TW202417641A

TW202417641A - 預測對egfr激酶活性之抑制劑的反應之方法

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Publication number: TW202417641A
Application number: TW112131888A
Authority: TW
Inventors: 強納森伍德史密斯; 亞力山德芙蘿
Original assignee: 德商英迪弗美德有限公司
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2023-08-24
Publication date: 2024-05-01

Abstract

本發明係關於一種選擇可能對酪胺酸激酶抑制劑(TKI)治療有反應的患者之方法。本發明又係關於一種用於預測對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之診斷套組。此外，本發明係關於一種在SHP2上磷酸化的T59作為生物標記以預測EGFR激酶活性之用途。

Description

預測對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法

在許多情況下，蛋白質的特定酪胺酸殘基的磷酸化為細胞中訊息傳遞的特徵。能夠催化此類反應的酶被稱為酪胺酸激酶，而酪胺酸激酶抑制劑(TKI)係藉由酪胺酸磷酸化而抑制蛋白質活化的藥物。生長因子受體酪胺酸激酶在多種病症或疾病的病因學及進展中扮演一角色，包括例如人類的惡性疾病。此等受體藉由跨膜結構域而被錨定在表現它們的細胞膜上。胞外結構域會與生長因子結合。生長因子與胞外結構域的結合造成訊息從細胞外部傳遞至胞內激酶結構域。此訊息傳遞有助於許多種多效反應，其負責例如DNA合成的誘導、改變的基因表現、細胞生長、增殖及分化等。

表皮生長因子受體(EGFR)為一種酪胺酸激酶受體且為由四種成員組成的HER/ErbB家族之一成員﹕EGFR (HER1/ErbB1)、HER2/neu (ErbB2)、HER3 (ErbB3)及HER4 (ErbB 4)。此受體由三部分組成：糖基化的胞外配體結合結構域、由單鏈組成的跨膜結構域、及胞內蛋白質-酪胺酸激酶結構域。配體與胞外結構域的結合導致受體二聚化並活化蛋白質-酪胺酸激酶活性。包括EGF及轉形生長因子-α (TGF-α)之數種生長因子會與表皮生長因子受體結合。EGFR廣泛分佈於哺乳動物上皮細胞、纖維母細胞、神經膠細胞、角質形成細胞等細胞表面。EGFR傳訊路徑在如細胞生長、增殖、分化等生理過程中扮演重要角色。如EGFR的蛋白質酪胺酸激酶之功能缺陷，或相關傳訊路徑中關鍵因子的活性或細胞定位異常皆可能導致腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發生。

數種惡性腫瘤與ErbB家族成員的突變或表現增加有關連。EGFR及ErbB2的過度表現與某些類型的上皮來源腫瘤中的細胞增殖密切相關，例如神經膠母細胞瘤(包括多形性神經膠母細胞瘤)、肺癌(腺癌，包括支氣管肺泡癌(BAC)及非小細胞肺癌(NSCLC))、以及乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎臟癌、頭頸癌。腫瘤細胞膜上EGF受體的擴增及/或過度表現與患者的不良預後相關。

此種觀察已刺激針對抑制人類EGFR或HER2功能作為治療癌症的治療途徑之研究。例如，抗EGFR抗體以及抗HER2抗體在人類癌症治療中已顯示出豐碩的成果。目前已上市的EGFR相關藥物包括(參見M.L.Uribe et al., Cancer 2021, 13, 2748)吉非替尼(Gefitinib)(Iressa®)、厄洛替尼(Erlotinib)(Tarceva®)及阿法替尼(Afatinib)(Gilotrif®)皆為口服投予的喹唑啉衍生物，其作用為選擇性EGFR酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)且用於治療EGFR-突變型(ERBB1-突變型)肺癌。拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb®)為口服有效的喹唑啉衍生物，其為一種EGFR/HER2雙重抑制劑，用於治療ErbB2-過度表現的乳癌。前述TKI競爭性結合在胞內段的酪胺酸激酶之磷酸化位點以阻斷磷酸化位點與ATP的相互作用，並抑制酪胺酸的磷酸化及一系列下游訊息傳遞，然後抑制腫瘤細胞的生長。可逆性EFGR抑制劑吉非替尼及厄洛替尼對具有EGFR突變的非小細胞肺癌患者顯示有利的治療效果；它們可以顯著延長患者的疾病無惡化存活(PFS)及總存活(OS)。曲妥珠單抗(Trastuzumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、埃萬妥單抗(Amivantamb)(Rybrevant®)及曲妥珠單抗-美坦新(Trastuzumab-Emtansine)為被靜脈注射給予的單株抗體，靶向胞外結構域並用於治療ErbB2陽性乳癌。曲妥珠單抗-美坦新為一種抗體藥物結合物，其遞送細胞毒性藥物至過度表現ErbB2的細胞。西妥昔單抗(Cetuximab)及帕尼單抗(Panitumumab)係靶向ErbB1的單株抗體，且用於治療結腸直腸癌。

然而，並非所有受試者皆對EGFR療法有反應。因此，患者可能會暴露於與EGFR靶向療法相關的有害副作用而沒有益處。

WO2007/106432描述一種用於預測患有由EGFR介導的疾病或病況(例如，上皮來源的癌症，諸如NSCLC)之受試者對EGFR激酶抑制劑的反應之方法。依據此方法，測量在EGFR中殘基Y1068及T1148的磷酸化的量。在此兩個殘基的磷酸化水平升高被用作受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應的指標。然而，此方法在實踐中尚未確立。目前還沒有其中EGFR上的磷酸位點用於選擇抗腫瘤治療的反應者之伴隨式診斷試驗。

