DE60003449T2

DE60003449T2 - Testverfahren

Info

Publication number: DE60003449T2
Application number: DE60003449T
Authority: DE
Inventors: Yuan Xu
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-11-04
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2020-11-02
Also published as: BRPI0015283B8; PT1226269E; PL355389A1; ZA200202687B; CZ302023B6; AU1581601A; HK1046158A1; HUP0202973A3; KR100649043B1; EP1226269B1; NO20022122D0; AU781023B2; BRPI0015283B1; PL204011B1; IL149006A0; ES2200973T3; DE60003449D1; BRPI0015283A; JP2003513638A; CN1387579A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf einen Assay zur Bestimmung der Menge an von Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO)-produziertem tPA, welche in Proben von rekombinantem humanen tPA mit nativer Sequenz oder seinen Varianten, welche in CHO-Zellen hergestellt wurden, anwesend ist.
Beschreibung des Standes der Technik
Plasminogen-Aktivatoren vom Gewebetyp (tPA) (Englisch: tissue-type plasminogen activators) sind endogene Serin-Proteasen, die in einer Ereigniskaskade involviert sind, welche zur Auflösung eines Blutgerinsels führt (Astrup und Permin, Nature, 159, 681–682 (1947); Camiolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 138, 277–280 (1971); Collen, J. Biol. Chem., 33 77–86 (1987); Hoylaerts et al., J. Biol. Chem., 257, 2912-2919 (1982)). ACTIVASE^® ist die rekombinante Form von humanem tPA (r-tPA), welche beim Management von akutem Myocardinfarkt und Lungenembolie verwendet wird (Grossbard, Pharm. Res., 4 375–378 (1987)). ACTIVASE ist inzwischen auch zur Behandlung von ischemischem Schlaganfall zugelassen (Smith et al., Acad. Emergency Medicine, 6 (6), 618–25 (1999); Kwiatkowski et al., New Eng. J. Med., 340 (23), 1781–1787 (1999)). Es ist ein Glykoprotein, welches hergestellt wird, indem man die komplementäre DNA (cDNA) für das natürliche humane tPA in Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert. TNK-tPA ist eine genmanipulierte Variante des humanen tPAs, welche in CHO-Zellen kloniert und exprimiert wurde (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91 3670–3674 (1994)). Stellenspezifische Mutationen wurden an drei spezifischen Stellen des humanen tPAs eingeführt, um die TNK-tPA-Variante zu erzeugen. Diese sind Thr103 zu Asn (T103N), Asn 117 zu Gln (N 117Q) und Lys-His-Arg-Arg 296–299 zu Ala-Ala-Ala-Ala (KHRR296-299AAAA). Im Vergleich zu tPA weist TNK-tPA in vitro ähnliche biologische Aktivität auf, eine erhöhte Widerstandsähigkeit gegenüber dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor und eine erhöhte Fibrinspezifizität und es wird langsamer aus dem Plasma entfernt (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 3670–3674 (1994); Thomas et al., Stroke, 25 : 10, 2072–2079 (1994); Benedict et al., Circulation, 92 : 10, 3032–3040 (1995); Modi et al., Thromb Haemost, 79 134-139 (1998)). Gegenwärtig wird auf die behördliche Zulassung einer als Einzelbolus verabreichten Form von r-tPA gewartet. CHO-Zellen stellen endogenes Hamster-tPA biosynthetisch her, welches CHO-PA genannt wird. CHO-PA hat eine ähnliche fibrinolytische Aktivität wie humanes tPA, wie mit dem Gerinsel-Lyse-Assay bestimmt. Die Aminosäuresequenz von CHO-PA ist 80% identisch mit der von humanem tPA. Viele der Substitutionen sind semikonservativ, wie: Arg ← → Lys, Glu ← →Asp, Phe← → Tyr, Val← → Ala, Ile ← → Leu oder Thr ← → Ser. Wenn man ein Modell der Protease-Domäne des humanen tPAs basierend auf der bovinen Chymotrypsin-Struktur verwendet, beobachtet man, dass praktisch alle Substitutionen im CHO-PA auf oder in der Nähe der Proteinoberfläche lokalisiert sind.
r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA sind alles einzelne Polypeptidketten aufgebaut aus 527 Aminosäuren mit 17 Disulfidbindungen (Nguyen und Carole, „Stability Characterization and Formulation Development of Altepase, a Recombinant Tissue Plasminogen Activator" in Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories, Y. J. Wang, R. Pearlman, Herausgeber, (Plenum Press: New York, 1993), Seiten 91–135. Bei allen drei Proteinen ist die Peptidbindung zwischen Arg₂₇₅ und Ile₂₇ ₆ besonders empfindlich gegenüber Protease-Spaltung. Die Spaltung führt zu zwei Fragmenten: das eine bestehend aus den N-terminalen 275 Aminosäuren und das andere bestehend aus den Cterminalen 252 Aminosäuren. Die N-terminale Kette enthält Regionen, die mit der in Plasminogen und Prothrombin gefundenen Kringle-Region homolog sind und wird darum oft als das „Kringle-Fragment" bezeichnet (Nguyen und Carole, supra; de Vos et al., Biochem., 31 270–279 (1992)).
Die C-terminale Kette enthält das katalytisch aktive Zentrum und wird darum gemeinhin als das „Protease-Fragment" bezeichnet (Pennica et al., Nature, 301, 214–221 (1983)). Die gespaltenen zwei Ketten sind über eine einzelne Disulfid-Bindung, ausgebildet zwischen Cys₂₆₄ und Cys₃₉₅, verbunden. Das gespaltene Molekül wird gemeinhin als „zwei-Ketten tPA" bezeichnet im Gegensatz zum „Einzelketten tPA" oder der intakten Form.
r-tPA enthält vier potenzielle Stellen zur N-gebundenen Glykosilierung, gekennzeichnet durch die Sequenz Asn-X-Ser/Thr (Nguyen und Carole, supra). Diese sind Asn₁₁₇, Asn₁₈₄, Asn₂₁₈ und Asn₄₄₈. r-tPA kommt als zwei Glykosilierungs-Isozyme vor, welche als Typ I und Typ II bezeichnet werden. Typ I r-tPA ist an Asn₁₁₇, Asn₁₈₄ und Asn₄₄₈ glykosiliert, wogegen Typ II r-tPA nur an Asn₁₁₇ und Asn₄₄₈ glykosiliert ist. Asn₂₁₈ ist bei keiner der Isoformen glykosiliert. TNK-tPA hat das gleiche Glykosilierungsmuster wie r-tPA, ausser dass die Mutationen Thr103 zu Asn und Asn₁₁₇ zu Gln in ihrer Wirkung Endeffekt die Glykosilierungsstelle von der Position 117 zu 103 verschob (Keyt et al., supra). Das Glykosilierungsmuster für CHO-PA ist nicht vollständig charakterisiert worden (Rijken und Collen, J. Biol. Chem., 256: 7035–7041 (1981).
