JP5321780B2 - 肺癌の治療方法 - Google Patents

Description

本発明は、肺癌の治療に関する。

上皮成長因子受容体 (Epidermal growth factor receptor; EGFR)は、多様な組織に由来する固形癌の成長に重要な役割を果しており、調査した非小細胞肺癌において40-80％の過剰発現をしていた(Salomon DS, et al., Crit Rev Oncol Hematol 1995;19:183-232.; Mendelsohn J, et al., Oncogene 2000;19:6550-65.)。EGFRの過剰発現は、肺癌患者の予後不良にも関連している(Selvaggi G, et al., Ann Oncol 2004;15:28-32.)。ゲフィチニブ（イレッサ、ZD1839）は、癌細胞の拡散、浸潤、そして生存に関連したEGFRシグナル経路の鍵となる酵素であるEGFRチロシンキナーゼの経口投与阻害剤である(Wakeling AE, et al., Cancer Res 2002;62:5749-54.)。
白金製剤を用いた化学療法が効果を示さなかった進行性の非小細胞肺癌患者に対する治験においては、ゲフィチニブは有効な抗腫瘍効果を示した(Fukuoka M, et al., J Clin Oncol 2003;21:2237-46.; Kim YH, et al., Clin Cancer Res 2004;10:7311-7.)。これらの知見に基づいて、日本、オーストラリア、アメリカを含む数カ国において、進行した非小細胞肺癌の治療にゲフィチニブが用いられてきた。

日本では、認可後およそ37,000人の進行した非小細胞肺癌患者にこの薬が処方された(Evans TL. Oncologist 2004;9:232-8.)。しかしながら、ゲフィチニブは多くの日本人患者に予後やQOLの改善を示したものの、その60％には症状の改善が見られなかった。それだけでなく、5.4％の人が重篤なゲフィチニブ誘導性の急性間質性肺炎を発症した(Takano T, et al., Lung Cancer 2004;45:93-104.)。したがって、ゲフィチニブが有効な患者を医師が選択できる指標が必要とされる。

しかし、EGFRの体細胞変異を含むこれまでに検討された因子は、いずれも病気のコントロールや延命効果の観点からゲフィチニブ投与に対する応答性を決定できるものではなかった。すなわち、現在のところ、ゲフィチニブに対する応答性の低い患者と、応答性を有する患者を正しく判別することが可能な指標は明らかにされていない。
EGFRの変異の存在に基づいて、ゲフィチニブに対して部分奏功(partial response;(PR))する患者を予測しうることが報告されている。しかし、安定状態を維持している患者が延命効果を得られることをはっきりと示すことはできない(Lynch TJ, et al., N Engl J Med 2004;350:2129-39.; Paez JG et al., Science 2004;304:1497-500.; Pao W, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:13306-11.; Tokumo M, et al., Clin Cancer Res 2005;11:1167-73.; Mitsudomi T, et al., J Clin Oncol 2005;23:2513-20.)。

最近になって、進行した非小細胞肺癌で発現する遺伝子の発現情報の統計的な解析により、ゲフィチニブ感受性に関連した12種類の遺伝子が見出された。そして、ゲフィチニブの投与に対し部分奏功する患者群(PR)と病気が進行する群(PD)との間で発現レベルが大きく異なる遺伝子の発現レベルに基づいたゲフィチニブ応答性スコアリングシステムが提案されている(Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.; WO 2005/49829)。
WO 2005/49829 Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.

本発明の課題は、肺癌の新規な治療技術を提供することである。具体的には、ゲフィチニブに代表されるerbB受容体阻害剤に対する応答性を有する肺癌患者を応答性の低い患者から識別し、応答性が期待できる患者へのerbB受容体阻害剤の投与を可能とする技術を提供する。あるいは、本発明の好ましい態様において、erbB受容体阻害剤に対する応答性が低い患者を高い感度で検出しうる技術が提供される。

前記のゲフィチニブ応答性スコアリングシステム(Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.; WO 2005/49829)に基づく予測結果は、追加で行った全ての被検対象症例（PRおよびPD）において、ゲフィニチブ臨床応答性と一致した。さらに、このシステムは安定状態（SD）の患者群を、長期間腫瘍の状況を安定に維持することができる群と、そうでない群の二つに区別することも可能であった。しかしながら、発現プロファイルや変異の分析には、生検や手術による臨床検体の取得が必要である。ところが現実には、通常、進行した非小細胞肺癌においては、生検や手術は行われない。そのため、スコアリングに必要なサンプルを患者から得ることは困難である。つまり、前記ゲフィチニブ応答性スコアリングシステムは、臨床現場への応用が難しい方法であった。

そのため、ゲフィチニブ治療に対する肺癌の感受性や抵抗性を、血清学的なマーカーを用いて予測できる実用的な診断法の開発が早急に望まれている。この目標のためのステップとして、前述したようにcDNA マイクロアレイ解析により、ゲフィチニブ非応答性の患者より取得した腫瘍組織において、二つのEGFRリガンドamphiregulin（以下、AREGと記載することがある）とtransforming growth factor-alpha（TGF-α、以下TGFAと記載することがある）をコードする遺伝子が過剰発現していたことを明らかにした（Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.)。そして、TGFAの血清レベルは、ゲフィチニブ応答性を予測するための指標としうる可能性も示された(WO 2005/49829)。

とはいえ、血中TGFAレベルのみを指標とした場合には、非応答性患者の半数以上は、応答性患者と識別することができない。具体的には、血中TGFAレベルに基づいてポジティブと判定された患者は、ほぼ完全(約95%)にゲフィチニブ応答性が低い患者であった。しかし一方で、血中TGFAレベルに基づいてネガティブと判定された患者の中にも、なおゲフィチニブ応答性が低い患者も多く含まれていた。つまり、血中TGFAレベルは、特異度(specificity)は高いものの、ゲフィチニブ応答性が低い患者の検出感度(sensitivity)に改善の余地を残す指標であった。
したがって、ゲフィチニブ応答性患者を、非応答性患者とより正確に識別することができる方法の提供が待たれる。より具体的には、ゲフィチニブ応答性が低い患者の検出感度を改善することが本発明の課題である。

血液中の物質を指標とするゲフィチニブ応答性予測は、次のような利点を有する。
−検査試料（血液）の採取が容易：たとえば外科的手術によって摘出される癌組織や、生検試料と比較して、血液試料の採取は、患者の負担（侵襲性）が明らかに小さい。
−定量的な測定が容易：血中マーカーは、免疫学的な測定方法などの簡便な方法で迅速に、かつ定量的に分析することができる点も有利である。

ところが、公知のゲフィチニブ応答性予測のためのマーカーである血中TGFAは、ゲフィチニブ応答性が低い患者の検出感度に改善の余地を残していた。なお検出感度は、検出すべき表現型（すなわち応答性が低いこと）を有する患者の検出感度を意味する。言い換えれば、ある血中マーカーの「検出感度」とは、当該血中マーカーを指標とする予測方法によって見出された患者数の、検出すべき表現型を有する全ての患者数に占める割合と見なすこともできる。あるいは、当該血中マーカーの測定値に基づいて、目的とする患者を見出すことができる確率と考えることもできる。したがって、検出感度が低い場合には、検出すべき表現型を有する患者を見落としている可能性が高まる。検出されるべき患者のうち、見落とされる患者は、統計学的には擬陰性(false negative)と呼ばれる。

血中マーカーの検出感度は、統計学的に算出される数値である。一般に、統計学的には、検出感度と擬陽性率がトレードオフの関係にある。たとえば、カットオフ値を低く設定することによって、検出感度は高まる。しかしカットオフ値を低く設定すると、検出感度のみならずノイズ（擬陽性;false positive）が増える。ここでいうノイズとは、「応答性を有する患者」に相当する。つまり、実際には応答性を有しているのにもかかわらず、応答性が低い患者として判定される患者が増えることを意味している。このように、カットオフ値を下げると、通常、予測精度の低下は避けられない。つまりある表現型を検出するためのマーカーの検出感度は、そのマーカーに固有の統計学的な数値である。

本発明者らは、血中TGFAレベルに基づく応答性の予測方法の検出感度の改善を目的として研究を重ねた。その結果、血中のTGFAとamphiregulin(AREG)の２種類のマーカーのレベルを指標とすることによって、血中TGFA単独で予測したときの検出感度を、大幅に改善できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の、肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法、この検査方法に基づく肺癌の治療方法、並びにそのための試薬、あるいはキットに関する。

〔１〕血中のAREG濃度が基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法。
〔２〕血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度のいずれか、または両方が基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法。
〔３〕血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度のいずれかが基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、〔２〕に記載の肺癌の治療方法。
〔４〕erbB受容体阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、PKI-166、ペリチニブ、ラパチニブ、およびカネルチニブからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔１〕に記載の治療方法。
〔５〕血中のAREG濃度が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための、erbB受容体阻害剤を有効成分として含有する肺癌の治療剤。
〔６〕血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度の両方が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための、erbB受容体阻害剤を有効成分として含有する肺癌の治療剤。
〔７〕erbB受容体阻害剤が、ゲフィチニブ、エルロチニブ、PKI-166、ペリチニブ、ラパチニブ、およびカネルチニブからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔５〕または〔６〕に記載の肺癌の治療剤。
〔８〕erbB受容体阻害剤の、血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度の両方が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための肺癌の治療剤の製造における使用。

〔９〕次の要素を含む、肺癌の治療用キット；
(1) erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤；および
(2) 血中のAREG濃度が基準値と比較して高い患者は、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いことを記載した指示書。
〔１０〕付加的に次の要素を含む、〔９〕に記載の肺癌の治療用キット；
(3) 血中のTGFA濃度が基準値と比較して高い患者は、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いことを記載した指示書。

〔１１〕次の工程を含む、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法；
(1) 肺癌患者の血液試料のAREG濃度を測定する工程、および；
(2) AREG濃度が基準値と比較して高いときに、当該患者がerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いと判定される工程。
〔１２〕付加的に、次の工程を含む、〔１１〕に記載の検査方法；
(1) 肺癌患者の血液試料のTGFA濃度を測定する工程、および；
(2) AREG濃度およびTGFA濃度のいずれか、または両方が基準値と比較して高いときに、当該患者がerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いと判定される工程。
〔１３〕AREG濃度およびTGFA濃度のいずれかが基準値と比較して高いときに、当該患者がerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いと判定される〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕血液試料のAREG濃度をイムノアッセイによって測定することを特徴とする〔１１〕に記載の検査方法。

〔１５〕次の要素を含むerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査用キット；
i. AREGの血液中濃度を測定するためのイムノアッセイ用試薬、および
ii. AREGの陽性対照。
〔１６〕付加的に次の要素を含む〔１５〕に記載の検査用キット；
iii. TGFAの血液中濃度を測定するためのイムノアッセイ用試薬、および
iv. TGFAの陽性対照。
〔１７〕陽性対照試料が、AREGおよびTGFAの両方を含む〔１６〕に記載の検査用キット。
〔１８〕陽性対照試料が液体である〔１７〕に記載の検査用キット。