與酪胺酸激酶在訊息傳遞級聯中扮演重要角色的另一組酶為蛋白質酪胺酸磷酸酶(PTPs)，其能夠從蛋白質上的磷酸化酪胺酸殘基中移除磷酸基團。PTP家族的一成員為SHP2(含有Src同源區2結構域的磷酸酶-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2))，一種亦稱為蛋白酪胺酸磷酸酶非受體11型(亦稱為PTPN11)的酶。SHP2含有兩個串聯的Src同源2結構域，其作用為作為磷酸酪胺酸結合結構域並介導SHP2與其基質的相互作用。作為SH2家族的一成員，SHP2可藉由許多種上游活性激活，而介導多種細胞性途徑中的磷酸-酪胺酸訊息傳遞(參見Z.Song et.al, Acta Pharmaceutica Sinica B, 11 (1), 2021, 13-29.)。

J. Biol. Chem., Vol 270, No. 36,1995, p. 21277-21284描述人類腫瘤細胞中SH2結構域蛋白質酪胺酸磷酸酶與EGFR的關聯。

一般而言，現有技術已知西方墨點法試劑或西方墨點法測定。

Zhang et al., Cancer Research, vol. 81, no. 11, 2021, p. 3051-3066係關於一系列對此等藥物敏感或耐藥的同基因型EGFR突變肺腺癌細胞株的蛋白質體及磷酸蛋白質體的研究。其確定了SHP2的磷酸化變化是否與TKI耐藥細胞中的PI3K/AKT及MAPK傳訊相關。磷酸化蛋白質標準化為總蛋白表現的相對定量在西方墨點法上進行。

Li et al., Oncology Reports, vol. 33, no. 2, 2014, p. 951-957係關於用於預測對酪胺酸激酶抑制劑的反應之生物標記。為了確定磷酸化水平，使用西方墨點法分析。

WO2007/027916揭示在訊息傳遞蛋白質及人類癌症潛在途徑中鑑定的磷酸化位點。此文件進一步提供用於選擇性檢測及定量此等磷酸化位點/蛋白質之磷酸化位點特異性抗體和重同位素標示肽(heavy-isotope labeled peptides)(AQUA肽)。藉由ELISA及西方墨點法分析而測試此抗體。

Grimes et al, Science Signaling, vol. 11, no. 531, 2018係關於蛋白質磷酸化、乙醯化及甲基化資料集(dataset)的整合以概述肺癌傳訊網路的研究。使用酪胺酸特異性抗體進行免疫沉澱。然而，使用此篇文章引用的抗體及方法不可能實驗性地確定SHP2中T59的水平。除了T59之外，SHP2還具有至少7個其他已知的可被磷酸化的蘇胺酸殘基。不可能使用所述抗體來確定僅存在於T59上的訊息。僅可能確定所有蛋白質上蘇胺酸磷酸化的總水平。

此結果被本發明之發明人確認。尤其，本申請案之圖4及圖5表明，SHP2上的總磷酸化蘇胺酸訊息和總磷酸化訊息皆不能作為EGFR活性的良好分類器。因此，參考抗體可用於測量SHP2(PTN11)的所有磷酸-蘇胺酸殘基，但作為分類器的性能較差。

綜合上述，現有技術文獻描述潛在的生物標記，其被設計為能夠識別對治療有抗性的癌症(陰性選擇標準)，而不是識別具有活化的EGFR傳訊路徑的患者(陽性選擇標準)，其為本發明的主題。與此相反，本發明定義一種定義從EGFR治療中受益的患者之新穎方法，且沒有將此組進一步細分為反應者和無反應者(參見本發明之圖6)。

此外，儘管先前技術並未被設計定義EGFR活性(因此用於抗EGFR治療的陽性選擇標準)，但根據本發明，測試所述生物標記HER3及ERK1/2的磷酸化是否可預測如通過基因體突變狀態所定義的EGFR活性。HER3及ERK1/2為已知的傳訊中樞，此等之磷酸化依賴於多個輸入訊息，且它們磷酸化許多輸出蛋白質。因此，雖然它們可能在EGFR活化的細胞中被磷酸化，但它們亦在許多其他條件下或在許多其他分子狀態下被磷酸化，並且無法預期它們能形成準確的EGFR活性預測因子的基礎。此被本發明所證實(參見本發明之圖4及5)。尤其，此數據顯示，與PTN11上的pT59相比，HER3和ERK1/2的表現非常差。

由於患者對抗癌治療的反應不同，特別是對生物治療，因此需要找到預測哪種治療方案最適合特定患者的方法。尤其，期望有一種對患者進行分層的方法，尤其是用於區分反應者與無反應者的方法，以鑑定出一類可能受益於EGFR靶向療法之受試者。

因此，本發明之一目的係提供一種用於預測罹患疾病或病症的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法。

尤其，本發明之一目的係提供一種用於預測罹患使其成為以EGFR激酶活性之抑制劑治療的候選者的癌症的患者是否對以EGFR激酶活性之抑制劑治療(投予)有反應(易感性、順從)的方法。特別是該方法適用於具有上皮細胞來源的癌症的患者，特別是具有NSCLC(非小細胞肺癌)的患者。

