JP2003093095A - 大腸菌の特異的検出方法 - Google Patents
大腸菌の特異的検出方法Info
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- JP2003093095A JP2003093095A JP2001291018A JP2001291018A JP2003093095A JP 2003093095 A JP2003093095 A JP 2003093095A JP 2001291018 A JP2001291018 A JP 2001291018A JP 2001291018 A JP2001291018 A JP 2001291018A JP 2003093095 A JP2003093095 A JP 2003093095A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、大腸菌を特異的に検出できる、簡
便かつ迅速な検出方法を提供すること。 【解決手段】 ｉ）検体（微生物を含み得る試料）を大
腸菌選択液体培地で培養する工程、ii) 前記培養され
た培養物を大腸菌が特異的に溶菌する条件下で処理する
工程、iii) 工程ii）で得られる溶液（細胞ライセー
ト）中に存在する大腸菌群特異的酵素活性または大腸菌
特異的酵素活性を検出する工程、を含む、大腸菌検出方
法。特に、上記方法において、工程ii）が、0.1〜10mg/
lのリゾチーム、１〜10mMのEDTA、10〜30mMのTris-HCl
緩衝液(pH6.9〜9.1)を含む溶液中で、温度24〜38℃にて
インキュベーションすることを特徴とする方法
便かつ迅速な検出方法を提供すること。 【解決手段】 ｉ）検体（微生物を含み得る試料）を大
腸菌選択液体培地で培養する工程、ii) 前記培養され
た培養物を大腸菌が特異的に溶菌する条件下で処理する
工程、iii) 工程ii）で得られる溶液（細胞ライセー
ト）中に存在する大腸菌群特異的酵素活性または大腸菌
特異的酵素活性を検出する工程、を含む、大腸菌検出方
法。特に、上記方法において、工程ii）が、0.1〜10mg/
lのリゾチーム、１〜10mMのEDTA、10〜30mMのTris-HCl
緩衝液(pH6.9〜9.1)を含む溶液中で、温度24〜38℃にて
インキュベーションすることを特徴とする方法
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、大腸菌の特異的検
出方法に関する。特に、本発明は、簡便かつ迅速な大腸
菌の特異的検出方法に関する。
出方法に関する。特に、本発明は、簡便かつ迅速な大腸
菌の特異的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品工業、清涼飲料工業の分野では使用
する原料、水、原料、中間製品、完成製品中の生菌の管
理は極めて重要である。特に、大腸菌群（Coliform）
は、食品、飲料工業の分野において汚染の指標として最
も一般的に利用されており、中でも、大腸菌(Escherich
ia coli)は特に衛生管理上重要である。そのため、例え
ば我が国では食品衛生法に基づいて、清涼飲料水、生鮮
食品、加熱食肉製品、冷凍食品等について、大腸菌の検
査が義務づけられており、成分規格も定められている。
このような検査において、まず大腸菌を含む大腸菌
群の検査が広く行なわれている。従来から、発酵管によ
る検出法、寒天培地上の培養による検出、β−グルクロ
ニダーゼ活性を利用した蛍光検出法、PCR等を利用したD
NAレベルの検出に基づく大腸菌の検出が行われてきた。
しかしながら、寒天培地を用いた検出方法では、大腸菌
群の判定のために約４８時間程度を必要とし、発酵管に
よる方法や蛍光法は少数の菌を含む検定については検出
感度が充分とは言えない。例えば、発酵管による検査方
法では一定量以上の生菌（約106CFU/ml以上）を含む試
料には適用できるものの、それより少量の菌の存在を判
定するのは困難である。また、酵素免疫抗体法、DNAプ
ローブ法、ATPとルシフェラーゼ反応を利用した発光検
出法は微量の生菌をも測定できる可能性があるため注目
されてきているが、これらの方法は高価な機器や試薬を
必要とし、更には操作に熟練を要するなど、簡便かつ迅
速な検出方法としては必ずしも満足できる方法とは言え
ない。従って、検体中の大腸菌を簡便かつ迅速に検出で
きる検出法が強く望まれている。
する原料、水、原料、中間製品、完成製品中の生菌の管
理は極めて重要である。特に、大腸菌群（Coliform）
は、食品、飲料工業の分野において汚染の指標として最
も一般的に利用されており、中でも、大腸菌(Escherich
ia coli)は特に衛生管理上重要である。そのため、例え
ば我が国では食品衛生法に基づいて、清涼飲料水、生鮮
食品、加熱食肉製品、冷凍食品等について、大腸菌の検
査が義務づけられており、成分規格も定められている。
このような検査において、まず大腸菌を含む大腸菌
群の検査が広く行なわれている。従来から、発酵管によ
る検出法、寒天培地上の培養による検出、β−グルクロ
ニダーゼ活性を利用した蛍光検出法、PCR等を利用したD
NAレベルの検出に基づく大腸菌の検出が行われてきた。
しかしながら、寒天培地を用いた検出方法では、大腸菌
群の判定のために約４８時間程度を必要とし、発酵管に
よる方法や蛍光法は少数の菌を含む検定については検出
感度が充分とは言えない。例えば、発酵管による検査方
法では一定量以上の生菌（約106CFU/ml以上）を含む試
料には適用できるものの、それより少量の菌の存在を判
定するのは困難である。また、酵素免疫抗体法、DNAプ
ローブ法、ATPとルシフェラーゼ反応を利用した発光検
出法は微量の生菌をも測定できる可能性があるため注目
されてきているが、これらの方法は高価な機器や試薬を
必要とし、更には操作に熟練を要するなど、簡便かつ迅
速な検出方法としては必ずしも満足できる方法とは言え
ない。従って、検体中の大腸菌を簡便かつ迅速に検出で
きる検出法が強く望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、大腸菌を特
異的に検出できる、簡便かつ迅速な検出方法を提供する
ことを目的とする。
異的に検出できる、簡便かつ迅速な検出方法を提供する
ことを目的とする。
【課題を解決するための手段】本発明者らは、溶菌酵素
に対する細胞表層構造の感受性が種によって異なること
に注目して本発明を完成させるに至った。すなわち、本
発明は、大腸菌群を含み得る試料を、大腸菌が特異的に
溶菌する条件で処理し、溶菌によって得られる細胞ライ
セート中の大腸菌群特異的、または大腸菌特異的酵素活
性を測定することを特徴とする、大腸菌の特異的検出法
である。すなわち、より具体的には、 ｉ）検体（微生物を含み得る試料）を大腸菌選択液体培
地で培養する工程、 ii)前記培養された培養物を大腸菌が特異的に溶菌する
条件下で処理する工程、 iii)工程ii）で得られる溶液（細胞ライセート）中に存
在する大腸菌群特異的酵素活性または大腸菌特異的酵素
活性を検出する工程、 を含む、大腸菌検出方法である。特に本発明は、上記方
法において、工程ii）が、0.1〜10mg/lのリゾチーム、
１〜10mMのEDTA、10〜30mMのTris-HCl緩衝液(pH6.9〜9.
1)を含む溶液中で、温度25〜45℃にてインキュベーショ
ンすることを特徴とする大腸菌検出方法である。また本
発明は、上記方法において工程ii）が、0.45〜2.2mg/l
のリゾチーム、2.2〜11mMのEDTAを含む10〜30mMのTris-
HCl (pH6.9〜9.1)緩衝液中で、温度24〜38℃にてインキ
ュベーションすることを特徴とする大腸菌に対して極め
て特異的な検出方法である。また本発明は、上記方法に
おいて工程ii）が、0.9〜1.1mg/のリゾチーム、4.5〜5.
