CN1570100A

CN1570100A - 一种类神经内分泌特异性蛋白，其编码序列，制法和应用

Info

Publication number: CN1570100A
Application number: CNA031416136A
Authority: CN
Inventors: 蔡勇平; 余龙; 唐丽莎
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2005-01-26

Abstract

本发明涉及基因工程领域。本发明提供了人RTN3L的cDNA序列。本发明还提供了由该核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和多肽的应用。本发明的RTN3L涉及神经细胞的生长发育，与神经细胞足突生长尤其相关。将RTN3L制成药剂或试剂盒，可用于促进神经细胞生长，辅助治疗神经损伤及其他由于RTN3L表达异常导致的疾病。

Description

一种类神经内分泌特异性蛋白，其编码序列，制法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人RTN3L的cDNA序列和由该核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和多肽的应用。

背景技术

RTN(Reticulon)是一个多功能的基因家族。该家族中基因所编码的蛋白主要定位于内质网。迄今为止，已发现的RTN基因家族有四大成员，即RTN1，RTN2，RTN3和RTN4。它们分布于不同的染色体。

RTN家族的第一个成员RTN1，过去又称为NSP(Neuroendocrine-SpecificProtein，神经内分泌特异性蛋白)，最早由Roebroek et al(1993)克隆成功(J BiolChem 1993 Jun 25；268(18)：13439-47)。Van de Velde et al于1994年将NSP基因组序列及cDNA序列与核酸序列数据库比较，发现了RTN家族中三个新成员(J Cell Sci.1994 Sep；107(Pt 9)：2403-16.)。为了突出说明这些基因同NSP基因的关系，当时这些基因被称为类NSP基因I，II，III。后来，考虑到它们都与内质网相关，因而将这些基因重命名为RTN家族。NSP基因即RTN1，类NSP基因I、II、III分别命名为RTN2、RTN3、RTN4。

对RTN家族成员功能的研究已有一定进展。RTN家族蛋白能够通过Bcl-XL和Bcl-2这些抗凋亡蛋白结合并且以改变它们在ER上的定位的方式调整它们活性以调整细胞的凋亡(Oncogene.2000 Nov 23；19(50)：5736-46.)。RTN1/NSP异构体可作为区别小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(non-SCLC)的独立标志物。NSPA在SCLC肿瘤细胞中存在，而non-SCLC肿瘤中不存在。通过以NSP异构体为标志物，还可区别一般non-SCLC肿瘤和有神经内分泌分化的non-SCLC。NOGO基因突变而高表达影响到神经系统的发育并且可由此而造成精神分裂症(Schizophrenia)(Brain Res Mol Brain Res.2002 Nov15；107(2)：183-9.)。无论在散发性的还是在家族性的肌萎缩性(脊髓)侧索硬化病例中，NOGO的表达都发生了改变。这些也同时说明NOGO在这种疾病中有着非常重要的作用(Neurobiol Dis.2002 Aug；10(3)：358-65)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码人RTN家族的成员RTN3的一个异构体，本发明的RTN3的异构体被命名为人RTN3L。

本发明的另一个目的是提供一种新的人的RTN家族成员，该蛋白被命名为人RTN3L蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的RTN3L多肽的方法。

本发明还提供了这种人的RTN3核酸序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人RTN3L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQID NO：1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO：2所示的序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的人RTN3L蛋白多肽，它包括：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人RTN3L蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有人RTN3L蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人RTN3L蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人RTN3L蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人RTN3L蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人RTN3L蛋白活性的多肽。

在本发明的分离出的人RTN3L多核苷酸全长为4936个核苷酸，其详细序列见SEQ IDNO：1，其中开放读框位于155-3253位核苷酸。编码的人RTN3L蛋白全长为1032个氨基酸，序列见SEQ ID NO：2。

在本发明中，“分离的”或“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人RTN3L蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人RTN3L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中155-3253位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列的编码框155-3253位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中155-3253位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO：2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQID NO：1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ IDNO：1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人RTN3L相同功能的蛋白的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。