ACTIVASE^® ist eine Marke für die rekombinante Form des humanen Plasminogen-Aktivators vom Gewebetyp (r-tPA), und wird beim Management von akutem Myocardinfarkt und Lungenembolie verwendet. tPA der Marke ACTIVASE^® ist inzwischen auch zur Behandlung von ichemischem Schlaganfall zugelassen. Es wird hergestellt, indem man die komplementäre DNA (cDNA) für natürliches humanes tPA in Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) exprimiert (U.S. Pat. Nr. 5,753,486). TNK-tPA ist eine genmanipulierte Variante von r-tPA mit erhöhter Wirksamkeit und einer geringeren Inzidenz an Blutungen im Vergleich zu ACTIVASE^® r-tPA. Sie wurde durch drei stellenspezifische Mutationen erzeugt (T103N, N117Q und KHRR296-299AAAA) und wird auch in CHO-Zellen kloniert und exprimiert (U.S. Pat. Nr. 5,612,029). CHO-Zellen stellen biosynthetisch endogenes Hamser-tPA her, welches CHO-PA genannt wird. Die Aminosäuresequenz von CHO-PA ist hochgradig homolog (80% identisch) zu der von r-tPA. Alle drei thrombolytischen Proteine existieren als heterogene Isoformen, hauptsächlich wegen Proteolyse/Hydrolyse und differenzieller Glykosilierung.
In U.S. Pat. Nr. 5,411,864 ist ein Verfahren beschrieben, um humanes tPA von CHO-PA zu reinigen. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Flüssigkeit, welche das humane tPA enthält mit Anitkörpern, welche das entsprechende endogene CHO-PA spezifisch binden, und das Erhalten des humanen tPAs. Vorzugsweise beinhaltet der Schritt des Inkontaktbringens, dass die Flüssigkeit durch ein Chromatographie-Bett strömt, welches die Antikörper daran immobilisiert hat.
Die Entwicklung von Proteinpharmazeutika, welche von rekombinanter DNA stammen, wurde durch die Einführung neuer analytischer Methoden, welche zur Proteincharakterisierung verwendet werden können und/oder um die Konsistenz der Herstellung eines Proteins zu zeigen, erleichtert. Die Peptidkartierung ist ein Schlüsselverfahren, um die Aminosäuresequenz zu überwachen und ist in der Lage, kleine Veränderungen in Proteinen mit kleiner oder mäßiger Größe, wie z. B. Insulin und humanes Wachstumshormon, zu detektieren. Die Analyse eines viel größeren Proteins, z. B. von Fibrinogen (Molekularmasse 350.000) oder von heterogenen Glykoproteinen, wie Antikörpern (Molekularmasse 150.000) wird durch die Komplexität der Vielzahl der Peptide, die durch einen enzymatischen Verdau erzeugt werden, behindert. Eine derartige Komplexität begrenzt den Nutzen einer einzelnen Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Trennung in Verbindung mit on-line-Ultraviolett-Detektion.
Das Aufkommen von kommerziell erhältlichen kombinierten HPLC- und Electrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie-(LC-ES-MS)-Systemen, welche mit üblicher HPLC kompatibel sind, hat die Leistungsstärke von Peptidkartierung beträchtlich erhöht (Ling et al., Anal. Chem., 63: 2909–2915 (1991); Guzetta et al., Anal. Chem., 65: 2953–2962 (1993)). LC-EM-MS in Kombination mit „inder-Quelle-durch-Kollision-induzierter-Dissoziation" (Engt: in-source collisionally-induced dissociation (CID)) wurde wirksam verwendet, um Stellen der Nund O-verknüpften Glykosilierung zu identifizieren (Carr et al., Protein Sci., 2: 183-196 (1993); Huddleston et al., Anal. Chem., 65: 877–884 (1993); Conboy und Henion, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 3: 804–814 (1992)). Allerdings ist selbst diese Technik durch die ungenügende Auflösung, welche aus der großen Anzahl von sehr ähnlichen Peptiden, die durch unterschiedliche Proteinglykosilierung und enzymatische Verdaue von Glykoproteinen mit mäßiger Größe entstehen, begrenzt. Darum ist es nötig, eine Vielzahl von Techniken mit orthogonaler Selektivität einzusetzen, um derartige Proben zu charakterisieren.
Die Verwendung von Kombinationen von Hochleistungskapillarelektrophorese, HPLC, LC-ES-MS, und von Matrix-unterstützter Laserdesorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie wurde daraufhin untersucht, ob sie die Charakterisierung von enzymatischen Verdauen von underivatisierten Glykoproteinproben, wie beispielhaft gezeigt an DSPAα1, einem einzelkettigen Plasminogen-Aktivator stammend aus den Speicheldrüsen der Vampirfledermaus (Apffel et al., J. Chromatography A, 717; 41–60 (1995)) erlauben würden. Man folgerte, dass diese vier Techniken hochgradig komplementäre Techniken zur Untersuchung von Glykoproteinen sind. Trotzdem gaben die Autoren zu, dass noch mehr Arbeit geleistet werden muss, um die Leistungsfähigkeit dieser Vorgehensweise zu verbessern, und dass Konzentrationsschritte mit hoher Ausbeute benötigt sein werden wegen der weitreichenden Heterogenität der Kohlenhydrate.
Es besteht ein Bedarf für eine Technik, um die relativen und absoluten Mengen an CHO-PA, welches anwesend ist, nachdem ein Reinigungsverfahren für tPA durchgeführt wurde, wie z. B. das im U.S. Pat. Nr. 5,411,864, supra, zu verfolgen.