5mMのEDTAを含む18〜22mMのTris-HCl (pH6.9〜9.1)緩衝
液中で、温度24〜38℃にてインキュベーションすること
を特徴とする大腸菌に対して極めて特異的な検出方法で
ある。特に、本発明は、上記方法において工程ii）が、
0.9〜1.1mg/のリゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む10
〜30mMのTris-HCl (pH7.9〜8.1)緩衝液中で、温度24〜3
8℃にてインキュベーションすることを特徴とする大腸
菌に対して極めて特異的な検出方法である。また、本発
明は、上記方法において、インキュベーション時間が５
分間〜10分間、特に4.5分間〜5.5分間である、大腸菌に
対して極めて特異的な検出方法である。ここで、濃度は
いずれも最終濃度、すなわち溶菌時の濃度である。更
に、本発明は、上記方法において、大腸菌群特異的酵素
がβ-ガラクトシダーゼであり、大腸菌特異的酵素がβ-
グルクロニダーゼである、特異的大腸菌検出方法であ
る。
に対する細胞表層構造の感受性が種によって異なること
に注目して本発明を完成させるに至った。すなわち、本
発明は、大腸菌群を含み得る試料を、大腸菌が特異的に
溶菌する条件で処理し、溶菌によって得られる細胞ライ
セート中の大腸菌群特異的、または大腸菌特異的酵素活
性を測定することを特徴とする、大腸菌の特異的検出法
である。すなわち、より具体的には、 ｉ）検体（微生物を含み得る試料）を大腸菌選択液体培
地で培養する工程、 ii)前記培養された培養物を大腸菌が特異的に溶菌する
条件下で処理する工程、 iii)工程ii）で得られる溶液（細胞ライセート）中に存
在する大腸菌群特異的酵素活性または大腸菌特異的酵素
活性を検出する工程、 を含む、大腸菌検出方法である。特に本発明は、上記方
法において、工程ii）が、0.1〜10mg/lのリゾチーム、
１〜10mMのEDTA、10〜30mMのTris-HCl緩衝液(pH6.9〜9.
1)を含む溶液中で、温度25〜45℃にてインキュベーショ
ンすることを特徴とする大腸菌検出方法である。また本
発明は、上記方法において工程ii）が、0.45〜2.2mg/l
のリゾチーム、2.2〜11mMのEDTAを含む10〜30mMのTris-
HCl (pH6.9〜9.1)緩衝液中で、温度24〜38℃にてインキ
ュベーションすることを特徴とする大腸菌に対して極め
て特異的な検出方法である。また本発明は、上記方法に
おいて工程ii）が、0.9〜1.1mg/のリゾチーム、4.5〜5.
5mMのEDTAを含む18〜22mMのTris-HCl (pH6.9〜9.1)緩衝
液中で、温度24〜38℃にてインキュベーションすること
を特徴とする大腸菌に対して極めて特異的な検出方法で
ある。特に、本発明は、上記方法において工程ii）が、
0.9〜1.1mg/のリゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む10
〜30mMのTris-HCl (pH7.9〜8.1)緩衝液中で、温度24〜3
8℃にてインキュベーションすることを特徴とする大腸
菌に対して極めて特異的な検出方法である。また、本発
明は、上記方法において、インキュベーション時間が５
分間〜10分間、特に4.5分間〜5.5分間である、大腸菌に
対して極めて特異的な検出方法である。ここで、濃度は
いずれも最終濃度、すなわち溶菌時の濃度である。更
に、本発明は、上記方法において、大腸菌群特異的酵素
がβ-ガラクトシダーゼであり、大腸菌特異的酵素がβ-
グルクロニダーゼである、特異的大腸菌検出方法であ
る。
【０００４】
【発明の実施の形態】本発明は、大腸菌の特異的な検出
法、特に大腸菌群から大腸菌を特異的に、簡便かつ迅速
に検出する方法である。本明細書において、「大腸菌群
(Coliforms)」とは、グラム陰性、無芽胞桿菌であっ
て、乳糖を分解して酸とガスを産生する通性嫌気性の細
菌群を言う。また、本明細書において「大腸菌」とは細
菌分類学でいうEshcerichia coliをいう。従って、大腸
菌群には、大腸菌の他、エンテロバクター属(Enterobac
ter)、シトロバクター属(Citrobacter)、クレブシエラ
属(Klebsiella)等の腸内細菌科に属する細菌が含まれ
る。より具体的には、例えば、Escherichia coli、Ente
robacter aerogenes、Citrobactre freundii、Klebsiel
la pneumoniae等が大腸菌群に含まれる。
法、特に大腸菌群から大腸菌を特異的に、簡便かつ迅速
に検出する方法である。本明細書において、「大腸菌群
(Coliforms)」とは、グラム陰性、無芽胞桿菌であっ
て、乳糖を分解して酸とガスを産生する通性嫌気性の細
菌群を言う。また、本明細書において「大腸菌」とは細
菌分類学でいうEshcerichia coliをいう。従って、大腸
菌群には、大腸菌の他、エンテロバクター属(Enterobac
ter)、シトロバクター属(Citrobacter)、クレブシエラ
属(Klebsiella)等の腸内細菌科に属する細菌が含まれ
る。より具体的には、例えば、Escherichia coli、Ente
robacter aerogenes、Citrobactre freundii、Klebsiel
la pneumoniae等が大腸菌群に含まれる。
【０００５】本発明は、簡単に言えば、食品サンプル等
から調製した試料（検体）中に含まれるかもしれない細
菌群のうち大腸菌を特異的に溶解し、大腸菌特異的酵素
活性または大腸菌群特異的酵素活性を測定することによ
って大腸菌を検出する方法である。より具体的には、ま
ず、食品サンプル等から調製した試料を大腸菌群選択培
地にて一定時間培養する。次に、得られた培養液または
得られた培養液から回収した菌体を含む可能性のある固
形物に大腸菌の細胞壁を特異的に溶解する組成の酵素溶
液を添加し、大腸菌をプロトプラスト化させると同時に
バースト（溶菌）させる。プロトプラスト化に続くバー
スト（溶菌）の結果得られる細胞ライセートに対して、
大腸菌群特異的あるいは大腸菌特異的酵素活性を測定す
ることによって大腸菌の検出が行なわれる。
から調製した試料（検体）中に含まれるかもしれない細
菌群のうち大腸菌を特異的に溶解し、大腸菌特異的酵素
活性または大腸菌群特異的酵素活性を測定することによ
って大腸菌を検出する方法である。より具体的には、ま
ず、食品サンプル等から調製した試料を大腸菌群選択培
地にて一定時間培養する。次に、得られた培養液または
得られた培養液から回収した菌体を含む可能性のある固
形物に大腸菌の細胞壁を特異的に溶解する組成の酵素溶
液を添加し、大腸菌をプロトプラスト化させると同時に
バースト（溶菌）させる。プロトプラスト化に続くバー
スト（溶菌）の結果得られる細胞ライセートに対して、
大腸菌群特異的あるいは大腸菌特異的酵素活性を測定す
ることによって大腸菌の検出が行なわれる。
【０００６】本発明の方法においては、食品サンプル等
を直接液体培地に添加してもよいが、水、適切な濃度の
塩溶液または適切な緩衝液による抽出物を検査用試料と
して使用するのが操作上好ましい。緩衝液としては、細
菌に損傷を与えにくい緩衝液であればよく、例えば、中
性付近のｐＨを有するTris-HCl緩衝液、リン酸緩衝生理
食塩水等を利用することができる。抽出は、例えば、食
品サンプルを水または前述のような適切な緩衝液ととも
に混合し、ミキサーなどで撹拌混合したのち、濾過して
残渣を除去することによって行なうことができる。これ
らの抽出物は必要に応じて希釈列を調製して検査用試料
としてもよい。次に、この検査用試料を大腸菌群選択培
地に添加する。大腸菌群選択培地は、グラム陽性菌の増
殖を抑制し、大腸菌群が選択的に増殖し得る培地であれ
ばどのようなものであってもよい。培地は液体培地が好
ましい。例えば、デオキシコール酸ナトリウムはグラム
陽性菌の増殖を抑制し、大腸菌群の増殖には影響を与え
ないことが知られているため、デオキシコール酸を、例
えば0.2〜1.0g/lの濃度で含む液体培地を本発明の方法
における大腸菌群選択液体培地として使用することがで
きる。より具体的には、例えば、以下の表１に示した組
成の培地を大腸菌群選択のための液体培地として使用す
ることができる。
を直接液体培地に添加してもよいが、水、適切な濃度の
塩溶液または適切な緩衝液による抽出物を検査用試料と
して使用するのが操作上好ましい。緩衝液としては、細
菌に損傷を与えにくい緩衝液であればよく、例えば、中
性付近のｐＨを有するTris-HCl緩衝液、リン酸緩衝生理
食塩水等を利用することができる。抽出は、例えば、食
品サンプルを水または前述のような適切な緩衝液ととも
に混合し、ミキサーなどで撹拌混合したのち、濾過して
残渣を除去することによって行なうことができる。これ
らの抽出物は必要に応じて希釈列を調製して検査用試料
としてもよい。次に、この検査用試料を大腸菌群選択培
地に添加する。大腸菌群選択培地は、グラム陽性菌の増
殖を抑制し、大腸菌群が選択的に増殖し得る培地であれ
ばどのようなものであってもよい。培地は液体培地が好
ましい。例えば、デオキシコール酸ナトリウムはグラム
陽性菌の増殖を抑制し、大腸菌群の増殖には影響を与え
ないことが知られているため、デオキシコール酸を、例
えば0.2〜1.0g/lの濃度で含む液体培地を本発明の方法
における大腸菌群選択液体培地として使用することがで
きる。より具体的には、例えば、以下の表１に示した組
成の培地を大腸菌群選択のための液体培地として使用す
ることができる。
【０００７】
【表１】表１．大腸菌群選択培地の例
【０００８】本発明の方法においては、大腸菌選択培地
で培養され、対数増殖期にある大腸菌を用いるのが好ま
しい。培養は好気的条件下、例えば10mlの培地を含むL
字管を用いる場合は約40〜約70ストローク／分の振盪培
養によって行うのが好ましい。培養時間は約３〜約５時
間が好ましいが、より適切な培養時間は、例えば660nm
における培養液の吸光度(OD660)を監視することによっ
て決定することができる。例えば、OD660の経時変化を
測定しOD660が所定の値、例えば0.4〜0.6に達した時点
で次の操作を行なってよい。日常的に特定の対象を検査
する場合は、予め特定の対象試料に対して増殖曲線を作
成することによって、より適切な時期を選択することが
できる。対数増殖期にある微生物は本発明の方法によっ
て大腸菌を特異的に検出するために適している。
で培養され、対数増殖期にある大腸菌を用いるのが好ま
しい。培養は好気的条件下、例えば10mlの培地を含むL
字管を用いる場合は約40〜約70ストローク／分の振盪培
養によって行うのが好ましい。培養時間は約３〜約５時
間が好ましいが、より適切な培養時間は、例えば660nm
における培養液の吸光度(OD660)を監視することによっ
て決定することができる。例えば、OD660の経時変化を
測定しOD660が所定の値、例えば0.4〜0.6に達した時点
で次の操作を行なってよい。日常的に特定の対象を検査
する場合は、予め特定の対象試料に対して増殖曲線を作
成することによって、より適切な時期を選択することが
できる。対数増殖期にある微生物は本発明の方法によっ
て大腸菌を特異的に検出するために適している。
