CN107344959B - 一种促皮肤修复超短肽Purin-WH、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促皮肤修复超短肽Purin‑WH、其制备方法及应用，属于生物医药领域。所述超短肽Purin‑WH为一种直链小肽，其氨基酸结构为：Val‑Val‑Pro‑Thr‑Val‑Val‑Cys‑Pro‑Lys，所述超短肽Purin‑WH可通过自动多肽合成仪合成，并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。本发明中的超短肽Purin‑WH分子量小、结构简单、合成成本极低，并且能够显著加速全皮肤伤口愈合，有效清除活性氧、并可促进皮肤胶原蛋白的生成、有助于皮肤修复；无细胞毒性和溶血性。该超短肽可用于制备用于受损表皮的修复与再生的药物，如治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡等药物，并可一定程度替代EGF在皮肤修复、刺激皮肤胶原蛋白增生的抗衰老、抗氧化美容护肤品领域的运用，并且它的作用可能还不止局限于此。

Description

一种促皮肤修复超短肽Purin-WH、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种促皮肤修复的超短肽Purin-WH、其制备方法及应用。

背景技术

皮肤是覆盖在人体表面最大的器官，易受多种因素的影响(如外界的物理化学因素、自身激素水平变化、机械压力等)。同时，皮肤作为机体与外界的第一道天然屏障，一旦受损，机体就会立即开启生理调节进行皮肤的损伤修复。

皮肤的损伤修复是一个需要多种类型细胞参与的复杂过程，一般包括三个阶段：(1)炎症发生；(2)伤口重新上皮化，新生组织形成；(3)再生的组织结构重塑。这三个阶段之间既彼此交错，又相互区别，是一个连续的生物反应的自我修复过程。同时，活性氧簇作为有氧呼吸过程中不可避免的副产物，对某些细胞和生化过程非常重要，活性氧簇参与伤口愈合过程，氧化应激是伤口愈合过程中的一个重要因素，通常能抑制组织的重构。活性氧类可导致氧化损伤，脂质过氧化，DNA断裂和酶失活，这些会抑制伤口愈合。

人们已经发现，使用抗氧化剂清除自由基可显著促进伤口愈合。另外，真皮成纤维细胞和表皮角质上皮细胞是创伤愈合过程中的主要功能细胞。成纤维细胞在信号的引导下，向伤口迁移，分泌细胞外基质，进行胶原排列，并收缩伤口，促进愈合。现已有研究证实，在皮肤损伤后的修复过程中，胶原蛋白作为细胞外间质的主要成分更是发挥其重要作用。胶原蛋白具有促进细胞迁移，诱导有助于细胞趋化作用的相关因子等表达，与皮肤修复密切相关。

长久以来，皮肤修复一直是临床外科学中常见问题，其中对创面修复的研究以及组织再生修复的机制研究是整个外科学领域范围内目前研究最为突出重要的部分。诸如皮肤缺损，大面积烧伤，以及闭合伤口等相关问题亟待解决。以往的研究发现表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)可以促进上皮再生，加快创伤愈合。hEGF(humanepidermal growth factor，hEGF)是再上皮化过程中重要的生长因子，其结构是由53个氨基酸组成，分子量为6045Da，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域。hEGF在广泛应用的同时，人们越来越关注的问题是如何兼顾高产量、高活性前提下，还能够保证商品化生产的价值与应用。已知最初获得EGF的传统方法是从动物的尿液中分离提取的，经过12道程序，消耗3000L人的尿液，但得率却非常低。而唾液、泪液、母乳和血浆等含有EGF的体液中提取EGF，产量也极低。每克售价近200万美元，大大限制了EGF在美容领域的应用。若采用化学合成，注意到hEGF包含3对二硫键，将对合成效率造成极大困难，且产量及活性均无法达到令人满意。而生物合成的手段将更无法直接保证产量和蛋白修饰的准确性。因此，序列短小、合成简单、活性高效的促皮肤修复的超短肽必将越来越受到人们的关注，其在皮肤修复、再生医疗、美容等领域的开发潜力亦是不容小觑。