在本发明中，术语“人RTN3L蛋白多肽”指具有人RTN3L蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与人RTN3L相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人RTN3L蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RTN3L DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人RTN3L多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人RTN3L多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人RTN3L多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人RTN3L多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人RTN3L蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人RTN3L多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括人RTN3L多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人RTN3L的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人RTN3L多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人RTN3L的核酸分子。

本发明还包括检测人RTN3L核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人RTN3L多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

在知晓了某基因与某疾病的相关性，本领域有许多现有的检测技术可供使用，不同点仅在于所用的引物和/或探针具有衍生自RTN3L的核苷酸序列，或者所用的抗体是对RTN3L蛋白特异性的抗体。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人RTN3L DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人RTN3L基因产物或片段。较佳地，指那些能与人RTN3L基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人RTN3L蛋白的分子，也包括那些并不影响人RTN3L蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人RTN3L基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人RTN3L基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人RTN3L或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人RTN3L功能的抗体以及不影响人RTN3L功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人RTN3L基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人RTN3L基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人RTN3L核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，PergamonPress，New York(1988)。

一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RTN3L发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人RTN3L蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人RTN3L蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人RTN3L蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医帅技能范围之内的。

在本发明中，人RTN3L的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人体脑组织的cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用五对寡核苷酸为引物--A1：5’-GCTCGGCTGAGTCAGTCAGT CTG-3’；A2：5’-CACTGAGAAA TAAAGAGGCA GGA-3’；A3：5’-GACCTGATAGCAGCCTTTAC AGA-3’；A4：5’-GTCTATGAGA AGTACAAGAC CCA-3’；A5：5’-GCT GTGCACTGCTGTAAACTTGT-3’；为正向引物，寡核苷酸B1：5’-GT ATTTCGTTAG TAAAGTTATG C-3’；B2：5’-GTC TGTCATCTTC TCTGATATTG-3’；B3：5’-TGG ATCTTTTCAA CAATTGACTT-3’；B4：5’-CCAATC GGAGATTTGA ATCTCGG-3’；B5：5’-GTGTTT TTAGATCTTT TATTAGC-3’；为反向引物，进行PCR，有效扩增片段分别约为一千二百、一千二百、一千一百、一千一百、八百个碱基。然后将上述片段连接，测序并拼接，获得全长cDNA序列，共4936bp，详细序列见SEQ ID NO：1，其中开放读框位于155-3253位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出人RTN3L的氨基酸序列，共1032个氨基酸残基。

根据同源检索发现，人RTN3L与RTN家族成员在核苷酸和氨基酸水平上都有较高同源性(见附图3)。RTN是一个多基因家族，所编码的蛋白主要定位于内质网。RTN家族成员编码的蛋白最早因为具有神经内分泌特异性而被命名为NSP(Neuroendocrine-Specific Protein)。后来，考虑到它们都与内质网相关，因而将这些基因重命名为RTN家族。本发明的RTN3L与且RTN3L具有RTN家族共有的结构功能域，且在脑以外的其他组织中几乎没有表达，这说明它与神经细胞的生长发育有关，又由于其与内质网的关系，认为RTN3L在神经细胞足突生长有关。将RTN3L制成药剂或试剂盒，可用于促进神经细胞生长，辅助治疗神经损伤及其他由于RTN3L表达异常导致的疾病。

此外，由于本发明的人RTN3L具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

附图说明

图1为人RTN3L与人RTN3A核苷酸序列同源比较图。

图2为人RTN3L与人RTN3A氨基酸序列同源比较图。

图3为人RTN3L与RTN1、RTN2、RTN3、NSP蛋白的氨基酸序列的同源比较。

图4为RNT3在16种组织中的表达情况。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施方式

实施例1

人RTN3L的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人体脑组织的cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用五对寡核苷酸为引物--A1：5’-GCTCGGCTGA GTCAGTCAGT CTG-3’；A2：5’-CACTGAGAAA TAAAGAGGCA GGA-3’；A3：5’-GACCTGATAG CAGCCTTTAC AGA-3’；A4：5’-GTCTATGAGA AGTACAAGAC CCA-3’；A5：5’-GCT GTGCACTGCT GTAAACTTGT-3’；为正向引物，寡核苷酸B1：5’-GT ATTTCGTTAGTAAAGTTATG C-3’；B2：5’-GTC TGTCATCTTC TCTGATATTG-3’；B3：5’-TGG ATCTTTTCAACAATTGACTT-3’；B4：5’-GCAATC GGAGATTTGA ATCTCGG-3’；B5：5’-GTGTTT TTAGATCTTTTATTAGC-3’；为反向引物，进行PCR，有效扩增片段分别约为一千二百、一千二百、一千一百、一千一百、八百个碱基。