【０００９】培養物は必要に応じて遠心分離等を行うこ
とによって濃縮および液体培地成分を除去してもよい。
遠心の条件は、菌体が破壊されない条件であればよい。
遠心分離は、例えば6000rpm〜12,000rpmで５分間〜20分
間、低温、例えば約４℃にて行うことができる。微生
物、特に大腸菌群を含む微生物が培養物中に存在してい
れば遠心分離によって、微生物の菌体を含む固形物が沈
殿として得られる。遠心分離によって得られた固形物を
適当な濃度の緩衝液、例えば20mMのTris-HClを含む緩衝
液に懸濁して検体懸濁液とすることができる。緩衝液の
pHは、溶菌に用いる酵素溶液と一致させることが好まし
い。また、懸濁液は、OD650＝0.4〜0.5に相当する濃度
に調製するのが好ましい。場合により、上述の条件の遠
心により得られた固形物を同様な条件で更に１回以上遠
心することにより洗浄してもよい。
とによって濃縮および液体培地成分を除去してもよい。
遠心の条件は、菌体が破壊されない条件であればよい。
遠心分離は、例えば6000rpm〜12,000rpmで５分間〜20分
間、低温、例えば約４℃にて行うことができる。微生
物、特に大腸菌群を含む微生物が培養物中に存在してい
れば遠心分離によって、微生物の菌体を含む固形物が沈
殿として得られる。遠心分離によって得られた固形物を
適当な濃度の緩衝液、例えば20mMのTris-HClを含む緩衝
液に懸濁して検体懸濁液とすることができる。緩衝液の
pHは、溶菌に用いる酵素溶液と一致させることが好まし
い。また、懸濁液は、OD650＝0.4〜0.5に相当する濃度
に調製するのが好ましい。場合により、上述の条件の遠
心により得られた固形物を同様な条件で更に１回以上遠
心することにより洗浄してもよい。
【００１０】溶菌のために用いる酵素溶液は、リゾチー
ム、EDTA、を含む適切な濃度およびpHの緩衝液である。
一般には、リゾチームの濃度は0.1〜10mg/lが好まし
く、0.5〜1.5mg/lがより好ましい。EDTAの濃度は１〜10
mMが好ましく、４〜６mMがより好ましい。緩衝液として
は約10mM〜約30mMのTris-HCl緩衝液が好ましい。緩衝液
のpHは6.9〜9.1が好ましく、7.5〜8.5がより好ましい。
溶菌のための処理温度は24〜45℃が好ましく、24〜38℃
がより好ましい。本発明の方法において、特に好ましい
範囲の組み合わせは、リゾチーム0.45〜2.2mg/l、EDT
A、2.2〜11mM、10〜30mM Tris-HCl（pH6.9〜9.1）、24
℃〜38℃である。濃度は、いずれも最終濃度、すなわ
ち、溶菌のための反応混合物中の濃度である。上記条件
のうち、特異的大腸菌検出のために特に適した溶菌条件
を更に具体的かつ例示的に列挙すれば以下の通りであ
る。前述したように、濃度はいずれも溶菌反応液中の最
終濃度である。
ム、EDTA、を含む適切な濃度およびpHの緩衝液である。
一般には、リゾチームの濃度は0.1〜10mg/lが好まし
く、0.5〜1.5mg/lがより好ましい。EDTAの濃度は１〜10
mMが好ましく、４〜６mMがより好ましい。緩衝液として
は約10mM〜約30mMのTris-HCl緩衝液が好ましい。緩衝液
のpHは6.9〜9.1が好ましく、7.5〜8.5がより好ましい。
溶菌のための処理温度は24〜45℃が好ましく、24〜38℃
がより好ましい。本発明の方法において、特に好ましい
範囲の組み合わせは、リゾチーム0.45〜2.2mg/l、EDT
A、2.2〜11mM、10〜30mM Tris-HCl（pH6.9〜9.1）、24
℃〜38℃である。濃度は、いずれも最終濃度、すなわ
ち、溶菌のための反応混合物中の濃度である。上記条件
のうち、特異的大腸菌検出のために特に適した溶菌条件
を更に具体的かつ例示的に列挙すれば以下の通りであ
る。前述したように、濃度はいずれも溶菌反応液中の最
終濃度である。
【００１１】１）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5mM
〜5.5mM、Tris-HCl 18mM〜22mM、pH6.9〜9.1、24〜38℃ ２）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5mM〜5.5mM、Tri
s-HCl 18mM〜22mM、pH7.9〜8.1、24〜38℃ ３）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5mM〜5.5mM、Tri
s-HCl 18mM〜22mM、pH7.9〜8.1、29〜31℃ ４）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH7.9〜8.1、24〜26℃ ５）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH7.9〜8.1、36〜38℃ ６）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、24〜38℃ ７）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、36〜38℃ ８）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、29.5〜30.5℃ ９) リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9〜7.1、24〜26℃ １０）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、24〜38℃ １１）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、36〜38℃ １２）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、29.5〜30.5℃ 1３) リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris
-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、24〜26℃ １４）リゾチーム0.45〜0.55mg/l、EDTA 11.3〜13.8m
M、Tris-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、36〜38℃ １５）リゾチーム0.45〜0.55mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 8.9〜9.1、36〜38℃、 １６） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、29〜38℃、 １７） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、29〜31℃、 １８） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、36〜38℃、
〜5.5mM、Tris-HCl 18mM〜22mM、pH6.9〜9.1、24〜38℃ ２）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5mM〜5.5mM、Tri
s-HCl 18mM〜22mM、pH7.9〜8.1、24〜38℃ ３）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5mM〜5.5mM、Tri
s-HCl 18mM〜22mM、pH7.9〜8.1、29〜31℃ ４）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH7.9〜8.1、24〜26℃ ５）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH7.9〜8.1、36〜38℃ ６）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、24〜38℃ ７）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、36〜38℃ ８）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9.〜7.1、29.5〜30.5℃ ９) リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris-
HCl 18〜22mM、pH6.9〜7.1、24〜26℃ １０）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、24〜38℃ １１）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、36〜38℃ １２）リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tri
s-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、29.5〜30.5℃ 1３) リゾチーム0.9〜1.1mg/l、EDTA 4.5〜5.5mM、Tris
-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、24〜26℃ １４）リゾチーム0.45〜0.55mg/l、EDTA 11.3〜13.8m
M、Tris-HCl 18〜22mM、pH8.9〜9.1、36〜38℃ １５）リゾチーム0.45〜0.55mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 8.9〜9.1、36〜38℃、 １６） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、29〜38℃、 １７） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、29〜31℃、 １８） リゾチーム1.8〜2.2mg/l、EDTA 9.0〜11.0mM、
Tris-HCl 18〜22mM、pH 6.9〜9.1、36〜38℃、
【００１２】このような条件に従い、適切な組成の酵素
溶液を検体懸濁液に添加したのち、適切な温度にて約５
分間〜30分間、好ましくは5分間〜10分間、特に好まし
くは4.5分間〜5.5分間インキュベーションすることによ
って大腸菌をプロトプラスト化およびバーストさせるこ
とによって溶菌することができる。本発明に用いる酵素
溶液は低張液であるから、このような酵素溶液と共にイ
ンキュベーションすることにより大腸菌はプロトプラス
ト化し、続いて同一酵素溶液中でバーストする。このプ
ロトプラスト化とバーストは大腸菌の溶菌過程における
一連の変化であり、本明細書では両過程をあわせて「溶
菌」と呼ぶ。作用させる酵素溶液の組成および作用させ
る温度等の条件に依存してインキュベーション時間を大
腸菌特異的検出のために最適化することができる。
溶液を検体懸濁液に添加したのち、適切な温度にて約５
分間〜30分間、好ましくは5分間〜10分間、特に好まし