活性生物肽主要意义在于它们能够参与生物体内蛋白质的合成代谢和分解代谢，促进生物体内相关细胞的有丝分裂与增殖分化，并且主动调节细胞内外蛋白质的合成与分泌。尤其是一些小分子的超短肽，一级序列全长小于10个氨基酸、分子量小，在具备高安全性、利于皮肤高效吸收的同时，更明显的优势在于其合成制备的方法简便、产量高且纯度高，较之EGF更为经济，更利于超短肽商品化的投入与生产。可见，促皮肤修复肽在再生美容护肤品、创面愈合医疗药品等领域均具有十分诱人的应用前景和开发潜质。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种促皮肤修复超短肽Purin-WH、其制备方法及应用旨在解决上述技术问题。

本发明采用的技术方案为：一种促皮肤修复超短肽Purin-WH，所述超短肽Purin-WH为一种直链小肽，其氨基酸全序列的一级结构为：Val-Val-Pro-Thr-Val-Val-Cys-Pro-Lys。

优选的，所述促皮肤修复超短肽Purin-WH分子量为941.2Da，等电点是8.19。

优选的，所述促皮肤修复超短肽Purin-WH的制备方法，具体步骤如下：

1)多肽肽链的合成；

2)对多肽进行纯化；

3)测定纯化后多肽的分子量；

4)测定多肽的等电点及序列。

优选的，所述促皮肤修复超短肽Purin-WH可用于受损表皮的修复与再生药物的制备以及促进皮肤胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化护肤品的开发。

本发明的有益效果在于：本发明所述的促皮肤修复超短肽Purin-WH可显著加速动物模型的体表创伤愈合，相比于EGF具有更好的愈合效果；对DPPH自由基、ABTS·+正离子自由基以及人皮肤成纤维细胞中的活性氧簇均具有显著的清除能力；并且通过双荧光素报告系统检测、Western Blotting电泳法检测均显示超短肽Purin-WH显著提高I型胶原蛋白的转录和翻译水平的含量，能够促进皮肤的修复；同时，该超短肽具有分子量小、细胞毒性低、溶血活性极低、结构简单、易于制备等特点，因此可将其应用于制备用于体表创伤、烧伤、皮肤溃疡的药物、皮肤修复与再生、美容护肤品领域。

附图说明

图1为pGL3-COLIα2(左)和phRL-TK(右)质粒图谱；

图2为HEK293T细胞中Purin-WH对COLIα2转录活性的影响实验结果；

图3为超短肽Purin-WH对UVA照射成纤维细胞后Col1、MMP-1蛋白表达的影响实验结果；

图4为超短肽Purin-WH对细胞内活性氧簇的检测实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种促皮肤修复超短肽Purin-WH，其特征在于：所述超短肽Purin-WH为一种直链小肽，其氨基酸全序列的一级结构为：Val-Val-Pro-Thr-Val-Val-Cys-Pro-Lys。

优选的，所述促皮肤修复超短肽Purin-WH的制备方法，具体步骤如下：

1、根据设计的超短肽氨基酸序列：Val-Val-Pro-Thr-Val-Val-Cys-Pro-Lys，用自动多肽合成仪(型号：433A，Applied Biosystems)合成得到粗多肽；

2、将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，通过多次分离纯化、并鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；

HPLC纯化及鉴定方法：将1mg待测样品溶于1mL含有0.1％TFA的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.22μm滤膜过滤，流动相A为0.1％TFA-H2O，流动相B为0.1％TFA-CH3CN(所用洗脱溶剂均需过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡)，待基线平稳后开始上样，上样量为10μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm id×250mm，胶粒大小5μm id，孔径大小为300目)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长215nm，25℃下测定。

3、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量为941.2Da；

方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成2μmol/mL的溶液，取1μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。

4、通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为8.19，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为Val-Val-Pro-Thr-Val-Val-Cys-Pro-Lys。

优选的，所述促皮肤修复超短肽Purin-WH可用于受损表皮的修复与再生药物的制备，以及促进皮肤胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化护肤品的开发。

