DE69323589T2 - Einen Basophilen bindender monoclonaler Antikörper, Verfahren zur Abtrennung von Basophilen, Verfahren für die Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen, und Verfahren zur Prüfung der Freisetzung von von Basophilen abgeleiteten chemischen Vermittlern - Google Patents
Einen Basophilen bindender monoclonaler Antikörper, Verfahren zur Abtrennung von Basophilen, Verfahren für die Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen, und Verfahren zur Prüfung der Freisetzung von von Basophilen abgeleiteten chemischen VermittlernInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, welche die Eigenschaften haben, (1) mit Basophilen zu reagieren, (2) ihre Reaktivität mit Basophilen sogar nach Immobilisierung an einen festen Träger zu erhalten, (3) die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung aus Basophilen nicht zu hemmen, und (4) keine unspezifische Histamin-Freisetzung aus Basophilen zu induzieren, und betrifft auch feststoffimmobilisierte monoclonale Antikörper, welche durch Immobilisierung der monoclonalen Antikörper an einen festen Träger hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hybridome, welche die monoclonalen Antikörper herstellen, ein Verfahren zur Abtrennung der Basophilen aus humoralen Flüssigkeiten unter Verwendung der monoclonalen Antikörper, ein Verfahren zur Freisetzung von chemischen Vermittlern aus den Basophilen, welche durch das Verfahren für die Abtrennung von Basophilen abgetrennt wurden, und ein Verfahren zur Prüfung der Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen.
- Der Basophile, eine bestimmte Art von Leukocyt und eine Zielzelle für IgE, speichert verschiedene chemische Vermittler wie Histamin in seinen Granula und erfährt, ähnlich wie Mastzellen, Aufmerksamkeit als Schlüsselelement für allergische Reaktionen.
- Im allgemeinen gibt es zwei Mechanismen der Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen.
- Einer davon ist derart, daß IgEs, welche an Rezeptoren auf der Membranoberfläche der Basophilen gebunden werden, durch das Allergen oder den Anti-IgE-Antikörper vernetzt werden und diese Stimulierung eine Degranulationsreaktion verursacht, was in der Freisetzung des chemischen Vermittlers resultiert. Das entspricht der Freisetzung von chemischen Vermittlern durch eine allergische Reaktion (nachfolgend als IgE-vermittelte spezifische Freisetzung von chemischen Vermittlern bezeichnet). In dem anderen Typ der Freisetzung von chemischem Vermittler, dessen Mechanismus und Bedeutung unbekannt geblieben ist, tritt die Freisetzung von chemischem Vermittler direkt, ohne Vernetzung der IgEs mit der Membranoberfläche der Basophilen auf. Im Gegensatz zu der IgE-vermittelten spezifischen Freisetzung von chemischem Vermittler, kann dieser zweite Typ der Freisetzung von chemischem Vermittler sogar in Abwesenheit von Anti-IgE-Antikörper und Allergen auftreten (nachfolgend als unspezifische Freisetzung von chemischem Vermittler bezeichnet).
- Für die Diagnose und pathologische Analyse allergischer Erkrankungen ist es zweckmäßig, die IgE-vermittelte spezifische Freisetzung von chemischem Vermittler zu prüfen, typischerweise durch den Histamin-Freisetzungstest. Histamin, ein sehr wichtiger chemischer Vermittler, der allergische Reaktionen vom Typ I verursacht, ist dafür bekannt, verschiedene Reaktionen wie die Konstriktion der bronchialen glatten Muskulatur und eine Erhöhung der Gefäßdurchlässigkeit, zu induzieren. Der Histamin-Freisetzungstest ist ein einzigartiges Testverfahren, welches auf einer biologischen Reaktion basiert, in welcher Immunglobulin E (IgE), das über einen Rezeptor an die Oberfläche des Basophilen in menschlichem peripherem Blut gebunden ist, mit verschiedenen Allergenen umgesetzt wird, um Histamin freizusetzen und die Menge an Histamin, die derart freigesetzt wird, bestimmt wird. Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Allergen-Identifizierung wie spezifische IgE- Tests (z. B. RAST) und Hauttests, ist der Histamin-Freisetzungstest für die Suche nach verursachenden Allergenen in Allergiepatienten gut geeignet, da er in einem, den tatsächlichen klinischen Bedingungen näherkommenden Rahmen stattfindet.
- Dieser Histamin-Freisetzungstest, der peripheres Blut verwendet, kann auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden, wobei eine das gesamte Blut und die andere gewaschene Leukocyten verwendet. Obwohl das Gesamtblut-Verfahren im allgemeinen für die Erfassung der allergischen Situation des Patienten verwendet werden kann, besteht hier die Möglichkeit, daß nicht-basophile Serumkomponenten den Histamin-Freisetzungstest beeinflussen können. Aus diesem Grund ist es allgemeine Praxis gewaschene Leukocyten zu verwenden, wenn zur Erforschung der Wirkungsmechanismen von Mitteln usw. oder zur grundlegenden Erforschung der Mechanismen zur Freisetzung von Histamin die Reaktivität der Basophilen näher analysiert wird. Die Abtrennung der gewaschenen Leukocyten erfordert jedoch aufwendige Verfahren, einschließlich der Entfernung der Erythrocyten mit Dextran- Lösung, gefolgt von zwei oder drei Zentrifugations- und Waschzyklen und nachfolgender Einstellung der Leukocytenzahl. Das resultiert in der Erfordernis eines erhöhten Blutvolumens für den Test. Diese Einschränkungen werfen zahlreiche Probleme für die Verwendung der Methode mit gewaschenen Leukocyten als Routine-Testverfahren auf.
- Es ist auch bekannt, daß Substanzen, die nach der Degranulation der Basophilen freigesetzt werden, chemische Vermittler einschließen, die eine potente Gefäßdurchlässigkeits-verstärkende Aktivität/Leukocyten-Wanderungsfähigkeit besitzen, wie Leukotrien und der Thrombocyten-aktivierende Faktor (platelet activating factor; PAF). Diese verschiedenen chemischen Vermittler aus Basophilen sind jetzt zur pathologischen Analyse der Allergie grundlegend untersucht worden. Die meisten dieser chemischen Vermittler werden jedoch nach ihrer Freisetzung in das Blut schnell verstoffwechselt und eine Vorraussetzung für deren erfolgreichen Test ist die schnelle und streng kontrollierte Art und Weise der Proben-Aufarbeitung. Die Analyse der meisten dieser chemischen Vermittler aus Basophilen ist zur Zeit sehr schwierig.
- Wie vorstehend gesagt, beinhaltet die Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen zwei Typen: Die IgE-vermittelte spezifische Freisetzung von chemischen Vermittlern durch allergische Reaktion und die unspezifische Freisetzung von chemischem Vermittler. Bei der Diagnose allergischer Erkrankungen ist es notwendig, die IgE-vermittelte spezifische Freisetzung von chemischen Vermittlern zu prüfen. Wie vorstehend beschrieben sind jedoch eine aufwendige Arbeitsweise und eine große Menge Blut erforderlich, da die Leukocyten abgetrennt werden müssen, um sicherzustellen, daß der Histamin-Freisetzungstest von Serumkomponenten unbeeinflußt ist. Dies ist für eine Routineüberprüfung nicht wünschenswert. Zusätzlich ist es, aufgrund des aufwendigen Hantierens der Proben, auch schwierig andere chemische Vermittler als Histamin zu analysieren.
- Ausgehend von dieser Situation, stellten die hier genannten Erfinder Untersuchungen an, um das vorstehende Problem zu lösen, die Basophilen vom Blut abzutrennen und sie in Freisetzungstests für Histamin usw. zu verwenden.
- Herkömmliche Verfahren zur Abtrennung I Reinigung von Basophilen schließen das Verfahren von P. J. Frederik (J. Immunol. Methods (1992) 149, 207) ein, in welchem zur Reinigung von Basophilen verunreinigende Zellen aus der Probe entfernt werden, deren Dichte an Basophilen zuvor durch Gravitationszentrifugation erhöht worden war, unter Verwendung von magnetischen Teilchen, die mit einem Antikörper gekoppelt sind, der mit nicht-Basophilen-Zellkomponenten reagiert.
