CN107383164A - 一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用 - Google Patents

一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用 Download PDF

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Abstract

一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用,属于生物医学技术领域。所述的超短肽含有超短肽Mapin‑WH,Tinin‑WH,Orin‑G‑OT中的至少一种,其具有促进胶原蛋白合成能力,并且具有极强的抗氧化、抗衰老活性、分子量小、结构简单、细胞毒性极低、无溶血活性、制备方法简单等特点。所述的超短肽用于制备治疗受损表皮的修复与再生,如治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡等药物,以及代替EGF用于皮肤修复、刺激皮肤胶原蛋白增生的抗衰老、抗氧化美容护肤品新原料等领域。超短肽分子量小、结构简单、采用化学合成方法的成本极低,相比每克售价近200万美元的EGF具有突出有益的特点。

Description

一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用
技术领域
本发明涉及一类用于促胶原分泌的超短肽及其应用,属于生物医学技术领域。
背景技术
衰老是任何生物生命过程的必然规律,随着世界范围内人口老龄化问题的日益突出,抗衰老领域已成为全球关注的热点。皮肤是机体衰老过程中最为明显的器官之一,随着年龄的增长,皮肤会发生退行性变化,例如弹性消退、含水量减少、萎缩、出现皱纹等。
皮肤衰老是皮肤组织一系列复杂的生物学过程,是所有内源性生理因素和外源性环境因素共同作用的结果。衰老不仅会影响正常皮肤组织结构和生理功能,而且,也会直接影响皮肤外层的外观和容貌。皮肤是由表皮层、真皮层和皮下脂肪组成。其中,真皮层中的成纤维细胞分泌产生胶原蛋白,以维持皮肤的强度和弹性,与皮肤的老化问题直接相关。胶原蛋白是构成人体结缔组织的蛋白质,占人体总蛋白含量的三分之一还多,而皮肤中的胶原蛋白则高达85%以上,其中主要含有Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I)。胶原蛋白的分子量为30万道尔顿,它是由三条肽链构成,其中Ⅰ型胶原蛋白是由2条α1和1条α2亚基结合而成的三螺旋结构,并互相盘绕成螺旋结构。胶原蛋白的存在与皮肤健康程度,保水及弹性等有着密切的关系。皮肤衰老的组织学改变主要是胶原蛋白的减少和流失。衰老皮肤中胶原蛋白流失主有两方面原因,一方面是皮肤细胞合成的胶原蛋白量减少,另一方面是被基质金属蛋白酶家族(MMPs)中的MMP-1不断降解。由于遗传因素等不可抗内因紫外线、辐射等外界刺激,皮肤会逐渐老化,进而影响到胶原蛋白的合成和降解过程。当胶原蛋白降解的速度大于其生成的速度时,皮肤便会出现松弛、产生皱纹等明显衰老特征。
近年来具备抗老化的功能制剂一直受到相关学科领域,特别是医疗保健、美容化妆品科学等领域的高度重视和普遍关注。目前已经研制出种类繁多、剂型多样、琳琅满目的皮肤美容抗衰老化妆品。但是,市面上存在的胶原蛋白相关产品,皆以直接补充胶原蛋白为主要功能,然而,胶原蛋白分子量大,涂抹方式几乎无法使其穿透皮肤角质层作用于真皮层的成纤维细胞;若为注射方式直接补充胶原蛋白,因此实际补充胶原蛋白的效果有限。自从人们发现生物活性肽以来,特别是皮肤组织细胞相关的生长因子多肽、胶原多肽、谷胱甘肽、肌肽等天然活性肽、基因重组多肽分子和化学合成多肽等被开发并成功应用于皮肤美容抗衰老化妆品之后,人们发现部分活性肽可以直接激活皮肤细胞自身合成胶原蛋白,从而达到最为有效地促进补充胶原蛋白含量,从根本上提升皮肤自身的活力,激活皮肤细胞合成胶原蛋白,抵抗皮肤衰老。
生物活性肽就是指一类对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物,是一类相对分子质量小于6000Da,具有多种生物学功能的多肽。生物活性肽的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面。尤其是一些小分子的超短肽,由于其具有超短的序列、小分子量,因此更是具备高安全性、易于合成、利于皮肤吸收等优势特征,并且兼具活性肽本身的高生物活性、调节细胞生理功能和代谢活动进而从本质上改变皮肤问题,同时也是大众认为最为安全高效的抗老化原料之一,因此超短肽在皮肤美容、医疗保健以及食品、药品添加剂等方面具有十分重要的应用价值和开发前景。
发明内容
本发明提供一类用于促胶原分泌的超短肽,其包含Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT中至少一种肽。
本发明的技术方案:
一类用于促胶原分泌的超短肽,选自以下超短肽,包括但不限于Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT。
(1)超短肽Mapin-WH:一种直链小肽,分子量为1086.3Da,等电点是5.97,含有9个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Val-Leu-Pro-Lys-Leu-Glu-Cys-Val-Trp;
(2)超短肽Tinin-WH:一种直链小肽,分子量为1309.6Da,等电点是9.51,含有11个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Leu-Leu-Pro-Pro-Trp-Leu-Arg-Pro-Lys-Cys-Ser;
(3)超短肽Orin-G-OT:一种直链小肽,分子量为1407.79,等电点是8.06,含有13个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Phe-Val-Pro-Ala-Ile-Leu-Cys-Ser-Ile-Leu-Lys-Thr-Cys。
本发明的有益效果:本发明提供的一类用于促胶原分泌的超短肽,其包含Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT中至少一种肽。通过双荧光素报告系统检测超短肽对于I型胶原蛋白有极强转录活性,浓度为5μg/ml时即可高效激活其转录。同时,该组超短肽具有极强的抗氧化、抗衰老活性,对DPPH自由基,以及ABTS·+正离子自由基清除率均十分明显;且超短肽具有分子量小、细胞毒性低、无溶血活性、结构简单、易于制备等特点,因此将其应用在促胶原分泌、抗氧化、抗衰老化妆品或医疗、保健品的开发中。