(一)皮肤修复超短肽Purin-WH对小鼠皮肤损伤模型的伤口愈合作用实验

随机选取6-8周大(20g左右)昆明小鼠用1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射(100μL/20g)麻醉后，用剪刀尽量剪净其背部毛发。酒精消毒后，在其背部用打孔器开两个直径8mm的创口。以PBS溶液为空白对照组；鼠源EGF(mEGF，100μg/mL)及人源EGF(hEFG，20μg/ml)为阳性对照；Purin-WH(20μg/mL)为实验组；EGF和Purin-WH均用PBS溶液配制。每天给药两次，每次20μL。样品加在右侧创面，左侧创面加相应的空白/阳性对照。每两天用相机拍下创面变化，直到加药创面完全脱痂愈合为止。拍照时用量尺比照创口作标尺。

实验结果表明，在为期10天的创面结果观察中可以看出，促皮肤修复超短肽Purin-WH浓度为20μg/ml对创伤愈合效果明显优于浓度为100μg/ml鼠源mEGF及20μg/ml人源hEGF，可见Purin-WH具备显著提高伤口修复能力。故此超短肽可应用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物、减少疤痕产生、加快疤痕修复领域。

(二)溶血性测定实验

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的超短肽样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。

表1.超短肽Purin-WH溶血活性

结果表明：超短肽Purin-WH在浓度为160μg/ml时的溶血率只有0.59％。说明Purin-WH溶血活性极低，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在皮肤修复的药物、食品或者化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

(三)细胞毒性测定实验

用MTT法检测该组超短肽对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。

人皮肤成纤维细胞HFF-1购于上海细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到10⁵个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl5mg/ml MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μlDMSO，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nm，参考波长630nm。

表2.超短肽Purin-WH对HFF-1细胞的毒性

结果如表2所示，表明超短肽Purin-WH浓度为160μg/ml时的细胞毒性只有5.14％，说明超短肽Purin-WH对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。

(四)应用双荧光素酶报告系统检测超短肽对胶原蛋白转录活性的影响实验

选取状态良好的HEK 293T细胞，用0.25％胰酶消化之后，用含有10％FBS的DMEM终止消化。将生长旺盛的293T细胞以5×10⁴～1×10⁵个/ml的密度接种24孔板。每孔500μL用10％FBS的DMEM培养基培养，待贴壁之后进行处理。然后，取用两只无菌2ml EP管。一只加入1.2mL无血清无双抗DMEM培养基并加入20μL脂质体Lipofectamine 2000，缓慢吹打均匀静置5min。另一只加入1.2mL无血清无双抗DMEM培养基，同时加入构建好的pGL3-COLIα2(如图1左)，phRL-TK(如图1右)，pEGFP-N3质粒(质量比为10∶2∶1)并使加入的总质量不超过1μg。均匀吹打，静置5分钟。将上述两EP管的液体混合室温静置20min，让脂质体充分包裹质粒。随后吸去24孔培养板中的培养基，每孔加入400μL无血清无双抗DMEM培养液体并缓慢加入100μL脂质体质粒混合液体。空白组加入100μL无血清无双抗DMEM培养基。最后，将24孔板置于37℃中培养6-8h。即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。这是由于宿主细胞表达绿色荧光光蛋白质粒中的基因所致。我们可以计算发光细胞在全细胞中的比例得知转染效率。一般转染效率超过30％就能有效检测荧光素酶的变化。

所有的药物用无血清DMEM培养液稀释配制成5μg/ml和50μg/ml高低两种浓度稀释液。由于所有体系均加入等量的内参质粒，如果内参荧光表达过低可推断上述两种浓度下药物毒性过大，因稀释更低浓度进一步筛选。加入转染有质粒的293T细胞，每孔500μl，每个浓度梯度3个重复，对照组则加入等体积的无血清无双抗DMEM培养液。加入药物的24孔板置于37℃培养箱培养，12小时后吸去上清液，用PBS缓冲溶液小心清洗细胞2次。之后用PBS稀释的5×被动裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer，PLB，Promega试剂盒)。每孔加入100μL稀释好的1×PLB。室温震荡裂解15min，-20℃冷冻15min，重复冻融步骤2～3次，以使细胞完全充分破裂释放出细胞内的荧光素酶。

