CN107973838A - 一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽及其应用,属于生物医药领域。该小分子多肽为含有SNFLHLG核心序列的连续4个及其以上的4~12个氨基酸长度的线性肽或环肽。本发明提供的小分子多肽与目前类似的产品外用重组bFGF相比,促增殖效果相当,但亲和力更高,分子量更小,且采用化学合成方法而非基因工程方法,故在同等摩尔浓度的使用条件下,所需的生产成本和使用成本更低,所以是很好的替代重组bFGF的促皮肤创伤修复和细胞增殖产品。而本发明提供的多肽相对bFGF,因为仅有几个到十几个氨基酸,故降解程度大大降低,而且本发明公开的实验结果证明,该种多肽能持续作用于治疗部位,因此具有技术上的先进性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽及其应用。
背景技术
皮肤是人体面积最大的且最直接与外界接触组织,同时也是最容易受到外界刺激而损伤的器官。正常创伤的愈合对维持机体稳态至关重要,而异常愈合如大面积烧烫伤造成的不愈或者迟愈、其他疾病导致的慢性创面愈合、以及不正常的愈合如病理性瘢痕的形成等等不仅影响了美观,更会造成结构和功能的障碍,往往对患者造成沉重的心理压力,严重影响着患者的身心健康。因此,如何在皮肤创伤治疗中快速达到最佳愈合效果,一直是人们研究的热点。
皮肤的愈合过程是一个复杂的、协调有序的组织修复再生过程,是多种细胞及细胞因子共同作用完成的过程。该过程大致可以分为炎症反应期、增生期和重塑期,三个期相互交叉并无严格的界线,且均有大量的细胞及细胞因子参与愈合过程。参与愈合的细胞包括角质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞和肥大细胞等;参与愈合的细胞因子包括成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生因子(Plateletderived growth factor,PDGF)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowth factors,IGF)和多种凝血因子等。细胞分泌细胞因子调节创伤愈合,细胞因子又反过来影响细胞的功能,其中任何一个环节的异常都可能造成皮肤愈合结果的异常,而且皮肤愈合过程受到的影响因素众多(年龄、营养状况、内分泌变化、药物、局部血液循环、感染、电离辐射和系统性疾病等),因此,皮肤愈合的机制目前仍不完全明确。
目前临床上,皮肤创伤修复主要针对急性皮肤软组织创伤、慢性皮肤软组织创伤来进行不同的用药和处理。基于我国传统中医药的优势,在创伤修复领域涌现了许多单方如康复新液,复方则由少则四、五味,多则二三十味中药进行配伍制备而来,例如治疗烧烫伤的“湿润烧伤膏”、“京万红”等。现代医药开发特别是基因工程技术介入的生物医药开发后,促细胞生长的重组生长因子的生产也是创伤修复药物开发的生力军,比如已经在临床上应用于创伤、烧烫伤等的生物技术药物--外用重组碱性成纤维细胞生长因子,就是我国第二个基因工程I类新药(注:碱性成纤维细胞生长因子又称为成纤维细胞生长因子-2,bFGF)。
与皮肤修复的多肽药物开发方面,2014年中科院昆明动物研究所报道了来源于蜥蜴的一条强效的皮肤修复肽Tylotoin,含12个氨基酸残基,表现出强烈的促创伤愈合活性,可以促进角质上皮和成纤维细胞的增殖和迁移,还能促进TGF-b和IL-6的生成。也有中国发明专利公开了从华南雨蛙、红瘰疣螈、无指盘臭蛙中分别提取出了能促进皮肤修复的多肽,分别为16肽、13肽、24和11肽。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽。该小分子多肽促进皮肤细胞增殖从而重塑皮肤组织结构。
本发明提供的是一种4~12个氨基酸残基组成的小分子多肽,该种多肽是基于序列SNFLHLG而衍生的若干线肽和环肽,均暂命名为重塑肽,该种多肽序列的核心序列的获得是通过噬菌体肽库,以成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)的膜外段为靶点,多轮筛选并鉴定而获得的。目前为止尚无文献报道含有该核心序列多肽能用于皮肤创伤修复。
本发明的另一目的在于提供上述这种促进皮肤损伤修复的小分子多肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