Zusammenfassung der Erfindung
Demgemäß wurde hier ein Umkehrphasen-HPLC-Verfahren zur Analyse der drei thrombolytischen Moleküle CHO-tPA, rekombinantes humanes tPA mit der nativen Sequenz, und TNK-tPA entwickelt. Dieses Verfahren ist nicht nur in der Lage, humanes tPA und/oder TNK-tPA von CHO-PA aufzutrennen, sondern kann auch verschiedene Isoformen eines jeden Moleküls identifizieren und quantifizieren.
Im speziellen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verfolgen der Wirksamkeit eines Reinigungsprozesses zum Entfernen des den chinesischen Hamster Ovarienzellen (CHO) endogenen Plasminogen-Aktivators (PA) aus einer Probe enthaltend humanes tPA oder Varianten davon bereit, wobei das Verfahren umfasst, dass die Probe mit einer Protease inkubiert wird, die in der Lage ist, spezifisch die Arg₂₇ ₅-Ile₂₇ ₆-Bindung von humanem Wildtyp tPA zu spalten und dann mit Denaturierungs- und Reduktionsmitteln in Mengen, die wirksam sind, um die Disulfid-Bindungen von humanem Wildtyp tPA zu reduzieren; dass die Probe einem Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Schritt unterzogen wird und dass das Elutionsprofil des Chromatographie-Schritts in Hinsicht auf die Menge des den chinesischen Hamsterovarienzellen (CHO) endogenen PAs, welche darin enthalten ist, analysiert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse von nativem r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA.
2 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse von DTT/Harnstoffbehandeltem r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA. Plasminogen-Aktivatoren wurden vor der Chromatographie mit DTT/Harnstoff behandelt.
3 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse von Plasmin- und DTT/Harnstoff-behandeltem r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA. Plasminogen-Aktivatoren wurden vor der Chromatographie einer Plasmin-Behandlung unterzogen, gefolgt von einer DTT/Harnstoff-Behandlung.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Die Begriffe „Gewebeplasminogen-Aktiviator" und „tPA" beziehen sich auf den humanen extrinsischen (Gewebetyp) Plasminogen-Aktivator mit fibrinolytischer Aktivität, der typischerweise eine Struktur mit fünf Domänen (Finger, Wachstumsfaktor, Kringle-1, Kringle-2 und Protease-Domänen} hat, aber dennoch weniger Domänen haben darf oder einige seiner Domänen wiederholt haben darf, so lange er immer noch als ein proteolytisches Mittel wirkt und die Nverknüpften Glykosilierungsstellen an den Positionen 117, 184 und 448 beibehält. Als Minimum besteht das tPA aus einer Protease-Domäne, die in der Lage ist, Plasminogen zu Plasmin umzuwandeln, und einer N-terminalen Region, von der man glaubt, dass sie zumindest teilweise für die Fibrinbindung verantwortlich ist, und behält die N-verknüpften Glykosilierungsstellen an Positionen, die den Aminosäurepositionen 117, 184 und 448 des humanen Wildtyp tPAs entsprechen, bei. Das Beibehalten dieser Glykosilierungsstellen erfolgt wegen der Tatsache, dass eine variable Belegung der Stellen von rekombinantem und aus Melanom stammendem Wildtyp tPA zur Herstellung von zwei Varianten führt, die als „Typ I tPA" bzw, als „Typ II tPA" bezeichnet werden. Typ I tPA enthält N-verknüpfte Oligosaccharide an den Positionen 117, 184 und 448. Typ II tPA enthält Nverknüpfte Oligosaccharide an den Positionen 117 und 448. Man wird erkennen, dass natürliche allelische Variationen existieren und bei Individuen vorkommen können, wie dies durch Unterschiede in einer oder mehreren Aminosäuren in den Aminosäuresequenzen von tPA von einzelnen Individuen gezeigt wurde.
Die Begriffe „humaner Wildtyp Gewebeplasminogen-Aktivator", „humanes Wildtyp tPA", „nativer humaner Gewebeplasminogen-Aktivator" und „natives humanes tPA", wobei „humanes tPA" abgekürzt sein kann als „htPA", beziehen sich auf humanes tPA mit der nativen Sequenz, d. h., das durch die im U.S. Pat. Nr. 4,766,075, erteilt am 23. August 1988, berichtete cDNA-Sequenz kodierte. Die Stellennummern oder Positionen der Aminosäuren im tPA-Molekül sind gemäß dem U.S. Pat. Nr. 4,766,075 bezeichnet.
Wie hier verwendet, bedeuten Bezüge auf verschiedene Domänen von tPA die Domänen des oben definierten humanen Wildtyp tPAs und funktionell äquivalente Teile von humanem tPA mit Aminosäure-Änderungen im Vergleich zur nativen humanen tPA-Sequenz, oder von (nativem oder variantem) tPA aus anderen Quellen, wie dem Fledermausgewebe-Plasminogen-Aktivator (bat-PA). Darum bezieht sich, wie hier verwendet, der Begriff „Protease-Domäne" auf die Region, die sich von der Aminosäure-Position 264 bis einschließlich der Aminosäure-Position 527 der reifen Form des humanen Wildtyp tPAs erstreckt und auf funktionell äquivalente Teile von humanem tPA, die im Vergleich zur nativen humanen tPA-Sequenz Aminosäure-Änderungen haben, oder von tPA aus anderen Quellen, wie bat-PA.
Wie hier verwendet beziehen sich „tPA-Varianten" auf Moleküle, die sich vom nativen tPA durch einen oder mehrere Aminosäure-Austausche oder Modifikationen an existierenden Aminosäuren unterscheiden. TNK-tPA ist hier die bevorzugte Variante. Die Modifikation, um die geeignete(n) Aminosäure(n) im nativen Molekül zu ändern oder zu insertieren, um die gewünschten Sequenzvariationen zu bewirken, wird durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Mittel erreicht, wie z. B. Stellen-spezifische Mutagenese oder Ligation der geeigneten Sequenz in die DNA, die das relevante Protein kodiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich „TNK-tPA" auf ein tPA-Molekül, wobei Thr103 des Wildtyp tPAs zu Asn geändert ist (T103N), Asn117 von Wildtyp tPA zu Gln geändert ist (N117Q und Lys-His-Arg-Arg 296-299 von Wildtyp tPA zu Ala-Ala-Ala-Ala geändert ist (KHRR296-299AAAA). Derartiges TNK ist weiterhin in U.S. Pat. Nr. 5,612,029 beschrieben.