該方法應克服現有技術的缺點。尤其，本發明之一目的係提供一種預測對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法。現有技術之方法係基於突變分析，其具有生物學局限性。過度活化的EGFR不僅可由突變引起，還可以通過其他機制造成。基於IHC(免疫組織化學)的方法可為一種良好的替代方法，且能檢查並識別更多可從TKI治療中受益的患者。

此外，本發明之一目的係提供一種用於鑑定標記之方法，該標記可預測具有過度活化的EGFR的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應。

有腫瘤活化突變可用於識別對TKI治療有反應的患者。例如，EGFR突變存在於NSCLC腺癌患者之亞群(約15%)，其可使用作為EGFR活性的指示性標準，並識別對TKI治療有反應的患者。

依據本發明使用的磷酸位點係藉由比較以野生型EGFR和突變型活化的EGFR標註的NSCLC病例之間從NSCLC腫瘤數據集而鑑定。在此分析中，通過質譜測定法測量磷酸位點之磷酸化訊息。令人驚訝地，在SHP2上的T59胺基酸之磷酸化在兩組之間顯示出最大的統計顯著效果，且單獨產生的訊息足夠強，足以將具有活化的EGFR的樣本與大部分小組清楚地區分開。

依據本發明之方法具有下列優點﹕ - 依據本發明之方法可在治療前先確定個體患者的藥物敏感性，可選擇地與基因體分析結合，如此可作為個體化靶向療法的基礎。 - 基於測量p位點訊息而不是通過突變測試而鑑別具活化的EGFR之NSCLC患者。SHP2上T59處的磷酸位點(p位點)可作用作為生物標記。 - 此方法能夠鑑別典型突變測試可能漏掉的具活化的EGFR之患者。 - 基於伴隨式診斷的免疫組織化學可能為常規實驗室或臨床環境中的有用替代方案。 - 可檢查並鑑別更多可從TKI治療中受益的患者。 - 依據本發明使用的磷酸位點的穩定性不會受缺血時間的影響。p位點的穩定性有時限制實際應用，然而在這種情況下，缺血時間並非本發明方法的限制因素。 [發明摘述]

本發明係關於一種預測罹患疾病或病症的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有上皮細胞來源的癌症的受試者之腫瘤收集樣本； b) 確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。

尤其，本發明係關於一種預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者之腫瘤收集樣本； b) 確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。

本發明又係關於一種用於選擇罹患可能對EGFR激酶活性之抑制劑反應的疾病或病症的受試者之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有上皮細胞來源的癌症的受試者之腫瘤收集樣本； b) 確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。

尤其，本發明又係關於一種用於選擇罹患可能對EGFR激酶活性之抑制劑反應的非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者之腫瘤收集樣本； b) 確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。

本發明又係關於一種用於鑑別在受試者中過度活化的EGFR之方法，其包含下列步驟﹕ i) 從患有上皮細胞來源的癌症之受試者的腫瘤收集樣本； ii) 確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； iii) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能具有過度活化的EGFR。

尤其，本發明又係關於一種用於鑑別在受試者中過度活化的EGFR之方法，其包含下列步驟﹕ i) 從患有非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者的腫瘤收集樣本； ii) 確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； iii) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能具有過度活化的EGFR。

本發明亦係關於一種用於預測罹患疾病或病症的受試者對EGFR激酶之抑制劑的反應之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。

尤其，本發明亦係關於一種用於預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者對EGFR激酶之抑制劑的反應之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。

本發明又係關於一種用於預測罹患疾病或病症的受試者對EGFR激酶之抑制劑之過度活化的EGFR之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。

尤其，本發明又係關於一種用於預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者對EGFR激酶之抑制劑之過度活化的EGFR之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。

本發明又係關於一種在SHP2上磷酸化的T59作為標記之用途，該標記可預測具有過度活化的EGFR的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應。此用途包含確定與對照水平相比，來自EGFR傳訊路徑的一種或多種蛋白質中磷酸化過度或不足的胺基酸殘基。

尤其，本發明又係關於一種在SHP2上磷酸化的T59作為標記之用途，該標記可預測具有過度活化的EGFR的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應，包含確定與對照水平相比，來自EGFR傳訊路徑的一種或多種蛋白質中SHP2上的T59之磷酸化為過度或不足的磷酸化。

本發明之另一具體實施例係關於一種用於預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的患者是否適合抗EGFR療法之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者之腫瘤收集樣本； b) 確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者適合抗EGFR療法。

在本發明之適合且較佳的具體實施例之下列描述中，術語「預測罹患疾病，特別是非小細胞肺癌(NSCLC)之受試者的反應」若沒有具體定義，可以被術語「預測患者是否適合抗EGFR療法」替換。

[發明之描述]

在本發明的意義上，SHP2與PTPN11係同意義地使用。

「蛋白質」與多肽可互換使用，且包括蛋白質片段及結構域(domain)以及完整蛋白質。

「可磷酸化的胺基酸」或磷酸化意指能夠藉由添加磷酸基團進行修飾的任何胺基酸，且包括此種胺基酸的兩種形式。

「可磷酸化的肽序列」意指包含至少一個可磷酸化的胺基酸的肽序列。

在本發明的意義上，術語「受試者」係指任何人類或動物。(非人類)動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，包括牛、綿羊、豬、山羊、馬、家禽、狗、貓、非人靈長類動物、囓齒類動物等。在一具體實施例中，受試者為人類受試者。