2.PCR产物的测序

将上述PCR扩增产物与pGEM-T^载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprepPlasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTM DNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序并拼接，获得全长cDNA序列，共4936bp，详细序列见SEQ ID NO：1，其中开放读框位于155-3253位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出人RTN3L的氨基酸序列，共1032个氨基酸残基。

实施例2

同源比较

用本发明的人RTN3L的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，本发明的RTN3L与人RTN3A(NM_006054)在核苷酸和氨基酸水平上都有较高同源性(见附图1与幅图2)。此外，RTN3L蛋白还含有reticulon特征性结构域，本发明的RTN3L中相对应的序列为844-1032位氨基酸VHDLIFWRDVKKTGFVFGTTLIMLLSLAAFSVISVVSYLILALLSVTISFRIYKSVIQAVQKSEEGHPFKAYLDVDITLSSEAFHNYMNAAMVHINRALKLIIRLFLVEDLVDSLKLAVFMWLMTYVGAVFNGITLLILAELLIFSVPIVYEKYKTQIDHYVGIARDQTKSIVEKIQAKLPGIAKKKAE。该结构域为RTN家族成员C-末端共有，由两个大的疏水区域及其间的一个亲水区域组成，该结构域在RTN蛋白与内质网的作用之间扮演着重要的角色。疏水区被认为处于膜内，亲水区则处于膜外侧。

RTN是一个多基因家族，所编码的蛋白主要定位于内质网。RTN家族成员编码的蛋白最早因为具有神经内分泌特异性而被命名为NSP(Neuroendocrine-SpecificProtein)。后来，考虑到它们都与内质网相关，因而将这些基因重命名为RTN家族。本发明的RTN3L与且RTN3L具有RTN家族共有的结构功能域，且在脑以外的其他组织中几乎没有表达，这说明它与神经细胞的生长发育有关，又由于其与内质网的关系，认为RTN3L在神经细胞足突生长有关。将RTN3L制成药剂或试剂盒，可用于促进神经细胞生长，辅助治疗神经损伤及其他由于RTN3L表达异常导致的疾病。

本发明的人RTN3L除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人RTN3L还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人RTN3L的N端与鼠的RTN3L的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

本发明的人RTN3L还可用于筛选抑制本发明蛋白活性的拮抗剂、或增强本发明蛋白活性的激动剂等。

针对本发明人RTN3L的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

此外，本发明人RTN3L核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人RTN3L的表达水平或者抑制人RTN3L的过度表达。本发明的人RTN3L蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人RTN3L缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

人RTN3在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以实施例1中拼接产物为模板，将编码人RTN3L的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人RTN3L cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-TCGCGGATCCATGGCG GAGCCGTCGG CGG-3’，

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人RTN3L编码序列的19个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-CATGGTCGACC TTCTGCCTTT TTTTTGGCG-3’

该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人RTN3L的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-30(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用BamHI和SalI消化pQE-30载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-30载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M1S/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人RTN3L的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人RTN3L。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人RTN3L。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO：2的序列一致。

实施例4

人RTN3L在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，以实施例1中拼接后产物为模板，将编码人RTN3L的cDNA序列用对应于该DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人RTN3L cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-TCGCggatccATGGCG GAGCCGTCGG CGG-3’

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人RTN3L编码序列的部分核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-CATGGATATC TTCTGCCTTT TTTTTGGCG-3’

该引物含有EcoR V限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人RTN3L的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用EcoR V和BamHI消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人RTN3L的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris.HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris.HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris.HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人RTN3L基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