- Dieses Verfahren ist jedoch nicht zur Abtrennung des gewünschten Basophilen selbst, sondern zur Entfernung von Verunreinigungen vorgesehen und seine Wirksamkeit ist gering und der Arbeitsvorgang ist aufwendig.
- Andererseits ist eine große Zahl Antikörper bekannt, die mit dem Basophilen selbst reagieren (z. B. P. Valent et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1990) 91, 198 und M. P. Bodger et al., Blood (1987) 69, 1414). Bodger et al. (Br. J. Haematol. (1987) 67, 281-284) offenbaren ein Verfahren zur Reinigung von Basophilen durch FACS unter Verwendung eines IgM monoclonalen Antikörpers.
- Es gab bisher jedoch keinen erfolgreichen Versuch, solch einen Basophilenreaktiven Antikörper an einen festen Träger zu immobilisieren und zur Abtrennung menschlicher Basophiler zu verwenden. Demgemäß gab es bisher keine Versuche, derart abgetrennte menschliche Basophile in einem Freisetzungstest für chemische Vermittler wie Histamin zu verwenden. Obwohl diese Tatsache auf Fehlschläge aufgrund eines Verlustes an Reaktivität des Antikörpers mit Basophilen, als Ergebnis der Immobilisierung des Basophilenreaktiven Antikörpers an einen festen Träger (nachstehendes experimentelles Beispiel 1 (1)), zurückzuführen sein kann, ist es sehr wahrscheinlich, daß die Basophilen, die mit Hilfe eines solchen Basophilenreaktiven Antikörpers abgetrennt wurden, derart geschädigt wurden, daß die IgE- vermittelte, spezifische Histamin-Freisetzung der Basophilen gehemmt wird (P. J. Frederik et al., J. Immunol. Methods (1992) 149, 213 und J. T. Schroeder et al., J. Immunol. Methods (1990) 133, 269-277) und ihre unspezifische Histamin- Freisetzung ausgesprochen induziert wird und deshalb die Basophilen nicht für den Test der Histamin-Freisetzungsreaktion verwendet werden können. (Experimentelles Beispiel 1 (2) unterhalb). Es darf angenommen werden, daß Frederik et al. ihr offensichtliches Umweg-Verfahren, in welchem Basophile unter Verwendung eines Antikörpers, der mit nicht-basophilen Zellkomponenten reagiert gereinigt werden, benutzt haben, um die vorstehenden Nachteile zu vermeiden.
- Vorausgesetzt jedoch, daß Basophile unter Verwendung eines Basophilenreaktiven Antikörpers, der direkt auf die Basophilen selbst abzielt, abgetrennt und gereinigt werden können, wird eine einfache und sehr genaue Reinigung möglich sein.
- Mit dem Vorstehenden im Sinn, stellten die hier genannten Erfinder Ermittlungen zur Suche nach einem Antikörper an, der für diese Zwecke verwendet werden kann. Das heißt, einen monoclonalen Antikörper, der seine Reaktivität mit den Basophilen sogar nach der Immobilisierung an einen festen Träger beibehält und der den Basophilen sogar nach der Kopplung mit dem Basophilen nicht schädigt, das heißt, ein monoclonaler Antikörper, der weder einen signifikanten Einfluß auf die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung von Basophilen noch auf die unspezifische Histamin-Freisetzung von Basophilen hat. Als Ergebnis gelang den Erfindern die Herstellung des gewünschten monoclonalen Antikörpers. Die Erfinder entwickelten ein Verfahren zur leichten Abtrennung der Basophilen, indem sie solch einen Antikörper an einen festen Träger immobilisieren, ihn mit einer humoralen Flüssigkeit umsetzen, die Basophilen in der humoralen Flüssigkeit mit dem monoclonalen Antikörper einfangen und dann die unreagierte humorale Flüssigkeit entfernen und es gelang, die abgetrennten Basophilen zur Freisetzung von Histamin mit einem Allergen oder einem Anti-IgE-Antikörper umzusetzen. Die hier genannten Erfinder entwickelten auch ein Verfahren zur Prüfung der IgE- vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung aus Basophilen, welche unter Verwendung des Antikörpers abgetrennt wurden und vervollständigten damit die vorliegende Erfindung.
- Demgemäß ist ein Gegenstand dieser Erfindung, monoclonale Antikörper bereitzustellen, welche die vorstehenden Nachteile überwinden.
- Ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist, einen feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörper bereitzustellen, der durch Immobilisierung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung an einen festen Träger hergestellt wurde.
- Ein weiterer Gegenstand ist, ein Hybridom bereitzustellen, welches den monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung produziert.
- Noch ein anderer Gegenstand dieser Erfindung ist, ein Verfahren zur Abtrennung Basophiler aus humoralen Flüssigkeiten unter Verwendung des feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörpers, bereitzustellen.
- Noch ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist, ein Verfahren für die Freisetzung eines chemischen Vermittlers aus Basophilen, unter Verwendung der abgetrennten Basophilen, bereitzustellen.
- Ein zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung ist, ein Verfahren zur Prüfung der Freisetzung des chemischen Vermittlers aus einem Basophilen bereitzustellen.
- Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung haben folgende Eigenschaften:
- (1) Sie sind reaktiv mit Basophilen,
- (2) Sie erhalten ihre Reaktivität mit Basophilen sogar nach Immobilisierung an einen festen Träger,
- (3) Sie hemmen die IgE-vermittelte spezifische Freisetzung von Histamin aus den Basophilen nicht, und
- (4) sie induzieren keine unspezifische Freisetzung von Histamin aus den Basophilen.
- Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung machen es möglich, die Basophilen, die für den Test der IgE-vermittelten spezifischen Freisetzung von chemischem Vermittler geeignet sind, abzutrennen, weil sie ihre Reaktivität mit Basophilen sogar nachdem sie an einen festen Träger immobilsiert worden sind erhalten und weil sie die IgE-vermittelte Freisetzung von spezifischem chemischem Vermittler aus Basophilen, welche durch Allergene oder Anti-IgE-Antikörper verursacht wird, nicht hemmen und keine unspezifische Freisetzung chemischer Vermittler aus Basophilen induzieren. Auch vereinfacht das Verfahren zur Abtrennung der Basophilen der vorliegenden Erfindung die Abtrennung von Basophilen aus Blut und unter Verwendung dieses Verfahrens kann der Histamin- Freisetzungstest, welcher andernfalls komplexe Schritte erfordert, vereinfacht werden. Darüber hinaus kann die Gruppe von Zellen, die durch das Verfahren zur Abtrennung von Basophilen der vorliegenden Erfindung erhalten wird, in den Freisetzungstests für die von Basophilen freigesetzten chemischen Vermittlern, wie Leukotriene und PAF, leicht verwendet werden, was andernfalls Sachkenntnis für die Handhabung erfordert.
- Die vorliegende Erfindung wird aufgrund der nachstehend gegebenen detaillierten Beschreibung vollständiger verstanden werden und anhand der begleitenden Zeichnungen, welche ausschließlich zur Veranschaulichung dargestellt und damit nicht einschränkend für die vorliegende Erfindung sind und worin folgendes dargestellt wird:
- Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Gesamtmenge an Histamin in den Basophilen, die mit dem an Kügelchen immobilisierten monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, abgetrennt wurden (weißer Balken), die Menge an IgE- vermittelter spezifischer Freisetzung von Histamin aus den Basophilen (schraffierter Balken), und die Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung aus den Basophilen (schwarzer Balken), zeigt.
- Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die eine Kurve der Anti-menschliches IgE-Antikörper-konzentrationsabhängigen Histamin-Freisetzungsreaktion, unter Verwendung von Gesamtblut oder den Zellen, welche mit den Magnetkügelchen, die BA312 daran immobilisiert haben, zeigt.
- Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche eine Kurve der Eiweiß- Allergen-konzentrationsabhängigen Histamin-Freisetzungsreaktion unter Verwendung der Zellen, die mit den Magnetkügelchen, welche BA312 daran immobilisiert haben, aus dem Blut von pädiatrischen Patienten mit atopischer Dermatitis abgetrennt worden waren, zeigt.
- Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die eine Standardkurve der Histamin- Konzentration, die durch RIA erhalten wurde, zeigt. B/B&sub0; bedeutet prozentualer Spiegel des gebundenen markierten Analyten.