くは4.5分間〜5.5分間インキュベーションすることによ
って大腸菌をプロトプラスト化およびバーストさせるこ
とによって溶菌することができる。本発明に用いる酵素
溶液は低張液であるから、このような酵素溶液と共にイ
ンキュベーションすることにより大腸菌はプロトプラス
ト化し、続いて同一酵素溶液中でバーストする。このプ
ロトプラスト化とバーストは大腸菌の溶菌過程における
一連の変化であり、本明細書では両過程をあわせて「溶
菌」と呼ぶ。作用させる酵素溶液の組成および作用させ
る温度等の条件に依存してインキュベーション時間を大
腸菌特異的検出のために最適化することができる。
【００１３】一定時間インキュベーション後、残存して
いる微生物および細胞破砕断片を除去するために溶液を
濾過してもよい。この目的のためには、商業的に入手可
能なフィルターおよびフィルターユニット、例えば0.2
μmのフィルター等を利用することができる。得られた
濾液を「細胞ライセート」と呼ぶ。任意の時点でフィル
ターを用いて濾過することにより、任意の時点まで溶菌
が進行した細胞ライセートを得ることができる。このよ
うにして調製した細胞ライセートについて、大腸菌群特
異的または大腸菌特異的酵素活性を測定することによっ
て、大腸菌を検出することができる。大腸菌群特異的酵
素としては例えばβ−ガラクトシダーゼ、大腸菌特異的
酵素としては、例えばβ-グルクロニダーゼを挙げるこ
とができる。但し、β-グルクロニダーゼを使用する場
合は、一部の食肉類、魚類にβ−グルクロニダーゼ活性
があることが知られているため、大腸菌に汚染されてい
ないことが他の方法によって確認されている対照につい
て検査に先立って、あるいは、検査と並行して測定する
ことが必要である。
いる微生物および細胞破砕断片を除去するために溶液を
濾過してもよい。この目的のためには、商業的に入手可
能なフィルターおよびフィルターユニット、例えば0.2
μmのフィルター等を利用することができる。得られた
濾液を「細胞ライセート」と呼ぶ。任意の時点でフィル
ターを用いて濾過することにより、任意の時点まで溶菌
が進行した細胞ライセートを得ることができる。このよ
うにして調製した細胞ライセートについて、大腸菌群特
異的または大腸菌特異的酵素活性を測定することによっ
て、大腸菌を検出することができる。大腸菌群特異的酵
素としては例えばβ−ガラクトシダーゼ、大腸菌特異的
酵素としては、例えばβ-グルクロニダーゼを挙げるこ
とができる。但し、β-グルクロニダーゼを使用する場
合は、一部の食肉類、魚類にβ−グルクロニダーゼ活性
があることが知られているため、大腸菌に汚染されてい
ないことが他の方法によって確認されている対照につい
て検査に先立って、あるいは、検査と並行して測定する
ことが必要である。
【００１４】これらの酵素活性を測定するための方法は
当業者に良く知られたものであり、測定のための合成基
質も商業的に入手可能である。例えば、β-ガラクトシ
ダーゼ活性測定のための基質としては、X-Gal（5-ブロ
モ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトピラノシド、青
色に発色）やONPG（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピ
ラノシド、黄色に発色）が挙げられる。また、β-グル
クロニダーゼ活性測定のための基質としては、MUG（4-
メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド、蛍光を発
する）、X-Gluc（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-
D-グルクロニド、青色に発色）等が挙げられる。これら
の基質を用いて前述の酵素活性を測定する方法も当業者
には良く知られたものである。
当業者に良く知られたものであり、測定のための合成基
質も商業的に入手可能である。例えば、β-ガラクトシ
ダーゼ活性測定のための基質としては、X-Gal（5-ブロ
モ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトピラノシド、青
色に発色）やONPG（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピ
ラノシド、黄色に発色）が挙げられる。また、β-グル
クロニダーゼ活性測定のための基質としては、MUG（4-
メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニド、蛍光を発
する）、X-Gluc（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-
D-グルクロニド、青色に発色）等が挙げられる。これら
の基質を用いて前述の酵素活性を測定する方法も当業者
には良く知られたものである。
【００１５】本発明の方法においては、大腸菌群細菌の
中で大腸菌が特異的に溶菌するため、大腸菌の検出のた
めには、大腸菌群特異的酵素活性、例えばβ-ガラクト
シダーゼ活性を測定すればよい。これにより、安価なON
PGを合成基質として利用することができる。ただし、β
-ガタクトシダーゼ活性を大腸菌の存在に対する指標と
して用いる場合には、この酵素を誘導するため、前述の
大腸菌群選択培地にラクトースが含まれることが好まし
い。またガラクトースの添加は大腸菌を含む大腸菌群の
増殖を促進する効果もある。
中で大腸菌が特異的に溶菌するため、大腸菌の検出のた
めには、大腸菌群特異的酵素活性、例えばβ-ガラクト
シダーゼ活性を測定すればよい。これにより、安価なON
PGを合成基質として利用することができる。ただし、β
-ガタクトシダーゼ活性を大腸菌の存在に対する指標と
して用いる場合には、この酵素を誘導するため、前述の
大腸菌群選択培地にラクトースが含まれることが好まし
い。またガラクトースの添加は大腸菌を含む大腸菌群の
増殖を促進する効果もある。
【００１６】β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロ
ニダーゼの酵素活性測定は、当業者によく知られた方法
で行なうことができる。例えば、β-ガラクトシダーゼ
については、大腸菌を特異的溶解し、濾過後にえられた
ライセートを37℃で数分間予備加温し、適当な緩衝液、
例えば0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液または10〜30mMのTr
is-HCl緩衝液(pH7.0)に溶解した適切な濃度、例えば4mg
/ml程度のONPG溶液を加え400nmにおける吸光度を測定す
ればよい。必要により、前述のライセートは酵素活性測
定に先立ち希釈してもよく、特に段階希釈してもよい。
活性測定のための反応時間は例えば37℃において、ONPG
溶液添加から０分〜30分間でよく、０分より大きい任意
の１以上の時点で測定してよく、連続的に測定してもよ
い。大腸菌検出のためには５〜10分間の反応時間でもよ
い。対照としては、ライセートを含まない試料を用いる
ことができる。400nmにおける吸光度が対照に比べて統
計的に有意に高い場合、例えば有意水準５％として吸光
度に差が認められる場合に、もとの試料中に大腸菌が存
在していたと判定することができる。
ニダーゼの酵素活性測定は、当業者によく知られた方法
で行なうことができる。例えば、β-ガラクトシダーゼ
については、大腸菌を特異的溶解し、濾過後にえられた
ライセートを37℃で数分間予備加温し、適当な緩衝液、
例えば0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液または10〜30mMのTr
is-HCl緩衝液(pH7.0)に溶解した適切な濃度、例えば4mg
/ml程度のONPG溶液を加え400nmにおける吸光度を測定す
ればよい。必要により、前述のライセートは酵素活性測
定に先立ち希釈してもよく、特に段階希釈してもよい。
活性測定のための反応時間は例えば37℃において、ONPG
溶液添加から０分〜30分間でよく、０分より大きい任意
の１以上の時点で測定してよく、連続的に測定してもよ
い。大腸菌検出のためには５〜10分間の反応時間でもよ
い。対照としては、ライセートを含まない試料を用いる
ことができる。400nmにおける吸光度が対照に比べて統
計的に有意に高い場合、例えば有意水準５％として吸光
度に差が認められる場合に、もとの試料中に大腸菌が存
在していたと判定することができる。
【００１７】β-グルクロニダーゼについては、大腸菌
を特異的に溶解し、得られた細胞ライセートを37℃で数
分間予備加温し、適当な緩衝液、例えば50mM〜100mM Tr
is-HCl緩衝液(pH7.0〜7.2)に溶解した適切な濃度、例え
ば１〜5mg/mlのMUG溶液を加え、360nmのUVを照射して45
5nmの蛍光を測定すればよい。必要により、前述の細胞
ライセートは酵素活性測定に先立ち希釈してもよく、特
に段階希釈してもよい。活性測定のための反応時間は例
えば37℃において、MUG溶液添加から０分〜30分間でよ
く、０分より大きい任意の１以上の時点で測定してよ
く、連続的に測定してもよい。大腸菌検出のためには５
〜10分間の反応時間でもよい。対照としては、ライセー
トを含まない試料を用いることができる。蛍光強度が対
照に比べて統計的に有意に高い場合、例えば有意水準５
％として蛍光強度に差が認められる場合に、もとの試料
中に大腸菌が存在していたと判定することができる。上
述した本発明の方法により、大腸菌検出のための一連の
操作を約５時間〜約７時間で終了させることができる。
を特異的に溶解し、得られた細胞ライセートを37℃で数
分間予備加温し、適当な緩衝液、例えば50mM〜100mM Tr
is-HCl緩衝液(pH7.0〜7.2)に溶解した適切な濃度、例え
ば１〜5mg/mlのMUG溶液を加え、360nmのUVを照射して45
5nmの蛍光を測定すればよい。必要により、前述の細胞
ライセートは酵素活性測定に先立ち希釈してもよく、特
に段階希釈してもよい。活性測定のための反応時間は例
えば37℃において、MUG溶液添加から０分〜30分間でよ
く、０分より大きい任意の１以上の時点で測定してよ
く、連続的に測定してもよい。大腸菌検出のためには５
〜10分間の反応時間でもよい。対照としては、ライセー
トを含まない試料を用いることができる。蛍光強度が対
照に比べて統計的に有意に高い場合、例えば有意水準５
％として蛍光強度に差が認められる場合に、もとの試料
中に大腸菌が存在していたと判定することができる。上
述した本発明の方法により、大腸菌検出のための一連の
操作を約５時間〜約７時間で終了させることができる。
【００１８】
【実施例】実施例１．大腸菌に対する選択的検出(Ｉ)
（１）大腸菌群細菌培養物の調製
大腸菌(Escherichia coli)IFO3301、エンテロバクター
・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 12348、
シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundi
i） IFO12681、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsie
lla pneumoniae)IFO13541をスラントよりそれぞれ１白
金耳とり、Trypto-soy培地（栄研化学）（表２）10mlを
含むＬ字管で37℃にて50ストローク/分でそれぞれ８時
間振盪することにより前培養を行なった。
・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 12348、
シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundi
i） IFO12681、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsie
lla pneumoniae)IFO13541をスラントよりそれぞれ１白
金耳とり、Trypto-soy培地（栄研化学）（表２）10mlを
含むＬ字管で37℃にて50ストローク/分でそれぞれ８時
間振盪することにより前培養を行なった。
【００１９】
【表２】表２．Trypto-soy培地
【００２０】この前培養物を各細菌について0.5mlを下
記の大腸菌群選択培地（表３）10mlを含むＬ字管にそれ
ぞれ摂取し、37℃にて、50ストローク/分で本培養を３
時間行なった。
記の大腸菌群選択培地（表３）10mlを含むＬ字管にそれ
ぞれ摂取し、37℃にて、50ストローク/分で本培養を３
時間行なった。
【表３】表３．大腸菌群選択培地
【００２１】この培養物における前述の４種の細菌の増
殖曲線を図１に示した。この培養条件で、４種の細菌と
もよく増殖し、約４〜５時間程度で４種の細菌とも増殖
速度落ち、特に大腸菌は約４〜５時間でほぼ定常期に入
ることが示された。
殖曲線を図１に示した。この培養条件で、４種の細菌と
もよく増殖し、約４〜５時間程度で４種の細菌とも増殖
速度落ち、特に大腸菌は約４〜５時間でほぼ定常期に入
ることが示された。
【００２２】（２）大腸菌特異性プロトプラスト化
（１）で示したような条件で５時間培養して得られた４
種の培養物をそれぞれ10,000rpmで10分間遠心して集菌
し、20mM Tris-Hcl緩衝液（pH8.0）に懸濁し、再び10,0
00rpmで10分間遠心して集菌し、OD650＝0.45になるよう
に20mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に懸濁した。次にこの
細胞懸濁液をそれぞれ２mlとり、分光光度計のセル内に
移した。30℃に保温しておいた酵素溶液1mlを各セルに
添加し（最終濃度、リゾチーム1mg/l、EDTA 5mM、20mM
Tris-HCl、pH8.0）、30℃にてインキュベーションし、
それぞれ650nmにおける吸光度の変化を測定した。その
結果を図２に示す。図２から明らかなように、４種の大
腸菌群の細菌のうち大腸菌(E.coli)のみがプロトプラス
ト化し、バーストし、溶菌したことが示された。
種の培養物をそれぞれ10,000rpmで10分間遠心して集菌
し、20mM Tris-Hcl緩衝液（pH8.0）に懸濁し、再び10,0
00rpmで10分間遠心して集菌し、OD650＝0.45になるよう
に20mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に懸濁した。次にこの
細胞懸濁液をそれぞれ２mlとり、分光光度計のセル内に
移した。30℃に保温しておいた酵素溶液1mlを各セルに
添加し（最終濃度、リゾチーム1mg/l、EDTA 5mM、20mM
Tris-HCl、pH8.0）、30℃にてインキュベーションし、
それぞれ650nmにおける吸光度の変化を測定した。その
結果を図２に示す。図２から明らかなように、４種の大
腸菌群の細菌のうち大腸菌(E.coli)のみがプロトプラス
ト化し、バーストし、溶菌したことが示された。
【００２３】（３）ライセート中のONPGによるβ-ガラ
クトシダーゼの検出 （２）において、15分間インキュベーションして得られ
た４種類の各溶菌液（細胞ライセート）をそれぞれ0.2
μmのフィルターで濾過し、50μlのＺ緩衝液（Na2HPO4・
7H2O 16g/l、NaH2PO4・7H2O g/l、KCl 7.5g/l、MgSO4・7H
2O 0.25g/l、2-メルカプトエタノール2.7ml/l）を加え
て全量を2mlにして４種の測定試料を調製した。この溶
液にパスツールピペットでクロロホルム２滴とSDS１滴
を加えて激しく撹拌した。この溶液を37℃にて５分間イ
ンキュベーションした。次に使用直前に調製した0.4ml
のONPG溶液（50ml 0.1Mリン酸緩衝液pH7.0、ONPG 200m
g）を加え、直ちに撹拌し、吸光度を測定した。示した
各時間におけるそれぞれの試料の吸光度を図３に示し
た。図３から明らかなように大腸菌についてのみβ-ガ
ラクトシダーゼの活性が見られた。
クトシダーゼの検出 （２）において、15分間インキュベーションして得られ
た４種類の各溶菌液（細胞ライセート）をそれぞれ0.2
μmのフィルターで濾過し、50μlのＺ緩衝液（Na2HPO4・
7H2O 16g/l、NaH2PO4・7H2O g/l、KCl 7.5g/l、MgSO4・7H
2O 0.25g/l、2-メルカプトエタノール2.7ml/l）を加え
て全量を2mlにして４種の測定試料を調製した。この溶
液にパスツールピペットでクロロホルム２滴とSDS１滴
を加えて激しく撹拌した。この溶液を37℃にて５分間イ
ンキュベーションした。次に使用直前に調製した0.4ml
のONPG溶液（50ml 0.1Mリン酸緩衝液pH7.0、ONPG 200m
g）を加え、直ちに撹拌し、吸光度を測定した。示した
各時間におけるそれぞれの試料の吸光度を図３に示し
た。図３から明らかなように大腸菌についてのみβ-ガ
ラクトシダーゼの活性が見られた。
【００２４】（４）生野菜からの大腸菌の検出
代表的な生野菜であるキャベツおよびモヤシを材料とし
て大腸菌の検出を行なった。なお、キャベツおよびモヤ
シ抽出物にはβ-ガラクトシダーゼ活性も、β-ガラクト
シダーゼ阻害活性も実質的に存在しないことは確認され
ている。 （ａ）モヤシからの大腸菌の検出 市販のモヤシと生理食塩水を約１：９（体積比）の割合
で混合し、ミキサーで充分に撹拌した後0.22μmのフィ
ルターで濾過して試料液を調製した。一方、スラントよ
り大腸菌を１白金耳とり、Tripto-soy培地（表２）10ml
を含むL字管で37℃、50ストローク/分で８時間振盪培養
し前培養大腸菌を調製した。この試料液1ml、この試料
液1ml＋前培養大腸菌５μl、20mMTris緩衝液＋前培養大
腸菌５μlをそれぞれ大腸菌選択培地（表３）10mlの入
ったＬ字管に接種し、37℃、50ストローク/分で振盪培
養し、示した時間における660nmにおける吸光度をそれ
ぞれ測定した。その結果を図４に示した。この結果に基
づき、上述の条件で培養し、OD660=0.5程度に達した培
養物を実施例１（２）および（３）に記載の方法に従っ
て、プロトプラスト化に伴う溶菌による吸光度変化およ
びONPGの発色を検出した。プロトプラスト化による吸光
度変化を図５に、ONPGによる発色を図６に示した。これ
らの実験により、実験に使用したモヤシには大腸菌が含
まれていなかったこと、および、大腸菌が含まれていた
ならばこの方法によって検出し得ることが示された。な
お、OD660=0.5に達するまでの時間は、モヤシのみを含
む試料については約６時間、モヤシ＋大腸菌を含む試料
および、緩衝液＋大腸菌を含む試料については約４時間
であった。
て大腸菌の検出を行なった。なお、キャベツおよびモヤ
シ抽出物にはβ-ガラクトシダーゼ活性も、β-ガラクト
シダーゼ阻害活性も実質的に存在しないことは確認され
ている。 （ａ）モヤシからの大腸菌の検出 市販のモヤシと生理食塩水を約１：９（体積比）の割合
で混合し、ミキサーで充分に撹拌した後0.22μmのフィ
ルターで濾過して試料液を調製した。一方、スラントよ
り大腸菌を１白金耳とり、Tripto-soy培地（表２）10ml
を含むL字管で37℃、50ストローク/分で８時間振盪培養
し前培養大腸菌を調製した。この試料液1ml、この試料
液1ml＋前培養大腸菌５μl、20mMTris緩衝液＋前培養大
腸菌５μlをそれぞれ大腸菌選択培地（表３）10mlの入
ったＬ字管に接種し、37℃、50ストローク/分で振盪培
養し、示した時間における660nmにおける吸光度をそれ
ぞれ測定した。その結果を図４に示した。この結果に基
づき、上述の条件で培養し、OD660=0.5程度に達した培
養物を実施例１（２）および（３）に記載の方法に従っ
て、プロトプラスト化に伴う溶菌による吸光度変化およ
びONPGの発色を検出した。プロトプラスト化による吸光
度変化を図５に、ONPGによる発色を図６に示した。これ
らの実験により、実験に使用したモヤシには大腸菌が含
まれていなかったこと、および、大腸菌が含まれていた
ならばこの方法によって検出し得ることが示された。な
お、OD660=0.5に達するまでの時間は、モヤシのみを含
む試料については約６時間、モヤシ＋大腸菌を含む試料
および、緩衝液＋大腸菌を含む試料については約４時間
であった。
【００２５】（ｂ）キャベツからの大腸菌の検出
市販のキャベツと生理食塩水を約１：９（体積比）の割
合で混合し、ミキサーで充分に撹拌した後0.2μmのフィ
ルターで濾過して試料液を調製した。一方、スラントよ
り大腸菌を１白金耳とり、Tripto-soy培地（表２）10ml
を含むL字管で37℃、50ストローク/分で８時間振盪培養
し前培養大腸菌を調製した。この試料液1ml、この試料
液1ml＋前培養大腸菌５μl、0.02MTris緩衝液＋前培養
大腸菌５μlをそれぞれ大腸菌選択培地（表３）10mlの
入ったＬ字管に接種し、37℃、50ストローク/分で振盪
培養し、示した時間における660nmにおける吸光度をそ
れぞれ測定した。その結果を図７に示した。この結果に
基づき、上述の条件で培養し、OD660=0.5程度に達した
培養物を実施例１（２）および（３）に記載の方法に従
って、プロトプラスト化およびONPGの発色を検出した。
プロトプラスト化に伴う溶菌による吸光度変化を図８
に、ONPGによる発色を図９に示した。これらの実験によ
り、実験に使用したキャベツには大腸菌が含まれていな
かったこと、および、大腸菌が含まれていたならばこの
方法によって検出し得ることが示された。なお、OD660=
0.5に達するまでの時間は、キャベツのみを含む試料に
ついては約15.5時間、キャベツ＋大腸菌を含む試料およ
び、緩衝液＋大腸菌を含む試料については約3.5時間で
あった。
合で混合し、ミキサーで充分に撹拌した後0.2μmのフィ
ルターで濾過して試料液を調製した。一方、スラントよ
り大腸菌を１白金耳とり、Tripto-soy培地（表２）10ml
を含むL字管で37℃、50ストローク/分で８時間振盪培養
し前培養大腸菌を調製した。この試料液1ml、この試料
液1ml＋前培養大腸菌５μl、0.02MTris緩衝液＋前培養
大腸菌５μlをそれぞれ大腸菌選択培地（表３）10mlの
入ったＬ字管に接種し、37℃、50ストローク/分で振盪
培養し、示した時間における660nmにおける吸光度をそ
れぞれ測定した。その結果を図７に示した。この結果に
基づき、上述の条件で培養し、OD660=0.5程度に達した