本発明によって、血中マーカーに基づくerbB受容体阻害剤に対する応答性予測方法が提供された。血中マーカーは血液を試料として簡便に、安価に測定することができる。またイムノアッセイなどの手法によって、定量的に評価することができる。更に本発明においては、既知のマーカーであるTGFAに加え、第２のマーカーとしてAREGを加えることによって、応答性の低い患者の検出感度が著しく改善される。

更に本発明は、本発明によってerbB受容体阻害剤に対する応答性が予測された患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法を提供した。erbB受容体阻害剤には、ゲフィチニブなどが含まれる。ゲフィチニブは、できるだけ応答性が期待される患者を選んで投与するのが望ましいと考えられている薬剤である。本発明によれば、応答性の低い患者を高い感度で検出し、応答性が期待される患者を特異的に選択することができる。その結果、ゲフィチニブなどのerbB受容体阻害剤を用いる肺癌の治療方法において、その治療効果を飛躍的に改善できる可能性がある。

また本発明によって、応答性が期待できない患者への薬剤投与に伴う、必要の無い副作用の不利益を防ぐこともできる。治療効果の期待できない薬物による副作用は、患者の生活の質(QOL)を著しく損なう。一般に、薬剤の投与をはじめとする疾患の治療行為には、程度の差はあれ、副作用の危険が伴う。したがって、副作用の不利益(risk)と、期待される治療効果(benefit)を勘案し、もっとも治療効果が大きいと考えられる治療方法を選択するのが、医療の原則である。治療効果(benefit)が期待できない治療行為は、本来選択すべきではない。したがって、応答性の低い患者を予め予測できることは、肺癌患者の生活の質を高めることにもつながる。

TGFAとAREGは、いずれも肺癌の組織における発現レベルとゲフィチニブ応答性との間の関連性が指摘されているEGFRリガンドである。更にTGFAについては、その血中レベルとゲフィチニブ応答性の関連性も明らかにされている。しかし、AREGの血中レベルがerbB受容体阻害剤に対する応答性の予測マーカーとなることは報告されていない。更に、TGFAとAREGの予測結果を組み合わせることによって、TGFA単独で予測した場合と比較して、応答性の低い患者の検出感度が著しく改善できることは、予想を超える知見であった。具体的には、AREGとの組み合わせによって、血中TGFAによる予測では検出できない患者の５０％以上を検出することができる。言い換えれば、TGFAの測定によって見逃される、実際には応答性の低い患者の半数以上を、AREGによって拾い上げることができるのである。

更に詳細に見ると、TGFAとAREGの検出感度は、たとえば後に述べる実施例のデータにおいては、それぞれ４３．３％および４０％である。この結果は、これらのマーカーを測定することによって、応答性の低い患者の４０％強が見出されることを示している。本発明者らは、TGFA陽性患者と、AREG陽性患者のそれぞれについて、更に詳細に解析した。そして、両者が完全にはオーバーラップしないことを見出した。つまり、TGFAとAREGの２つのマーカーを指標とすることによって、それぞれ単独では見落とされる患者が互いに補われていた。その結果、最終的には、それぞれのマーカーを単独で利用したときに見落とされる患者の５０％以上を、新たに検出することができた。

更に、本発明の望ましい態様においては、PDの症例をPRもしくはSD患者と区別することができる。これに対して、公知の、EGFRの変異を解析する方法では、PRの患者を選択することはできるがSDの患者を認識することが殆どできなかった。これは、本発明の重要な利点の一つである。

erbBファミリーに属するチロシンカイネース受容体が、細胞増殖や、癌細胞の生存に密接に関連することが明らかにされている。この種の受容体には、erbB2、erbB3、erbB4、あるいはEGFRなどが知られている(Klapper LN. et al.,Adv. Cancer Res. 2000, 77:25-79)。これらの受容体の発現レベルが高い癌は、活動性が高く予後が悪い傾向にあることが観察されている。逆に、erbBの発現や活性を阻害することによって、細胞増殖が抑制されることも明らかにされた(Mendelsohn et al., Oncogene 2000, 19, 6550-65)。これらの知見に基づいて、erbBファミリーに属するチロシンカイネース受容体阻害剤の抗癌剤としての開発が進められた。ゲフィチニブも、こうした経緯で見出された化合物である。

本発明において、erbB受容体阻害剤とは、erbBファミリーに属するチロシンカイネース受容体の活性を抑制する作用を有する化合物を言う。したがって、たとえば、erbB2、erbB3、erbB4、あるいはEGFRの活性阻害剤は、本発明におけるerbB受容体阻害剤に含まれる。
erbB受容体阻害剤は、特定の受容体に対して特異的に作用する化合物であることもできるし、複数の受容体に対して作用する化合物であっても良い。本発明において、受容体の活性の阻害とは、リガンドとの結合によって細胞にシグナルを伝達する受容体機能のいずれかの段階を抑制することを言う。したがって、リガンド−受容体間の結合を阻害するアンタゴニストは、代表的なerbB受容体阻害剤である。あるいは、シグナル伝達に必要なチロシンカイネース活性に対する阻害作用を有する化合物も、erbB受容体阻害剤に含まれる。たとえばゲフィチニブは、経口投与により、生体中でEGFR受容体のシグナル伝達をブロックすることにより、癌細胞の増殖を阻害する。
具体的には、たとえば、次のような化合物を本発明におけるerbB受容体阻害剤として示すことができる。これらの化合物は、医学的に許容される塩として投与することもできる。本発明における好ましいerbB受容体阻害剤はゲフィチニブである。

ゲフィチニブ：
N-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)quinazolin-4-amine); (Gefitinib; ZD1839, Chemical Abstracts Registry Number 184475-25-2、商品名「イレッサ/Iressa」, Woodburn, J.R., et al.：Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 633 Abs 4251, 1997; Pharmacol. Ther., 1999, 82, 241-250)

エルロチニブ：
N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine; （Erlotinib, OSI-774, Chemical Abstracts Registry Number 183319-69-9, 商品名「タルセバ/Tarceva」WO 99/55683）

開発コードPKI-166：
4-[(1R)-1-phenylethylamino]-6-(4-hydroxyphenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine; (PKI-166, WO 97/02266)

ペリチニブ：
2-Butenamide, N-(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-3-cyano-7-ethoxy-6-quinolinyl)-4-(dimethylamino)-, (2E)-; (Pelitinib; EKB-569, Chemical Abstracts Registry Number 257933-82-7, Torrance CJ, et al., Nature Med. 2000, 6, 1024-1028, US 6002008)

ラパチニブ：
N-(3-chloro-4-(((3-fluorobenzyl)oxy)phenyl)-6-(5-(((2-methylsulfonyl)ethyl)amino)methyl) -2-furyl)-4-quinazolinamine; (Lapatinib, GW572016, Chemical Abstracts Registry Number 231277-92-2, WO 99/35146, WO 01/04111)

カネルチニブ：
2-Propenamide, N-(4-((3-chloro-4-fluorophenyl) amino)-7-(3-(4-morpholinyl) propoxy)-6-quinazolinyl); (Canertinib; CI-1033, Chemical Abstracts Registry Number 289499-45-2, Smaill JB, et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 1803-15, WO 00/31048)

一般に、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤の投与によって、治療すべき癌病巣を構成する腫瘍の縮退が確認できた患者は、治療剤に対する応答性があると見なされる。逆に、治療剤の投与による腫瘍の縮退が確認できない患者は、応答性が無いと見なされる。応答性の程度を比較するためのいくつかの基準が確立されている。本発明における応答性は、たとえば、これらの公知の抗癌剤に対する応答性の比較基準に基づいて判定することができる。

1970年代に国際対癌連合(International Union Against Cancer;UICC)は抗腫瘍剤の効果の判定基準を提唱した(Eur J Cancer 13：89-94，1977)。WHO（世界保健機構;World Health Organization）もこの評価体系を推奨した (WHO offset Publication No.48，1979)。WHOの評価体系は、代表的な応答性の判定基準である (Miller AB et al., Cancer 1981; 47:207-14)。その後、WHOのガイドラインの問題点として、誤って進行(PD)と判定されるケースが見られることが指摘された。そこで、Southwest Oncology Group (SWOG)などの研究グループは、新たなガイドラインを作成した (Green S and Weiss GR., Invest New Drugs 1992; 10:239-53)。Green と Weissのガイドラインでは、主に、PDの基準が見直された。

更に、これらの評価基準を元に、RECIST（Response Evaluation Criteria in Solid Tumores Group）が新たに策定したガイドラインも、代表的な評価基準のひとつである(Therasse P, et al., J Natl. Cancer. Ins. 2000, Vol.92, No.3, 205-16)。WHOのガイドラインとRECISTのガイドラインの主な相違点は、腫瘍の大きさの測定方法である。WHOのガイドラインにおいては、抗癌剤の効果を腫瘍の体積の和（２次元的情報）の変化に基づいて判断している。一方、腫瘍の最長径の和（一次元的情報）で評価するのが、RECISTのガイドラインである。表１に、これらのガイドラインの概要をまとめた。

CR: 完全奏功 (Complete Response)
PR: 部分奏功 (Partial Response)
SD: 安定 (Stable Disease); NC 変化無し (No Change)とも記載される
PD: 進行 (Progressive Disease)

なお実際には、これらのガイドラインにおいては、腫瘍の大きさの変化に基づく効果の判定基準に加えて、たとえば次のような、治療効果の判定にあたって必要とされるさまざまな注意事項が指摘されている。いずれにせよ当業者は、ある抗癌剤に対する患者の応答性を、これら公知のガイドラインに基づいて、客観的に評価することができる。
統計学的な基準
腫瘍組織の測定方法の基準
腫瘍マーカーの測定
組織学的な検査
診察結果の記録方法
非標的組織の評価

肺癌患者のerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性は、たとえば肺癌組織におけるいくつかのマーカー遺伝子の発現レベルを指標とするスコアリングシステムによって高い精度で予測しうる(Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.; WO 2005/49829)。ところが、肺癌組織は必ずしも採取が容易なサンプルとはいえない。また肺癌組織中の複数の遺伝子の発現レベルを定量的に決定するためには、時間のかかる高度な分析技術が求められる。そこでこれらの報告の中で、血中のTGFA濃度と、応答性の関連性が検討された。血中のTGFA濃度の測定によって、応答性の低い患者をある程度スクリーニングできることが示された。しかしその検出感度は、５０％に満たなかった。本発明者らは、血中のAREG濃度を指標とすることにより、応答性の低い患者をより高い検出感度で見出すことができることを明らかにして本発明を完成した。
本発明は、血中のAREG濃度が基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法に関する。

本発明において、血中濃度は、血中に存在する物質の、全血に占める血球体積が補正された濃度を言う。血液中に占める血球体積の割合は、個体間の変動が大きい。たとえば赤血球が全血に占める割合は、男女間で大きな相違がある。更に個体間の相違も無視できない。そのため、血球成分を含む全血中の見かけの物質濃度は、血球体積の割合によって大きく変動する。たとえば、血清中の濃度が同じでも、血球成分が多いサンプルの測定値は、血球成分が少ないサンプルよりも低くなる。そのため、通常、血中成分の測定値を比較するためには、血球体積を補正した値が利用される。
たとえば、全血から血球を分離することによって得られる血清や血漿をサンプルとして血中成分を測定することにより、血球体積の影響を除いた測定値を得ることができる。したがって、本発明における血中濃度は、通常、血清中、あるいは血漿中の濃度として求めることができる。あるいは、全血中の濃度として測定した後に、血球体積による影響を補正することもできる。全血サンプルに占める血球体積の測定方法は公知である。