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper, welche folgende Eigenschaften haben:
- (1) Sie reagieren mit Basophilen,
- (2) sie erhalten ihre Reaktivität mit Basophilen sogar nach Immobilisierung an einen festen Träger,
- (3) sie hemmen nicht die IgE-vermittelte Freisetzung von spezifischen Histaminen aus Basophilen, und
- (4) sie induzieren keine unspezifische Histamin-Freisetzung aus Basophilen.
- Hinsichtlich des monoclonalen Antikörper, der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, welcher die vorstehend beschriebenen Eigenschaften (1), (2), (3) und (4) hat, bedeutet "(1) reaktiv sein mit Basophilen", daß der monoclonale Antikörper mit dem Oberflächenantigen des Basophilen reagiert. Auch "(2) erhalten ihre Reaktivität mit Basophilen sogar nach Immobilisierung an einen festen Träger" bedeutet, daß der monoclonale Antikörper seine Basophilen-einfangende Fähigkeit sogar nach Immobilisation an einen festen Träger nicht verliert. Ein beliebiger Träger kann für diesen Zweck verwendet werden, solange es ein gewöhnlicher Träger zur Feststoffimmobilisierung von Antikörpern ist, wie Glas oder Teilchen (Kügelchen), Kugeln (Bälle), Röhrchen, Platten aus synthetischem Harz oder magnetische Teilchen, wie Magnetkügelchen, wobei Magnetteilchen bevorzugt sind.
- Die Basophilen-einfangende Fähigkeit eines feststoffimmobilisierten Antikörpers wird bestimmt, indem man testet, ob er mit Basophilen paaren kann oder nicht. Diese Bestimmung wird gemäß dem nachfolgend beschriebenen Verfahren, unter Verwendung von Histamin als Index, durchgeführt. Als erstes wird ein monoclonaler Antikörper, der mit dem menschlichen Basophilen reagiert, welcher an Magnetkügelchen feststoffimmobilisiert ist, mit menschlichem Blut zur Reaktion gebracht. Als nächstes werden die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt und der Überstand wird entfernt, wonach ein Histamin-Freisetzungspuffer (der HEPES- Puffer, enthaltend Calciumchlorid, Magnesiumchlorid usw.) hinzugefügt und in mehreren Zyklen wird das Einfrieren und Auftauen wiederholt. Der gesamte Histamin-Gehalt im Überstand wird durch ein bekanntes Verfahren, wie ein Histamin- Test-System unter Verwendung von HPLC (Y. Tsuruta et al., J. Chromatography (1981) 224, 10&sup5;) (hergestellt von Shimadzu Corporation), bestimmt und der Antikörper, mit welchem Histamin nachgewiesen wird, wird als ein Antikörper, der Basophilen-einfangende Fähigkeit hat, ausgewählt.
- Ferner bedeutet "(3) die spezifische IgE-vermittelte Histamin-Freisetzung aus Basophilen nicht hemmend", daß der Basophile, der mit dem monoclonalen Antikörper gekoppelt wird seine IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzungsfähigkeit, welche natürlicherweise im Blut beobachtet wird, beibehält.
- Ob der Basophile seine IgE-vermittelte spezifische Histamin- Freisetzungsfähigkeit erhält oder nicht, kann durch ein vergleichendes Experiment mit BA312, einem monoclonalen Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, überprüft werden.
- Da der von BA312 eingefangene Basophile seine Histamin- Freisetzungsfähigkeit, welche natürlicherweise im Blut beobachtet werden kann, erhält (nachstehendes experimentelles Beispiel 2) wird der feststoffimmobilisierte monoclonale Antikörper als "IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung aus Basophilen nichthemmend" und als "innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung liegend" betrachtet, wenn die Menge an aus Basophilen, welche mit dem Gegenstand monoclonalen Antikörper gekoppelt sind, freigesetztem Histamin nicht weniger als 60% dessen, was von den Basophilen, die mit BA312 gekoppelt sind, freigesetzt wurde. Dies wurde durch die Umsetzung des feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörpers mit dem Basophilen, unter den gleichen Bedingungen wie denjenigen für den feststoffimmobilisierten BA312 und durch Behandlung der resultierenden zwei Basophilen, die mit den jeweiligen monoclonalen Antikörpern mit Anit-IgE-Antikörpern unter den gleichen Bedingungen zur Freisetzung von Histamin, bestimmt.
- Außerdem bedeutet "(4) unspezifische Histamin-Freisetzung aus Basophilen nicht induzierend", daß die Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung aus Basophilen, die mit dem monoclonalen Antikörper gekoppelt sind, nicht mehr als 30% der Menge an IgE-vermittelter spezifischer Histamin-Freisetzung beträgt. Die Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung kann bestimmt werden, indem man zu den Basophilen ein geeignetes Lösungsmittel, wie Hydroxyethylpiperazin-N' -2- Ethansulfonsäure (HEPES)-Puffer, enthaltend Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, menschliches Serumalbumin (HSA) usw. (nachfolgend als Histamin- Freisetzungspuffer bezeichnet) zugibt, eine Reaktion zur Freisetzung von Histamin bei 10-50ºC während 10 bis 60 Minuten durchführt und dann die freigesetzte Menge an Histamin, unter Verwendung eines bekannten Verfahrens wie HPLC, mißt.
- Die Menge an IgE-vermittelter spezifischer Histamin-Freisetzung kann bestimmt werden, indem man die Basophilen mit dem hergestellten Anti-IgE- Antikörper, gelöst in dem Histamin-Freisetzungspuffer, bei der gleichen Reaktionstemperatur und während der gleichen Reaktionszeit wie vorstehend umsetzt und die Menge an freigesetztem Histamin mit dem gleichen Verfahren und unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend mißt.
- Ein Verfahren zur Herstellung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung ist nachstehend kurz beschrieben
- Eine Maus wird durch mehrmalige intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Injektion von menschlichen Basophilen in Intervallen von mehreren Wochen mit menschlichen Basophilen immunisiert. Antikörper-produzierende Zellen werden aus der immunisierten Maus gesammelt und zum Erhalt von Hybridomen mit Myelomzellen fusioniert. Die so erhaltenen Hybridome werden auf Reaktivität mit menschlichen Basophilen getestet und ein Hybridom, das einen Antikörper herstellt, der mit den menschlichen Basophilen reagiert, wird als positiv ausgewählt.
- Das so ausgewählte Hybridom wird cloniert. Nachdem der Antikörper, der durch den resultierenden Hybridomclon hergestellt wird, an Magnetkügelchen immobilisiert wurde, wobei diese zuvor mit Schaf-anti-Maus-Immunglobulin- Antikörpern gekoppelt worden waren, werden seine Einfang-Fähigkeit für Basophile aus menschlichem Blut erkennende Fähigkeit und die Eigenschaft betreffend die Histamin-Freisetzung des abgetrennten Basophilen bestimmt.
- Die Basophilen-Einfang-Fähigkeit kann nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
- Zur Bestimmung der Histamin-Freisetzungseigenschaft der abgetrennten Basophilen wird der an Magnetkügelchen immobilisierte Antikörper, wie bei der Bestimmung der Basophilen-Einfang-Fähigkeit beschrieben, mit menschlichem Blut zur Reaktion gebracht. Die Kügelchen werden mit einem Magneten gesammelt und der Überstand wird entfernt, wonach die Mengen an unspezifischer Histamin- Freisetzung und diejenigen der IgE-vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung, nach den vorstehend beschriebenen Verfahren, bestimmt werden und der Antikörper, der die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung nicht gehemmt hat und der keine unspezifische Histamin-Freisetzung induziert hat, d. h. der Antikörper, mit dem die Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung nicht mehr als 30%, vorzugsweise nicht mehr als 10% von der IgE-vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung beträgt, wird ausgewählt. Damit wird ein Hybridomclon ausgewählt, der seine Reaktivität mit Basophilen erhält, das ist die Basophilen- Einfang-Fähigkeit, sogar nach der Immobilisierung an Träger, welche die IgE- vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung aus abgetrennten Basophilen nicht hemmt und welche keine unspezifische Histamin-Freisetzung aus den abgetrennten Basophilen induziert. Dieser Hybridomclon wird gezüchtet und der monoclonale Antikörper wird gewonnen.