培養物を実施例１（２）および（３）に記載の方法に従
って、プロトプラスト化およびONPGの発色を検出した。
プロトプラスト化に伴う溶菌による吸光度変化を図８
に、ONPGによる発色を図９に示した。これらの実験によ
り、実験に使用したキャベツには大腸菌が含まれていな
かったこと、および、大腸菌が含まれていたならばこの
方法によって検出し得ることが示された。なお、OD660=
0.5に達するまでの時間は、キャベツのみを含む試料に
ついては約15.5時間、キャベツ＋大腸菌を含む試料およ
び、緩衝液＋大腸菌を含む試料については約3.5時間で
あった。
【００２６】実施例２．大腸菌に対する選択的検出(II)
実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH8.0、25℃ 結果を図１０に示す。
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH8.0、25℃ 結果を図１０に示す。
【００２７】実施例３．大腸菌に対する選択的検出(II
I) 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法で菌をプロ
トプラス化し、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH8.0、37℃結果を図１１に示す。
I) 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法で菌をプロ
トプラス化し、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH8.0、37℃結果を図１１に示す。
【００２８】実施例４．大腸菌に対する選択的検出(IV)
実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法で菌をプロ
トプラス化し、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
18〜22mM、pH7.0、37℃ 結果を図１２に示す。同様な結果が、温度のみ30℃およ
び25℃とした場合にそれぞれ得られた。
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法で菌をプロ
トプラス化し、吸光度変化を測定した。ただし、酵素は
以下の条件で作用させた： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
18〜22mM、pH7.0、37℃ 結果を図１２に示す。同様な結果が、温度のみ30℃およ
び25℃とした場合にそれぞれ得られた。
【００２９】実施例５．大腸菌に対する選択的検出
（V） 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下に従った： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH9.0、37℃ 結果を図１３に示す。同様な結果が、温度のみ30℃、25
℃とした場合にもそれぞれ得られた。
（V） 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下に従った： 最終濃度：リゾチーム1.0mg/l、EDTA 5.0mM、Tris-HCl
20mM、pH9.0、37℃ 結果を図１３に示す。同様な結果が、温度のみ30℃、25
℃とした場合にもそれぞれ得られた。
【００３０】実施例６．大腸菌に対する選択的溶解(VI)
実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下の通りである： リゾチーム0.5mg/l、EDTA 12.5mM、Tris-HCl 20mM、pH
9.0、37℃ 結果を図１４に示す。
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下の通りである： リゾチーム0.5mg/l、EDTA 12.5mM、Tris-HCl 20mM、pH
9.0、37℃ 結果を図１４に示す。
【００３１】実施例７．大腸菌に対する選択的検出(VI
I) 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下の通りである： リゾチーム0.5mg/l、EDTA 10.0mM、Tris-HCl 20mM、pH
9.0、37℃ 結果を図１５に示す。
I) 実施例１（１）と同様にして、大腸菌を含む大腸菌群培
養物を調製し、実施例１（２）と同様な方法でプロトプ
ラス化を行い吸光度変化を測定した。ただし、酵素溶液
を作用させる条件は以下の通りである： リゾチーム0.5mg/l、EDTA 10.0mM、Tris-HCl 20mM、pH
9.0、37℃ 結果を図１５に示す。
【００３２】実施例８．β-グルクロニダーゼを指標と
した大腸菌に対する選択的検出 実施例１（１）と同様な条件で大腸菌 IFO3301およびエ
ンテロバクター・アエロゲネス IAM12348をそれぞれ培
養した。次に、実施例１（２）に記載したように細菌懸
濁液を調製し、その細胞懸濁液2mlを特殊分光光度計の
セル内に移した。30℃に保温しておいた酵素溶液1mlを
各セルに添加し（最終濃度、1mg/lリゾチーム、5mM EDT
A、20mM Tris-HCl、pH8.0）、30℃にてインキュベーシ
ョンして細胞ライセートを調製した。２種類の各溶菌液
（細胞ライセート）および対照溶液（緩衝液および酵素
のみ；細胞ライセートなし）をそれぞれ0.2μmのフィル
ターで濾過し、50μlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)を
加えて全量を2mlにして３種の測定試料を調製した。こ
の溶液を37℃にて５分間インキュベーションした。次に
使用直前に調製した0.25mlのMUG溶液（50mM Tris-HCl、
pH7.2中、１mg/ml）を加え、直ちに撹拌した。反応の停
止は、0.1Mグリシン-NaOH緩衝液(pH10.3)を加えること
によって行った。360nmの励起光を照射して455nmの蛍光
を測定した。示した各時間におけるそれぞれの試料の蛍
光強度を図１６に示した。図から明らかなように、大腸
菌のみが溶菌し蛍光を示したのに対し、エンテロバクタ
ー・アエロゲネスは溶菌しなかった。同じ条件でシトロ
バクター・フロインディIFO12681およびクレブシエラ・
ニューモニアエIFO13541を処理した場合、いずれの菌も
溶菌しなかった。
した大腸菌に対する選択的検出 実施例１（１）と同様な条件で大腸菌 IFO3301およびエ
ンテロバクター・アエロゲネス IAM12348をそれぞれ培
養した。次に、実施例１（２）に記載したように細菌懸
濁液を調製し、その細胞懸濁液2mlを特殊分光光度計の
セル内に移した。30℃に保温しておいた酵素溶液1mlを
各セルに添加し（最終濃度、1mg/lリゾチーム、5mM EDT
A、20mM Tris-HCl、pH8.0）、30℃にてインキュベーシ
ョンして細胞ライセートを調製した。２種類の各溶菌液
（細胞ライセート）および対照溶液（緩衝液および酵素
のみ；細胞ライセートなし）をそれぞれ0.2μmのフィル
ターで濾過し、50μlの50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)を
加えて全量を2mlにして３種の測定試料を調製した。こ
の溶液を37℃にて５分間インキュベーションした。次に
使用直前に調製した0.25mlのMUG溶液（50mM Tris-HCl、
pH7.2中、１mg/ml）を加え、直ちに撹拌した。反応の停
止は、0.1Mグリシン-NaOH緩衝液(pH10.3)を加えること
によって行った。360nmの励起光を照射して455nmの蛍光
を測定した。示した各時間におけるそれぞれの試料の蛍
光強度を図１６に示した。図から明らかなように、大腸
菌のみが溶菌し蛍光を示したのに対し、エンテロバクタ
ー・アエロゲネスは溶菌しなかった。同じ条件でシトロ
バクター・フロインディIFO12681およびクレブシエラ・
ニューモニアエIFO13541を処理した場合、いずれの菌も
溶菌しなかった。
【発明の効果】本発明により、飲料や食品サンプル等な
どに含まれている可能性のある大腸菌を特異的に、極め
て簡便かつ迅速に検出できるようになる。本発明の方法
によれば、約５〜７時間で一連の検出操作を完了させる
ことができ、専用の設備も不要で高価な試薬も必要とし
ないため安価に検出操作を行なうことがでる。さらに
は、操作に熟練を要しないため、食品等の製造工場だけ
でなく流通過程の種々の段階でも迅速かつ容易に行なう
ことができ、従って、消費者に届くまでの衛生管理がよ
り確実なものとなる。
どに含まれている可能性のある大腸菌を特異的に、極め
て簡便かつ迅速に検出できるようになる。本発明の方法
によれば、約５〜７時間で一連の検出操作を完了させる
ことができ、専用の設備も不要で高価な試薬も必要とし
ないため安価に検出操作を行なうことがでる。さらに
は、操作に熟練を要しないため、食品等の製造工場だけ
でなく流通過程の種々の段階でも迅速かつ容易に行なう
ことができ、従って、消費者に届くまでの衛生管理がよ
り確実なものとなる。
【図１】大腸菌(Escherichia coli)IFO3301（●）、エ
ンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogene
s) IAM 12348（□）、シトロバクター・フロインディ
（Citrobacter freundii） IFO12681（△）、クレブシ
エラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO135
41（◇）の増殖曲線を示す。
ンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogene
s) IAM 12348（□）、シトロバクター・フロインディ
（Citrobacter freundii） IFO12681（△）、クレブシ
エラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO135
41（◇）の増殖曲線を示す。
【図２】1mg/l リゾチーム、5mM EDTA、20mM Tris-HC
l、pH8.0、30℃における大腸菌（●）、エンテロバクタ
ー・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 12348
（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter
freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニューモ
ニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）のプロ
トプラスト化経時変化を示す。
l、pH8.0、30℃における大腸菌（●）、エンテロバクタ
ー・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 12348