本発明において、血中のAREG濃度は、基準値と比較することによって、erbB受容体阻害剤に対する応答性と関連付けられる。基準値とは、被検対象が応答性を有するかどうかを判定するための基準となる数値である。基準値は、カットオフ値とも呼ばれる。本発明においては、血中AREG濃度が高い患者は、erbB受容体阻害剤に対する応答性が低いと判定される。一般に、判定すべき性状の有無をふるい分けることができる値が、基準値（カットオフ値）として使用される。本発明においては、判定すべき性状は、erbB受容体阻害剤に対する応答性である。したがって、基準値は、erbB受容体阻害剤に対する応答性と関連付けられる。つまり本発明は、次の工程を含む肺癌の治療方法に関する。
(1) 肺癌患者の血中のAREG濃度を測定する工程；
(2) (1)の測定値をerbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者の血中のAREG濃度の測定値と比較する工程；および
(3) (2)の比較の結果、(1)の測定値がerbB受容体阻害剤に対する応答性が確認された患者の測定値と同じレベルである患者に対して、erbB受容体阻害剤を投与する工程。

本発明の好ましい態様において、上記の工程(3)において、たとえば、CR、およびPRのいずれかに判定されるであろう患者を、erbB受容体阻害剤を投与すべき患者として選択することができる。すなわち、本発明によって、erbB受容体阻害剤の投与にかかわらず、PDと判定されるであろう患者に対して、erbB受容体阻害剤の投与を避けることができる。ここでいうCR、PR、SD、およびPDは、たとえば次のような基準に基づいて判定することができる。なおCR、PR、SD、およびPDの判定基準は、先に述べたWHOやGreenらの基準、あるいはRECISTのガイドラインにしたがって判定される。

完全奏功(CR)；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてCRとして評価された患者、
部分奏功(PR)；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてPRもしくはそれ以上の効果が出ていると評価された患者、
安定状態(SD)；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてSDもしくはそれ以上の効果が出ていると評価された患者でCRやPRではない患者。最初のSDの判定は、投薬治療を初めてから28日後、あるいはそれより後の腫瘍評価時点に行う。
進行状態(PD)；投薬治療を始めて28日後の最初の腫瘍評価時点あるいはそれ以前にPDと判定された患者

本発明において、血中のAREG濃度が基準値と比較して低い患者は、たとえば前記工程(2)および(3)によって、選択することができる。すなわち、まず応答性を判断すべき患者（被検者）のAREGの測定値が、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者（対照者）の血中のAREG濃度の測定値と比較される。そして、被検者の測定値が対照者と同じレベルであれば、前記血中のAREG濃度が基準値と比較して低い患者であることを示している。本発明の好ましい態様において、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者とは、CRまたはPRと判定された患者を含む。一方、応答性が低かった患者は、PDと判定された患者を含む。

AREGの血中濃度が同じレベルであることは、統計学的な比較によって明らかにすることができる。たとえば、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた複数の患者の、血中AREG濃度を測定し、標準的な血中AREG濃度を統計学的に決定することができる。統計学的に十分な母集団を集められる場合には、平均値を中心として標準偏差(S.D.: standard deviation)の２倍の値の範囲が、しばしば標準値として利用される。したがって、平均値＋２×S.D.の値を基準値とすることができる。こうして設定された基準値には、理論的には、CRまたはPRと判定された患者の９０％が含まれる。

あるいは、実際にerbB受容体阻害剤を投与された患者について、上記の基準に従って応答性を判定し、その血中AREG濃度に基づいて、基準値を決定することもできる。通常、このようにして設定される基準値は、擬陽性率を最小とし、かつ検出感度が最大化できる条件を満たす範囲から選択される。ここで、擬陽性率とは、CRあるいはPRのいずれかであった患者に占める、AREGの血中濃度が基準値より高いと判定される患者の割合を言う。逆に、CRあるいはPRのいずれかであった患者に占める、AREGの血中濃度が基準値より低いと判定される患者の割合は特異度である。つまり、擬陽性率と特異度の合計は常に１である。また検出感度は、PDのあるいはSDのいずれかであった全ての患者に占める、基準値と比較してAREGの血中濃度が高いと判定される患者の割合である。

更に、本発明において、AREG濃度が基準値より高いと判定された患者に占める、SDあるいはPDの患者の割合は、陽性予測率(positive predictive value)である。一方、AREG濃度が基準値より低いと判定された患者に占める、CRあるいはPRの患者の割合は、陰性予測率(negative predictive value)である。これらの数値の関係を表２にまとめた。以下の関係が示すとおり、応答性の予測精度を評価する指標である、感度、特異度、陽性予測率、そして陰性予測率の各数値は、いずれも、血中AREG濃度のレベルを判定する基準値によって変動する。

さて、既に述べたように、基準値は、通常、擬陽性率を低く、そして感度が高くなるように設定される。しかし上記の関係からも明らかなように、擬陽性率と感度とは、トレードオフの関係にある。つまり基準値を低くすれば、検出感度は高まる。しかし擬陽性率も上がってしまうので、「低い擬陽性率」という条件を満たすのが難しくなる。これらの状況を考慮して、本発明における好ましい基準値として、たとえば、次のような予測結果を与える数値を選択することができる。
擬陽性率を５０％以下とする基準値（すなわち特異度を５０％以上とする基準値）
感度を２０％以上とする基準値

本発明において、基準値は、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver operating characteristic curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、血中AREG濃度の高／低を判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。
なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析ために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のAREGの測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。

得られたROC曲線に基づいて、上記の条件を満たす範囲から、本発明に用いるための好適な基準値を選択することができる。あるいは、AREGの測定値の大部分が含まれる範囲で、基準値を変化させることによって作成されたROC曲線に基づいて、基準値を選択することもできる。具体的には、たとえば本発明者らが解析した患者群においては、カットオフ値と擬陽性率、および感度の関係を次のようにまとめることができる。以下の数値をグラフにプロットすると、図２のROC曲線を得ることができる。

AREG
カットオフ値(pg/mL) 擬陽性率；感度
50 50% ; 73.3 %
70 30% ; 53.5 %
80 25% ; 43.3 %
85 10% ; 40 %
90 10% ; 36.7 %
93.8 10% ; 36.7 %
95 10% ; 36.7 %
100 10% ; 33.3 %
110 10% ; 26.7 %
130 5% ; 23.3 %
150 5% ; 23.3 %
155.219 5% ; 20 %

TGFA
カットオフ値(pg/mL) 擬陽性率；感度
10 50% ; 70 %
11 45% ; 70 %
12 45% ; 66.7 %
13 35% ; 63.3 %
13.5 35% ; 60 %
14 30% ; 53.3 %
14.5 25% ; 50 %
15 15% ; 46.7 %
15.5 10% ; 43.3 %
16 10% ; 43.3 %
17 5% ; 36.7 %
18 5% ; 33.3 %
19 5% ; 30 %
20 10% ; 43.3 %
21 5% ; 20 %
したがって、ROC曲線に基づいて、５０％以下の擬陽性率、および２０％以上の感度を与える基準値として、５６．３０６pg/mL〜１５５．２１９pg/mLを示すことができる。

あるいは、陽性予測率と陰性予測率を指標として、次のような条件を満たす基準値を採用することもできる。
陽性予測率を６０％以上とする基準値
陰性予測率を４０％以上とする基準値

本発明において、基準値を決定するためにAREGの血中濃度を測定される患者は、肺癌の治療を目的としてerbB受容体阻害剤を投与された患者から得ることができる。erbB受容体阻害剤には、既に市販されたもの、あるいは臨床試験を開始している薬剤が多く知られている。したがって、これらの薬剤を投与された患者の同意を得て、血液試料を採取することができる。更に、血液試料を採取した患者の治療成績をAREGの血中濃度と関連付ければ、上記のような方法にしたがって、基準値を設定することができる。
基準値を設定するためにAREGの血中濃度を測定する患者は、本発明によって治療すべき患者集団を代表すると考えられる患者集団とするのが望ましい。具体的には、たとえば人種ごとに設定された基準値は、本発明における好ましい基準値である。

本発明の治療方法において、erbB受容体阻害剤を投与すべき患者の選択に当たり、AREGの血中濃度に加えて、TGFAの血中濃度を参照することができる。すなわち本発明は、血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度のいずれか、または両方が基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法に関する。あるいは本発明は、血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度のいずれかが基準値と比較して低い患者にerbB受容体阻害剤を投与する工程を含む、肺癌の治療方法に関する。

あるいは本発明は、血中のAREG濃度が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための、erbB受容体阻害剤を有効成分として含有する肺癌の治療剤に関する。既に述べたとおり、erbB受容体阻害剤に対する応答性が低い患者は、血中のAREGとともにTGFA濃度の測定値を組み合わせることによって、より高い感度で検出することができる。すなわち、本発明においては、血中のAREGおよびTGFAの両方の測定値がカットオフ値よりも低い患者は、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤の投与対象として好ましい患者群である。したがって本発明によって、血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度の両方が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための、erbB受容体阻害剤を有効成分として含有する肺癌の治療剤が提供される。
更に本発明は、erbB受容体阻害剤の、血中のAREG濃度が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための肺癌の治療剤の製造における使用に関する。また本発明は、erbB受容体阻害剤の、血中のAREG濃度、および血中のTGFA濃度の両方が基準値と比較して低い肺癌患者に投与するための肺癌の治療剤の製造における使用に関する。
本発明における肺癌治療剤の有効成分は、erbB受容体阻害剤である。好ましいerbB受容体阻害剤として、ゲフィチニブ、エルロチニブ、PKI-166、ペリチニブ、ラパチニブ、およびカネルチニブを示すことができる。

TGFAの血中濃度によって、erbB受容体阻害剤に対する応答性を予測できることが既に明らかにされている。そして本発明によって、新たにAREGの測定値による判定を組み合わせることによって、TGFA、あるいはAREGのそれぞれ単独の測定結果に基づく応答性の予測精度を改善できることが明らかにされた。すなわち本発明は、TGFAとAREGの２項目を指標としてerbB受容体阻害剤の応答性を予測し、肺癌を治療する方法を提供した。あるいは本発明は、TGFAとAREGの血中濃度でスクリーニングされた特定の肺癌患者に投与するための肺癌治療剤を提供した。

具体的には、たとえば血中のTGFAとAREGの２項目を測定して、そのいずれかが、それぞれの基準値を超えた場合に、被検者が、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有していないことが示される。言い換えれば、血中のTGFAとAREGの両方の血中濃度が基準値以下の肺癌患者は、本発明に基づいて、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有すると判定される。本発明によれば、TGFA単独の測定結果に基づく判定と比較して、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有していない患者の検出感度を大きく改善することができる。その背景には、TGFA陽性患者群と、AREG陽性患者群とが完全に一致していないという事実がある。この事実を更に具体的に説明する。