- Die vorstehend beschriebene Immunisierung, Zellfusion, Auswahl fusionierter Zellen, Clonierung usw. kann nach bekannten herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
- Das ausgewählte Hybridom wird durch in vitro-Kultur oder in vivo-Kultur zum Erhalt eines monoclonalen Antikörpers vermehrt. In dem in vitro-Kulturverfahren wird das Hybridom in einem RPMI-Medium, das mit fötalem Kälberserum angereichert ist (vollständiges RPMI-Medium) gezüchtet, bis die Proliferationsgrenze erreicht ist, und der Kulturüberstand wird gewonnen, um den monoclonalen Antikörper zu erhalten. In dem in vivo-Kulturverfahren wird das Hybridom in die Bauchhöhle einer Maus transferiert, nachdem diese zuvor durch intraperitoneale Verabreichung von Pristan behandelt worden war. Einige Wochen später wird eine Schwellung des Bauches festgestellt und die Ascitesflüssigkeit wird gesammelt. Von der Ascitesflüssigkeit wird eine IgG- oder IgM-Fraktion durch eine geeignete Kombination bekannter Verfahren, wie Ammoniumsulfat-Fraktionierung und DEAE-Sepharose-Säulenchromatographie, abgetrennt und gereinigt, um den gewünschten monoclonalen Antikörper zu erhalten.
- Die nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen Hybridome, welche die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung, BA101, BA20, BA135 oder BA312 herstellen, wurden am 10. September 1992 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Instustrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken 305, Japan, gemäß den Richtlinien des Budapester Vertrages als "BA101 SHIONOGI," "BA20 SHIONOGI" "BA135 SHIONOGI" und "BA312 SHIONOGI" mit den Hinterlegungsnummern FERM BP-4004, FERM BP- 4005, FERM BP-4006 bzw. FERM BP-4007 hinterlegt.
- Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist somit durch diejenigen, die durch die hinterlegten Hybridome produziert werden, veranschaulicht. Jedoch liegt jeder monoclonale Antikörper, solange er die vorstehend beschriebenen Eigenschaften von (1) bis (4) hat innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, wobei dem monoclonalen Antikörper BA312 der Vorzug gewährt wird.
- Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung reagiert mit Leukocyten, menschliche Basophile einschließend, reagiert jedoch nicht mit menschlichen Erythrocyten. Der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist fähig, den Basophilen sogar nach Immobilsierung an einen festen Träger befriedigend zu erkennen, und induziert weder unspezifische Freisetzung von chemischem Vermittler aus dem erkannten Basophilen, noch hemmt er die IgE- vermittelte spezifische Freisetzung von chemischem Vermittler. Ferner kann der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung vorteilhaft als ein feststoffimmobilisierter monoclonaler Antikörper verwendet werden, der erhalten wird, indem man ihn wie vorstehend beschrieben an einen Träger immobilisiert. Das Verfahren zur Immobilisierung des monoclonalen Antikörpers an einen festen Träger unterliegt keiner Einschränkung und kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie das Verfahren von Lea et al. (T. Lea et al., Scandinavian J. Immunol. (1985) 22, 207). Der monoclonale Antikörper kann z. B. mit einem festen Träger, der nicht beschichtet ist oder mit einem Stoff, der eine funktionelle Gruppe wie eine Tosyl-Gruppe besitzt oder mit einem anti-Maus-Immunglobulin beschichtet ist, bei 0-50ºC, vorzugsweise 4-40ºC in 5 Minuten bis 72 Stunden, vorzugsweise in 30 Minuten bis 48 Stunden, umgesetzt werden.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Abtrennung von Basophilen bereit, worin der feststoffimmobilisierte monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung, der wie vorstehend erhalten wurde, mit einer humoralen Flüssigkeit zur Reaktion gebracht wird und die Basophilen in der humoralen Flüssigkeit durch Kopplung an den feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörper erkannt werden.
- Solche humoralen Flüssigkeiten beinhalten Blut, Nasenschleim, Tränen und Speichel, wobei Blut bevorzugt ist.
- Es gibt verschiedene, weit bekannte Verfahren zur Kopplung eines Antikörpers an magnetische Teilchen und zur Abtrennung des gewünschten Zelltyps, einschließlich des Verfahrens, welches von Gaudernack et al. berichtet wurde (G. Gaudernack et al., J. Immunol. Methods (1986) 90, 179). Ein anderes Verfahren wurde von Frederic et al. berichtet, in welchem verunreinigende Zellen, die keine Basophile sind, aus der Probe, deren Dichte an Basophilen zuvor durch Gravitationszentrifugation erhöht worden ist, unter Verwendung von magnetischen Teilchen, die mit einem Antikörper, der mit Zellkomponenten von nicht-Basophilen reagiert, gekoppelt sind, zur Reinigung der Basophilen entfernt werden (P. J. Frederik et al., J. Immunol. Methods (1992) 149, 207). Dieses Verfahren ist jedoch im wesentlichen unterschiedlich von der vorliegenden Erfindung, dadurch, daß in der vorliegenden Erfindung ein Antikörper gegen den Basophilen verwendet wird, während darin ein Antikörper gegen eine nicht-basophile Zelle verwendet wird.
- Andererseits erlaubt das Abtrennungsverfahren von Basophilen der vorliegenden Erfindung die Abtrennung einer Basophile-reichen Zellgruppe durch ein einfaches Verfahren, in welchem der monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung an einen festen Träger, wie ein magnetisches Teilchen, direkt oder über ein anti-Maus-Immunglobulin immobilisiert wird, um ein Antikörper-gekoppeltes magnetisches Teilchen zu erhalten, welches dann mit einer humoralen Flüssigkeit, vorzugsweise Blut, bei 0-50ºC, vorzugsweise 15-40ºC, für eine kurze Zeitspanne (1-60 Minuten) umgesetzt wird, wonach das magnetische Teilchen mit einem Magneten gesammelt wird um die Basophilen aus der unreagierten Probe zu sammeln.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Überprüfung der Freisetzung von chemischem Vermittler aus Basophilen bereit, worin ein Basophiler, der durch das Basophilen-Abtrennungsverfahren der vorliegenden Erfindung abgetrennt worden war, mit einem Allergen oder einem Anti-IgE-Antikörper zur Reaktion gebracht wird.
- Jedes Allergen, das normalerweise zur Diagnose von Allergie verwendet wird, kann entsprechend der Notwendigkeit benutzt werden, was Inhalate, wie Hausstaub und Pollen, diätische Allergene, wie Fleisch und Eier, und chemische Substanzen beinhaltet.
- Die Reaktion des Basophilen mit einem Allergen oder Anti-IgE-Antikörper wird bei 10-50ºC, vorzugsweise 25-40ºC in 0,5 bis 300 Minuten, vorzugsweise 10-60 Minuten durchgeführt.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Überprüfung der Freisetzung von chemischen Vermittlern aus Basophilen bereit, welches folgende Schritte (a) bis (c) umfaßt:
- Schritt (a): Reaktion des feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung mit einer humoralen Flüssigkeit und Einfangen des Basophilen in der humoralen Flüssigkeit durch Kopplung des Basophilen mit dem feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörper zur Abtrennung des Basophilen;
- Schritt (b): Reaktion des in Schritt (a) abgetrennten Basophilen mit Allergen oder Anti-IgE-Antikörper zur Freisetzung eines chemischen Vermittlers aus den Basophilen; und
- Schritt (c): Bestimmung der Menge an chemischem Vermittler, der aus dem Basophilen aus Schritt (b) freigesetzt wurde.