Der Begriff „chinesische Hamster-Ovarienzelle" oder „CHO-Zelle" bezieht sich auf Zellen oder Zelllinien, die aus Ovarien des chinesischen Hamsters stammen, wie z. B. beschrieben in EP 117,159 , veröffentlicht am 29. August 1989; U.S. Pat. Nrn. 4,766,075; 4,853,330; 5,185,259; Lubiniecki et al., in Advances in Animal Cell Biology and Technologe for Bioprocesses, Spier et al., Herausgeber (1989), Seiten 442–451), sowie auf CHO-Derivate wie CHO/-DHFR (Urlaub und Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)), CHO-K1 DUX B11 (Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2495–2499 (1983); Urlaub und Chasin, supra), und dp12.CHO-Zellen ( EP 307,247 veröffentlicht am 15. März 1989). Bevorzugte Wirtszellen schließen CHO-K1 DUX B11- und dp12.CHO-Zellen ein.
Die für die Produktion von tPA im großen Maßstab entwickelten CHO-Zellen werden kryogen in einem MCB/Working Cell Bank (WCB)-System, wie von Wiebe et al., in Lame Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, Herausgeber (Marcel Dekker: New York, 1990), Seiten 147–160 beschrieben, aufbewahrt. DHFR+ CHO-K1-Zellen, die mit DNA, welche für humanes tPA kodiert, transfiziert wurden, wurden bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (ATCC) hinterlegt und sind unter der Zugangsnummer CCL 61 erhältlich.
Eine Probe einer weiteren tPA-produzierenden CHO-Zelllinie (CHO-Zelllinie 1-15₁₅) wurde unter der ATCC-Zugangsnummer CRL 9606 hinterlegt. Es wurde berichtet, dass die letztere Zelllinie humane tPA-Spiegel liefert, die 50 pg/Zelle/Tag annähernd erreichen.
Wie hier verwendet bezieht sich „CHO Plasminogen-Aktivator" oder „CHO-PA" auf den Plasminogen-Aktivator, welcher endogen durch die CHO-Zellen hergestellt wird. Dieser endogene PA, der von den CHO-Zellen exprimiert wird, hat eine Sequenz, welche etwas anders als die des humanen Wildtyp tPAs ist (etwa 80% identisch). Der CHO-PA ist kein PA vom Gewebetyp.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Protease" auf ein Enzym, das in der Lage ist, spezifisch die Arg₂₇₅-Ile₂₇ ₆-Bindung von humanem Wildtyp-tPA zu spalten. Beispiele schließen Plasmin (oder Plasminogen, das sich zu Plasmin umwandelt), Gewebe-Kallikrein oder Faktor Xa, sowie eine jede Trypsin-artige Protease, die diese spezifische, limitierte Proteolyse bewirken kann, ein. In Frage kommende Proteasen sind weiters in Ichinosi et al., FEBS Letters, 175: 412–418 (1984) beschrieben. Bevorzugt ist hier Plasmin/Plasminogen.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Denaturierungs-/Reduktionsmittel" oder „Denaturierungsmittel und Reduktionsmittel" auf eine Kombination eines Denaturierungsmittels und Reduktionsmittels, die die Disulfid-Bindungen von humanem Wildtyp tPA reduziert. Vorzugsweise ist das Denaturierungsmittel Guanidin oder Harnstoff und das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol.
Arten der Durchführung, der Erfindung
Nach der rekombinanten Herstellung wird das tPA oder die tPA-Variante aus dem CHO-Kulturmedium gewonnen, entweder als sekretiertes Protein oder aus Lysaten der Wirtszelle, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal exprimiert wurde. Es ist nötig, das tPA oder die Variante davon von den Proteinen der Wirtszelle zu reinigen um Preparationen zu erhalten, die in Bezug auf das Protein im Wesentlichen homogen sind. Als ein erster Schritt wird das Kulturmedium oder das Lysat zentrifugiert oder filtriert, um teilchenförmigen Zelldebris zu entfernen.
Das humane tPA oder die Variante davon wird dann von entsprechenden kontaminierenden endogenen Proteinen wie CHO-PA durch derartige Techniken wie Fraktionierung auf Immunoaffinitäts-Säulen oder Ionenaustauscher-Säulen wie beschrieben, z. B. im U.S. Pat. Nr. 5,411,864; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silica-Gel oder auf einem Kationenaustauscher-Harz wie DEAE; Chromatofokusierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Fällung; oder Gel-Elektrophorese unter Verwendung von z. B. Sephadex G-75 gereinigt. Ein Protease-Inhibitor, der die tPA-Aktivität nicht stört, wie Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF), kann auch nützlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu inhibieren, und Antibiotika können eingeschlossen werden, um das Wachstum von hinzukommenden Kontaminanten zu verhindern. Der Fachmann wird erkennen, dass für das native tPA geeignete Reinigungsverfahren einer Modifikation bedürfen können, um die Änderungen im Charakter von tPA oder seiner Varianten bei der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn eine tPA-Variante hergestellt wird, diese sekretiert und der Überstand über eine mit PBS vorkondizionierte Säule aus Glaskügelchen, an die der Anti-tPA-polyklonale Ziegenantikörper A6 gekoppelt ist, geleitet, die Säule wird mit einem Puffer equilibriert, und die tPA-Variante wird dann eluiert.
Die Erfindung betrifft hier das Verfolgen (einschließlich dem Qualifizieren und Quantifizieren) der Spiegel von nativem CHO-PA in einer Probe, die aus solchen Aufreinigungssystemen entnommen wurde, welche zumindest eine Form von humanem tPA, der in CHO-Zellen hergestellt wurde, enthält. Das Verfahren umfasst das Inkubieren der Probe mit einer Protease, die in der Lage ist, spezifisch die Arg₂₇ ₅-Ile₂₇ ₆-Bindung zu spalten. Dem folgt eine Inkubation der Protease-behandelten Probe mit einer Kombination aus einem Denaturierungsund Reduktionsmittel in geeigneten relativen und absoluten Mengen, um eine Reduktion der Disulfid-Bindungen in humanem Wildtyp tPA zu bewirken. Da die Behandlung mit Denaturierungs- und Reduktionsmitteln den Verlust der Enzymaktivität bewirkt, erfolgt die Inkubation mit der Protease zuerst.