まず、TGFAの測定結果によって、基準値よりも低い（erbB受容体阻害剤に対する応答性がある）と判定される患者の中には、実際には一定の割合で、応答性を有しない患者が含まれる。このような患者をTGFA擬陰性患者とする。TGFAによる判定にAREGの判定を組み合わせることによって、TGFA擬陰性患者の中から、AREGの基準値を超える患者を見出すことができるのである。つまり、TGFAの血中濃度が低いために、誤って「応答性あり」と判定される患者の中から、本発明によって、実際には応答性を有していない患者を見出すことができる。こうして、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有しない患者の検出感度が、本発明によって改善されたのである。一般に、単に複数のマーカーによる判定結果を組み合わせるだけでは、たとえ検出感度が上昇しても、一方で特異度が低下することがしばしば起こる。ところが本発明においては、感度と特異度の最良のバランスを決定することにより特異度を犠牲にすることなく、検出感度を上げられる、特有の組み合わせが明らかにされたのである。

本発明においては、TGFAおよびAREGの両方が基準値を越えない患者に対して、erbB受容体阻害剤を投与することもできる。両方が基準値を越えない患者を選択することによって、応答性を有する患者の割合を高めることができる。

本発明においてTGFAの測定結果を合わせて考慮するためには、たとえば先に述べたAREGの測定と基準値との比較と同様に、TGFAの血中濃度を測定し、基準値と比較することができる。たとえば、血中のTGFA濃度の測定と、基準値の比較については、既に報告もある(Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.; WO 2005/49829)。またTGFAのELISA用キットは市販もされている。これら公知の報告に記載された方法を、本発明におけるerbB受容体阻害剤による肺癌の治療方法に利用することができる。

本発明において測定される血中のAREG(amphiregulin)は、schwannoma-derived growth factorとも呼ばれるタンパク質である。AREGをコードする遺伝子は、The National Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) Program の成果物として単離された１５０００を超える遺伝子の一つである(Strausberg RL, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Dec 24;99(26):16899-903.)。上皮成長因子ファミリーに属し、自己分泌型の増殖因子であると考えられている。すなわち、EGF/TGF-alpha受容体に結合して、細胞増殖をもたらす。一方で、特定の悪性度の高い上皮性の癌(carcinoma)の細胞株に対しては、発育阻害作用を示すことも知られている。

血中のAREGは、タンパク質を定量することができる任意の方法によって、測定することができる。たとえば、イムノアッセイ、液体クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance;SPR)、あるいは質量分析(Mass Spectrometry)などをタンパク質を定量するための方法として応用することができる。質量分析においては、適当な内部標準を利用することによって、タンパク質を定量することができる。内部標準には、同位体で標識したAREGなどを利用することができる。内部標準と血中のAREGのピーク強度から、血中のAREG濃度を決定することができる。一般に、タンパク質の質量分析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)が利用される。質量分析や液体クロマトグラフィーを利用する分析方法によれば、AREGとTGFAを同時に分析することもできる。

本発明における好ましいAREGの測定方法は、イムノアッセイである。AREGのアミノ酸配列は公知である(Genbank Accession Number BC009799)。AREGのアミノ酸配列を配列番号：２に、まったそれをコードするcDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。したがって、当業者は、AREGのアミノ酸配列に基づいて、必要な免疫原を合成し、抗体を調製することができる。免疫原とするペプチドは、ペプチド合成装置によって容易に合成することができる。合成ペプチドはキャリアタンパク質に結合させることによって、免疫原とすることができる。

キャリア蛋白質としては、キーホールリンペットのヘモシアニン(Keyhole limpet hemocyanin)、ミオグロビン、アルブミンなどを利用することができる。好ましいキャリアタンパク質は、KLHやウシ血清アルブミンなどである。合成ペプチドをキャリア蛋白質に結合させるためには、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロスクシンイミド法（maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester method、以下MBS法と省略する）等が一般に用いられている。
具体的には、合成ペプチドにシステインを導入し、そのSH基を利用してMBSによってKLHと架橋させる。システイン残基の導入は、合成したペプチドのN末端であっても、C末端であってもよい。

あるいはAREGの塩基配列(Genbank Accession Number BC009799)に基づいて、AREGを遺伝子組み換え体として得ることもできる。必要な塩基配列からなるDNAは、AREG発現組織から調製したmRNAを利用してクローニングすることができる。あるいは市販のcDNAライブラリーをクローニングソースとすることもできる。得られたAREGの遺伝子組み換え体、あるいはその断片を免疫原とすることもできる。このようにして発現されたAREGの組み換え体は、本発明に用いる抗体を得るための免疫原として好ましい。あるいは市販のAREGの組み換え体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、製品番号：262-AR-100）を免疫原に利用することもできる。

こうして得られた免疫原を、適当なアジュバントと混合して免疫動物に免疫する。アジュバントには、フロイントコンプリートアジュバント(FCA)、あるいはインコンプリートアジュバント等が公知である。免疫操作は、抗体価の上昇が確認されるまで適当な間隔で繰り返される。本発明における免疫動物は特に限定されない。具体的には、マウス、ラット、あるいはウサギなどの一般的な免疫動物を利用することができる。
抗体をモノクローナル抗体として得る場合には、その産生に有利なものを利用すれば良い。たとえばマウスでは、細胞融合用の骨髄腫細胞株が多く知られているうえに高い確率でハイブリドーマを樹立可能な技術が既に確立されている。したがってマウスは、モノクローナル抗体を得るための望ましい免疫動物のひとつである。

更に、免疫処理はインビボに限定されない。培養した免疫担当細胞をインビトロで免疫感作する方法を採用することもできる。これらの方法によって得られた抗体産生細胞を、形質転換させクローニングを行う。モノクローナル抗体を得るために抗体産生細胞を形質転換する方法は、細胞融合に限定されない。たとえば、ウイルスの感染によってクローニング可能な形質転換体を得る方法が知られている。

本発明に用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、AREG対する反応性に基づいてスクリーニングすることができる。具体的には、まず、免疫原として用いたAREGやそのドメインペプチドに対する結合活性を指標に抗体産生細胞を選ぶ。スクリーニングで選び出されたポジティブクローンは、必要に応じてサブクローニングされる。
樹立したハイブリドーマを適当な条件の下で培養し、産生される抗体を回収すれば本発明に用いるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマは、ホモハイブリドーマの場合には同系の動物の腹腔に接種して生体内培養が可能である。この場合、モノクローナル抗体は腹水として回収される。ヘテロハイブリドーマの場合にはヌードマウスを宿主として生体内で培養することができる。

生体内培養のみならず、適当な培養環境を与えて生体外でハイブリドーマを培養することも一般に行われている。たとえばRPMI1640やDMEM等の基礎培地がハイブリドーマの培地として一般に利用されている。これらの培地には、抗体産生能を高く維持するために動物血清等の添加剤を加えることができる。生体外でハイブリドーマを培養する場合には、モノクローナル抗体は培養上清として回収することができる。培養上清は、培養終了時に細胞から分離することにより回収することもできるし、あるいはホローファイバーを応用した培養装置においては、培養を継続しながら連続的に回収することも可能である。

腹水や培養上清として回収したモノクローナル抗体は、飽和硫安塩析によりそのイムノグロブリン分画を分取し、更にゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィー等の精製工程を経て本発明に用いるモノクローナル抗体とする。この他にモノクローナル抗体がIgGであれば、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムによるアフィニティークロマトグラフィーに基づく精製方法が有効である。

一方、本発明に用いる抗体をポリクローナル抗体として得るには、免疫後に抗体価の上昇した個体から採血し、その血清を分離することにより抗血清を得ることができる。抗血清から公知の方法でイムノグロブリンを精製し、本発明に用いる抗体とすることができる。イムノグロブリンの精製において、AREGをリガンドとするイムノアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせれば、AREG特異抗体とすることができる。

また、以下に示す市販の抗体を組み合わせて本発明の測定に用いることができる。例えば、モノクローナル抗体としては、次のような製品が市販されている。
Anti-human Amphiregulin Antibody（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号：MAB262）；この製品は、大腸菌由来のAREG組み換え体を免疫原として得られたマウスーマウスハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体である。
あるいはポリクローナル抗体も、たとえば次のような製品が市販されている。
Anti-human Amphiregulin Antibody（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号：AB-262-NA）；この製品は、大腸菌由来のAREG組み換え体をヤギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。
Biotinylated Anti-human Amphiregulin Antibody（Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号：BAF262）；この製品は、大腸菌由来のAREG組み換え体をヤギに免疫して得られたポリクローナル抗体をビオチン化した抗体である。

AREGに対する抗体が、AREGと接触すると、抗体は、抗原抗体反応によって当該抗体が認識する抗原決定基（エピトープ）に結合する。抗原に対する抗体の結合は、各種のイムノアッセイの原理によって検出することができる。イムノアッセイは、不均一系の分析方法と、均一系の分析方法に大別される。イムノアッセイの感度と特異性を高い水準に維持するためには、モノクローナル抗体の利用が望ましい。各種のイムノアッセイフォーマットによる本発明のAREGの測定方法について、具体的に述べる。

まず、不均一系イムノアッセイによるAREGの測定方法について述べる。不均一系イムノアッセイにおいては、AREGに結合した抗体を結合しなかったものと分離して検知するしくみが必要である。
分離を容易に行うために固相化試薬が一般に用いられる。たとえば、まずAREGを認識する抗体を固定した固相を用意する（固相化抗体）。これにAREGを結合させ、更に標識した第２抗体を反応させる。
固相を液相から分離し、更に必要に応じて洗浄すれば、固相上にはAREGの濃度に比例して第２抗体が残る。第２抗体を標識しておけば、この標識に基づくシグナルを測定することによりAREGを定量することができる。

抗体の固相への結合方法は、任意である。たとえばポリスチレンなどの疎水性素材には、抗体を物理的に吸着させることができる。あるいは、各種の官能基を表面に有する素材に対して、抗体を化学的に結合させることもできる。更に、結合性のリガンドで標識された抗体を、当該リガンドの結合パートナーで捕捉することによって固相に結合することもできる。結合性リガンドとその結合パートナーの組み合わせとしては、アビジン−ビオチンなどを示すことができる。固相と抗体とは、第２抗体との反応と同時、あるいはその後に結合させることができる。
同様に第２抗体の標識化も、必ずしも直接標識でなくてもよい。すなわち、抗体に対する抗体や、アビチン−ビオチンといった結合性の反応を利用して間接的に標識することもできる。
AREG濃度が既知の標準試料によって得られたシグナル強度に基づいて、試料中のAREG濃度が決定される。

上記不均一系イムノアッセイのための固相化抗体および第２抗体は、AREGを認識する抗体、あるいはその抗原結合部位を含む断片であれば、任意の抗体を利用することができる。したがって、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、あるいは両者の混合物や組み合わせであってよい。なお両者をモノクローナル抗体とするときには、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を組み合わせるのが好ましい。
このような不均一系イムノアッセイは、測定対象抗原を抗体で挟むことからサンドイッチ法と呼ばれている。サンドイッチ法は、測定感度や再現性に優れるため、本発明における好ましい測定原理の１つである。