本发明的目的是提供一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽,暂命名为重塑肽,该重塑肽为含有SNFLHLG核心序列的连续4个及其以上的4~12个氨基酸长度的线性肽或环肽。该重塑肽能靶向FGFR2,并具有高亲和力。
具体的,所述的重塑肽的T1肽序列为SNFLHLG,
T2肽序列为ATDVSNFL,
T3肽序列为NFLHLGADLWPD,
T4肽序列为CSNFLHLGC。
其中T1肽仅含有核心序列;T2肽含有核心序列的四个连续氨基酸SNFL;T3肽含有核心序列的六个连续的氨基酸NFLHLG;T4肽含有核心序列的全部7个氨基酸,且通过两端两个半胱氨酸的二硫键形成环肽。
本发明所述的重塑肽可以采用化学合成的方法获得。
本发明的目的是提供重塑肽在制备皮肤创伤、烧烫伤、慢性创面愈合、放射性溃疡、皮肤细胞修复和新生等方面的产品中的应用。
所述的产品优选为医用产品、护肤品或化妆品。
所述的产品的制剂类型优选但不局限为溶液、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料等。
本发明的内容为在小鼠成纤维细胞balb/c 3T3、人血管内皮细胞HUVEC、鸡胚尿囊膜和小鼠的动物模型上的实验。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
本发明提供的重塑肽是一种能够与FGFR2有高亲和的氨基酸短肽,与目前类似的产品外用重组bFGF(包括155个氨基酸)相比,促增殖效果相当,但亲和力更高,分子量更小,而且采用化学合成方法而非基因工程方法,故在同等摩尔浓度的使用条件下,所需的生产成本和使用成本更低,所以是很好的替代重组bFGF的促皮肤创伤修复和细胞增殖产品。而且重组bFGF在体外保存和运输条件较为苛刻,易降解,导致治疗部位的积累低,难以持续作用,因此在某些程度上限制和影响了其使用和相关剂型的开发,而本发明提供的多肽相对bFGF,因为仅有几个到十几个氨基酸,故降解程度大大降低,而且本发明公开的实验结果证明,该种多肽能持续作用于治疗部位,因此具有技术上的先进性。
附图说明
图1是ITC法检测重塑肽的T1肽和bFGF与FGFR2的亲和力的结果图;其中,A:重塑肽的T1肽→FGFR2;B:bFGF→FGFR2。
图2是CCK-8法检测重塑肽的T1、T2、T3和T4肽和bFGF对小鼠成纤维细胞Balb/c3T3的促细胞增殖作用的结果图。
图3是CCK-8法检测重塑肽的T1、T2、T3和T4肽和bFGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的促细胞增殖作用的结果图。
图4是重塑肽的T1、T2、T3和T4肽促进鸡胚尿囊膜中血管生成的结果图。
图5是重塑肽的T1、T2、T3和T4肽促进小鼠皮肤创伤的修复的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,实施例中所使用的实验材料、试剂等如无特殊说明,均为商业途径获取。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
实施例1
1、ITC法检测重塑肽SNFLHLG与FGFR2的亲和力
采用等温微量量热仪(ITC)检测的亲和力,结果如图1所示,A图为重塑肽T1肽与FGFR2的结合力检测结果,它们的亲和常数K=3.11E7±1.63E6M-1,解离常数Kd≈32.1nM,B图为bFGF与FGFR2的结合力检测结果,它们的亲和常数为K=1.62E5±2.50E4M-1,解离常数Kd≈6.17μM。结果显示重塑肽T1肽与FGFR2的亲和力远远高于bFGF与FGFR2的亲和力,前者是后者的约200倍。(K表示亲和常数,Kd表示解离常数,K越大,Kd越小,表示亲和力越强)。
2、CCK-8法检测重塑肽T1、T2、T3和T4肽和bFGF对成纤维细胞Balb/c3T3的促增殖作用
取Balb/c 3T3细胞,按每孔4000个细胞铺96板,贴壁后饥饿24小时后,取重塑肽T1、T2、T3、T4肽、bFGF,按5×倍增浓度处理24小时,之后采用CCK-8试剂处理,酶标仪检测各个孔OD值。如图2所示,在较低浓度组,重塑肽T1、T2、T3和T4肽与bFGF促增殖活性相当,而高浓度组,bFGF组出现细胞增殖抑制的现象,但T1、T2、T3和T4肽依然有促增殖活性但促增殖的程度不等。结果提示,上述重塑肽与bFGF都能促进成纤维细胞增殖方面,且没有出现高浓度抑制增殖的现象,说明其作用持续性好。
