CN101434648A - 一种血管新生抑制肽及其在制备血管新生药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血管新生抑制肽(氨基酸序列为NNRGDFRW),以及该肽在治疗和/或预防血管新生相关疾病等领域的应用。本发明表明,PR8在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、人脐带静脉内皮细胞迁移实验、人脐带静脉内皮细胞侵袭实验、人脐带静脉内皮细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生和小鼠角膜实验上等均有明显的抑制作用,可用于制备抑制血管新生的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的抗血管新生蛋白多肽—PR8(氨基酸序列为NNRGDFRW),以及该肽在治疗和/或预防血管新生相关疾病等领域的应用。
背景技术
血管新生是指在原有血管的基础上产生新血管的过程,血管新生是一复杂的过程,主要包括内皮细胞增殖、迁移、侵袭、成管等几个关键步骤。
1971年,哈佛大学医学院Judah Folkman首次提出通过抑制血管新生来抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤在没有养分的供应下,只能长到2—3立方毫米。如果有新生的血管与其相连,肿瘤获得营养物质与氧气,便能以几何级数迅速生长;同时肿瘤细胞还可以通过新生的血管转移到其他器官,发生肿瘤转移,导致人体死亡,因此,肿瘤的生长与转移依赖于血管新生。
由于肿瘤种类繁多,而且肿瘤细胞生长快,易对药物产生耐药性。而血管的内皮细胞由于遗传稳定,突变概率相对小得多。理论上应用抗血管新生药物较难产生耐药性,而且抗血管新生药物具有广谱的抗肿瘤活性。
除了肿瘤之外,关节炎、银屑病、糖尿病性视网膜病变及老年黄斑病变等眼科疾病等都涉及血管新生。
G蛋白偶联受体124(G protein—coupled receptor—124),是人类G蛋白偶联受体超家族中的一员,含有长的氮—末端,又名肿瘤内皮标记(Tumorendothelial marker 5)。G蛋白偶联受体—124在人体第8号染色体的p12位,含1331个氨基酸。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种抗血管新生的蛋白多肽及其活性片段、衍生物和类似物。
本发明的另一个目的在于提供一种抗血管新生的蛋白多肽及其活性片段、衍生物和类似物在制备治疗与血管新生异常相关的疾病的药物中的用途。
本发第一个方面,提供抗血管新生的蛋白多肽,是人G蛋白偶联受体124(GPCR124)来源的含有8个氨基酸的肽片段,分子量为1064.8,命名为PR8,氨基酸序列为NNRGDFRW。
本发明还提供了上述抗血管新生的蛋白多肽的保守性。
本发明的第二个方面,提供编码这些多肽的多核苷酸片段,该多核苷酸包括一核苷酸,该核苷酸与选自下列一组核苷酸序列有至少70%同源性:(1)编码上述抗血管新生蛋白PR8的多核苷酸;(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸;
本发明的第三方面,本发明的蛋白多肽或其一部分可以治疗和/或治疗预防血管新生方面引起的疾病。
如本发明所用,“新的抗血管新生蛋白多肽”PR8是指抗血管新生蛋白多肽中基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。
本发明提供了一种新的多肽——抗血管新生多肽PR8。本发明的多肽可以是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌,酵母,高等植物,昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,也可以是非糖基化的。
本发明的多肽还可以包括或是不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括抗血管新生蛋白多肽PR8的片段、衍生物和类似物。如本发明所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的抗血管新生蛋白多肽PR8相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽片段、衍生物和类似物是指:(I)这样一种,其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代,而且取代的氨基酸可以是也可以不是有遗传密码子编码的;或者(II)这样一种,其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基;或是(III)这样一种,多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合;或者(IV)这样一种,其中附加的氨基酸融合进多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。通过本文的阐述,这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
“同源性”是指同一祖先来源的物种间生物进化距离的远近,主要反应在核苷酸或是氨基酸上。通常将序列排列起来,以获得最大限量的匹配,“同源性”本身具有本领域认识的意义并且可用公开的技术计算。该术语“同源性”为技术人员周知。测定同源性或形似性的方法以按规则编在计算机程序中,任选的、用于测量两个序列间的同源性或相似性的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包。