不均一系のイムノアッセイには、競合阻害反応原理を応用することもできる。すなわち、抗体に対する既知濃度のAREGの結合を、試料中のAREGが競合的に阻害する現象に基づくイムノアッセイである。既知濃度のAREGを標識しておき、抗体に反応した（またはしなかった）AREGを測定すれば試料中のAREG濃度を決定することができる。
既知濃度の抗原と試料中の抗原とを同時に抗体に反応させれば競合的な反応系が成立する。また試料中の抗原と抗体の反応後に既知濃度の抗原とを反応させれば、阻害的な反応系による分析が可能である。いずれの反応系においても、抗体、あるいは試薬成分として用いる既知濃度の抗原のいずれか一方を標識成分とし、他方を固相化試薬としておくことにより操作性に優れる反応系を構成することができる。

これら不均一系のイムノアッセイにおいて、標識成分としては放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素活性物質、肉眼的に観察可能な物質、あるいは磁気的に観察可能な物質などが用いられる。これらの標識物質の具体例を以下に示す。
酵素活性物質：
ペルオキシダーゼ
アルカリホスファターゼ
ウレアーゼ、カタラーゼ
グルコースオキシダーゼ
乳酸脱水素酵素、あるいは
アミラーゼ等

蛍光物質：
フルオレセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート、あるいは
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等

放射性同位元素：
トリチウム、
¹²⁵I、あるいは
¹⁸¹I等

中でも酵素のような非放射標識は、安全性、操作性、感度等の点で有利な標識のひとつである。酵素標識と抗体、あるいはAREGとは、過ヨウ素酸法やマレイミド法等の公知の方法により結合することができる。

一方、固相としては、ビーズ、容器内壁、微粒子、多孔質担体、あるいは磁性粒子などが用いられる。これらの固相は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、ガラス、金属、あるいはセラミック等の素材を利用して成型されたものを利用できる。これらの固相素材の表面に、抗体等を化学的に結合するための官能基を導入した固相素材も知られている。固相と抗体（あるいは抗原）についても、ポリ-L-リジンやグルタールアルデヒド処理といった化学的な結合や、物理吸着といった公知の結合方法を応用することができる。

ここで例示した不均一系のイムノアッセイでは、いずれも固相／液相の分離工程や洗浄工程が必要となるが、サンドイッチ法の変法であるイムノクロマトグラフ法によれば、これらの工程を簡単に処理することができる。
すなわち、毛管現象によって試料溶液の移送が可能な多孔質担体に固相化抗体を固定し、その中を標識抗体と混合したAREG含有試料を毛管現象によって展開する。展開中にAREGは標識抗体と反応し、更に固相化抗体と接触すると、その位置に捕捉される。AREGと反応しなかった標識抗体は、固相化抗体に捕捉されることなく通過する。

結果的に固相化抗体の位置に残る標識抗体のシグナルを指標にAREGの存在を検知することができる。標識抗体を多孔質担体の上流に予め保持させておけば、試料溶液の滴下だけで全ての反応が開始し完結するので、きわめて簡便な反応系を構成することができる。イムノクロマトグラフ法においては、着色粒子のような肉眼的に識別しうる標識成分を組み合わせることにより、特殊な読取装置さえ不要な分析デバイスを構成することができる。
更に、イムノクロマトグラフ法においては、AREGの検出感度を調節することができる。たとえば、検出感度を前記のカットオフ値付近に調節することによって、カットオフ値を越える場合に前記標識成分が検出される。このようなデバイスを利用すれば、被検者が陽性か陰性なのかを、極めて簡便に判定することができる。標識を肉眼で識別できる構成とすれば、イムノクロマトグラフィー用のデバイスに血液試料を適用するだけで、必要な検査結果を得ることができる。

イムノクロマトグラフ法の検出感度を調節する方法として、種々の方法が公知である。たとえば、試料を適用する位置と、固相化抗体の間に、検出感度の調節用の第２の固相化抗体を配置することができる（特開平6-341989)。試料が適用された位置から、標識を検出するための第１の固相化抗体の位置まで展開される間に、試料中のAREGは、第２の固相化抗体に捕捉される。第２の固相化抗体が飽和した後に、その下流に配置された第１の固相化抗体の位置にAREGが達することができる。その結果、試料中に含まれるAREGが、所定の濃度を越える場合に、第１の固相化抗体の位置において、標識抗体と結合したAREGが検出される。

続いて均一系のイムノアッセイについて説明する。以上のような反応液の分離を必要とする不均一系の免疫学的分析方法に対して、均一系の分析方法によってもAREGを測定することができる。均一系の分析方法では、抗原抗体反応の反応生成物を反応液から分離することなく検出することができる。
抗原抗体反応に伴って生成する沈降物を観察することにより、抗原性物質の定量的な分析を行う免疫学的沈降反応は、代表的な均一系の分析方法である。免疫学的沈降反応にはポリクローナル抗体を利用するのが一般的である。モノクローナル抗体を応用する場合には、AREGに対して異なるエピトープに結合する複数種のモノクローナル抗体を利用するのが好ましい。免疫学的な反応に伴う沈降反応生成物は、肉眼的に観察することもできるし、あるいは光学測定することにより数値化することもできる。

抗体を感作した微粒子の抗原による凝集を指標とする免疫学的粒子凝集反応も、一般的な均一系の分析方法である。この方法でも先に延べた免疫学的沈降反応と同じように、ポリクローナル抗体、あるいは複数種のモノクローナル抗体の組み合わせを利用することができる。微粒子への抗体の感作は、抗体の混合物を感作しても良いし、あるいは抗体ごとに感作した粒子を混合することによって調製することもできる。こうして得られた微粒子は、AREGとの接触により、マトリクス状の反応生成物を生じる。反応生成物は、粒子の凝集として検出することができる。粒子の凝集は、肉眼で観察することもできるし、光学測定することにより数値化することもできる。

均一系のイムノアッセイとして、エネルギー転移や酵素チャンネリングに基づく免疫学的分析方法が知られている。エネルギー転移を利用した方法においては、抗原上の接近したエピトープを認識する複数の抗体に対して、それぞれドナー／アクセプターの関係にある異なる光学標識を結合させるようにする。免疫学的な反応が起きると両者が接近するため、エネルギー転移現象が生じ、消光や蛍光波長の変化といったシグナルにつながる。一方、酵素チャンネリングとは、やはり接近したエピトープに結合する複数の抗体に対し、一方の反応生成物が他方の基質となっているような関係にある酵素の組み合わせを標識として利用する。免疫学的な反応によって両者が接近すると、酵素反応が促進されることから両者の結合を酵素反応速度の変化としてとらえることができる。

本発明において、AREGを測定するための血液は、患者から採取された血液から調製することができる。好ましい血液試料は、血清、あるいは血漿である。血清あるいは血漿試料は、測定に先立って希釈することもできる。あるいは、全血を試料として測定し、得られた測定値を補正して血清濃度を決定することもできる。たとえば、同じ血液試料に占める血球体積の割合を決定して、全血中の濃度を血清濃度に補正することができる。

本発明の肺癌の治療方法によって、erbB受容体阻害剤に応答性を有するあらゆる肺癌を治療することができる。本発明における好ましい肺癌は、非小細胞性肺癌(NSCLC;Non Small Cell Lung Cancer)である。
本発明において、AREGの血中濃度が基準値よりも低いと判定された患者に、erbB受容体阻害剤が投与される。投与されるerbB受容体阻害剤は、一般的な治療プロトコールにしたがって決定される。すなわち、成人に対し、１日当たり、たとえば、１０〜２０００mg、通常２０〜１０００mg、具体的には５０〜７００mg、より具体的には１００〜７００mgを投与することができる。たとえばゲフィチニブの場合、現在、標準的な治療プロトコルにおいては、成人に対して、性別や体重に関わらず、１日当たり２５０mgが投与されている。本発明において、erbB受容体阻害剤は、経口的に、あるいは非経口的に投与することができる。非経口的投与には、たとえば静脈注射が含まれる。

本発明の治療方法に利用される要素を組み合わせて、肺癌の治療用キットを提供することができる。すなわち本発明は、次の要素(1)-(2)を含む、肺癌の治療用キットに関する。
(1) erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤；および
(2) 血中のAREG濃度が基準値と比較して高い患者は、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いことを記載した指示書
本発明の治療用キットは、付加的に次の要素(3)を含むことができる。
(3) 血中のTGFA濃度が基準値と比較して高い患者は、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いことを記載した指示書

たとえば、次の要素(1)-(2)を含む肺癌の治療用キットは、本発明における肺癌の治療用キットに含まれる。
(1) erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤；および
(2) AREGの血中濃度とTGFAの血中濃度のいずれかが基準値を越える患者には、前記erbB受容体阻害剤の投与を薦めないことを記載した指示書
あるいは、次の要素(1)-(2)を含む肺癌の治療用キットは、本発明における肺癌の治療用キットに含まれる。
(1) erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤；および
(2) AREGの血中濃度およびTGFAの血中濃度の両方が基準値を越えない患者に、前記erbB受容体阻害剤を投与できることを記載した指示書

本発明の肺癌の治療用キットの指示書には、投与すべき患者に関する指示に加え、前記erbB受容体阻害剤を用いた治療に必要な種々の情報を含むことができる。具体的には、薬剤の作用機序、予想される副作用、薬剤の保存条件、薬剤の製造年月、あるいは薬剤の有効期限などの情報を含むことができる。

本発明の肺癌の治療方法は、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有する患者に対して当該薬剤を投与することを特徴とする。erbB受容体阻害剤に対する応答性を有する患者を選ぶためには、肺癌患者の当該薬剤に対する応答性の検査が必要である。すなわち本発明は、次の工程を含む、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法を提供する。
(1) 肺癌患者の血液試料のAREG濃度を測定する工程、および；
(2) AREG濃度が基準値と比較して高いときに、当該患者がerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いと判定される工程

本発明の肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法は、次の工程によって実施することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、erbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法を提供する。
(1) 肺癌患者の血液試料のAREG濃度を測定する工程、および；
(2) (1)の測定値をerbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者の血中のAREG濃度の測定値と比較する工程；および
(3) (2)の比較の結果、(1)の測定値がerbB受容体阻害剤に対する応答性が確認された患者の測定値と同じレベルであるとき、当該肺癌患者がerbB受容体阻害剤に対する応答性を有することが示される工程

本発明の応答性の検査方法は、付加的に次の工程を含むことができる。
(1) 肺癌患者の血液試料のTGFA濃度を測定する工程、および；
(2) AREG濃度およびTGFA濃度のいずれか、または両方が基準値と比較して高いときに、当該患者がerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性が低いと判定される工程。
前記AREGの測定値の評価方法と同様に、TGFA濃度の比較についても、次のような工程によって実施することができる。
(1) 肺癌患者の血液試料のTGFA濃度を測定する工程、および；
(2) (1)の測定値をerbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者の血中のTGFA濃度の測定値と比較する工程；および
(3) (2)の比較の結果、(1)の測定値がerbB受容体阻害剤に対する応答性が確認された患者の測定値と同じレベルであるとき、当該肺癌患者がerbB受容体阻害剤に対する応答性を有することが示される工程

