、252、255、258、262、79、87、266、86、269、95、296、303、305、308および138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項41に記載の基質のアレイ。
- 配列番号5、10、38、30、54、57、68、72、73、74、82、91、98、99、102、104、110、135、118、119、71、138のペプチドキナーゼ基質よりなる、請求項41に記載の基質のアレイ。
- (i)正常および腫瘍組織を包含する癌患者生検から細胞ライセートを調製する段階、
(ii)キナーゼ阻害剤の存在下で、段階(i)の細胞ライセートの画分と請求項33ないし38のいずれかに記載の基質の第一のアレイを接触させる段階;
(iii)キナーゼ阻害剤の非存在下で、段階(i)の細胞ライセートの画分と基質の前記第一のアレイに同一の基質の第二のアレイを接触させる段階;および
基質の第二のアレイの応答に対する基質の第一のアレイの応答の比として患者の薬理学的プロファイルを得る段階(前記薬理学的プロファイルは可能なキナーゼ阻害剤応答を予測する)
を含んでなる、癌の処置における患者での可能なキナーゼ阻害剤応答の予測方法。
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