荧光素梅活性检测：吸出40μL裂解液，加入到荧光酶检测专用的96孔圆底检测板(Greiner U-plate)。之后避光每孔加入20ul萤火虫荧光素酶反应底物Luciferase AssayBuffer(LAB)，上仪器读值。此步骤用于检测萤火虫荧光素酶活力。之后再加入20μl海肾荧光素酶反应底物Stop&Glo(STOP)，上仪器读值。通过这样处理分别得到了报告质粒和内参质粒的酶含量(酶的数量与荧光发光强度成正比)，数据处理时每一个孔都有各自的LAB/STOP值，即萤火虫荧光素酶与海参荧光素酶的比值(fLuc/rLuc)。

相对荧光素酶活性的结果如图2所示，结果表明：超短肽Purin-WH浓度为5μg/ml时的相对荧光素酶活性为1.69，即对于胶原蛋白COLIα2转录活性为空白组的1.69倍，结果极显著。故超短肽Purin-WH，绝对具备高效激活I型胶原蛋白转录的能力，促进细胞迁移，因此十分利于其在皮肤修复、再生领域进一步的开发应用。

(五)Western blotting电泳法检测COL1和MMP-1蛋白表达实验

人皮肤成纤维细胞(HFF-1)用含有15％胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，用0.25％胰酶消化后，以10⁵个/ml接种于6孔板中，每孔2ml。在37℃的CO₂培养箱中过夜培养使细胞贴壁，待细胞密度长至80％左右，将培养基吸去，用磷酸盐缓冲液(PBS：0.8gNaCl；0.2g KCl；2.9g Na₂HPO₄.12H₂O；0.27gKH₂PO₄溶于800ml去离子水，搅拌溶解，定容至1L，用浓HCl调节PH至7.4，高压灭菌)洗涤细胞2-3次。加入10ug/ml样品，空白加入2％血清DMEM处理24h后采用长波紫外线UVA(320nm-400nm)紫外进行照射处理，细胞处理完毕后再换为无血清DMEM培养基继续培养24h。然后弃去细胞上层培养液，1000g离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次。每孔细胞内加入250ulRIPA细胞裂解液[50Mm Tris-HCl(PH7.4)，1％Nonidet P-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mMNaCl，1mM EDTA，1Mm PMSF，1Mm NaF，1mM Na₃VO₄，各1ug/ml的aprotinin，leupeptin和pepstatin]，冰上裂解30min。4℃，12000g离心20min，小心吸取上清，并将上清分装至新的eppendorf管，吸取2ul用Bradford法测定蛋白浓度。40ug裂解产物在8％的SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5％牛血清白蛋白封闭2h；加特异一抗，一抗(Col1、MMP-1)(1∶2000)购自Cell Signaling Technology公司，GAPDH(1∶3000)购自ComWin Biotech公司，按说明书操作，4℃孵育过夜；TBST(39g Tris，89gNaCl，0.29g KCl，0.5％Tween，定容至1000ml，用浓HCl调节PH至7.4)洗涤3次，每次5min；然后加辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔抗体常温孵育1h，二抗购自Cell SignalingTechnology公司，TBST洗涤3次，每次5min；暗室中加入显色液显色。

蛋白表达结果如图3所示，结果表明：在外界环境胁迫情况下(UVA＝10.8J/cm²照射)，I型胶原蛋白含量显著低于正常细胞，加药组，即10ug/ml超短肽Purin-WH可以提高损伤组的胶原蛋白含量至正常组。并有效抑制胶原蛋白水解酶MMP-1的蛋白表达。由此说明超短肽Purin-WH能够有效促进胶原蛋白表达并抑制其水解，从而促进细胞的迁移，利于皮肤修复。故此超短肽Purin-WH在皮肤修复及再生、刺激皮肤细胞胶原蛋白分泌，防止皮肤老化、粗糙的抗衰老医美等领域具备极佳的开发前景。

(六)抗氧化活性测定实验

1)DPPH自由基清除活性(DPPH radical scavenging assay)

称取一定量的DPPH(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate，Sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6×10^-5M的溶液，现配现用。将48μl DPPH溶液和2μl样品(2mg/ml)混合(最终样品与DPPH的质量比为3∶1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。