- Es wird bevorzugt, daß die vorstehend beschriebenen Schritte (a) und (b) in Übereinstimmung mit den vorstehend beschriebenen Basophilen-Trennverfahren bzw. dem Verfahren zur Freisetzung von chemischem Vermittler aus Basophilen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
- Die Bestimmung der Mengen an freigesetztem chemischem Vermittler in Schritt (c) kann nach einem bekannten Verfahren, das danach gewählt wird, wie es für den gewünschten chemischen Vermittler geeignet ist, ausgeführt werden. Im Falle von Histamin z. B. kann die Menge durch ein Histamin-Testsystem unter Verwendung von HPLC bestimmt werden (Y. Tsuruta et al., J. Chromatography (1981) 224, 10&sup5;) (Shimadzu Corporation). Im Falle von Leukotrien und PAF kann die Menge durch das Verfahren von Hayes et al. (E. Hayes et al., J. Immunol (1983) 131, 429) bzw. das Verfahren von Smal et al. (M. A. Smal et al., J. Immunol. Methods (1990) 128, 183) bestimmt werden. Insbesondere kann der Histamintest, der HPLC verwendet, in den folgenden Schritten durchgeführt werden: Eine Probe wird zur Elution von Histamin durch eine Säule geschickt, die mit einem Kationen- Austauschharz bepackt ist; 0,1% Orthophthalaldehyd und NaOH werden zu dem Eluat zugegeben und mit Histamin zur Ausbildung eines Histamin-Phosphor bei 45º umgesetzt; Der Histamin-Phosphor wird zur Stabilisierung und Intensivierung der Fluoreszenz mit H&sub2;SO&sub4; zur Reaktion gebracht; und dann wird die Intensität der Fluoreszenz bestimmt. Die Menge an chemischem Vermittler kann durch RIA bestimmt werden. Im Fall des Leukotrien-Tests, der RIA verwendet, kann er wie folgt durchgeführt werden: Anti-Leukotrien-Antikörper und ³H-markiertes Leukotrien werden zu einer Probe oder einem nichtmarkierten Leukotrien als Standard zugegeben und bei 4ºC 5-24 Stunden umgesetzt; das erhaltene Gemisch wird mit Dextran-beschichteter Holzkohle 10 Minuten unter Eiskühlung zur Reaktion gebracht; und dann wird das resultierende Gemisch zentrifugiert und die Radioaktivität des Überstandes wird bestimmt. Im Falle des PAF-Tests, der RIA verwendet, kann dies wie folgt durchgeführt werden: Anti-PAF-Antikörper, ¹²&sup5;I- markiertes PAF und der zweite Antikörper werden zu einer Probe oder einem nichtmarkierten PAF als Standard zugegeben und 5-24 Stunden umgesetzt; das erhaltene Gemisch wird zentrifugiert und die Radioaktivität des Bodensatzes wird bestimmt. Im Falle des Histamintests durch RIA wird eine Probe oder ein nichtmarkiertes Histamin als Standard mit Anti-Histaminantikörper und ¹²&sup5;I-markiertem Histamin bei 0-40ºC, vorzugsweise bei 0-10ºC 5-48 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 24 Stunden, zur Reaktion gebracht. Dann wird ein B/F abtrennender Wirkstoff wie Polyethylenglykol zugegeben und 10 Minuten unter Eiskühlung umgesetzt. Nach Zentrifugation wird die Radioaktivität des Bodensatzes bestimmt. Die Menge an Histamin kann auch durch EIA bestimmt werden. Obwohl jedes bekannte EIA-Verfahren, wie das "Sandwich"-Verfahren, das kompetitive Verfahren und ELISA verwendet werden können, wird das Verfahren, welches z. B. von Knox Van Byke et al. berichtet wurde (Luminescence Immunoassay and Molecular Application, CRC Press (1990) 2-10), bevorzugt. Insbesondere wird ein Gemisch einer Probe, Biotinmarkiertem-Standard-Histamin und Enzym-markiertem anti- Histamin-Antikörper mit einem Avidin-immobilisierten Träger zur Reaktion gebracht. Nach Waschen wird die enzymatische Aktivität des Komplexes zwischen Biotinmarkiertem Histamin und Enzym-markiertem anti-Histamin-Antikörper, der an den Avidin-immobilisierten Träger gebunden ist, bestimmt. Jeder Träger und jedes Enzym, die gewöhnlich für EIA verwendet werden, können benutzt werden, es wird jedoch bevorzugt, eine Mikrotiterplatte und eine Meerettichperoxidase als Enzym zu verwenden.
- In dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt gleichzeitig die Gesamtmenge an chemischem Vermittler (in Übereinstimmung mit dem Verfahren zur Bestimmung der Gesamtmenge an Histamin) und die Menge an unspezifischer Freisetzung von chemischem Vermittler (in Übereinstimmung mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren), zu bestimmen und das Verhältnis der IgE- vermittelten spezifischen Freisetzung von chemischem Vermittler zu berechnen, indem man die folgende Gleichung verwendet, um den Einfluß der unspezifischen Freisetzung von chemischem Vermittler aus den abgetrennten Basophilen aufzuheben: Das Verhältnis der spezifischen Freisetzung von chemischem Vermittler (%) =
- Die vorliegende Erfindung ist nachstehend mit Hilfe der folgenden Arbeitsbeispiele genauer beschrieben, jedoch ist die vorliegende Erfindung durch sie nicht eingeschränkt.
- Zwei weiblichen BALB/c-Mäusen im Alter von 8 Wochen werden intraperitoneal 1 · 10&sup6; menschliche Basophile pro Maus verabreicht, gefolgt von der intraperitonealen Verabreichung von 1 · 10&sup6; menschlichen Basophilen, 3 · in Intervallen von 3 Wochen.
- Drei Tage nach der abschließenden Immunisierung wurde von jeder Maus die Milz herausgeschnitten und eine Zellsuspension in RPMI-Medium daraus hergestellt. Diese Milzzellen (2 · 10&sup6;) und NS-1 Myelomzellen (6 · 10&sup7;) werden gemischt und zentrifugiert. Dem Bodensatz wurde unter sanftem Rühren 1 ml 50% Polyethylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht von 4.000) zugegeben, gefolgt von 1 Minute weiterem Rühren. Diesem Gemisch wurde über eine Zeitspanne von 1 Minute 1 ml RPMI-Medium zugegeben, gefolgt von einer Zugabe von 1 ml und dann Zugabe von 7 ml über eine Zeitspanne von 3 Minuten. Nach Absetzung durch Zentrifugieren wurde der Bodensatz in 40 ml eines 15% fötales Kälberserum enthaltenden RPMI-Mediums (vollständiges RPMI-Medium) suspendiert und diese Suspension wurde zu jeweils 0,1 ml pro Vertiefung in 4 Platten mit 96 Mikrovertiefungen überimpft, gefolgt von einer Züchtung bei 37ºC in Anwesenheit von 7% Kohlendioxid. 24 Stunden später wurden 0,1 ml eines vollständigen RPMI-Mediums, enthaltend 100 uM Hypoxanthin, 0,4 uM Aminopterin und 16 uM Thymidin (HAT-Medium) zugegeben. An den Tagen 2, 3, 5 und 8 der Züchtung wurden 0,1 ml des Kulturüberstandes verworfen und 0,1 ml HAT-Medium wurden zugegeben. An den Tagen 11 und 14 wurden 0,1 ml des Kulturüberstandes verworfen und 0,1 ml eines vollständigen RPMI-Mediums, enthaltend 100 uM Hypoxanthin und 16 uM Thymidin (HT-Medium) wurden zugegeben. In allen 384 Vertiefungen erschienen Hybridomkolonien.
- Die Hybridoma wurden in jeder Kulturplatte in einem vollständigen RPMI- Medium gezüchtet und der Kulturüberstand wurde wie folgt auf spezifische Anitkörperproduktion getestet:
- Zu 20 ml menschlichem peripherem Blut wurden 5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 5% Dextran, zugegeben, um die Erythrocyten auszufällen, wonach die Leukocyten aus dem Überstand abgetrennt wurden. Von diesen Leukocyten wurden Zellen, die eine spezifische Dichte im Bereich von 1,07 bis 1,08 haben durch das diskontinuierliche Gravitations-Zentrifugationsverfahren, unter Verwendung von zwei Percoll®-Lösungen, die bei spezifischen Dichten von 1,07 und 1,08 hergestellt wurden, abgetrennt. Die abgetrennten Zellen wurden mit dem Alcian Blue-Verfahren gefärbt (S. G. Harriet et al., Blood (1975) 46, 279) und Basophile wurden gezählt. Eine Zellsuspension von 4 · 10&sup5; Basophilen/ml in einem 10 mM Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES)-Puffer (pH 7,4) enthaltend 0,8% Natriumchlorid, 0,037% Kaliumchlorid und 0,03% menschliches Serumalbumin (HSA) (HA-HEPES-Puffer), wurde hergestellt. Die Suspension wurde zu 2 · 10&sup4; Basophilen pro Teströhrchen auf Teströhrchen verteilt. Zu jedem Teströhrchen wurden 50 ul des Hybridomkultur-Überstandes zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei 37ºC für eine Stunde. Nach der Reaktion wurde das Gemisch einmal mit HA-HEPES-Puffer gewaschen, ein 50 ul-Gemisch eines Ziege-anti- Mensch-IgE-Antikörpers, markiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und eines Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers, markiert mit Phycoerythrin, zugegeben, gefolgt von einer Reaktion bei Raumtemperatur für eine Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde, nachdem es einmal mit HA-HEPES-Puffer gewaschen worden war, unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um zu bestimmen, ob die FITC-markierten Zellen auch mit Phycoerythrin markiert worden waren. Derart wurden 100 Vertiefungen ausgewählt, in welchen der monoclonale Antikörper, der in dem Hybridomkultur-Überstand enthalten war, mit den FITC-markierten Basophilen reagierte.