表皮生長因子(EGF)為一種刺激細胞生長及分化的蛋白質。EGF受體(EGFR)與EGF結合並形成蛋白質-配體相互作用。

術語「p-位點」、「磷酸位點」及「磷酸化位點」係同意義地使用。

本發明之第一具體實施例為一種用於預測罹患疾病或病症(特別是非小細胞肺癌)的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法。

本發明之一特定具體實施例為一種用於預測罹患使其成為以EGFR激酶活性之抑制劑治療的候選者的癌症的(人類)患者是否對以EGFR激酶活性之抑制劑治療有反應的方法，其包含步驟a)至c)，如上文和下文所定義，其中包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化，表明患者可能對以抑制EGFR激酶活性的藥劑的治療有反應。

步驟 a)在步驟a)中，收集來自患有上皮細胞來源的癌症的受試者的腫瘤之樣本。

適合的樣本含有來自患有上皮細胞來源的癌症的受試者之腫瘤的組織或細胞。樣本較佳包含生檢樣本，諸如腫瘤生檢、原發組織、轉移組織。尤其，可藉由穿刺生檢、影圖引導生檢、手術(切除)生檢、刮取/鑽取式生檢、內視鏡活生檢、腹腔鏡生檢及其組合而獲得檢體。

如本文使用之術語「從腫瘤收集樣本」係指從患者獲取的用於診斷目的之樣本。腫瘤樣本可藉由所屬技術領域中具通常知識者已知的常規措施，即生檢(藉由抽吸或穿刺、切除或藉由導致生檢或切除的細胞材料之任何其他手術方法進行)從患者獲得。以此方式，可能獲得用於本發明之方法的組織。然而，在樣本收集過程中，腫瘤不會被(完全)去除。在本發明的意義上，「從腫瘤收集樣本」並不意圖針對治療性處理方法。

在一較佳具體實施例中，受試者具有過度活化的EGFR。

EGFR之過度活性並不等同於EGFR之過度表現。在許多癌症中皆觀察到表皮生長因子受體(EGFR)之過度活化，有時伴隨基因擴增。換言之，過度活化的EGFR係指EGFR-驅動的磷酸化活性的增加，而非EGFR表現本身的增加。

基於樣本的體細胞突變概況，樣本被分類為EGFR過度活化。尤其，若樣本攜帶至少一種如下定義的活化突變，則該樣本被認為係EGFR過度活化的。

過度活化的EGFR係由EGFR中的突變或由與EGFR的蛋白質相互作用引起，使得該突變或該蛋白質相互作用導致受體構形改變並成為參與有助於疾病狀況的活化的傳訊狀態。

在第一較佳具體實施例中，EGFR的過度活化係由EGFR基因突變引起，EGFR基因存在於染色體7p11.2上，有28個外顯子，編碼464個胺基酸的跨膜受體蛋白。在EGFR基因中，外顯子5-7及13-16編碼配體結合結構域，外顯子18-24編碼酪胺酸激酶結構域，且自磷酸化發生在外顯子25-28編碼的區域。特別是，該突變影響至少一個上述結構域。在可能對TKI治療產生積極反應的肺癌患者中，EGFR突變尤其在外顯子18-21中被觀察到。

EGFR突變尤其選自改變L858、T790、G719、L861、S768的突變；外顯子19的缺失；

尤其，該突變包括﹕ ● 點突變體L858R， ● 點突變體T790M， ● 點突變體G719A/C， ● 點突變體L861Q， ● 點突變體S768I，及相當的突變，例如 ● 外顯子19缺失。

其它相當的突變包括L858所位於的功能部分中的突變，諸如EGFR的酪胺酸激酶部分中的突變，或EGFR的ATP結合口袋中或附近的突變。

第二較佳具體實施例中過度活化的EGFR由與EGFR的蛋白質相互作用所引起，使得受體構形改變並成為參與有助於疾病狀況的活化的傳訊狀態。

較佳地，受試者罹患的疾病或病症為癌症，特別是上皮細胞來源的癌症。此癌症包括原發性癌及繼發性(轉移性)疾病。

尤其，該癌症選自神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、及肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰臟癌、膀胱癌、頭癌、頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、及腎臟癌。

特別是該疾病或病症為非小細胞肺癌(NSCLC)。

步驟 b)在依據本發明之方法的步驟b)中，確定在SHP2蛋白質中磷酸化位點殘基T59的磷酸化水平。

磷酸化水平可藉由對腫瘤組織進行靶向質譜分析而確定。

亦可藉由開發特異性靶向p位點的抗體及/或IHC測定法而進行測定。

用於本發明的抗體可藉由本領域已知的任何適合的方法生產。此類抗體包括但不限於多株、單株、人類化、噬菌體展示所衍生的抗體或嵌合抗體。

步驟 c)在依據本發明之方法的步驟c)中，將包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較。

因此，與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。

因而，與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者具有過度活化的EGFR。

對照水平係指在非癌性組織中蛋白質的指定的胺基酸殘基處的磷酸化水平，特別是胺基酸側鏈上的胺基酸殘基磷酸化水平。換言之，對照水平係指在正常非腫瘤組織中蛋白質指定的胺基酸殘基處的磷酸化水平。

磷酸化水平「顯著升高」(與對照水平相比)係使用本領域適當且眾所周知的統計方法而與對照水平的差異特別顯著的水平。例如，在具有過度活化的EGFR的受試者中包含SHP2的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化。