（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter
freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニューモ
ニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）のプロ
トプラスト化経時変化を示す。
【図３】1mg/lゾチーム、5mM EDTA、20mM Tris-HCl、pH
8.0、30℃、15分間の溶菌処理によって得られた、大腸
菌（●）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobac
ter aerogenes) IAM 12348（□）、シトロバクター・フ
ロインディ（Citrobacter freundii） IFO12681
（△）、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pn
eumoniae) IFO13541（◇）から得られたそれぞれのライ
セート中のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。記号×は
緩衝液のみの試料である。
8.0、30℃、15分間の溶菌処理によって得られた、大腸
菌（●）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobac
ter aerogenes) IAM 12348（□）、シトロバクター・フ
ロインディ（Citrobacter freundii） IFO12681
（△）、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pn
eumoniae) IFO13541（◇）から得られたそれぞれのライ
セート中のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。記号×は
緩衝液のみの試料である。
【図４】もやし抽出物中の微生物の増殖曲線を示す。
□：もやし抽出液、■：もやし抽出液＋大腸菌、○：緩
衝液＋大腸菌
□：もやし抽出液、■：もやし抽出液＋大腸菌、○：緩
衝液＋大腸菌
【図５】もやし抽出物中の微生物のプロトプラスト化の
経時変化を示す。□：もやしのみ、■：もやし＋大腸
菌、○：緩衝液＋大腸菌
経時変化を示す。□：もやしのみ、■：もやし＋大腸
菌、○：緩衝液＋大腸菌
【図６】もやし抽出物中の微生物から得たライセート中
のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。□：もやしのみ、
■：もやし＋大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌、×：緩衝液
のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。□：もやしのみ、
■：もやし＋大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌、×：緩衝液
【図７】キャベツ抽出物中の微生物の増殖曲線を示す。
◇：キャベツのみ、◆：キャベツ＋大腸菌、○：緩衝液
＋大腸菌
◇：キャベツのみ、◆：キャベツ＋大腸菌、○：緩衝液
＋大腸菌
【図８】キャベツ抽出物中の微生物のプロトプラスト化
の経時変化を示す。◇：キャベツのみ、◆：キャベツ＋
大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌
の経時変化を示す。◇：キャベツのみ、◆：キャベツ＋
大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌
【図９】キャベツ抽出物中の微生物から得たライセート
中のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。◇：キャベツの
み、◆：キャベツ＋大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌、×：
緩衝液
中のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す。◇：キャベツの
み、◆：キャベツ＋大腸菌、○：緩衝液＋大腸菌、×：
緩衝液
【図１０】1.0mg/l リゾチーム、5.0mM EDTA、20mM Tri
s-HCl、pH8.0、25℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
s-HCl、pH8.0、25℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
【図１１】1.0mg/l リゾチーム、5.0mM EDTA、20mM Tri
s-HCl、pH8.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
s-HCl、pH8.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
【図１２】1.0mg/l リゾチーム、5.0mM EDTA、20mM Tri
s-HCl、pH7.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
s-HCl、pH7.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
【図１３】1.0mg/l リゾチーム、5.0mM EDTA、20mM Tri
s-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
s-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロバ
クター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM 1
2348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrobac
ter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニュ
ーモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）の
プロトプラスト化経時変化を示す。
【図１４】0.5mg/l リゾチーム、12.5mM EDTA、20mM Tr
is-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロ
バクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM
12348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrob
acter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニ
ューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）
のプロトプラスト化経時変化を示す。
is-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロ
バクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM
12348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrob
acter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニ
ューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）
のプロトプラスト化経時変化を示す。
【図１５】0.5mg/l リゾチーム、10.0mM EDTA、20mM Tr
is-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロ
バクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM
12348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrob
acter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニ
ューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）
のプロトプラスト化経時変化を示す。
is-HCl、pH9.0、37℃における大腸菌（●）、エンテロ
バクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes) IAM
12348（□）、シトロバクター・フロインディ（Citrob
acter freundii） IFO12681（△）、クレブシエラ・ニ
ューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) IFO13541（◇）
のプロトプラスト化経時変化を示す。
【図１６】1mg/lゾチーム、5mM EDTA、20mM Tris-HCl、
pH8.0、30℃、５分間の溶菌処理によって得られた、大
腸菌（●）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterob
acter aerogenes) IAM 12348（□）からのそれぞれのラ
イセート中のβ-グルクロニダーゼ活性を示す。記号○
は緩衝液のみの試料である。図中、○と□はほとんど重
なっている。
pH8.0、30℃、５分間の溶菌処理によって得られた、大
腸菌（●）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterob
acter aerogenes) IAM 12348（□）からのそれぞれのラ
イセート中のβ-グルクロニダーゼ活性を示す。記号○
は緩衝液のみの試料である。図中、○と□はほとんど重
なっている。
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フロントページの続き
(72)発明者 一色 賢司
茨城県牛久市神谷２−３−22
(72)発明者 蛭田 修
神奈川県小田原市祖比3217−６
Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ35 QR15
QR57 QS11 QS24 QS36 QX02
Claims (24)
- 【請求項１】 （ｉ）検体を大腸菌群選択液体培地で培
養する工程、（ii）工程(i)で得られた培養物を大腸菌
が特異的に溶菌する条件で処理する工程、（iii）工程
(ii)によって得られた溶液中の大腸菌群特異的酵素活性
または大腸菌特異的酵素活性を測定する工程、を含む大
腸菌の特異的検出方法。 - 【請求項２】 （ｉ）検体を大腸菌群選択液体培地で培
養する工程、(ii) 工程(i)で得られた培養物を0.1〜10
mg/lのリゾチーム、１〜14mMのEDTAを含むpH6.9〜9.1の