本発明の応答性の検査方法において、血中AREG濃度あるいは血中TGFA濃度は、先に述べたような方法によって測定することができる。また、それぞれの測定値を比較すべき基準値、あるいは比較すべきerbB受容体阻害剤に対する応答性を有していた患者の血中の濃度についても、先に述べたようにして設定することができる。
AREG、およびTGFAの血中濃度の、いずれか、または両方の測定値を評価し、いずれか、または両方が、基準値を越えた場合、被検者のerbB受容体阻害剤に対する応答性が低いことが示される。本発明の好ましい態様において、AREGおよびTGFAの血中濃度のいずれかが、基準値を越えた場合に、被検者のerbB受容体阻害剤に対する応答性が低いことが示される。既に述べたように、本発明の検査方法において、基準値として、erbB受容体阻害剤に対する応答性が確認された患者の測定値を用いることができる。

本発明に基づくerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査方法を実施するために利用される要素は、予め組み合わせて検査用キットとして供給することができる。すなわち本発明は、次の要素を含むerbB受容体阻害剤を有効成分とする肺癌の治療剤に対する応答性の検査用キットを提供する。
i. AREGの血液中濃度を測定するためのイムノアッセイ用試薬、および
ii. AREGの陽性対照
本発明のキットは、付加的に次の要素を含むことができる。
iii. TGFAの血液中濃度を測定するためのイムノアッセイ用試薬、および
iv. TGFAの陽性対照。

本発明の検査用キットを構成するイムノアッセイ用試薬は、先に述べた各種のイムノアッセイに必要な試薬を含むことができる。具体的には、イムノアッセイ用試薬は、測定すべき物質を認識する抗体を含む。抗体は、イムノアッセイのアッセイフォーマットに応じて修飾することができる。本発明における好ましいアッセイフォーマットとして、ELISAを利用することができる。ELISAにおいては、たとえば、固相に固定化した第１の抗体と、標識を有する第２の抗体が利用されるのが一般的である。

すなわち、ELISA用のイムノアッセイ試薬は、固相担体に固定化された第１抗体を含むことができる。固相担体には、微粒子や反応容器の内壁を利用することができる。微粒子としては磁性粒子を利用することができる。あるいは反応容器には、９６穴マイクロプレートなどの、マルチウエルプレートがしばしば利用される。あるいは、９６穴よりも更に小容量のウエルを高密度で備えた、大量試料の処理用の容器も公知である。本発明においては、これらの反応容器の内壁を固相担体として利用することができる。

ELISA用のイムノアッセイ試薬は、更に標識を有する第２抗体を含むことができる。ELISA用の第２抗体は、酵素を直接結合したものであっても良いし、間接的に酵素を結合することもできる。酵素を化学的に抗体と結合するための方法は公知である。たとえばイムノグロブリンを酵素的に切断して可変領域を含む断片を得ることができる。この断片が有する-SS-結合を還元して-SH基とすれば、２官能性リンカーを結合することができる。２官能性リンカーに予め酵素を結合させておくことによって、抗体断片に酵素を結合することができる。

あるいは、間接的に酵素を結合するために、たとえばアビジンービオチン結合を利用することができる。すなわち、ビオチン化された抗体を、アビジンを付加した酵素と接触させることによって、抗体に酵素を間接的に結合することができる。その他、第２抗体を認識する抗体を酵素標識した第３の抗体を使って、第２抗体に間接的に酵素を結合することもできる。抗体を標識する酵素は、たとえば先に例示したような酵素を利用することができる。

本発明のキットは、AREGの陽性対照を含む。AREGの陽性対照は、予め濃度が検定されたAREGを含む。好ましい濃度は、たとえば、前記応答性の検査方法において、基準値として設定された濃度とすることができる。あるいは、より高い濃度の陽性対照を組み合わせることもできる。本発明におけるAREGの陽性対照は、付加的に予め濃度が検定されたTGFAを含むことができる。AREGとTGFAの両方を含む陽性対照は、本発明における陽性対照として好ましい。

本発明における陽性対照は、液状であることが好ましい。本発明においては、血液試料がサンプルとして利用される。したがって、対照とする試料も液状であることが求められる。あるいは、乾燥させた陽性対照を使用時に所定量の液体で溶解することによって、検定された濃度を与える対照を調製することもできる。溶解に必要な量の液体を乾燥させた陽性対照とともにパッケージしておけば、ユーザーは、両者を混合するだけで必要な陽性対照を得ることができる。陽性対照とするAREGあるいはTGFAは、天然の蛋白質であることもできるし、組み換え体であっても良い。本発明のキットには、陽性対照のみならず、陰性対照を付加的に組み合わせることができる。陽性対照、あるいは陰性対照は、イムノアッセイが正しい結果を示していることを確認するために用いられる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。

患者
2002年8月から2005年2月の間に、化学療法が効果を示さなかった50人の進行性非小細胞肺癌患者にゲフィチニブを処方した（250mg/１日）。局所進行癌（ステージ IIIB）、転移癌（ステージ IV）の患者、および一つまたはそれ以上の通常の化学療法に耐性を示し、手術後に再発した非小細胞肺癌患者などがこの試験には含まれていた。試験対象患者基準は前報に記載した通りである（Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.）。概略としては、20歳以上で、一般状態（performance status；PS）は0,1,もしくは2であり、肝臓や腎臓の機能には顕著な異常がない患者を対象とした。治療は患者の病気の進行、耐え難い毒性、あるいは薬物使用の同意の撤回などにより試験が中止されるまで行われた。

ゲフィチニブ投与開始の1週間前に血清を採取し、-80℃で保存した。ELISA解析に血清サンプルを用いた50人の患者のうち、最初の治療として手術を行った後、再発や化学療法耐性によりゲフィチニブ治療を行った13人の患者から原発性非小細胞肺癌の組織サンプルを採取してホルマリン固定した（9人の腺癌、3人の扁平上皮癌、そして1人の腺扁平上皮癌である）。

全ての臨床検体の使用は書面で得た患者の同意に基づき、研究倫理委員会で承認された。評価可能な病巣の客観的な腫瘍治療効果は、治療開始後の4週間毎に、先に報告した（Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.）基準に基づき評価した。治療開始の4ヶ月後に下記の定義に従って、治療の総合評価がなされた。
完全奏功（Complete response：CR）；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてCRとして評価された患者、
部分奏功（PR）；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてPRもしくはそれ以上の効果が出ていると評価された患者、
安定状態（SD）；28日以上のインターバルで実施された2回の治療においてSDもしくはそれ以上の効果が出ていると評価された患者でCRやPRではない患者。最初のSDの判定は、ゲフィチニブ治療を初めてから28日後、あるいはそれより後の腫瘍評価時点に行わなければならない。
進行状態(PD)；ゲフィチニブ治療を始めて28日後の最初の腫瘍評価時点あるいはそれ以前にPDと判定された患者を指す。

ELISA
血清中のTGFA値は先に報告したように、市販のELISAキット（TGFA ELISAキット, R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて測定された（Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.、Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004;10:8363-70.）。血清中に溶解しているamphiregulinを検出するために、９６穴マイクロタイタープレート (Nalge Nunc International, Rochester, NY)を1ng/mLの一次抗体（抗amphiregulinモノクローナル抗体, R&D Systems）で１晩コーティングした。その後それぞれのウェルを１％BSA、5％ ショ糖、そして0.05％ NaN₃を含んだ300μL PBS（pH7.4）で2時間ブロッキングした後、1％BSAを含んだPBS（pH7.4）に1:3の割合で希釈した血清サンプルを添加し、静置した。0.05％のTween20を含んだPBS（pH7.4）で洗浄した後、それぞれのウェルに100ng/mLのビオチン標識した抗amphiregulin ポリクローナル抗体（R&D Systems）を添加し2時間静置した。その後、基質試薬（R&D Systems）を用い、アビジン標識したペルオキシダーゼ（DakoCytomation, Glostrup, Denmark）と反応させた。

この呈色反応は2N硫酸を添加することで停止した。呈色強度は630nmを参照として、光度計で450nmの強度を測定した。各プレートの検量線はリコンビナントのamphiregulin、もしくはTGFA蛋白を標準物質とした。血清中のamphiregulin及びTGFAの最少検出値は、それぞれ10.1pg/mLと3.1pg/mLであった。血清中にamphiregulin／TGFAが認められた5人の進行性非小細胞肺癌患者より採取した癌性胸水を用いて、ウェスタンブロット及び、免疫沈降法により、これらの市販の抗amphiregulin抗体、あるいは抗TGFA抗体がそれぞれの蛋白を特異的に検出できることを確認した。

EGFR 変異
EGFRのエキソン18から21での変異がホットスポットと報告されており（Lynch TJ,et al. N Engl J Med 2004;350:2129-39.、Paez JG, et al. Science 2004;304:1497-500.、Pao W, , et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:13306.11.、Tokumo M, et al. Clin Cancer Res 2005;11:1167-73.、Mitsudomi T, et al. J Clin Oncol 2005;23:2513-20.；p-ループ (p-loop)から活性ループ(activation loop)まで、コドン位置709-870）、これをゲフィチニブを投与した13人の非小細胞肺癌患者から切除した腫瘍組織でスクリーニングした（上記に記述）。ゲノムDNAは先に報告した方法で抽出した（Daigo Y, et al., Am J Pathol 2001;158:1623-31.）。

概略としては、癌組織をすばやく10mmol/LのTris-HCL（pH8.3）、2.5mmol/L MgCl₂、50mmol/L KCl、0.45% NP40、0.45% Tween20、そして0.1mg/mLのproteinase Kを含んだ20μL bufferに再懸濁し、55℃で一晩静置した。proteinase Kを不活化するために10分間煮沸し、その後PCRに用いた。PCRによるダイレクトシーケンシングは、他で報告したものと同じエキソン18から21のプライマーを用いて行った（Tokumo M, et al., Clin Cancer Res 2005;11:1167-73.）。

免疫組織化学および組織マイクロアレイ
手術を行った患者から得た449のホルマリン固定した原発性の癌組織（腺癌285例、扁平上皮癌121例、肺大細胞癌28例、そして腺扁平上皮癌15例）とそれぞれの癌周辺正常肺組織とが用いられた。腺癌の組織学的なパターンは次の4種類のサブタイプに分類された。
腺房型腺癌(acinar adenocarcinoma)、
乳頭腺型癌(papillary adenocarcinoma)、
細気管支肺胞上皮癌(bronchiolo-alveolar carcinoma)、および
粘液産生充実型癌(solid carcinoma with mucus formation)
病理学的なステージは国際対癌連合（Union Internationale Contre le Cancer）の分類に従って決定された（Travis WD, et al., 3rd ed. New York: Springer-Verlag; 1999.）。

腫瘍組織のマイクロアレイ解析はこれらの449ホルマリン固定原発性肺癌組織を用いて前報の通り実施された（Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70.）。臨床病理学的に多様性のある臨床検体中のamphiregulin、及びTGFA蛋白のレベルを調べるために、Envision＋ kit/horseradish peroxidase（HRP；DakoCytomation）を用いて組織を染色した。