实施例6：RTN3L在正常人组织中的表达谱分析

多种组织Northern(MTNTM)印迹膜(16种组织)购自Clontech公司，以引物A1(5’-GAC TCTTCAGTTT CTCTTGCAGC)和B2(5’-GT ATTTCGTTAG TAAAGTTATG C-3’)从人骨骼肌cDNA文库(Clontech)中扩增得到655bp的片段，以此片段为探针，用α-³²P-dATP(DuPont公司)对其进行随机引物标记，条件为37℃1小时，具体操作见MegaprimeDNA标记系统说明书(Amersham)。Northern杂交按用户手册操作。主要步骤如下：(1)配制MTN杂交液(终浓度如下：5XSSPE，10Xdenhardt’s，100μg/mlCTDNA，50％甲酰胺，2％SDS)，68℃预热杂交液，彻底溶解沉淀物。(2)烫膜，倒入少许烧开的0.05％SDS溶液于膜上，震荡、冷却后测信号(3)将尼龙膜放在杂交管中，加入预杂交液，42℃预杂交12小时(4)变性后探针加入杂交管中，42℃杂交24小时(5)洗膜，42℃，用2XSSC，0.05％SDS溶液洗两次，每次20分钟(6)用X光片进行放射自显影。

16种组织(心脏、脑、胰腺、胸腺、前列腺、胎盘、卵巢、睾丸、小肠、大肠、外周血白细胞、胎盘、肺、骨骼肌、肾、肝等)的Northern杂交结果显示：RTN3-L长度约为6kb左右，在脑组织中高表达，同时在肌肉组织中仅有少量表达，其它组织没有表达。这亦提示此蛋白与神经细胞的活动有着密切的关系。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<210>1

<211>4936

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(155)..(3253)

<223>

<400>1

gctcggctga gtcagtcagt ctgtcggagt ctgtcctcgg agcaggcgga gtaaagggac 60

ttgagcgagc cagttgccgg attattctat ttcccctccc tctctcccgc cccgtatctc 120

ttttcaccct tctcccaccc tcgctcgcgt agcc atg gcg gag ccg tcg gcg gcc 175

Met Ala Glu Pro Ser Ala Ala

1 5

act cag tcc cat tcc atc tcc tcg tcg tcc ttc gga gcc gag ccg tcc 223

Thr Gln Ser His Ser Ile Ser Ser Ser Ser Phe Gly Ala Glu Pro Ser

10 15 20

gcg ccc ggc ggc ggc ggg agc cca gga gcc tgc ccc gcc ctg ggg acg 271

Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ala Cys Pro Ala Leu Gly Thr

25 30 35

aag agc tgc agc tcc tcc tgt gcg gat tcc ttt gtt tct tcc tct tcc 319

Lys Ser Cys Ser Ser Ser Cys Ala Asp Ser Phe Val Ser Ser Ser Ser

40 45 50 55

tct cag cct gta tct cta ttt tcg acc tca caa gag gga ttg agc tct 367

Ser Gln Pro Val Ser Leu Phe Ser Thr Ser Gln Glu Gly Leu Ser Ser

60 65 70

ctt tgc tct gat gag cca tct tca gaa att atg act tct tcc ttt ctt 415

Leu Cys Ser Asp Glu Pro Ser Ser Glu Ile Met Thr Ser Ser Phe Leu

75 80 85

tca tct tct gaa ata cat aac act ggc ctt aca ata cta cat gga gaa 463

Ser Ser Ser Glu Ile His Asn Thr Gly Leu Thr Ile Leu His Gly Glu

90 95 100

aaa agc cat gtg tta ggg agc cag cct att tta gcc aaa gaa gga aaa 511

Lys Ser His Val Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Ala Lys Glu Gly Lys