Nach der Inkubation wird die Probe einem Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Schritt unterzogen und das Elutionsprofil des Chromatographie-Schritts wird in Hinsicht auf die Menge des den CHO-Zellen endogenen PA, welche darin enthalten ist, analysiert. Vorzugsweise ist die Protease Plasminogen, welche sich zur aktiven Form, Plasmin, umwandelt, das humane tPA ist tPA mit natürlicher Sequenz, und die tPA-Variante ist TNK-tPA.
Der darauffolgende Inkubationsschritt mit der Protease gefolgt von den Denaturierungs-/Reduktionsmitteln findet typischerweise bei einer Temperatur von etwa 30–40°C, stärker bevorzugt etwa 36–38°C und am meisten bevorzugt etwa 37°C, für eine minimale Dauer von etwa 15 Minuten, stärker bevorzugt etwa 20–40 Minuten lang statt.
Auch wird, vorzugsweise vor der Inkubation, die Probe mit einem Verdauungs-Puffer verdünnt, wobei dieser vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 7–8 hat, stärker bevorzugt ein Phosphatpuffer bei pH 7,4–7,6, wobei er stärker bevorzugt auch Arginin enthält.
Jede geeignete HPLC-Säule, auf welche die Probe geladen wird, kann für den erfindungsgemäßen Verwendungszweck verwendet werden, einschließlich einem präparativen oder analytischen Maßstab. Typischerweise wird die Säule zumindest etwa 15 Minuten lang vor der Injektion der Probe equilibriert. Die Säulengröße, das Säulenmaterial, die Flussrate, die Elutionspuffer, die Art des Gradienten, das Injektionsvolumen und die Teilchengröße in der Säule hängen von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Größe der zu untersuchenden Probe, der Art der Zusammensetzung der mobilen Phase und des Gradienten, und der Formen von tPA, die unterschieden werden.
Das Lösungsmittel für die Beladung kann jedes beliebige Lösungsmittel sein, aber ist vorzugsweise ein auf Acetonitril basierendes Lösungsmittel, wie Wasser, Acetonitril und Trifluor-Essigsäure (TFA). Vorzugsweise ist die Säule eine Zorbax C8-, Vydac-, oder Baker-C-18-Säule, die mit einem Mittel gepackt wurde, welches einen Teilchendurchmesser von etwa 4–40 μm, stärker bevorzugt etwa 5-15 μm und eine Porengröße von etwa 100–4000 Å, stärker bevorzugt etwa 150-350 Å, hat. Das Mittel hat auch vorzugsweise eine C4-, C8- oder C18-Alkylgruppe und ist am meisten bevorzugt ein C8-Silica-Medium. Vorzugsweise wird die Elution mit einem Lösungsmittel durchgeführt, welches Acetonitril umfasst, wie Wasser, Acetonitril und TFA, in einem Gradienten-Format über 60-100 Minuten, vorzugsweise einem linearen Gradienten, wobei die relative Menge an Acetonitril im Lösungsmittel erhöht wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine flache Gradientenrampe mit etwa 0,25% Acetonitril pro Minute verwendet.
Wenn die Reinheitsanalyse hier anzeigt, dass die verwendete Technik erfolgreich CHO-PA entfernt, können weitere Reinigungsschritte durchgeführt werden, sofern nötig, um irgendwelche anderen Kontaminanten zu entfernen. Wenn die Technik CHO-PA nicht erfolgreich bis zu akzeptablen Spiegeln entfernt hat, kann ein anderes Aufreinigungsschema verwendet werden und das hier vorgestellte Verfahren wiederholt werden, um zu bestimmt, wie wirksam dieses Schema ist.
Nach der Endaufreinigung kann das tPA oder die Variante davon gemäß bekannten Methoden formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zubereitungen herzustellen, wobei das tPA-Produkt durch Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert wird. Derartige Formulierungen sind in der Literatur wohl bekannt, sowie Dosierungen und Verwendungen. Zum Beispiel wird das tPA oder seine Varianten geeigneterweise parenteral an Subjekte, die an kardiovaskulären Krankheiten oder Störungen sowie an Schlaganfällen leiden, verabreicht.
Die folgenden Beispiele sollen eine inzwischen bekannte Ausführungsform der Erfindung veranschaulichen, aber man soll die Erfindung nicht als auf diese Beispiele begrenzt betrachten. Alle Zitierungen von offener und von Patentliteratur sind hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen.
BEISPIEL 1
Materialien
ACTIVASE^® (r-tPA) und TNK-tPA wurden von Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) in einer aus CHO-Zellen gereinigten Form erhalten. Siehe z. B. auch U.S. Pat. Nrn. 4,766,075 und 5,753,486 für ACTIVASE^® r-tPA und U.S. Pat. Nr. 5,612,029 für TNK-tPA.
Der monoklonale Antikörper #354 für CHO-PA wurde wie im U.S. Pat. Nr. 5,411,864 beschrieben hergestellt. Kurz dargestellt wurde eine weibliche Balb/c-Maus über einen Zeitraum von 12 Wochen mit Proteinlösungen, die mit dem aus Wirtszellen, welchen das humane tPA fehlte, gereinigten CHO-Plasminogen-Aktivator wesentlich angereichert waren, immunisiert. Es gab fünf Injektionen, die je aus etwa 30 μg bestanden. Die Anfangsinjektion war mit komplettem Freundsches Adjuvans emulgiert und wurde an subkutanen Stellen /an einer subkutanen Stelle verabreicht. Die zweite Injektion, die 1,5 Wochen später gegeben wurde, war mit nicht-komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und die Hälfte wurde subkutan verabreicht und die andere Hälfte intraperitoneal. Die restlichen drei Injektionen wurden zu den Wochen 3, 6 und 12 in Phosphatgepufferter Saline (PBS) gegeben und an einer intraperitonealen Stelle verabreicht.