附图说明
图1是三种超短肽对HFF-1细胞的毒性图。
图2(a)是pGL3-COLIα2的质粒图谱图。
图2(b)是phRL-TK的质粒图谱图。
图3是HEK293细胞中三种超短肽对COLIα2转录活性的影响图。
图中:
具体实施方式
以下结合附图和技术方案,进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1
抗老化超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT的化学合成:
(1)抗老化超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT的化学合成方法:根据超短肽氨基酸序列,用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列,通过HPLC反相柱层析脱盐。
(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
(3)纯化的三种抗老化超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度,分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF),等电聚焦电泳测定等电点,用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
超短肽Mapin-WH:一种直链小肽,分子量为1086.3Da,等电点是5.97,含有9个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Val-Leu-Pro-Lys-Leu-Glu-Cys-Val-Trp;
超短肽Tinin-WH:一种直链小肽,分子量为1309.6Da,等电点是9.51,含有11个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Leu-Leu-Pro-Pro-Trp-Leu-Arg-Pro-Lys-Cys-Ser;
超短肽Orin-G-OT:一种直链小肽,分子量为1407.79,等电点是8.06,含有13个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Phe-Val-Pro-Ala-Ile-Leu-Cys-Ser-Ile-Leu-Lys-Thr-Cys。
实施例2
溶血性测定:
将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝,生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的超短肽样品混合,37℃保温30min,再于1000rpm离心5min,上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水,阳性对照使用Triton X-100,溶血百分比按以下公式计算:溶血百分比H%=(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100%。
表1.三种超短肽溶血活性
结果表明三种超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT浓度为160μg/ml时的溶血百分比均不到1%。说明Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT都不具有的溶血活性,不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害,因此十分利于其在促胶原分泌、抗氧化及抗皮肤老化的药物、食品或者化妆品添加剂领域进一步的开发应用。
实施例3
细胞毒性测定:
用MTT法检测该组超短肽对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。
人皮肤成纤维细胞HFF-1购于上海细胞库。先将成纤维细胞于含有15%胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM中培养,待细胞长满后,用0.25%的胰蛋白酶消化下来,用上述培养基洗两次,重新悬浮细胞,细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中,使每孔细胞数达到105个。加入样品,对照组加入相同体积的灭菌超纯水,置37℃,5%CO2培养箱内培养24h。培养结束后,96孔细胞培养板每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制),继续培养5h,用注射器吸出孔中液体,每孔加入100μlDMSO,用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收,测定波长490nm,参考波长630nm。
结果如图1所示,三种超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT浓度为160μg/ml时的细胞存活率分别83.34%、79.84%、82.42%,说明3种超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT不具有细胞毒性,对正常细胞存活率无显著性影响,因此十分利于其在促胶原分泌、抗衰老化妆品添加剂等领域进一步的开发应用。
实施例4
抗氧化活性测定:
(1)DPPH自由基清除活性(DPPH radical scavenging assay)
称取一定量的DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate,Sigma,美国),用甲醇溶解,配成6×10-5M的溶液,现配现用。将48μl DPPH溶液和2μl样品(2mg/ml)混合(最终样品与DPPH的质量比为3:1),室温下避光静置30min,于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行,紫外分光光度计调零时使用甲醇。