- Nachdem die derart-ausgewählten Hybridoma durch das Grenzverdünnungsverfahren cloniert worden waren, wurde jeder Clon in einer Flasche gezüchtet, bis die Proliferationsgrenze erreicht war. Ein 1 ml-Anteil dieses Kulturüberstandes wurde zu 15 mg magnetischen Kügelchen zugegeben, welche zuvor mit Schaf-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper gekoppelt worden waren, gefolgt von einer Reaktion bei 4ºC für 16 Stunden unter sanftem Rühren, um magnetische Kügelchen zu erhalten, welche einen monoclonalen Antikörper daran immobilisiert haben. Unter Verwendung dieser magnetischen Kügelchen wurden die Fähigkeit, Basophile aus menschlichem peripherem Blut einzufangen und Eigenschaften, die die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung und nichtspezifische Histamin-Freisetzung aus den abgetrennten Basophilen betreffen, in Übereinstimmung mit den, in nachstehendem Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, untersucht. Als ein Ergebnis wurden die Hybridoma BA101 Shionogi (FERM BP- 4004), BA20 Shionogi (FERM BP-4005), BA135 Shionogi (FERM BP-4006) und BA312 Shionogi (FERM BP-4007) ausgewählt, die jeweils die monoclonalen Antikörper BA101, BA20, BA135 und BA312 herstellen, welche die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzen und welche für die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Abtrennung einer Gruppe von Zellen, einschließlich der menschlichen Basophilen und zum Überprüfen der Histamin-Freisetzung aus den abgetrennten Zellen, geeignet sind, wie in nachfolgendem experimentellem Beispiel gezeigt. Die vorstehenden 4 Arten von monoclonalen Antikörpern wurden hinsichtlich der Maus-Immunglobulin-Klasse identifiziert. Es wurde gezeigt, daß BA20, BA101 und BA135 zu der Klasse IgG1 gehören während BA312 zur Klasse IgM gehört.
- Das Hybridom wurde in einem vollständigen RPMI-Medium kultiviert, bis die Proliferationsgrenze (1 · 10&sup6; Zellen/ml) erreicht war und der Kulturüberstand wurde gewonnen.
- Einer BALB/c-Maus, die zuvor durch intraperitoneale Verabreichung von 0,5 ml Pristan behandelt wurde, wurden 5 · 10&sup6; Hybridome intraperitoneal transplantiert. Etwa 3 Wochen später wurde ein Anschwellen der Bauchhöhle festgestellt und der Ascites wurde aus der Bauchhöhle gesammelt.
- Der Ascites des Bauchraumes, der in dem vorstehenden Verfahren erhalten wurde, wurde mit einer 18%-Natriumsulfatlösung ausgesalzen und der resultierende Rückstand wurde in 0,01 M Borat-gepufferter Kochsalzlösung (ph 8,0) gelöst, gefolgt von einer Dialyse gegen die gleiche Lösung. Eine Portion von 20 mg des monoclonalen Antikörpers, der durch dieses Aussalzen erhalten wurde, wurde in 2 ml einer 0,01 M Borat-gepufferten Kochsalzlösung (pH 8,0) gelöst und an eine Protein A-Sepharose (hergestellt von Pharmacia AB)-Säule (1,6 · 5 cm) adsorbiert. Nachdem Verunreinigungen mit ungefähr 50 ml einer 0,01 M Borat-gepufferten Kochsalzlösung (pH 8,0) ausgewaschen worden waren, wurde die Säule mit etwa 100 ml einer 0,01 M Citrat-gepufferten Kochsalzlösung (pH 4,0) eluiert und die gereinigten monoclonalen Antikörper BA20, BA101 und BA135 wurden erhalten.
- Eine Portion von 20 mg von jedem monoclonalen Antikörper, der durch das vorstehende Aussalzverfahren erhalten worden war, wurde in 2 ml einer 0,01 M Borat-gepufferten Kochsalzlösung gelöst und über eine Säule (1,6 · 70 cm) aus Sepharose CL-4B (hergestellt von Pharmacia AB) fraktioniert. Die Fraktion des Haupt-Peaks wurde gesammelt und ein gereinigter, monoclonaler Antikörper BA312 wurde erhalten.
- Eine 30 mg Kügelchen/ml-Suspension von Dynabeads M-450 Schaf-anti- Maus-Immunglobulin (hergestellt von Dynal) wurde gerührt und dann in ein 1 ml- Test-Röhrchen gegeben. Nachdem die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt worden waren und der Überstand entfernt worden war, wurde 1 ml Hybridomzellkultur-Überstand zugegeben und es folgte unter sanftem Rühren für 16 Stunden eine Reaktion bei 4ºC. Nachdem die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt worden waren und der Überstand entfernt worden war, wurden die Kügelchen viermal mit HA-HEPES-Puffer bei 4ºC 30 Minuten unter sanftem Rühren gewaschen, um Magnetkügelchen zu erhalten, welche einen monoclonalen Antikörper daran gebunden haben.
- Andere Magnetkügelchen, die einen monoclonalen Antikörper daran gebunden haben, wurden auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend hergestellt, mit Ausnahme daß der Hybridomkultur-Überstand durch 1 ml eines gereinigten monoclonalen Antikörpers (20 ug/ml), hergestellt mit HA-HEPES-Puffer, ersetzt wurde.
- Eine 30 mg Kügelchen/ml-Suspension von Dynabeads M-450 Schaf-anti-Maus- Immunglobulin (hergestellt von Dynal) wurde gerührt und dann in ein 1 ml-Test- Röhrchen gegeben. Nachdem die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt und der Überstand entfernt worden war, wurde eine 1 ml-Lösung von BA312 (0,3 mg/ml) in 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,5) zugegeben, gefolgt von heftigem Rühren. Unter sanftem Rühren wurde für 16 Stunden bei 4ºC eine Reaktion durchgeführt. Nachdem die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt worden waren und der Überstand entfernt worden war, wurden die Kügelchen viermal mit 0,01 M HEPES- Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,5% HSA gewaschen, jedes Mal für 5 Minuten und dann mit HA-HEPES-Puffer 16 Stunden bei 4ºC gewaschen, um Magnetkügelchen zu erhalten, welche BA312 daran immobilisiert haben.