通过一种多肽进行说明,其所具有的氨基酸序列例如NNRGDFRW参考氨基酸序列至少具有70%的“同源性”是指:NNRGDFRW序列中,该多肽之氨基酸序列与参考序列除了含有多达2个氨基酸序列,至少70%相同的多肽,参考序列中多达25%的氨基酸序列可被删除或被另一氨基酸取代,或可将一些氨基酸序列插入多肽序列中。其中插入的氨基酸多达参考氨基酸之总氨基酸残基的25%,参考序列的这些突变可发生在参考序列的氨基或羧基末端位置,或在氨基末端之间的任意地方,它们或单独分散在参考序列的参加中,或在一个或多个附近的组存在于参考序列中。
本发明在于PR8在制备血管新生抑制药物中的应用,尤其是PR8在制备抑制癌症以及类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。
根据本发明可以将治疗有效量的PR8和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物,也可以添加其他与PR8没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型,包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂、脂质体等。
为实施本发明的方法,PR8可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入式贮存器给药。“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。
口服可用固体或液体状的剂量单位,如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。
末剂是将本发明化合物磨成适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度,然后与同样细度的医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要,也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。
胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化的物质填充到如明胶胶囊外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中,然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等,如聚乙二醇,碳酸钠,可改善胶囊摄取时的药效。
本发明的有益结果:
本发明公开了蛋白多肽PR8及其在制备抗血管新生药物中的应用。实验表明,PR8在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、人脐带静脉内皮细胞迁移实验、人脐带静脉内皮细胞侵袭实验、人脐带静脉内皮细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生和小鼠角膜实验上等均有明显的抑制作用,可能可用于制备抑制血管新生的药物。
附图说明
图1为PR8抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖;
图2为PR8抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移;
图3为PR8抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Boyden小室中的迁移;
图4为PR8抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管;
图5为PR8抑制鸡胚尿囊膜新生血管新生;
图6为抑制抑制VEGF诱导的角膜血管新生,(A)生理盐水对照;(B)仅有PR8;(C)只有VEGF;(D)160ng VEGF与PR8的小鼠角膜图,箭头所指为缓释颗粒位置,下图显示新生血管面积的定量分析结果.
图中均以p<0.05表示有显著差异,*,p<0.05,**,p<0.01,***,p<0.001。
具体实施方式
实施例1:PR8抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖
目的和原理:人脐静脉内皮细胞增殖实验采用MTS Assay。MTS Assay是一种运用比色法来间接测量活细胞数量的测定方法。CellTiter AQueous单溶液试剂包含一种四唑化合物(内盐;MTS)和一个电子耦合试剂(乙硫吩嗪,PES)。MTS可被有代谢活性细胞中脱氢酶作用生成可溶于组织培养基的颗粒,在490nm测量产物的吸光值与培养物中活细胞的数量直接成正比。
方法:向96孔板中加入人脐静脉内皮细胞,设立对照组和加样组。对照组加入溶剂,加样组加入不同浓度的PR8多肽,每个浓度做三个复孔。孵育48—72小时后,加入细胞增殖检测试剂,再孵育4个小时,用酶标仪在490nm处检测吸光值。
结果与评价:与实验对照组相比,人脐静脉内皮细胞增殖能力受到抑制,说明PR8可以抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。
实施例2:PR8抑制人脐静脉内皮细胞迁移
目的和原理:在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用下,人脐静脉内皮细胞可以向没有细胞的划痕区域迁移。通过观察迁入划痕区的内皮细胞量,来评价PR8是否有具有抑制人脐静脉内皮细胞迁移的能力。
方法:在6孔板中加入人脐静脉内皮细胞,大约长满时,用Tip头划一个十字形划痕,用PBS洗净划下的细胞,加入含不同药物浓度及4ng/mlVEGF165的培养基,于5%CO2培养箱中37℃培养至划线两侧的细胞迁移至划线区域中央。