DPPH·清除率(%)=(AB-AA)/AB×100(AB:空白对照组吸光值;AA:样品组吸光值)。
(2)ABTS·+自由基正离子清除活性
ABTS(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液按体积比250:1混合,于室温避光放置15-16h。试验开始前,将ABTS·+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4μl不样品和96μl上述校正过的ABTS·+溶液混合,室温放置10min后,于734nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。
ABTS·+清除率I(%)=(AB-AA)/AB×100(AB:空白对照组吸光值;AA:样品组吸光值)。
表2.三种超短肽体外抗氧化活性
结果如表2所示,该组三种超短肽均具有抗氧化活性。其中,样品Magin-WH浓度为2mg/ml时,其DPPH自由基清除率I%可达到18.73%、ABTS·+正离子自由基清除率I%可以达到36.41%;样品Tinin-WH浓度为2mg/ml时,其DPPH自由基清除率I%可达到14.57%、ABTS·+正离子自由基清除率I%可以达到34.76%;样品Orin-G-OT浓度为2mg/ml时,其DPPH自由基清除率I%可达到73.72%,ABTS·+正离子自由基清除率I%可以达到47.57%;具备抗氧化活性,显著清除自由基,可直接防止胶原蛋白等生物大分子免受其损伤。
实施例5
应用双荧光素酶报告系统检测超短肽对胶原蛋白转录活性的影响:
选取状态良好的HEK 293T细胞,用0.25%胰酶消化之后,用含有10%FBS的DMEM终止消化。将生长旺盛的293T细胞以5×104~1×105个/ml的密度接种24孔板。每孔500μL用10%FBS的DMEM培养基培养,待贴壁之后进行处理。然后,取用两只无菌2ml EP管。一只加入1.2mL无血清无双抗DMEM培养基并加入20μL脂质体Lipofectamine 2000,缓慢吹打均匀静置5min。另一只加入1.2mL无血清无双抗DMEM培养基,同时加入构建好的pGL3-COLIα2(如图2(a)),phRL-TK(如图2(b)),pEGFP-N3质粒(质量比为10:2:1)并使加入的总质量不超过1μg。均匀吹打,静置5分钟。将上述两EP管的液体混合室温静置20min,让脂质体充分包裹质粒。随后吸去24孔培养板中的培养基,每孔加入400μL无血清无双抗DMEM培养液体并缓慢加入100μL脂质体质粒混合液体。空白组加入100μL无血清无双抗DMEM培养基。最后,将24孔板置于37℃中培养6-8h。即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。这是由于宿主细胞表达绿色荧光蛋白质粒中的基因所致。我们可以计算发光细胞在全细胞中的比例得知转染效率。一般转染效率超过30%就能有效检测荧光素酶的变化。
所有的药物用无血清DMEM培养液稀释配制成5ng/mL和50ng/mL高低两种浓度稀释液。由于所有体系均加入等量的内参质粒,如果内参荧光表达过低可推断上述两种浓度下药物毒性过大,因稀释更低浓度进一步筛选。加入转染有质粒的293T细胞,每孔500μl,每个浓度梯度3个重复,对照组则加入等体积的无血清无双抗DMEM培养液。加入药物的24孔板置于37℃培养箱培养,12小时后吸去上清液,用PBS缓冲溶液小心清洗细胞2次。之后用PBS稀释的5×被动裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer,PLB,Promega试剂盒)。每孔加入100μL稀释好的1×PLB。室温震荡裂解15min,-20℃冷冻15min,重复冻融步骤2~3次,以使细胞完全充分破裂释放出细胞内的荧光素酶。
荧光素梅活性检测:吸出40μL裂解液,加入到荧光酶检测专用的96孔圆底检测板(Greiner U-plate)。之后避光每孔加入20ul萤火虫荧光素酶反应底物Luciferase AssayBuffer(LAB),上仪器读值。此步骤用于检测萤火虫荧光素酶活力。之后再加入20μl海肾荧光素酶反应底物Stop&Glo(STOP),上仪器读值。通过这样处理分别得到了报告质粒和内参质粒的酶含量(酶的数量与荧光发光强度成正比),数据处理时每一个孔都有各自的LAB/STOP值,即萤火虫荧光素酶与海参荧光素酶的比值(fLuc/rLuc)。
结果如图3所示,三种超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT浓度为5μg/ml时的相对荧光素酶活性分别为1.72、1.61、1.49。说明三种超短肽Mapin-WH,Tinin-WH,Orin-G-OT具高效激活I型胶原蛋白转录的能力,因此十分利于其在促胶原分泌、抗衰老、抗氧化药物、食品及化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

Claims (3)

1.一类用于促胶原分泌的超短肽,包括三种:超短肽Mapin-WH、超短肽Tinin-WH和超短肽Orin-G-OT;其特征在于,
所述的用于促胶原分泌的超短肽Mapin-WH:一种直链小肽,分子量为1086.3Da,等电点是5.97,含有9个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Val-Leu-Pro-Lys-Leu-Glu-Cys-Val-Trp;
所述的用于促胶原分泌的超短肽Tinin-WH:一种直链小肽,分子量为1309.6Da,等电点是9.51,含有11个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Leu-Leu-Pro-Pro-Trp-Leu-Arg-Pro-Lys-Cys-Ser;
所述的用于促胶原分泌的超短肽Orin-G-OT:一种直链小肽,分子量为1407.79,等电点是8.06,含有13个氨基酸残基,全序列的一级结构为:Phe-Val-Pro-Ala-Ile-Leu-Cys-Ser-Ile-Leu-Lys-Thr-Cys。
2.权利要求1所述的一类用于促胶原分泌的超短肽制备治疗受损表皮的修复与再生的药物。
3.权利要求1所述的一类用于促胶原分泌的超短肽作为抗衰老、抗氧化美容护肤品的主要活性成分。
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