- Zu 10 ml normalem menschlichem Blut, welches in einem EDTA-Blutprobenröhrchen gesammelt worden war, wurden 40 ml eines HA-HEPES-Puffer zugegeben, um eine 20%ige Blutlösung herzustellen. Eine Suspension von Magnetkügelchen, die den monoclonalen Antikörper des Kulturüberstandes der Hybridome BA20 SHIONOGI, BA101 SHIONOGI, BA135 SHIONOGI oder BA312 SHIONOGI daran immobilisiert haben, wurde zu 3 mg Kügelchen/ml mit HA- HEPES-Puffer hergestellt. Die 20%ige Blutlösung wurde zu 500 ul pro Teströhrchen auf Teströhrchen verteilt. Zu jedem Teströhrchen wurden 50 ul der vorstehend beschriebenen Suspension von Magnetkügelchen, die BA20, BA101, BA135 oder BA312 daran immobilisiert haben, zugegeben, gefolgt von einer Reaktion für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln. Nachdem die Kügelchen mit einem Magneten gesammelt worden waren und der Überstand entfernt worden war, wurden die Kügelchen einmal mit 500 ul HA-HEPES-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wurden 500 ul eines 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,0), enthaltend 0,5 mM Calciumchlorid, 0,25 mM Magnesiumchlorid, 0,1% Glucose, 0,9% Natriumchlorid, 0,035% Natriumbicarbonat und 0,1% HSA (Histamin-Freisetzungspuffer) oder 500 ul einer 4 ug/ml Suspension von monoclonalem anti-Mensch-IgE-Antikörper (HE- 69B) in Histamin-Freisetzungspuffer zugegeben, gefolgt von Rühren, um eine Probe zu ergeben. Der Gesamt-Histamingehalt in den abgetrennten Zellen der Probe wurde, unter Verwendung der Probe nach 3 Zyklen Einfrieren und Auftauen in Histamin-Freisetzungspuffer, bestimmt. Die IgE-vermittelte spezifische Histamin- Freisetzungsreaktion wurde durchgeführt, indem die Probe für eine Stunde bei 37º C mit monoclonalem anti-Mensch-IgE-Antikörper umgesetzt wird. Die unspezifische Histamin-Freisetzungsreaktion wurde durchgeführt, indem man die Probe für eine Stunde bei 37ºC in Histamin-Freisetzungspuffer inkubierte. Nach Ende der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gerührt und dann bei 1.500 rpm 5 Minuten zentrifugiert und es wurden 300 ul Überstand erhalten. Die Menge an freigesetztem Histamin wurde in einem Histamin-Testsystem mit HPLC bestimmt (Y. Tsuruta et al., J. Chromatography (1981) 224, 105 (hergestellt von Shimadzu Corporation)). Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde für alle Antikörper Histamin nachgewiesen, wenn die Bestimmung des Gesamt-Histamingehaltes in den Zellen durchgeführt wurde, welche mit Magnetkügelchen, die BA20, BA101, BA135 oder BA312 daran immobilisiert haben, abgetrennt worden waren, was Basophilen-abtrennende Fähigkeit demonstriert. Auch zeigten die abgetrennten Zellen, wie in Fig. 1 gezeigt, ein gutes Verhältnis von IgE-vermittelter spezifischer Histamin-Freisetzung und die unspezifische Histamin-Freisetzung war auf unterhalb 30% der spezifischen Histamin-Freisetzung unterdrückt. Tabelle 1
- Basophilen-abtrennende Fähigkeit: ++ anwesend, - abwesend
- Unter Verwendung von CD-Antikörpern, die mit Antigenen, die auf der Oberfläche von Basophilen gute Expression zeigen, z. B. CD9-Antikörper (TP82TM, hergestellt von Nichirei) CD11 b-Antikörper (BEAR1TM hergestellt vom Immunotec), CD13- Antikörper (MCS2TM, hergestellt von Nichirei) und CD32-Antikörper (2E1TM, hergestellt von Immunotec), reagieren, wie von Valent et al. berichtet (P. Valent et al., Int. Archives Allergiy Applied Immunol. (1990) 91, 198), wurden nach dem Verfahren, das in vorstehendem Beispiel 2 beschrieben worden ist, Magnetkügelchen hergestellt, wovon jedes einen Antikörper daran immobilisiert hat. Unter Verwendung von Magnetkügelchen, die einen der vorstehenden CD- Antikörper, BA20 oder BA312, daran immobilisiert haben wurde eine spezielle Gruppe von Zellen aus der Blutprobe A und B abgetrennt und die Gesamtmenge an Histamin, die von den abgetrennten Zellen erhalten wurde, wurde auf die gleiche Art und Weise wie im experimentellen Beispiel 3 bestimmt.
- Wie in Tabelle 2 gezeigt, hatten der CD9-Antikörper, der CD11 B-Antikörper, BA20 und BA312 gute Basophilen-einfangende Fähigkeit, während der CD13- Antikörper und der CD32-Antikörper diese nicht zeigte. Tabelle 2
- Basophilen-einfangende Fähigkeit: ++ anwesend, - abwesend
- Von den CD-Antikörpern, die in vorstehendem experimentellen Beispiel 1 (1) überprüft wurden, wurden all diejenigen, die Basophilen-einfangende Fähigkeit zeigten, nämlich CD9-Antikörper und CD11b-Antikörper und BA21 und BA312, an Magnetkügelchen immobilsiert. Diese magnetischen Kügelchen wurden in der gleichen Art und Weise wie in vorstehendem Beispiel 4, unter Verwendung von 20 normalen menschlichen Blutproben auf drei Parameter der Histamin-Freisetzungsfähigkeit der abgetrennten Zellen bewertet, das sind die Gesamtmenge an Histamin, die Menge an IgE-vermittelter spezifischer Histamin-Freisetzung und die Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung.
- Als Ergebnis erwies sich, daß alle Antikörper die Basophilen-einfangende Fähigkeit haben, und obwohl es von Probe zu Probe Unterschiede gab, wurde für alle Antikörper die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung gezeigt.
- In der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß ein Antikörper, der an Magnetkügelchen immobilisiert ist, für Freisetzungs-Tests von chemischem Vermittler zweckmäßig ist, vorausgesetzt daß die relative Menge an unspezifischer Histamin-Freisetzung nicht höher als 30%, insbesondere nicht höher als 10%, der Menge an IgE-vermittelter spezifischer Histamin-Freisetzung aus Basophilen ist, welche durch den Antikörper eingefangen und abgetrennt werden. Im Falle des CD9- Antikörpers und CD11b-Antikörpers zeigen die durch diese Antikörper erkannten und abgetrennten Zellen oft eine bemerkenswert höhere unspezifische Histamin- Freisetzung im Vergleich zu der IgE-vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung; wie in Tabelle 3 gezeigt, überschreitet deshalb das vorstehende Verhältnis die 30% bei weitem und es war sehr schwierig, anhand dieser abgetrennten Zellen die IgE- vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung zu analysieren. Andererseits ergab ein monoclonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung, BA312, ein exzellentes Verhältnis von 7,5%. Tabelle 3
- Unspez./Spez: Verhältnis der Menge an Histamin, das durch die unspezifische Reaktion freigesetzt wird, zu der Menge an Histamin, das durch die IgE-vermittelte spezifische Reaktion freigesetzt wird.
- SD: Standardabweichung
- Diese Ergebnisse zeigen, daß die Zellen die mit Magnetkügelchen, welche BA20 oder BA312 daran immobilisiert haben, abgetrennt wurden, eine höhere Basophilen-Einfangrate, gute IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung und stark unterdrückte unspezifische Histamin-Freisetzung zeigten. Insbesondere die Magnetkügelchen, die BA312 daran immobilisiert haben, waren am meisten für die Abtrennung von Basophilen aus menschlichem Blut geeignet und die derart abgetrennten Zellen waren, entsprechend der vorliegenden Erfindung, am besten zum Testen der Histamin-Freisetzung aus den abgetrennten Zellen geeignet.
- Unter Verwendung einer Blutprobe eines normalen Freiwilligen wurden Gesamtblut und abgetrennte Zellen hinsichtlich der Histamin-Freisetzung verglichen.
- In dem Gesamtblut-Verfahren wurde eine 10 ml-Blutprobe in ein heparinisiertes Blutproben-Röhrchen gegeben. Dieses Blut wurde auf Test-Röhrchen zu 100 ul pro Teströhrchen aufgeteilt und 400 ul Histamin-Freisetzungspuffer oder eine 50.000, 5.000, 500, 50 oder 5 ng/ml Suspension aus monoclonalem anti- Mensch-IgE-Antikörper (HE-69B) in Histamin-Freisetzungspuffer wurde zu jedem Röhrchen zugegeben und nachfolgend gerührt, um eine Probe zu ergeben (die Endkonzentrationen der monoclonalen anti-Mensch-IgE-Antikörper waren 40.000, 4.000, 400, 40 bzw. 4 ng/ml). Die Gesamtmenge an Histamin wurde unter Verwendung der Probe nach 3 Zyklen Auftauen und Einfrieren in Histamin-Puffer bestimmt. Die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzungsreaktion wurde durchgeführt, indem eine Probe für eine Stunde bei 37ºC mit monoclonalem anti- Mensch-IgE-Antikörper umgesetzt wurde. Die unspezifische Histamin- Freisetzungsreaktion wurde durchgeführt, indem eine Probe für eine Stunde bei 37º C in Histamin-Freisetzungspuffer inkubiert wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch gerührt und dann für 5 Minuten bei 1.500 rpm zentrifugiert, und 300 ul des Überstandes wurden erhalten und in einem Histamin- Testsystem mit HPLC (hergestellt von Shimadzu Corporation) auf die freigesetzte Menge an Histamin getestet.