Zur Woche 13 wurde die Milz der immunisierten Maus entfernt und Milzzellen wurden mit der Maus-Myeloma-Zelllinie NP3X63-Ag8.653 fusioniert unter Verwendung der allgemeinen Verfahren von Fazekas et al., J. Immunol. Methods, 35: 1 (1980) und Lane, J. Immunol. Methods, 81: 223 (1985). Die Fusionszellen wurden auf zehn Mikrotiter-Platten, welche je 96 Vertiefungen enthielten, aufgeteilt. Jede Vertiefung wurde auf die Herstellung von spezifischem Antikörper hin ge-screent unter Verwendung von differenzieller Reaktivität in zwei EILISAs (enzyme linked immunoadsorbant assays). Ein ELISA detektierte spezifisch Antikörper gegen CHO-PA und der zweite detektierte Antikörper die mit rekombinantem humanen tPA kreuzreagierten.
Etwa 5% aller Vertiefungen waren nur mit CHO-PA reaktiv und 3% reagierten mit CHO-PA und humanem tPA.
Hyridoma-Zellen aus Vertiefungen, die CHO-PA-spezifische Antikörper enthielten, wurden expandiert und durch limitierende Verdünnung kloniert (Oi und Herzenberg, „Immunoglobin-Producing Hybrid Cell Lines", S. 351–372, in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell und Shiigi, Hrsg. (W. H. Freeman und Co., 1980)). Große Mengen an spezifischen manoklonalen Antikörpern wurden durch Zellkultur der Hybridoma-Zellen oder durch Injektion von Hybridoma-Zellen in Mäuse, was zu asziten Tumoren führte, hergestellt. MAb 354 war ein resultierender Antikörper, der die CHO-PA-Spiegel in einem einzelnen Säulendurchlauf mehr als 100-fach erniedrigte, wenn er immobilisiert wurde, und er ist stabil gegenüber mehreren verschiedenen Immobilisierungschemien und gegenüber harten Waschbedingungen.
MAb 354 wurde unter Verwendung der unten ausgeführten Schritte aufgereinigt, wobei alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Das Aufkonzentrieren wurde wie folgt durchgeführt: Die Ernteflüssigkeit (harvest fluid (HF)) der MAb-Hybridoma-Suspensionskultur wurde durch einen 0,2 μm-Filter filtriert. Die Kulturflüssigkeit wurde durch Ultrafiltration oder durch Chromatographie auf einem Ionenaustauscherharz aufkonzentriert.
Die Affinitätsaufreinigung wurde wie folgt durchgeführt: Zur konzentrierten MAb-HF-Lösung wurde Thimerosal bis zu etwa 0,02% zugegeben. Die Lösung wurde auf etwa 1,5 M Glycin, 3,0 M NaCl, pH 9,0 durch Zugabe von 3,0 M Glycin, gefolgt von Zugabe von kristallinem NaCl eingestellt. Protein A hat schlechte Ab-Bindungseigenschaften, und so erhöhen die Zugabe von NaCl und von Glycin die hydrophoben Wechselwirkungen, damit die Ab-Bindung erleichtert wird. Die Lösung wurde durch Filtration geklärt. Das geklärte, aufkonzentrierte MAb-HF wurde auf eine Säule von an Agarose immobilisiertem Protein A appliziert. Der gebundene MAb wurde mit dem zur Equilibrierung der Säule verwendeten Puffer gewaschen, welcher die ungefähre Zusammensetzung 1,5 M Glycin, 3,0 M NaCl, 0,02 M EDTA, pH 9,0 hatte. Der MAb wurde mit einem 0,1 M Natriumcitrat, 0,15 M NaCl, pH 3,0-Puffer eluiert. Die Protein-A-Säule wurde durch Waschen mit 3,0 M NaSCN, 0,03 M TRIS, pH 8,5 regeneriert und re-equilibriert. Der eluierte MAb-Peak wurde aufgrund des Absorptionsprofils bei 280 nm gesammelt. Der Citrat-eluierte MAb-Peak wurde sofort neutralisiert, indem er in einem Puffer mit der ungefähren Zusammensetzung 1,5 M TRIS-HCl, pH 9,0 gesammelt wurde. Nach ihrer Verwendung wurde die Protein-A-Säule abgebaut und in versiegelten Behältern bei 2–8°C in etwa 0,02% Thimerosal als Lagerpuffer aufbewahrt.
Dann wurde der Puffer für den 354 MAb durch Diafiltration ausgetauscht. Die Diafiltration schritt fort bis die Leitfähigkeit und der pH ähnlich zu den Werten für einen 0,03 M TRIS, 0,05 M NaCl, pH 8,5-Puffer waren.
Darauffolgend wurde der MAb auf eine Anionenaustauscher-Chromatographie-Säule enthaltend einen DEAE-FAST FLOW^TM Agarose-Träger appliziert und mit 0,03 M TRIS, 0,05 M NaCl, pH 8,5-Puffer gewaschen. Der MAb wurde schritteluiert mit einem Puffer mit der ungefähren Zusammensetzung: 0,03 M TRIS, 0,15 M NaCI, pH 8,5. Der eluierte MAb-Peak wurde basierend auf dem Absorptionsprofil bei 280 nm gesammelt.
Der MAb wurde in desinfizierte, verschließbare Behälter filtriert (0,2 μm) und unterhalb von –40°C gelagert.
Plasminogen wurde von Fluka (Schweiz) erhalten. Acetonitril mit HPLC-Qualität wurde von Burdick & Jackson (Muskgon, MI) erhalten und Trifluor-Essigsäure (TFA) war von Pierce (Rockford, IL). Wasser für die mobile Phase der HPLC und die Probenlösungen wurde mit einem MILLI-Q^TM-System von Millipore (Milford, MA) gereinigt. Alle anderen Chemikalien waren analysenrein von Sigma (St. Louis, MO).
METHODEN
Reinigung von CHO-PA
CHO-PA wurde aus CHO-Zellkultur-Flüssigkeit durch Affinitätschromatographie gefolgt von Immunoabsorption isoliert. Lysin-Hyper-D-Harz von BioSepra (Paris, Frankreich) wurde für die Affinitätschromatographie verwendet, da Lysin an die Kringle-2-Region der Plasminogen-Aktivatoren bindet (Cleary et al., Biochem. 28. 1884–1890 (1989)). Die Immunoabsorption wurde unter Verwendung des CHO-PA-spezifischen monoklonalen Antikörpers #354 (MAb #354) durchgeführt. MAb #354 wurde an CNBr-aktiviertes SEPHAROSE 4B^TM-Gel nach dem Protokoll des Verkäufers gekoppelt (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Etwa 10 mg des MAb #354 wurden pro ml des CNBr-aktivierten SEPHAROSE 4B-Gels gekoppelt. Nach der Kopplung wurde eine MAb #354-SEPHAROSE 4B^TM-Säule gepackt.