この実験はブロッキングの後、以下の抗体： 1:40に希釈したウサギ抗ヒトamphiregulin抗体（Ab-1, Lab Vision Corp., Fremont, CA）及び、1:80に希釈したマウス抗TGFAモノクローナル抗体（Ab-2, Oncogene Science, Manhasset, NY）を用いて行った。それぞれの組織は二次抗体として、HRP標識した抗ウサギもしくは抗マウスIgGと反応させた。発色性の基質を添加し、標本はヘマトキシリンによって対比染色された。3人の判定医師がそれぞれ臨床的なデータを前もって知ることなく、個々にamphiregulin、及びTGFAの有無を半定量的に判定した。細胞質の染色強度は次の基準に従ってスコア化された：0（なし）、1+（陽性）、2+（強陽性）。amphiregulinの細胞質、核、細胞質と核の両方の染色パターンについても前報に従って判定した（Ebert M, et al., Cancer Res 1994;54:3959-62.、Bostwick DG, et al., Prostate 2004;58:164-8.）。

統計学的解析
統計的な解析は、患者の特性と治療の効果を比較するために、StatView 統計プログラム（SAS, Cary, NC）を用いて行った。血清中のamphiregulin及び/もしくはTGFAの有無を含めた臨床病理学的な多様性と、ゲフィチニブに対する応答性との関係はフィッシャー検定により比較された。腫瘍特異的生存率と95％ 信頼区間（95% CI）はKaplan-Meier 法により評価し、二つのグループ間の差異はlog-rank 検定により評価した。予後に関連した危険因子は、ステップダウン法によるCox 比例ハザード回帰モデルを用いて評価した。検討の結果、比例ハザード仮説は「単変量解析において統計的に有意な結果を伴う変数のみが、多変量解析にも含まれる」ことを満たした。変数を除く規定は尤度比で、それは最大部分尤度に基づくものであった。(モデルに対する不一致率はP=0.05)。

〔実施例１〕 臨床情報
条件を満たした50人の患者に一日あたり250mgのゲフィチニブを投与した。患者の中央値は62歳であった（範囲30-80歳）；患者のうち36人が男性、14人が女性であった（表３）。

米国東海岸癌臨床試験グループ（Eastern Cooperative Oncology Group；ECOG）による一般状態分類（PS）は14人に対して0、26人に対して1、10人に対して2であった。21人の患者が少なくとも2種類以上の化学療法を受けており、34人が白金製剤を用いた化学療法を受けていた。研究の開始時において、32人の患者が検査時（17人）、あるいは過去に（15人）喫煙者であった。組織学的診断においては、40人（80.0％）が腺癌、7人（14.0％）が扁平上皮癌、3人（6.0％）が腺扁平上皮癌であった。

ゲフィチニブ治療の後、8人の患者がPRと分類され、CRと分類された患者はいなかった；また12人の患者がSD、そして30人がPDと分類された。ゲフィチニブ治療に対する腫瘍奏功率（CR+PR/CR+PR+SD+PD）は16.0%であり、病勢コントロール率（CR+PR+SD/CR+PR+SD+PD）は40.0％であった。最終的な判定は、最後の患者が治療を始めてから4ヵ月以上後の2005年7月に行われた。追跡期間の中央値は240日（33から1011日間）であった。

〔実施例２〕 血清 amphiregulin / transforming growth factor-α 濃度, 臨床病理学的特徴,およびゲフィチニブ治療に対する応答性
二次治療から七次治療でゲフィチニブ単独治療を受けている進行性の非小細胞肺癌患者の腫瘍に発現している遺伝子をcDNA マイクロアレイ解析で検討した結果、amphiregulin とTGFAはPDの症例では有意に過剰発現しているが、PRでは殆ど発現していないことが報告されている（パーミューテーションテストにおけるP値はそれぞれ9.3×10^-12 および 0.0095 、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43.）。

薬の応答性を予測するためのルーチンかつ侵襲性の低い臨床検査法を確立するために、二つの蛋白を血清マーカーとすることを試みた。すなわち、ゲフィチニブ治療を施した50人の異なる非小細胞肺癌患者より採取した血清を用いて、両方の蛋白のELISAを行った。「陽性」「陰性」の判定は、それぞれの蛋白のカットオフ値（amphiregulin 93.8pg/mL、TGFA 15.6pg/mL）を基に行った。カットオフ値は最適診断正確度、およびPDと病勢コントロール症例（PR+SD）とを区別する尤度比に従って作成されたROC曲線によって決められた（図２）。このカットオフ値により50の血清サンプルのうち、14例（28.0％）の患者の血清がamphiregulin 陽性、15例（30.0％）の患者血清がTGFA陽性であった（図１）。

表３に示したように、この患者らの集団において、血清中のamphiregulin 及びTGFAの陽性度とゲフィチニブ治療との相関性について分析した。30人のPD患者のうち、12例（40.0％）の血清においてamphiregulinが陽性である一方、病勢コントロール（PRもしくはSD）患者から採取した20サンプルのうち、18例（90.0％）が陰性であった（P =0.026フィッシャーの検定による）。PD患者より得た30サンプルのうち、13例（43.3％）がTGFA陽性であったのに対し、PRもしくはSD患者より得た20サンプルのうち、18例（90.0％）が陰性であった（P =0.014フィッシャー検定による）。PD患者より採取した血清30サンプルのうち19例（63.3％）が少なくとも一つの蛋白が陽性であり、一方PR+SD患者の20サンプル中、17例（85.0％）が陰性であった（P =0.001フィッシャーの検定による）。このことはPD症例の63％において、amphiregulin およびTGFAの両方を合わせた解析が低奏功性の良いマーカーであることを示している。PDを示した偽陽性の割合は15.0％のみであった。

表３ではさらに、50人の患者の臨床病理学的な要素と、ゲフィチニブ治療の応答性との相関性も示している。この研究では、一般状態（0/1 対 2；P =0.037 フィッシャーの検定による）と喫煙履歴（現在、及び過去の喫煙者 対 非喫煙者；P =0.035フィッシャーの検定による）の両方、およびamphiregulin とTGFAのどちらか一方または両方の陽性度も同様にゲフィチニブ応答性と有意な相関が認められた。上記に述べたように、amphiregulin陽性な14人の患者のうち12人と同様にTGFA陽性である15人の患者のうち13人が、ゲフィチニブ治療に対し、効果を示さなかった事が明らかとなった。どちらかのマーカーに対して陽性を示している22人の患者中、19例がPDと判定されていた。

ゲフィチニブ治療を施されているamphiregulin陰性患者の生存期間の中央値は、陽性患者と比較して有意に長かった（P =0.032 log-rank 検定による；図３A）。TGFA陰性の患者も同様であった（P =0.001 log-rank 検定による；図３Ｂ）。また、患者の予後と年齢や性別（男性対女性）、PS（0/1 対 2）、病態ステージ（IIIB 対 他のステージ）、喫煙履歴（現在もしくは過去の喫煙者 対 非喫煙者）、組織学的な分類（腺癌対他の組織学的タイプ）、血清中のamphiregulin値（陽性対陰性）、そして血清中のTGFA値（陽性対陰性）など他の因子との相関性の評価についても単変量解析を行った（表４）。

これらの要素の中で、血清中のamphiregulin陽性 [オッズ比（OR）、2.235；95％ CI、1.050-4.761；P =0.037] 、血清中のTGFA陽性（OR、3.315；95％ CI、1.557-7.059；P =0.002）、そしてPS（OR、6.707；95％ CI、2.544-17.682；P <0.002）は予後不良と有意に相関していた。しかし多変量解析では、血清中のTGFA値（OR、2.457；95％ CI、1.072-5.625；P =0.034）とPS（OR、4.792；95％ CI、1.420-16.171；P =0.012）は、ゲフィチニブ治療を受けた進行性の非小細胞肺癌患者に対する予後徴候とは有意な相関がないという結果を示した。

EGFRの変異と血清中のamphiregulin値及びTGFA値との間に機序的な関係があるのか検討するため、血清をELISAにも供した13人の患者の腫瘍を材料として、PCRによりEGFRチロシンキナーゼドメイン（エキソン18-21）のダイレクトシーケンスを行った。表５に示すように、ゲフィニチブ治療後にPRもしくはSDを示した8人の患者中4人（50％）、及びPDを示した5人中2人（40%）においてEGFR 変異が検出され、これはEGFR変異と血清中のamphiregulin値、及びTGFA値には有意な相関がないことを示すものである。

〔実施例３〕 無作為抽出した肺癌組織における amphiregulinとtransforming growth factor-αの発現状況
amphiregulinとTGFA過剰発現の臨床的有意差を検討するため、無作為に選んだ手術後の449人の非小細胞肺癌患者から採取した組織を使用し、組織マイクロアレイによりamphiregulin及びTGFA蛋白の発現を検討した。amphiregulinは前報（Ebert M, et al., Cancer Res 1994;54:3959-62.、Bostwick DG, et al., Prostate 2004;58:164-8.）で示したように、腫瘍細胞の細胞質及び／或いは核中に主に検出された。TGFAは主に腫瘍細胞の細胞質で染色された。

表６に示したように、性別（男性でより高い；P <0.001 ：フィッシャーの検定による）、組織学的分類（腺癌以外でより高い；P <0.001 ：フィッシャーの検定による）、そして喫煙履歴（現在及び過去の喫煙者でより高い；P <0.001 ：フィッシャーの検定による）はamphiregulin陽性と有意に相関していた。同じような傾向はTGFAでも見られた（男性でより高い；P =0.001；腺癌以外でより高い；P <0.001；現在及び過去の喫煙者でより高い；P =0.005 ：フィッシャーの検定による）。amphiregulin陽性は非細気管支肺胞腫瘍（P =0.004）及び非乳頭型（P =0.011）の腺癌で有意に高かった一方で、TGFAの陽性には有意な差が見られなかった。

amphiregulin陰性患者の生存期間の中間値はamphiregulin陽性患者と比較して有意に長かった（P =0.013 ：log-rank 検定よる；表７）。同様にTGFA陰性患者の生存期間の中央値は陽性患者のそれと比較してより長かった（P =0.029 ； log-rank 検定による；表７）。

ゲフィチニブはEGFRチロシンキナーゼ"選択的な"阻害剤として開発された。しかし、インビトロもしくはインビボの系において、EGFRレベルと癌細胞のゲフィチニブ応答性との間にはっきりとした相関性は示されていない。前報における患者の多変量解析では、ゲフィチニブに対する応答の割合は男性より女性において高く、扁平上皮癌の患者より腺癌の患者において高いことが示唆された（Fukuoka M et al., J Clin Oncol 2003;21:2237-46.; Kim YH et al., Clin Cancer Res 2004;10:7311-7.)。