測量在胺基酸殘基的磷酸化水平之方法為慣用且常規的。一般而言，測量依賴於抗體組的存在，此等抗體組係在感興趣的蛋白質(諸如EGFR)中的情形對特定目標胺基酸殘基的非磷酸化或磷酸化形式為特異性。此種抗體可由市售取得或可使用慣用程序而常規地生產。在一具體實施例中，使用包含來自感興趣的蛋白質(無論是非磷酸化形式或磷酸化形式)的感興趣胺基酸的合成肽作為抗原以製備適合的抗體。抗體可為多株或單株。選擇並驗證抗體，以僅檢測蛋白質的磷酸化版本，而不檢測天然或變性蛋白質的非磷酸化版本，反之亦然。

此種抗體可以多種方式使用，例如，可從患者樣本中製備全細胞裂解物，並將其以陣列形式點樣到適合的基質上，諸如硝化纖維素條或載玻片。較佳地，樣本中的蛋白質在點樣前變性。一般而言，細胞以系列稀釋液點樣，諸如兩倍系列稀釋，以提供寬的動態範圍。可以包括適合的對照，諸如陽性對照或對照水平的對照。然後用適合的可檢測抗體探測每個陣列，如上所述，以確定及/或定量各種感興趣的蛋白質中的胺基酸殘基被磷酸化。免疫定量之方法為慣用方法。運用此種抗體以評估感興趣的殘基處的磷酸化水平及/或程度的其他適合的測定法包括例如西方墨點法、ELISA測定法、免疫組織化學、質譜法、及其他慣用測定法。適合的方法包括能夠檢測非常小樣本(例如約200個細胞)中的磷蛋白質的方法。或者，可使用適合大樣本大小之方法(例如FFPE組織切片)。

測量磷酸化殘基的存在及/或水平的測定可容易地適應高通量形式，例如，若需要，使用機器人學。本發明方法可進一步包含確定EGFR的活化狀態。

即，可確定患者樣本中是否存在活化突變。例如，在SHP2殘基T59處具有活化突變及過度磷酸化的受試者可依據本發明被確定為反應者，並因此被選擇用於EGFR治療。

由EGFR介導的其他病況亦可經歷本發明之方法。此等病況選自過度增生病況，諸如癌症、癌前病況、代謝病症(例如糖尿病)、皮膚病症或疾病、心血管疾病、過度增生細胞疾病或病症、牛皮癬、肥胖症、炎症性呼吸道疾病、氣喘、COPD、及神經系統病症。罹患彼等病況的患者亦可藉由本發明之方法測定。

本發明之一態樣為一種用於治療罹患具有過度活化的EGFR的疾病或病症的受試者之方法，特別是非小細胞肺癌，包括以下步驟﹕ i) 測量來自受試者的樣本中在SHP2殘基T59的磷酸化水平，若與對照水平相比的磷酸化水平暗示受試者可能對EGFR治療有反應， ii) 對受試者實施EGFR治療(投予有效量之EGFR抑制劑，諸如EGFR激酶活性之抑制劑)。

較佳地，EGFR抑制劑係選自BIBX 1382；西妥昔單抗(Erbitux)；CI-1033 (卡奈替尼(Canertinib))；EKB-569；EMD 55900；EMD 72000；厄洛替尼(OSI-774；Tarceva)；吉非替尼 (ZD1839；Iressa)；GW-2016；hR3；ICR-62；拉帕替尼(GW-572016)；薰草菌素A(Lavendustin A)；薰草菌素B(Lavendustin B)；單株抗體E7.6.3；帕尼單抗(ABX-EGF)；PD 153035；PD-168393；PKIl 66；RG-13022；RG-14620；TheraCim hR3；Tyrophostins；Tyrphostin AG 490；Tyrophostin AG 494；Tyrphostin AG 825；Tyrphostin AG 1478；Tyrphostin 1 ；Tyrphostin 23 (RG-50810)；Tyrphostin 25 (RG-50875)；Tyrphostin 46；Tyrphostin 47 (RG-50864，AG-213)；Tyrphostin 51；ZD-6474；其衍生物、或其組合。

在一較佳具體實施例中，受試者為罹患NSCLC的人類患者，且EGFR激酶抑制劑係選自Iressa®(吉非替尼)、Tarceva®(厄洛替尼)、Vizimpro®(達可替尼(dacomitinib))、Gilotrif®(阿法替尼)、或其混合物。

可使用此等藥劑彼此之組合或此等藥劑與慣用藥劑諸如化療劑的組合。儘管化合物可被表徵為「EGFR抑制劑」、「EGFR激酶抑制劑」或「EGFR途徑之抑制劑」，但本發明不限於此種藥劑達成治療功效的機制。例如，依據本發明選擇的患者子集可能對EGFR治療有反應，儘管作用機制可能與EGFR路徑的調節不相關或不完全相關。

在EGFR酪胺酸激酶級聯中有許多下游蛋白質在罹患NSCLC並具有過度活化的EGFR的受試者(及/或在具有突變的培養細胞中)的特定殘基處被過度磷酸化。

本發明之另一態樣為以醫藥組成物治療被定義為潛在反應者之患者，該醫藥組成物包含有效量之至少一種如上定義的EGFR激酶活性之抑制劑及醫藥上可接受的載體(carrier)。