CHO-Zellkultur-Flüssigkeit, die sekretiertes CHO-PA enthielt, wurde auf eine Lysin-Affinitätssäule, die mit einem Equilibrierungspuffer enthaltend 50 mM Natriumphosphat und 0,01% POLYSORBATE 80^TM-Detergens bei pH 7,5 enthielt, geladen. Nach dem Laden wurde die Lysin-Affinitäts-Säule dreimal gewaschen: zuerst mit dem Equilibrierungspuffer, gefolgt von einem Puffer enthaltend 40 mM TRIS, 800 mM NaCl und 0,008% POLYSORBATE 80^TM bei pH 8,0 und schließlich mit dem Equilibrierungspuffer. CHO-PA wurde dann von der Lysin-Affinitäts-Säule mit einem Puffer enthaltend 50 mM Natriumphosphat, 200 mM L-Arginin und 0,01% POLYSORBATE 80^TM bei pH 7,5 eluiert. Nach Equilibrierung mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS, 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l NaHP₂O₄ und 0,24 g/l KHP₂O₄ bei pH 7,4) wurde die MAb #354-SEPHAROSE^TM-4B-Säule mit dem Elutionspool der Lysin-Affinitäts-Säule beladen. Nach dem Beladen wurde die Säule mit einem Puffer enthaltend 9,5 mM NaHP₂O₄, 1 M NaCl und 5% Propylenglykol (v/v) bei pH 7,4 gewaschen. Das gebundene CHO-PA wurde von der Säule mit 0,2 M Glycin-HCl bei pH 2,5 eluiert. Die Elution wurde spektrophotometrisch bei 280 nm verfolgt und die CHO-PA-enthaltenden Fraktionen wurden sofort nach dem Sammeln mit 0,14 Volumen an 1,5 M Arginin-Phosphat (pH 8,0) neutralisiert. Die Identität und Reinheit des eluierten CHO-PA wurde durch SDS-PAGE und Aminosäuresequenz-Analyse bestätigt.
DTT-/Harnstoff-Behandlung
Die Plasminogen-Aktivatorfen) enthaltende Lösung wurde 1 : 1 (Vol/Vol) mit einem Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff, 0,5 M TRIS und 3,2 mM EDTA bei pH 8,4) verdünnt. Dithiotreitol (DTT) wurde von einer 1-molaren Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert.
Plasmin-Behandlung
Die Plasminogen-Aktivator(en)-enthaltende Lösung wurde 1 : 3 (Vol/Vol) mit dem Verdauungs-Puffer (125 mM NaHP₂O₄, 200 mM Arginin und 0,01% NaN₃ bei pH 7,5) verdünnt. Ein Hundertstel (Gew/Gew) an Plasminogen wurde zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert.
Umkehrphasen-HPLC-Assay für Plasminogen-Aktivatoren
Der Assay wurde auf einem Hewlett-Packard 1090M^TM-HPLC-System (Hewlett Packard, Avondale, PA) mit einer Zorbax SB-C8-Säule mit 4,6 mm × 250 mm, mit 5 μm Teilchengröße und mit einem Harz mit 300 Å Poren (Mac-Mod, Chadds Ford, PA) durchgeführt. Die Säule wurde vor der Probeninjektion zumindest 15 Minuten lange equilibriert. Die ursprüngliche Zusammensetzung der mobilen Phase war 70/30/0,1 (Vol/Vol/Vol) Wasser/Acetonitril/TFA. Nach einem anfänglich fünf-minütigen Halten wurde ein linearer Gradient auf 50/50/0,1 (VoWoUVoI) Wasser/Acetonitril/TFA innerhalb von 80 Minuten (für 1 und 2) und innerhalb von 60 Minuten (für 3) durchgeführt. Unmittelbar auf den Gradienten folgend wurde die Säule mit 100/0,1 (Vol/Vol) Acetonitril/TFA 10 Minuten lang regeneriert. Die Zusammensetzung wurde dann innerhalb von 5 Minuten auf die anfänglichen Bedingungen zurückgebracht und das System wurde für die nächste Injektion re-equilibriert. Das Injektionsvolumen war 250 ml und die Flussrate war 1 ml/min. Die Chromatographie wurde bei 40°C durchgeführt. Fluoreszenz wurde mit einem programmierbaren Hewlett Packard 1046A^TM-Fluoreszenzdetektor (Ex = 275 nm und Ein = 340 nm) gemessen. Die Chromatogramme wurden aufgezeichnet und mit der CHEMSTATION^TM-Software von Hewlett Packard analysiert.
Ergebnisse und Diskussion
Wegen der hohen Sequenzhomologie haben ACTIVASE^® (r-tPA), TNK-tPA und CHO-PA sehr ähnliche biochemische-biophysikalische Eigenschaften. Analytische und präparative Verfahren, die in der Lage sind, diese drei Plasminogen-Aktivatoren voneinander aufzutrennen oder in der Lage sind, tPA von CHO-PA oder TNK-tPA von CHO-PA aufzutrennen, werden für die Entwicklung eines Gewinnungsverfahrens benötigt und um für klinische Studien und die kommerzielle Herstellung die Reinheit eines jeden Moleküls einzuschätzen. Hier ist ein einfaches Umkehrphasen-HPLC-Verfahren beschrieben, das diese Ziele erreicht.