近年の臨床研究ではゲフィチニブが奏功を示す患者は、気管支肺胞腫瘍もしくは乳頭型が優勢な腺癌であり、喫煙履歴がないことが示唆されている（前出のKim YH et al. 2004; Miller VA et al., J Clin Oncol 2004;22:1103-9.)。近年、Lynchら（Lynch TJ., et al., N Engl J Med 2004;350:2129-39.)やPaezら（Paez JG et al., Science 2004;304:1497-500.）の研究では、EGFRのチロシンキナーゼドメインの変異が非小細胞肺癌のゲフィチニブ感受性に関連していることが示された。EGFRの変異を含む臨床病理学的なゲフィチニブ感受性の判断はある程度までは予測できるが、しかしながら、既存の因子はどれも非小細胞肺癌のゲフィチニブ応答性を完全に予測できるものではないこと示唆している（前出のLynch TJ., et al., 2004; 前出のPaez JG et al., 2004; Pao W et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:13306-11.; Tokumo M et al., Clin Cancer Res 2005;11:1167-73.; Mitsudomi T et al., J Clin Oncol 2005;23:2513-20.; 前出のKakiuchi S et al., 2004)。

さらに言えば、ゲフィチニブ治療の臨床的効果はPRのような客観的な奏効に制限されず、SD患者にも適用されるべきである（前出のKakiuchi S et al., 2004）。既報の臨床試験（前出のFukuoka M et al., 2003; Kim YH et al., 2004)において、あるグループの患者は腫瘍サイズの目立った縮小なく、症状の改善や病状の安定期間の延長が見られた。この研究は本発明で得られた研究とも一致する；すなわち、PR+SDグループの患者の生存期間はPD患者と比較して、はるかに延長された（P =0.011 ；log-rank検定による）。

変異や発現プロファイルの解析は時間がかかる手法であり、充分量の癌細胞を含んだ生検試料を必要とする。進行性非小細胞肺癌患者は滅多に手術の候補とはならず、その治療の選択には必ずしも病理学的診断の為の組織を侵襲する生検採取が必要ではないことから、変異や発現プロファイルなどの上記の手法は薬の応答性の日常的な診断には適さない。実際、経気管支生検の主要な合併症の出現率は0.5%から6.8%である(British Thoracic Society. Guidelines on diagnostic flexible bronchoscopy. Subcommittee on Standards of Care Committee, British Thoracic Society. Thorax 2001;56:i1-21.)。このため本発明者らは、各患者の薬剤応答性を予測するために、血清学的診断のようにどのような病院でも容易に使用可能で、安全、かつ侵襲性の低いシステムの早急な確立が必要であると考えた。

本発明者らは、いずれもEGFRやErBbsのリガンドであるamphiregulinやTGFAが、応答性の細胞ではほとんど検出できないのに比較して、ゲフィチニブ非応答性の腫瘍細胞中で有意に過剰発現していることを見出した（前出のKakiuchi S et al., 2004）。進行性の非小細胞肺癌患者集団の血清中のamphiregulin、及びTGFA値の検討から、このような患者のゲフィチニブに対する低応答性を予測するのにamphiregulin、及びTGFA蛋白は高い診断価値がある可能性が得られた。ゲフィチニブ非応答性の患者はamphiregulinについては30人中12人（40％）、TGFAについては30人中13人（43.3％）の血清で陽性であった。さらに二つのマーカーを組み合わせることで、非応答性（患者）の検出度は63.3％に改善された。

公知の、EGFRの変異を解析する方法では、PRの患者を選択することはできるがSDの患者を認識することが殆どできない（前出のLynch TJ., et al., 2004; Paez JG et al., 2004; Pao W et al., 2004; Tokumo M et al., 2005; Mitsudomi T et al., 2005）。一方、本発明に基づく二つのマーカーを使用した予測システムによれば、主にゲフィチニブに対して、PDの症例をPRもしくはSD患者と区別することができる。これは、本発明の重要な利点の一つである。実際、統計学的な解析でも、血清中のamphiregulinやTGFA値は生物学的にEGFR変異の状態と無関係であるという仮説が支持されている。

この研究ではまた、amphiregulinもしくはTGFA陽性の患者の生存期間は、陰性の患者と比較して短いことが示された。特に、これらの血清中のマーカーでの診断により、それぞれのマーカーが独立して予後不良と関連していると見られた。フェーズIIIのトライアル（肺癌患者１６９２症例におけるイレッサ生存率評価；http://www.astrazeneca.com/pressrelease/4245.aspx）の主要エンドポイントにおける初めての解析では、全ての母集団（ハザード比, 0.89；P =0.11中央値, 5.6 対 5.1月）や腺癌患者（ハザード比, 0.83；P =0.07 中央値, 6.3 対 5.4 月）におけるプラセボによる二重盲検試験と比較して、ゲフィチニブは必ずしも生存期間を延長できないという結果が得られた。統計上はこれらの集団に対する客観的奏効率の改善や、東洋系の患者や、非喫煙者患者グループに延命効果があったにも関わらずである。

本発明者らが得た結果からは、血清中のamphiregulinおよび／あるいはTGFA値は、ゲフィチニブに対する応答性が乏しく延命効果を殆ど得ることができない患者を選択するのと同時に、その恩恵を実際には得られるであろう患者の範囲を広げるのに有効であると考えられる。現在のところ、進行性非小細胞肺癌に対するゲフィチニブ治療の非応答性を予測する方法として、血清中のamphiregulin及びTGFAの検出は唯一のルーチン且つ有意義な方法である。したがって、本発明に基づく診断キットが開発され、ゲフィチニブ治療の選択において血清中のamphiregulinとTGFA陽性度を調べることは有用である。

EGFRリガンドの自己分泌経路が肺癌細胞の生存や成長に重要であることは疑う余地がない（Fontanini G et al., Clin Cancer Res 1998;4:241-9.; Hurbin A et al., J Biol Chem 2002;277: 49127-33.)。しかしながら、非小細胞肺癌患者の生存期間の短縮にamphiregulinの過剰発現が関係していることは様々な証拠から示唆されているものの、肺癌細胞の発生や成長にamphiregulinやTGFAがどのような役割を果しているのかはよく分かっていない(前出のFontanini G et al., 1998)。本発明者らの研究結果では、ある程度確実に非小細胞肺癌腫瘍中のamphiregulinやTGFA蛋白が、手術後の患者の悪い予後に関係していることも示された。さらに、男性、腺癌以外、そして喫煙履歴が非小細胞肺癌組織中のamphiregulin及びTGFA陽性と関連し、組織学的に腺癌の一部の型（非乳頭型、非細気管支肺胞腫瘍）がamphiregulin陽性と関連していることも示された。

先ごろ、他の研究グループがゲフィチニブは特に乳頭優勢型及び／或いは細気管支肺胞腫瘍型の腺癌に効果があると報告した；彼らのデータもまた、ゲフィチニブ抵抗性にamphiregulin／TGFAの発現及び組織学的な分類が関係していることを示唆している。一方で最近、人の肺腺癌細胞でのamphiregulinの抗アポトーシス活性が報告された（前出のHurbin A et al., 2002）。このamphiregulinの抗アポトーシス活性が非小細胞肺癌細胞のゲフィチニブ抵抗性を誘導しているのかを調べるため、前もって、ゲフィチニブ感受性であるがamphiregulinを発現していない非小細胞肺癌細胞株、PC-9を使用して生物学的な解析を行った。そして、PC-9 に対するゲフィチニブの抗腫瘍活性がamphiregulinの自己分泌によって劇的に減少することを発見した（前出のKakiuchi S et al., 2004）。この結果は、EGFRによる成長因子シグナルがそのリガンド、二量化因子、エフェクター、そして下流経路などの多様性によりあらゆるステップで関係しているが、amphiregulinがリガンドー受容体自己分泌経路の主要な活性化因子となり癌細胞のゲフィチニブ抵抗性を誘導していることを強く示唆している。

結論として本発明では、血清中のamphiregulin及びTGFA値が非小細胞肺癌のゲフィチニブ応答性を予測するのに最も重要な因子であることを示した。血清中のamphiregulin及びTGFA値の測定は、erbB受容体阻害剤に対する応答性の予測に、日常的に実現可能で、非侵襲的であり、そして費用のかからない手法である。

本発明は、erbB受容体阻害剤の肺癌の治療効果の予測に有用である。erbB受容体阻害剤には、ゲフィチニブ（商品名「イレッサ;Iressa」登録商標）などが含まれる。更に、本発明は、erbB受容体阻害剤を用いる肺癌の治療方法を提供する。本発明に基づいてerbB受容体阻害剤に対する応答性が低いと予測される患者が特定される。つまり、本発明は、erbB受容体阻害剤に対する応答性が期待できない患者を、より高い感度で検出することができる。すなわち本発明によって、erbB受容体阻害剤に対する応答性を有する患者を、より特異的に見出すことができる。その結果、本発明に基づいて、erbB受容体阻害剤による、より効果的な肺癌の治療を行うことができる。

ゲフィチニブ治療を受けた50人のNSCLC患者血清中のamphiregulin (AREG; A) 及びTGFA(TGFA; B) 濃度のELISAによる測定結果を示す図である。8例がPR, 12例がSD、30例がPDを示した。水平線はカットオフ値を示し、これより高い濃度は陽性、低い場合は陰性とした。 ゲフィチニブ治療を受けた50人のの腫瘍縮小効果予測診断における血清中のamphiregulin濃度（A）或いはTGFA濃度（B）のさまざまなカットオフ値を用いた感度と擬陽性率を示すROC曲線である。 ゲフィチニブ治療を受けた50人の腫瘍特異的生存率を血清中のamphiregulin濃度（A）或いはTGFA濃度（B）の陽性もしくは陰性濃度に従ってKaplan-Meier法により解析した結果を示す図である。両グループ間の差異は、log-rank 検定により評価した。

Claims (3)

1. 非小細胞性肺癌の治療剤であって、
   (1) 非小細胞性肺癌患者の血中のAREG濃度およびTGFA濃度を測定し；
   (2) (1)の測定値をゲフィチニブに対する応答性を有することが確認された患者の血中AREG濃度のカットオフ値93.8pg/mLおよびTGFA濃度のカットオフ値15.6pg/mLと比較し；そして
   (3) (2)の比較の結果、(1)の測定値のいずれもが該カットオフ値より低い患者に対して投与するための、ゲフィチニブを有効成分として含有する非小細胞性肺癌の治療剤。
2. ゲフィチニブに対する非小細胞性肺癌患者の応答性を予測するためのマーカーを検出するための方法であって；
   (1) 前記マーカーは、非小細胞性肺癌患者から採取された血液試料のAREG濃度およびTGFA濃度であり；
   (2) 当該患者から採取された血液試料中の該AREG濃度およびTGFA濃度を測定し；
   (3) (2)の測定値をゲフィチニブに対する応答性を有することが確認された患者の血中AREG濃度のカットオフ値93.8pg/mLおよびTGFA濃度のカットオフ値15.6pg/mLと比較し；そして
   (4) (3)の比較の結果、(1)の測定値のいずれもが該カットオフ値より高いときに、当該患者がゲフィチニブを有効成分とする非小細胞性肺癌の治療剤に対する応答性が低いことが示される方法。
3. 血液試料のAREG濃度をイムノアッセイによって測定することを特徴とする請求項２に記載の方法。

Images