此種醫藥組成物可被投予至具有過度活化的EGFR之受試者，其中藉由依據本發明之方法確定該受試者可能對EGFR激酶抑制劑有反應。

本文討論的抑制劑可被調配成各種組成物，例如醫藥組成物，用於治療的治療方法中。醫藥組成物可被組裝成套組。一般而言，本發明之醫藥組成物包含抗癌有效量之抑制劑。如本文使用之「抗癌有效量」係足以在合理的時間框內在個體中有效產生至少治療反應的量。例如，它可至少在可檢測的程度上改善癌症的症狀，或者可抑制腫瘤的生長等。

該組成物可包含載體，諸如醫藥上可接受的載體。「醫藥上可接受」係意指不是生物學上或其他方面不期望的材料，即，該材料可被施用於受試者而不會引起任何不期望的生物效應或以有害的方式與醫藥組成物所含任何其他組分相互作用。如所屬技術領域中具通常知識者所熟知，載體將被自然地選擇來最小化活性成分的任何降解並且最小化受試者中的任何不良副作用。

所屬技術領域中具通常知識者將理解，特定調配物將部分取決於所使用的特定抑制劑或所利用的其他化療劑以及所選擇的投予途徑。因此，有眾多適合的組成物之調配物。適合於口服、腸胃外、氣溶膠、經皮、局部或其他形式之投予的調配物對於所屬技術領域中具通常知識者為顯而易見的。

所屬技術領域中具通常知識者可容易地確定所使用的組成物的精確調配物的適當劑量、時間表、及投予方法，以便在個體患者中達成藥劑所需抗癌有效量或有效濃度。所屬技術領域中具通常知識者亦可藉由對適當的患者樣本(例如，血液及/或組織)進行直接或間接分析，而容易地確定及使用本發明之化合物的「有效濃度」的適當指標。

被投予至動物(特別是人類)的本發明之抑制劑或其組成物的劑量應足以在合理的時間框內至少在個體中有效產生治療反應(抗癌有效量)。劑量的確切量將因受試者的不同而異，取決於受試者的物種、年齡、體重及一般狀況、所要治療的任何病症的嚴重性或機制、所使用的特定藥劑或媒劑、其投予模式等。用於在活體內達到所需抗癌濃度的劑量將由所使用的特定抑制劑的效力、在宿主中與該藥劑相關的藥效學、受影響個體的疾病狀態的嚴重程度、以及在全身投予的情況下個體的體重及年齡而確定。劑量的大小亦將由可能伴隨所使用的特定抑制劑或其組成物的任何不良副作用的存在而確定。只要有可能，通常希望將不良副作用保持在最低限度。

當以聯合療法給予時(例如，EGFR激酶抑制劑與在EGFR傳訊路徑中的下游蛋白質的一種或多種抑制劑聯合)，可同時給予抑制劑，或可根據需要而交錯進行投劑。組成物中亦可組合兩種或更多種藥物。當組合使用時，每種藥物的劑量可比單獨使用任何一種時的劑量少。

本發明之第二具體實施例，一種用於鑑別在受試者中過度活化的EGFR之方法，其包含下列步驟﹕ i) 從患有上皮細胞來源的癌症之受試者的腫瘤收集樣本，尤其是從患有非小細胞肺癌的受試者的腫瘤收集樣本； ii) 確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； iii) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能具有過度活化的EGFR。

本發明之第三具體實施例為一種用於預測罹患疾病或病症(特別是非小細胞肺癌)的受試者對EGFR激酶之抑制劑的反應之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。

例如，該套組可有用於預測罹患由過度活化的EGFR引起的疾病或病症(特別是非小細胞肺癌)的受試者之套組，特別是上皮來源的癌症，其包含用於測量包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平的試劑及/或裝置。

再者，該套組可包含用於製備樣本的試劑及/或裝置，諸如收集組織及/或從組織切除樣本；用於將測試樣本點樣於適合的表面上，例如硝化纖維條或載玻片；用於進行免疫定量，諸如標示抗體或用於標示抗體的試劑；用於進行本發明之方法的說明等。

該套組的組分可選擇性地被包裝在一個或多個容器中。

在其他用途中，根據本發明的套組可在實驗應用中鑑定可預測受試者對治療劑的反應的磷酸化模式。所屬技術領域中具通常知識者將認識到適合於實施本發明之任何方法的套組之組分。

可選擇地，依據本發明之套組包含適合的緩衝液；一個或多個容器或包裝材料；及/或用於進行此方法的說明。套組之試劑可在容器中，其中試劑為穩定的，例如為凍乾形式或穩定液體。試劑亦可為單次使用形式，例如單劑量形式。

用於確定例如突變是否存在以及是否與特定治療相關的伴隨式診斷(companion diagnostic)試驗&化合物可在FDA數據庫(https://www.fda.gov/medical-devices/in-vitro-diagnostics/list-cleared-or-approved-companion-diagnostic-devices-in-vitro-and-imaging-tools)中找到。

已通過或批准的伴隨式診斷裝置(活體外及成影工具)列表可在EMA網頁：https﹕//www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/post-authorisation/data-medicines-iso-idmp-standards/public-data-article-57-database上找到。

下表總結FDA批准的5種CDx(伴隨式診斷)試驗及其相應藥物： 1. cobas EGFR Mutation Test v2 (Roche Molecular Systems, Inc.) 2. FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) 3. ONCO/Reveal Dx Lung & Colon Cancer Assay (O/RDx-LCCA)(Pillar Biosciences, Inc.) 4. Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) 5. therascreen EGFR RGQ PCR Kit (Qiagen Manchester, Ltd.)