- In dem Verfahren mit abgetrennten Zellen wurden die Zellabtrennung und das Testen der Histamin-Freisetzung aus den abgetrennten Zellen in der gleichen Art und Weise wie in vorstehendem Beispiel 4 durchgeführt. Die Histamin-Freisetzungsrate wurde bestimmt, indem 40.000, 4.000, 400, 40 und 4 ng/ml Suspensionen von monoclonalem anti-Mensch-IgE-Antikörper (HE-69B) in Histamin-Freisetzungspuffer verwendet wurden. Die spezifische Histamin-Freisetzungsrate kann unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden: Verhältnis der spezifischen Histamin-Freisetzung (%)
- Wie in Fig. 2 gezeigt, ergaben das Gesamtblut-Verfahren und das Verfahren mit den abgetrennten Zellen vergleichbare Ergebnisse für die spezifische Histamin- Freisetzungsrate. Das zeigt, daß die Zellen, die unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung abgetrennt werden, ihre Histamin-Freisetzungsfähigkeit, die natürlicherweise im Blut beobachtet wird, erhalten.
- Aus zwei Blutproben von pädiatrischen Patienten mit atopischer Dermatitis, welche durch Eiweiß verursacht wird, wurden Zellen abgetrennt und in der gleichen Art und Weise wie in vorstehendem Beispiel 4, unter Verwendung der BA312- immobilisierten Magnetkügelchen, die nach dem Verfahren von vorstehendem Beispiel 3 hergestellt worden waren, auf Histamin-Freisetzung getestet. Das in dem Test verwendete Eiweiß-Allergen wurde mit dem Histamin-Freisetzungspuffer auf Konzentrationen von 4.000, 400, 40, 4 und 0,4 ng/ml eingestellt und das Verhältnis der IgE-vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung wurde unter Verwendung der Formel wie vorstehend beschrieben berechnet.
- Wie in Fig. 3 gezeigt, hing das Verhältnis der IgE-vermittelten spezifischen Histamin-Freisetzung von der Eiweiß-Allergen-Konzentration ab. In einigen Fällen, in welchen die Histamin-Freisetzungsrate abnahm, wenn die Allergen-Konzentration über ein bestimmtes Niveau anstieg, wurde auch eine glockenförmige, Konzentrations-abhängige Kurve erhalten.
- Zellen wurden abgetrennt und auf die gleiche Art und Weise wie in vorstehendem Beispiel 4, unter Verwendung von BA312-immobilisierten magnetischen Kügelchen, welche nach dem Verfahren von vorstehendem Beispiel 3 hergestellt worden waren, auf Histamin-Freisetzung getestet.
- Mit der Probe, welche freigesetztes Histamin enthält, wurde die Konzentration von Histamin durch Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Insbesondere wurden 100 ul einer Probe, die freigesetztes Histamin enthält, bzw. 100 ul einer Standard- Histamin-Lösung in ein Teströhrchen gegeben. Zu jedem Teströhrchen wurden 100 ul einer ¹²&sup5;I markierten Histamin-Lösung (10 KBq/ml), welche mit 50 mM Phoshatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0), enthaltend 0,3% menschliches Serumalbumin und 0,1% Natriumazid (Testpuffer), hergestellt wurde, und 100 ul anti-Histamin- Antikörperlösung, hergestellt mit Testpuffer, zugegeben und für 2 Stunden bei 4ºC umgesetzt. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 ul 2,5% Rinder-γ-Globulinlösung, hergestellt mit 50 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0), enthaltend 0,1% Natriumazid (50 mM PBS) und 500 ul einer 25% Polyethylenglykol-Lösung (PEG Nr. 6.000), hergestellt mit 50 mM PBS, zugegeben und 10 Minuten bei 4ºC umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde 20 Minuten bei 4ºC bei 1.800 · g zentrifugiert und die Radioaktivität des Bodensatzes wurde bestimmt. Fig. 4 zeigt die Standardkurve der Histamin-Konzentration, die durch RIA erhalten wurde.
Claims (15)
1. Monoclonaler Antikörper mit folgenden Eigenschaften:
(1) er reagiert mit Basophilen;
(2) er behält seine Reaktivität mit Basophilen auch nach
Immobilisierung an einen festen Träger;
(3) er hemmt nicht die IgE-vermittelte spezifische Histamin-Freisetzung
aus den Basophilen, und
(4) er induziert keine unspezifische Histamin-Freisetzung aus den
Basophilen.
2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der ein Maus-Immunglobulin ist,
welches zur Klasse IgG1 oder IgM gehört.
3. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der ausgewählt ist aus den
monoclonalen Antikörpern BA101, BA20, BA135 und BA312, produziert
von den Hybridomen BA101 SHIONOGI (FERM BP-4004), BA20
SHIONOGI (FERM BP-4005), BA135 SHIONOGI (FERM BP-4006) bzw.
BA312 SHIONOGI (FERM BP-4007).
4. Feststoff-immobilisierter monoclonaler Antikörper, der durch
Immobilisierung des monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 1, 2 oder 3
an einen festen Träger hergestellt wird.
5. Feststoff-immobilisierter monoclonaler Antikörper nach Anspruch 4, wobei
der feste Träger ausgewählt ist aus Glas- oder synthetischen Harzteilchen,
-kugeln, -röhrchen, -platten und magnetischen Teilchen.
6. Feststoff-immobilisierter monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, wobei
die magnetischen Teilchen magnetische Kügelchen sind.
7. Hybridom, welches den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1, 2 oder
3 produzieren kann.
8. Hybridom nach Anspruch 7, ausgewählt aus den Hybridomen BA101
SHIONOGI (FERM BP-4004), BA20 SHIONOGI (FERM BP-4005), BA135
SHIONOGI (FERM BP-4006) und BA312 SHIONOGI (FERM BP-4007).
9. Verfahren zur Abtrennung von Basophilen, umfassend das Umsetzen des
Feststoff-immobilisierten monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 4, 5
oder 6 mit humoraler Flüssigkeit; und Einfangen der Basophilen in der
humoralen Flüssigkeit durch Koppeln der Basophilen mit dem
Feststoffimmobilisierten monoclonalen Antikörper.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die humorale Flüssigkeit ausgewählt ist
aus Blut, Nasen-Sekret, Tränen und Speichel.
11. Verfahren zur Freisetzung eines chemischen Vermittlers aus Basophilen,
umfassend das Umsetzen der mit dem Verfahren nach Anspruch 9 oder 10
abgetrennten Basophilen mit einem Allergen oder Anti-IgE-Antikörper.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der chemische Vermittler ausgewählt
ist aus Histamin, Leukotrien und Thrombocyten-aktivierendem Faktor
(platelet activating factor; PAF).
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Allergen ausgewählt ist
aus Hausstaub, Pollen, diätetischen Allergenen und chemischen Stoffen.
14. Verfahren zum Überprüfen der Freisetzung von chemischem Vermittler aus
Basophilen, umfassend die Schritte:
Schritt (a): Umsetzen des Feststoff-immobilisierten monoclonalen
Antikörpers nach Anspruch 4, 5 oder 6 mit humoraler Flüssigkeit und
Einfangen des Basophilen in der humoralen Flüssigkeit durch Koppeln des
Basophilen mit dem Feststoff-immobilisierten mononclonalen Antikörper,
um den Basophilen abzutrennen;
Schritt (b): Umsetzen des in Schritt (a) abgetrennten Basophilen mit
Allergen oder Anti-IgE-Antikörper, um einen chemischen Vermittler aus den
Basophilen freizusetzen; und
Schritt (c): Bestimmen der Menge an chemischem Vermittler, der aus dem
Basophilen in Schritt (b) freigesetzt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der chemische Vermittler ausgewählt
ist aus Histamin, Leukotrien und Thrombocyten-aktivierendem Faktor
(PAF).
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