3、CCK-8法检测重塑肽的T1、T2、T3和T4肽和bFGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的促增殖作用
取HUVEC细胞,按每孔4000个细胞铺96板,贴壁后饥饿24小时后,取重塑肽T1、T2、T3、T4肽、bFGF,按5×倍增浓度处理24小时,之后采用CCK-8试剂处理,酶标仪检测各个孔OD值。如图3所示,在较低浓度组(≦0.16μM),重塑肽的T1、T2、T3和T4肽、bFGF促增殖活性相当,而高浓度组,bFGF组出现细胞增殖抑制的现象,但重塑肽的T1、T2、T3和T4肽依然有促增殖活性但程度不等。结果提示,上述重塑肽能促进血管内皮细胞生长,且作用持续性好。
4、重塑肽的T1、T2、T3和T4肽促进鸡胚尿囊膜中血管的生长
取培养5天的受精鸡蛋,大头朝上去蛋壳,暴露鸡胚尿囊膜,将100ng/mL浓度的各重塑肽和bFGF各100μL滴加其上,干净的滤纸封闭开口。再培养3天,之后剥取鸡胚尿囊膜,体视镜下观察,拍照,软件ImageJ plus对图像进行分析处理。如图4所示,分别加入重塑肽T1、T2、T3和T4后,鸡胚尿囊膜中的毛细血管明显增多,随着剂量增加而增加。说明上述重塑肽可以促进血管的生成。
5、重塑肽的T1、T2、T3和T4肽促进小鼠皮肤创伤的修复和血管生成
取Balb/c小鼠,在1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下(100mg/kg),背部脱毛并消毒,1%碘伏及75%酒精常规消毒。取眼科剪出直径8mm的伤口,再将重塑肽的T1、T2、T3和T4肽和bFGF各10μL滴加于伤口处,伤口开放不覆盖棉纱,设立生理盐水组为对照组。之后每日滴加一次,同时观察伤口愈合情况。如图5所示,加入重塑肽的T1、T2、T3和T4肽后,愈合速度增快。说明上述重塑肽明显促进了皮肤创伤的愈合。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重塑肽的T1肽序列
<400> 1
Ser Asn Phe Leu His Leu Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重塑肽的T2肽序列
<400> 2
Ala Thr Asp Val Ser Asn Phe Leu
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重塑肽的T3肽序列
<400> 3
Asn Phe Leu His Leu Gly Ala Asp Leu Trp Pro Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重塑肽的T4肽序列
<400> 4
Cys Ser Asn Phe Leu His Leu Gly Cys
1 5
Claims (8)
1.一种促进皮肤损伤修复的小分子多肽,其特征在于:
所述小分子多肽,暂命名为重塑肽,该重塑肽为含有SNFLHLG核心序列的连续4个及其以上的4~12个氨基酸长度的线性肽或环肽。
2.根据权利要求1所述的促进皮肤损伤修复的小分子多肽,其特征在于:
所述的重塑肽的T1肽序列为SNFLHLG的线性肽。
3.根据权利要求1所述的促进皮肤损伤修复的小分子多肽,其特征在于:
所述的重塑肽的T2肽序列为ATDVSNFL的线性肽。
4.根据权利要求1所述的促进皮肤损伤修复的小分子多肽,其特征在于:
所述的重塑肽的T3肽序列为NFLHLGADLWPD的线性肽。
5.根据权利要求1所述的促进皮肤损伤修复的小分子多肽,其特征在于:
所述的重塑肽的T4肽序列为CSNFLHLGC的环肽。
6.权利要求1~5任一项所述的促进皮肤损伤修复的小分子多肽在制备皮肤创伤、烧烫伤、慢性创面愈合、放射性溃疡、皮肤细胞修复和新生的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:
所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品。
8.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于:
所述的产品的制剂类型为溶液、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料。
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