本發明之第四具體實施例係SHP2上的T59作為標記之用途，該標記可預測具有過度活化的EGFR的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應。此用途包含：確定與對照水平相比，過度磷酸化或磷酸化不足的來自EGFR傳訊途徑的一種或多種蛋白質中的胺基酸殘基，特別是確定SHP2上T59的磷酸化。

將參考下列實施例進一步說明本發明，但其範圍不限於所描述的具體實施例。本發明包括所描述的特徵的所有組合，特別是不互相排斥的較佳特徵的所有組合。

對NSCLC患者中＞30,000個磷酸位點進行測量，每個患者平均進行約22,000個磷酸位點，其包括EGFR傳訊路徑的許多成員。已測試此等磷酸位點的任意組合是否可基於突變狀態而預測EGFR活性，迄今為止最好的預測因子為SHP2上的單個磷酸位點。

圖1顯示EGFR突變頻率。EGFR活性受特定基因突變的影響。在來自患者腫瘤樣本中檢測到的體細胞變異可用作EGFR激酶活性增加的主要指標。圖1顯示至少兩個樣本中出現的彼等15個突變，彼等突變來自NSCLC小組中所有樣本中報告的所有82個不同EGFR突變的頻率計數。彼等圖說明用於識別有希望的磷酸位點的腫瘤樣本數據基礎係具有代表性，由於如先前技術來源所預測，眾所周知的EGFR-活化外顯子-19缺失(23次，Glu746_Ala750del，7次，Leu747_Pro753delinsSer，3次Leu747_Flu749del，及2次Leu747_Thr571del)被發現是最常見的突變。隨後是在Leu858Arg(23次)的突變，及在Gly719的突變(6次Gly719Ala、2次Gly719Cys)。

圖2顯示PTPN11-T59的log2轉形強度。基於圖1中呈現的突變，可能基於樣本的EGFR活性對樣本進行分類。僅攜帶體細胞EGFR突變且對激酶活性影響增加的樣本，可被分類為「活化的EGFR」。反之亦然，不攜帶EGFR活化突變或攜帶其他突變的樣本可被視為「野生型EGFR」。基於此分類，我們鑑定435個野生型EGFR樣本及54個活化的EGFR樣本。當分析PTN11-T59的log2轉形強度時，兩組之間出現顯著差異。t≥16的示例閾值(水平虛線)顯示此磷酸位點作用係作為適合的基團分隔物。換言之，具有活化的EGFR的樣本通常顯示PTN11-T59強度超過16，而野生型EGFR低於此閾值。此外，攜帶多個但僅部分EGFR活化的突變的樣本被分類為「野生型EGFR」，但亦顯示出高於16的高PTN11-T59強度，其表明此方法能夠找到具有活化的EGFR的樣本，此可能超過體細胞突變衍生的激酶活性的純水平。

圖3﹕缺血時間的影響。此圖表示PTN11-T59的樣本log2轉形強度，如圖2所示。數據被分為5分鐘的缺血時間間隔，即，描述組織提取和冷凍之間經過的時間的間隔。藉由此方法，可能追踪PTN11-T59隨著時間的推移是否穩定。具有「野生型EGFR」和「活化的EGFR」樣本之間的差異在整個時間段內保持完好，且沒有一組隨著時間的增加而顯示出顯著的下降趨勢。

圖4a)、4b)、4c)及4d)﹕根據本發明的用於EGFR激酶活性之PTN11-T59生物標記可被視為基於閾值的二元分類，其中高分數與升高的激酶活性相關。因此，若每個樣本按其PTN11-T59磷酸化水平排序，則具有過度活化的EGFR激酶活性的樣本應在最高磷酸化測量值中富集。此種富集越好，則相應的接收者操作特徵(ROC)曲線(receiver operating characteristic curve)的曲線下面積(AUC)就越高。此曲線反映由基因突變定義的EGFR過度活化的樣本與彼等具有高磷酸化訊息的樣本(此處視為真陽性率TPR)的一致性。此處的假陽性率反映觀察到高磷酸化訊息的EGFR野生型樣本的存在。後者可以表明與EGFR基因突變狀態無關的生物EGFR活化過程。

顯示出，藉由提供最高的AUC(曲線下面積)，僅基於PTN11-T59強度的預測優於所有可替代模型，可通過最接近圖左上角的線觀察到，此代表潛在的最佳可實現模型表現。除此之外，此圖進一步顯示使用更全面的磷酸位點組時性能的下降，因為PTN11-T59提供的特異性訊息隨後被其他非特異性訊息稀釋。詳言之，藉由使用所有PTN11蘇胺酸p位點(PTN11-T*)的磷酸化強度總和，AUC從0.9397降至0.8262。當整合PTN11 (PTN11-*)的所有p位點時，該值下降得更多，降至0.7763。另外，圖4顯示與依據本發明的純PTN11-T59模型相比，ERBB3(ERBB3-*)及ERK1和ERK2(ERK1/2-*)的p位點具有低預測能力。