10〜30mMのTris-HCl緩衝液中で温度24〜38℃にてインキ
ュベーションする工程、（iii）工程(ii)で得られた溶
液中の大腸菌群特異的酵素活性または大腸菌特異的酵素
活性を測定する工程、を含む、請求項１に記載の大腸菌
の特異的検出方法。 - 【請求項３】 工程(ii)が、培養物を0.45〜2.2mg/lの
リゾチーム、2.2〜11mMのEDTAを含む10〜30mMのTris-HC
l緩衝液（pH6.9〜9.1）中で温度24〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項４】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH6.9〜9.1）中で温度24〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項５】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH7.9〜8.1）中で温度24〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項６】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH7.9〜8.1）中で温度29〜31℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項５記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項７】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH7.9〜8.1）中で温度24〜26℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項５記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項８】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH7.9〜8.1）中で温度36〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項５記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項９】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lのリ
ゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH6.9〜7.1）中で温度24〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項１０】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH6.9〜7.1）中で温度36〜38℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項９記載の大腸菌の
特異的検出方法。 - 【請求項１１】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH6.9〜7.1）中で温度29〜31℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項９記載の大腸菌の
特異的検出方法。 - 【請求項１２】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH6.9〜7.1）中で温度24〜26℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項９記載の大腸菌の
特異的検出方法。 - 【請求項１３】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度24〜38℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の
特異的検出方法。 - 【請求項１４】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度36〜38℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項１３記載の大腸菌
の特異的検出方法。 - 【請求項１５】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度29〜31℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項１３記載の大腸菌
の特異的検出方法。 - 【請求項１６】 工程(ii)が、培養物を0.9〜1.1mg/lの
リゾチーム、4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris
-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度24〜26℃にてインキ
ュベーションする工程、である請求項１３記載の大腸菌
の特異的検出方法。 - 【請求項１７】 工程(ii)が、培養物を0.45〜0.55mg/l
のリゾチーム、11.3〜13.8mMのEDTAを含む18mM〜22mMの
Tris-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度36〜38℃にてイ
ンキュベーションする工程、である請求項２記載の大腸
菌の特異的検出方法。 - 【請求項１８】 工程(ii)が、培養物を0.45〜0.55mg/l
のリゾチーム、9.0〜11.0mMのEDTAを含む18mM〜22mMのT
ris-HCl緩衝液（pH8.9〜9.1）中で温度36〜38℃にてイ
ンキュベーションする工程、である請求項２記載の大腸
菌の特異的検出方法。 - 【請求項１９】 工程(ii)が、培養物を1.8〜2.2mg/lの
リゾチーム4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH6.9〜9.1）中で温度29〜31℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項２０】 工程(ii)が、培養物を1.8〜2.2mg/lの
リゾチーム4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH6.9〜9.1）中で温度36〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項２１】 工程(ii)が、培養物を1.8〜2.2mg/lの
リゾチーム4.5〜5.5mMのEDTAを含む18mM〜22mMのTris-H
Cl緩衝液（pH6.9〜9.1）中で温度29〜38℃にてインキュ
ベーションする工程、である請求項２記載の大腸菌の特
異的検出方法。 - 【請求項２２】 大腸菌群特異的酵素がβ-ガラクトシ
ダーゼであり、大腸菌特異的酵素がβ-グルクロニダー
ゼである、請求項１〜２１に記載の大腸菌の特異的検出
方法。 - 【請求項２３】 工程(ii)におけるインキュベーション
時間が５分間〜10分間である、請求項２〜２２に記載の
大腸菌の特異的検出方法。 - 【請求項２４】 工程（ii）におけるインキュベーショ
ン時間が4.5分間〜5.5分間である、請求項２３に記載の
大腸菌の特異的検出方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001291018A JP2003093095A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | 大腸菌の特異的検出方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2001291018A JP2003093095A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | 大腸菌の特異的検出方法 |
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|---|---|
| JP2003093095A true JP2003093095A (ja) | 2003-04-02 |
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|---|---|---|---|
| JP2001291018A Pending JP2003093095A (ja) | 2001-09-25 | 2001-09-25 | 大腸菌の特異的検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003093095A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2308993A1 (en) * | 2009-09-28 | 2011-04-13 | Sysmex Corporation | Bacteria analysis apparatus, bacteria analysis method and computer program product |
| JP2012000076A (ja) * | 2010-06-21 | 2012-01-05 | Nissui Pharm Co Ltd | β−グルクロニダーゼ含有飲食品中の大腸菌検出用培地 |
| JP2013116053A (ja) * | 2011-12-01 | 2013-06-13 | Nissui Pharm Co Ltd | 腸管出血性大腸菌検出用培地 |
| JP2015006189A (ja) * | 2006-10-27 | 2015-01-15 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎａａｍｌｏｚｅ Ｖｅｎｎｏｏｔｓｃｈａｐ | キナーゼ阻害剤のプロファイリング方法 |
| KR102141430B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2020-08-05 | 국민대학교산학협력단 | 식품으로부터 병원성 미생물을 분리 및 검출하는 방법 |
-
2001
- 2001-09-25 JP JP2001291018A patent/JP2003093095A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
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| KR102141430B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2020-08-05 | 국민대학교산학협력단 | 식품으로부터 병원성 미생물을 분리 및 검출하는 방법 |
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