Mit einem flachen Gradientenanstieg mit 0,25% Acetonitril pro Minute und ohne Protease oder Denaturierungs-/Reduktionsmittel war Umkehrphasen-HPLC nicht in der Lage, die native Form von r-tPA von nativem CHO-PA zu trennen (1). Allerdings war die native Form von TNK-tPA unter diesen Bedingungen sehr gut von sowohl nativem r-tPA als auch CHO-PA aufgelöst. Als nächstes wurde eine DTT/Harnstoff-Behandlung durchgeführt, um die Disulfidbindungen zu reduzieren und die Proteine zu denaturieren. Bei allen drei Proteinen ist die Peptidbindung zwischen Arg₂₇₅ und Ile₂₇ ₆ sehr empfindlich gegenüber Protease-Spaltung. Im Laufe der Zeit führt diese Empfindlichkeit zu einer Heterogenität von r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA in der Lösung. Aufgrund der Protease-Spaltung wird eine kleine Menge der einzelkettigen Form zur Zwei-Ketten-Form umgewandelt. Die DTT/Harnstoff-Behandlung reduziert die Disulfidbindung zwischen Cys₂₆ ₄ und Cys₃₉₅, die die Zwei-Ketten-Form des Moleküls zusammenhält, was in der Dissoziation des Moleküls in zwei Fragmente resultiert (das Kringle-Fragment und das Protease-Fragment).
2 zeigt, dass unter Verwendung des gleichen Gradientenanstiegs die Umkehrphasen-HPLC in der Lage war, die einzelkettigen Formen der drei thrombolytischen Moleküle nach der DTT/Harnstoff-Behandlung voneinander aufzutrennen. Alle drei Proteine wiesen ähnliche Elutionsprofile auf wobei das Kringle-Fragment der Zwei-Ketten-Form zuerst eluierte, die Einzelkettenform als Zweites eluierte und das Protease-Fragment der Zwei-Ketten-Form als Letztes eluierte. Die jeweiligen Protease-Fragmente der drei Plasminogen-Aktivatoren wurden auch gut voneinander getrennt, während die Kringle-Fragmente für die drei Moleküle nicht gut aufgetrennt wurden. Folglich kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Fragmentierung der Einzelkettenform in die Zwei-Ketten-Form der Plasminogen-Aktivatoren zu detektieren und zu quantifizieren.
Die in den Profilen von r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA beobachtete Heterogenität (2) macht die Quantifizierung dieser Moleküle sehr schwierig, besonders, wenn man versucht, jedes einzelne Molekül in einer Mischung aus r-tPA, TNKtPA und CHO-PA zu quantifizieren. Um die mit der Proteolyse assoziierte Heterogenität zu eliminieren, wurde die gesamte Einzelkettenform durch Inkubieren mit Plasminogen zur Zwei-Ketten-Form umgewandelt. Plasminogen ist das Substrat des Plasminogen-Aktivators im natürlichen fibrinolytischen System. r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA haben alle die enzymatische Aktivität zur Spaltung der Arg₅₆₀-Val₅₆₁-Peptidbindung von Plasminogen. Eine derartige Spaltung wandelt Plasminogen in seine aktive Form, Plasmin, um. Plasmin ist eine Serin-Protease mit niedriger Spezifität und ist in der Lage, die Arg₂₇₅-Ile₂₇₆-Peptidbindung in r-tPA, TNK-tPA und CHO-PA zu spalten. Als Ergebnis wandelt die Inkubation mit Plasminogen die Einzelkettenform der drei Plasminogen-Aktivatoren zur Zwei-Ketten-Form um.
Auf die Plasmin-Behandlung folgend wurden die Proben mit DTT/Harnstoff behandelt um Disulfidbindungen zu reduzieren und derartig die Zwei-Ketten-Form des Moleküls in zwei diskrete Fragmente zu dissoziieren. 3 zeigt die Umkehrphasen-HPLC-Profile für die Plasmin- und DTT /Harnstoff-behandelten Plasminogen-Aktivatoren. Die jeweiligen Protease-Fragmente der drei Proteine wurden gut voneinander aufgetrennt, während die Kringle-Fragmente der drei Moleküle nicht aufgelöst wurden. Darum wurde das Protease-Fragment zur Integration und Quantifizierung eines jeden Plasminogen-Aktivators verwendet. Sowohl für r-tPA als auch für TNK-tPA wurden die Kringle-Fragmente der Typ Iund Typ II-Isozyme gut voneinander getrennt. Als Ergebnis ist dieses Verfahren auch für die Quantifizierung des Typ I zu Typ II-Verhältnisses für sowohl r-tPA als auch TNK-tPA nützlich.
Die Verfügbarkeit dieser Umkehrphasen-HPLC-Methode erleichtert die Entwicklung des Herstellungsprozesses deutlich. Sie wurde verwendet, um die Wirkung von verschiedenen Fermentationsbedingungen auf die Produktqualität in Bezug auf die Integrität des Produkts (d. h. Prozent Einzelkette) und das Verhältnis von Typ I- zu Typ II-Isozymen zu beurteilen. Sie wurde auch verwendet, um bei der Entwicklung des Reinigungsverfahrens zu helfen und um Konsistenz zwischen Chargen der Produktion sicherzustellen. All diese Anwendungen dienen als Beispiel für die Schlüsselrolle von analytischen und kommerziellen Verfahren bei der Entwicklung von neuen Pharmazeutika.

Claims

Verfahren zum Verfolgen der Wirksamkeit eines Reinigungsprozesses zum Entfernen des den Chinesischen Hamster Ovarien-Zellen (CHO) endogenen Plasminogen Aktivator (PA) aus einer Probe enthaltend humanes tPA oder Varianten davon, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: die Probe wird mit einer Protease inkubiert, die in der Lage ist, spezifisch die Arg₂₇ ₅-Ile₂₇ ₆-Bindung von humanem Wildtyp-tPA zu spalten und dann mit einem Denaturierungsmittel und einem Reduktionsmittel in Mengen, die wirksam sind, um die Disulfid-Bindungen von humanem Wildtyp-tPA zu reduzieren; die Probe wird einem Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie-Schritt unterzogen und das Elutionsprofil des Chromatographie-Schritts wird in Hinsicht auf die Menge des den Chinesischen Hamster Ovarien-Zellen (CHO) endogenen Plasminogen Aktivators (PA), welche darin enthalten ist, analysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease Plasminogen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das humane tPA tPA mit natürlicher Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die tPA-Variante TNK-tPA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe vor Inkubation mit einem Verdauungs-Puffer verdünnt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Puffer einen pH von etwa 7–8 hat.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Puffer ein Phosphatpuffer ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Puffer ferner Arginin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Denaturierungsmittel Harnstoff oder Guanidin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel Dithiotreitol oder 2-Mercaptoethanol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Chromatographieschritt durch Eluieren mit einem Lösungsmittel, welches Acetonitril umfasst, in einem Gradienten-Format durchgeführt wird.