DPPH·清除率(％)＝(AB-AA)/AB×100(AB：空白对照组吸光值；AA：样品组吸光值)。

2)ABTS^.+自由基正离子清除活性

ABTS(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K₂S₂O₈)水溶液按体积比250∶1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将ABTS^.+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4μl不样品和96μl上述校正过的ABTS^.+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。

ABTS^.+清除率I(％)＝(AB-AA)/AB×100(AB：空白对照组吸光值；AA：样品组吸光值)。

3)还原力测定

取10μl样品(2mg/ml)与50μl磷酸钠缓冲液以及50μ11％K₃Fe(CN)₆混合，50℃水浴20min；然后加入50μl 10％的三氯乙酸，3000rpm离心10min；取上清50μl，加入50μl去离子水和10μl 1％FeCl₃。于700nm测光吸收。光吸收越强表示还原力越强。

表3.超短肽Purin-WH体外抗氧化活性

超短肽Purin-WH体外抗氧化活性结果如表3所示，超短肽Purin-WH浓度为2mg/ml时，其DPPH自由基清除率可达到53.22％、ABTS·+正离子自由基清除率可以达到71.85％；具备显著的清除自由基作用，可直接防止胶原蛋白等生物大分子免受其损伤。

(七)细胞内活性氧簇的测定实验

将人皮肤成纤维细胞(HFF-1)以10⁵个/ml的细胞密度接种于6孔板培养板中，在37℃的CO2培养箱中过夜培养使细胞贴壁，待细胞密度长至80％左右，将培养基吸去，用PBS洗涤细胞2-3次。加入10ug/ml样品，空白加入2％血清DMEM处理24h，然后采用长波紫外线UVA(320nm-400nm)紫外进行照射处理，细胞处理完毕后再换为无血清DMEM培养基继续培养24h。细胞处理完后续立即进行ROS测定。首先用PBS冲洗细胞3次，再向细胞中加入终浓度为5μmol/L的DHE溶液，37℃孵育10min(避光)。然后用0.25％的胰酶将细胞消化下来，并用培养基终止消化，收集细胞，离心并用培养基清洗细胞3次。检测前在每孔中加入1ml PBS溶液。之后将样品加入流式细胞仪中，样品使用480-535mm激发波长，590-610mm发射波长，记录染色细胞的数目。

图4A反应的是单独加药组的结果：正常环境下培养的细胞也存在ROS，当加入超短肽Purin-WH后，浓度达到10ug/ml，ROS染色平均荧光强度已开始显著降低。

图4B反应的是加药处理24h后采用UVA进行氧化损伤的实验结果：在外界环境胁迫情况下(UVA＝10.8J/cm²照射)，ROS染色平均荧光强度显著高于正常细胞，加入药物后，染色强度降低。

由此可知，超短肽Purin-WH无论是否在有外界氧化压力的环境下，在10-50ug/ml范围即可显著降低细胞内ROS水平。故此超短肽Purin-WH可有效解除氧化应激对细胞的损伤，有助于促进皮肤修复，应用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物、减少疤痕产生、加快疤痕修复等皮肤修复与再生美容护肤品等领域。

序列表

<110>于海宁王慧王义鹏

<120>一种促皮肤修复超短肽 Purin-WH、其制备方法及应用

<160> 1

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 1

Val Val Pro Thr Val Val Cys Pro Lys

1 5

Claims (4)

1.一种促皮肤修复超短肽Purin-WH，其特征在于：所述超短肽Purin-WH为一种直链小肽，其氨基酸全序列的一级结构为：Val-Val-Pro-Thr-Val-Val-Cys-Pro-Lys。

2.如权利要求1所述的一种促皮肤修复超短肽Purin-WH，其特征在于：所述超短肽Purin-WH分子量为941.2Da，等电点是8.19。

3.如权利要求1-2任一项所述的一种促皮肤修复超短肽Purin-WH的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下：

1)多肽肽链的合成；

2)对多肽进行纯化；

3)测定纯化后多肽的分子量；

4)测定多肽的等电点及序列。

4.如权利要求1-2任一项所述的一种促皮肤修复超短肽Purin-WH在受损表皮的修复与再生药物的制备以及促进皮肤胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化护肤品的开发中的应用。

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