结果评价:在OLYMPUS倒置显微镜下观察拍照统计,结果显示与对照组相比,加入PR8肽后,人脐静脉内皮细胞的迁移受到抑制,说明PR8肽可以抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。
实验实例3:PR8肽抑制人脐静脉内皮细胞Boyden小室迁移
目的和原理:Boyben小室,用于研究白细胞的趋化性,这种研究基于小室被微孔分离成两个部分。细胞置于上面的部分,下面的部分含有趋化因子,在趋化因子的诱导下,上层细胞可以穿过微孔膜迁移至膜的底部并贴附在膜的背面。细胞在生长因子的诱导下可以透过多聚碳酸盐滤膜,此实验可以检测药物对内皮细胞穿过微孔膜能力的影响。
方法:用明胶将小室包被,培养箱中37℃孵育20分钟,弃明胶,用PBS洗三遍。小室外六孔板中加入含有血清和VEGF的内皮细胞培养基。小室中接入细胞,在培养箱中孵育四小时后,将所有培养液吸去,将小室在多聚甲醛中固定,用PBS洗三遍,苏木精伊红染色,用PBS将多余染料洗去,晾干,OLYMPUS显微镜下拍照计数统计数据。
结果与评价:与对照组相比,给予PR8后,人脐静脉内皮细胞穿过Boyden小室的能力受到抑制,说明PR8可以抑制内皮细胞穿过微孔膜的能力。
实验实例4:PR8抑制人脐静脉内皮细胞成管
目的和原理:Matrigel是从小鼠肉瘤中抽提得到的可容性基底膜抽提物,富含细胞外基质蛋白,人脐静脉内皮细胞可以在Matrigel上贴附成管,可以利用人脐静脉内皮细胞在Mtrigel上的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的影响。
方法:将Matrigel铺到48孔板上,于37℃,5%CO2培养箱放置30min待其凝固。每孔加入内皮细胞,再加入含有不同浓度PR8肽的培养基,混匀。于37℃ 5%培养箱中培养16-18h后在显微镜下观察微管形成情况。每孔选择不同部位,计算微管形成数量并进行统计学分析。
结果与评价:内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后,单个细胞在Matrigel上延伸,形成三维网状结构。结果显示与对照组相比,给予PR8之后,内皮成管过程受到影响,三维网络结构受到破坏,说明PR8可以抑制人微血管内皮细胞微管形成。
实施例5:PR8抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成
目的和原理:鸡胚尿囊膜模型目前是较为理想的国内外筛选血管新生类药物公认的筛选模型。经含药物载体置于受精鸡胚尿囊膜表面的无血管区,可观察到药物对新的微血管生成的影响。
方法:将受精的鸡胚置于孵化箱中孵化5天,在超净工作台中,用酒精擦拭表面,在鸡胚卵壳钝端用镊子开一个小口,通过开出的小孔观察胚胎所在的位置,在血管稀疏的地方撕开气室膜。将含不同量的PR8加到高压灭菌的滤纸片上,将滤纸片加在尿囊膜上无血管区,用灭菌透明胶带封口,放入孵育箱中继续孵育。
结果与评价:放入滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天后,揭去透明胶带,在OLYMPUS体视显微镜下拍照,计算滤纸周围6毫米环形范围内新生微血管数量,统计,结果显示与对照组比较,加PR8之后,新的微血管生成受到抑制,说明PR8可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新生。
实验实例6 PR8抑制小鼠角膜新生血管
目的与原理:小鼠角膜是一个无血管区域,在小鼠角膜上做一个小袋,植入含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒,可以诱导存在于角巩缘处的血管向含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒的小袋生长。在缓释颗粒上同时加入PR8肽,观察这些诱导的血管面积是否有改变。
方法:将C57/BL6小鼠麻醉,用胶带固定小鼠,在小鼠角膜上开一个小口,然后植入含有生理盐水、血管内皮细胞生长因子、PR8和血管内皮细胞生长因子+PR8的颗粒,实验后复苏,继续饲养一周,然后观察结果。
结果与评价:PR8可以抑制由血管内皮细胞生长因子缓释颗粒诱导的新生血管。
Claims (8)
1.一种血管新生抑制肽,其特征在于含有8个氨基酸,序列为NNRGDFRW,分子量为1064.8。
2.根据权利要求1所述的血管新生抑制肽在制备抑制肿瘤、关节炎病变组织、新生血管性眼病、血管瘤病变组织、银屑病病变组织、实体瘤病变组织、Kaposi’s肉瘤病变组织、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症、Paget’s疾病的血管新生药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的血管新生抑制肽的应用,其特征在于关节炎病变组织是类风湿性关节炎或者炎性关节炎。
4.根据权利要求2所述的血管新生抑制肽的应用,其特征在于新生血管性眼病为新生血管性角膜疾病、新生血管性视网膜疾病、血管新生性虹膜疾病、新生血管性青光眼、新生血管性脉络膜疾病、湿性老年黄斑病变、血管生成型白内障、新生血管性玻璃体眼病、新生血管性视神经疾病。
5.根据权利要求2所述的血管新生抑制肽的应用,其特征在于新生血管性视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或者视网膜动脉闭塞。
6.根据权利要求2所述的血管新生抑制肽的应用,其特征在于新生血管性脉络膜疾病为新生血管性结膜眼病。
7.根据权利要求2所述的血管新生抑制肽的应用,其特征在于血管瘤病变组织为多发性血管瘤、血管母细胞瘤或者良性血管增生疾病。
8.根据权利要求1所述的血管新生抑制肽在制备血管新生抑制剂组合物上的应用。
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