因此，依據本發明之預測EGFR激酶活性升高的方法依賴於p位點特異性測量。因此，一般蛋白質磷酸化並非足夠的資訊來源。

圖5a)、5b)、5c)及5d)﹕ROC曲線的資訊附加層由所謂的精確度-召回率(precision-recall，PR)曲線提供。此圖的構建與ROC曲線類似，但此處比較精確度(陽性預測值，PPV)(基因定義的EGFR過度活化的樣本相對於使用本發明預測為EGFR過度活化的樣本總數的分數(y軸上))與召回率(相當於真陽性率(x軸上的TPR))。

首次揭示了先前技術所述的模型皆未在PR曲線圖中達到極高的AUC(曲線下面積)，最佳為具有AUC為0.6181之PTN11-T59。此表明依據本發明的模型預測先前未知的樣本為EGFR過度活化，其被期待為基於突變信息會展現野生型活性。

圖6﹕可有用於EGFR療法的標記之圖示。首先，從所有NSCLC患者中定義顯露出適合EGFR療法的患者。目前這是在EGFR中使用突變所完成。依據本發明，PTN11上的單個磷酸位點用於定義EGFR的過度活化。在此群組中，可能進一步細化哪些患者可能對治療有反應或沒有反應，此外，哪些對治療有反應的患者可能在某個時點腫瘤復發。Zhang et al., 2021列出從肺細胞株中識別無反應者之標記的嘗試，並使用EGFR突變來定義EGFR的活性。Li et al., 2014定義了對治療反應的陰性選擇標準。兩種方法皆為陰性選擇標準，與EGFR活性本身無關。

無

圖1顯示EGFR突變頻率。圖2顯示PTPN11-T59的log2轉形強度。圖3﹕缺血時間的影響。圖4a)、4b)、4c)及4d)﹕根據本發明的EGFR激酶活性之PTN11-T59生物標記可被視為基於閾值的二元分類，其中高分數與升高的激酶活性相關。圖5a)、5b)、5c)及5d)﹕ROC曲線的資訊附加層由所謂的精確度-召回率(PR)曲線提供。圖6﹕可有用於EGFR療法的標記之圖示。

無。

Claims

一種用於預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應之方法，其包含下列步驟﹕ a) 從患有的受試者的腫瘤收集樣本； b) 確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； c) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能對抑制EGFR激酶活性的藥劑有反應。
如請求項1之方法，其中該受試者具有過度活化的EGFR。
如前述請求項中任一項之方法，其中該過度活化的EGFR係由EGFR中的突變或由與EGFR的蛋白質相互作用引起，使得該突變或該蛋白質相互作用導致受體構形改變並成為參與有助於疾病狀況的活化的傳訊狀態。
如請求項3之方法，其中該突變導致受體構形改變並成為參與有助於疾病狀況的活化的傳訊狀態。
如請求項3或4中任一項之方法，其中該突變係在編碼EGFR的核酸中，且係改變L858、T790、G719、L861、S768的突變；外顯子19的缺失。
如請求項1至3中任一項之方法，其中EGFR的過度活化係由與EGFR的蛋白質相互作用引起，使得受體構形改變並成為參與有助於疾病狀況的活化的傳訊狀態。
如前述請求項中任一項之方法，其中該癌症包括原發性及繼發性轉移性疾病。
如前述請求項中任一項之方法，其中該受試者為人類。
如前述請求項中任一項之方法，其中EGFR抑制劑為BIBX 1382；西妥昔單抗(Cetuximab)(Erbitux)；CI-1033 (卡奈替尼(Canertinib))；EKB-569；EMD 55900；EMD 72000；厄洛替尼(Erlotinib)(OSI-774；Tarceva)；吉非替尼(Gefitinib)(ZD1839；Iressa)；GW-2016；hR3；ICR-62；拉帕替尼(Lapatinib)(GW-572016)；薰草菌素A(Lavendustin A)；薰草菌素B(Lavendustin B)；單株抗體E7.6.3；帕尼單抗(panitumumab)(ABX-EGF)；PD 153035；PD- 168393；PKIl 66；RG-13022；RG-14620；TheraCim hR3；Tyrophostins；Tyrphostin AG 490；Tyrophostin AG 494；Tyrphostin AG 825；Tyrphostin AG 1478；Tyrphostin 1；Tyrphostin 23(RG-50810)；Tyrphostin 25(RG-50875)；Tyrphostin 46；Tyrphostin 47(RG-50864，AG-213)；Tyrphostin 51；ZD-6474；其衍生物、或其組合。
如前述請求項中任一項之方法，其中受試者為罹患NSCLC的人類患者，且EGFR激酶抑制劑為吉非替尼、厄洛替尼、達可替尼(dacomitinib)、阿法替尼(afatinib)、埃萬妥單抗(amivantamb)或其混合物。
一種用於鑑別在受試者中過度活化的EGFR之方法，其包含下列步驟﹕ i) 從患有非小細胞肺癌的受試者的腫瘤收集樣本； ii) 確定SHP2蛋白質中包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平； iii) 將包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平與對照水平進行比較；其中與對照水平相比，包含殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平顯著升高表明受試者可能具有過度活化的EGFR。
一種用於預測罹患非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者對EGFR激酶之抑制劑的反應之套組，其包含可選擇在一或多個容器中的用以確定包含SHP2蛋白質中的殘基T59的至少一個磷酸化位點的磷酸化水平之工具。
一種在SHP2上磷酸化的T59作為標記之用途，該標記可預測具有過度活化的EGFR的受試者對EGFR激酶活性之抑制劑的反應。