105 110 115

gac cac ttg gat ctt cta gat atg aaa aag atg gaa aag cct cag ggg 559

Asp His Leu Asp Leu Leu Asp Met Lys Lys Met Glu Lys Pro Gln Gly

120 125 130 135

acc agc aac aac gta tca gac tct tca gtt tct ctt gca gca gga gtt 607

Thr Ser Asn Asn Val Ser Asp Ser Ser Val Ser Leu Ala Ala Gly Val

140 145 150

cat tgt gac cgt cct tct att cca gcc agt ttc cca gag cat cct gct 655

His Cys Asp Arg Pro Ser Ile Pro Ala Ser Phe Pro Glu His Pro Ala

155 160 165

ttt ctc tca aag aaa att ggt caa gtg gaa gag caa ata gat aaa gag 703

Phe Leu Ser Lys Lys Ile Gly Gln Val Glu Glu Gln Ile Asp Lys Glu

170 175 180

acc aag aac cca aat ggg gta tca agt agg gag gct aaa act gca ttg 751

Thr Lys Asn Pro Asn Gly Val Ser Ser Arg Glu Ala Lys Thr Ala Leu

185 190 195

gat gct gat gac aga ttc act ttg ctg aca gcc cag aaa cca cct act 799

Asp Ala Asp Asp Arg Phe Thr Leu Leu Thr Ala Gln Lys Pro Pro Thr

200 205 210 215

gag tac tct aag gta gaa ggc att tat aca tat tct ttg tct cca tcc 847

Glu Tyr Ser Lys Val Glu Gly Ile Tyr Thr Tyr Ser Leu Ser Pro Ser

220 225 230

aaa gtt tca gga gat gat gtt att gaa aag gat tcc cct gaa tca cca 895

Lys Val Ser Gly Asp Asp Val Ile Glu Lys Asp Ser Pro Glu Ser Pro

235 240 245

ttt gaa gta att att gac aaa gca gca ttt gac aaa gaa ttt aaa gac 943

Phe Glu Val Ile Ile Asp Lys Ala Ala Phe Asp Lys Glu Phe Lys Asp

250 255 260

tca tat aag gag agc aca gat gat ttt ggt agc tgg tct gtg cac act 991

Ser Tyr Lys Glu Ser Thr Asp Asp Phe Gly Ser Trp Ser Val His Thr

265 270 275

gat aaa gaa tca tcc gaa gac att tca gag act aat gac aag ctt ttt 1039

Asp Lys Glu Ser Ser Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asn Asp Lys Leu Phe

280 285 290 295

cca ctg aga aat aaa gag gca gga cgt tac cca atg tct gca ttg ctc 1087

Pro Leu Arg Asn Lys Glu Ala Gly Arg Tyr Pro Met Ser Ala Leu Leu

300 305 310

agt agg cag ttt tca cac aca aat gca gca ctg gaa gag gtg tcc aga 1135

Ser Arg Gln Phe Ser His Thr Asn Ala Ala Leu Glu Glu Val Ser Arg

315 320 325

tgc gtg aat gat atg cat aac ttt act aac gaa ata ctg act tgg gat 1183

Cys Val Asn Asp Met His Asn Phe Thr Asn Glu Ile Leu Thr Trp Asp

330 335 340

ctg gtt ccc caa gtg aaa caa cag acc gat aaa tct tct gac tgc atc 1231

Leu Val Pro Gln Val Lys Gln Gln Thr Asp Lys Ser Ser Asp Cys Ile

345 350 355

aca aaa act aca gga ctt gac atg agt gaa tat aat tca gaa att cca 1279

Thr Lys Thr Thr Gly Leu Asp Met Ser Glu Tyr Asn Ser Glu Ile Pro

360 365 370 375

gtt gta aat ctt aaa act agc act cat cag aaa act cct gta tgt tct 1327

Val Val Asn Leu Lys Thr Ser Thr His Gln Lys Thr Pro Val Cys Ser

380 385 390

att gat ggg agc act ccc atc act aaa tca aca ggt gat tgg gca gaa 1375

Ile Asp Gly Ser Thr Pro Ile Thr Lys Ser Thr Gly Asp Trp Ala Glu

395 400 405

gca tct ctc cag caa gaa aat gct att act gga aaa cct gta cct gac 1423

Ala Ser Leu Gln Gln Glu Asn Ala Ile Thr Gly Lys Pro Val Pro Asp

410 415 420

tct ttg aat tcc aca aaa gaa ttc agt atc aaa ggt gtg caa ggc aat 1471

Ser Leu Asn Ser Thr Lys Glu Phe Ser Ile Lys Gly Val Gln Gly Asn

425 430 435

atg cag aaa cag gat gac aca ctt gca gaa tta cct gga tct cca cct 1519

Met Gln Lys Gln Asp Asp Thr Leu Ala Glu Leu Pro Gly Ser Pro Pro

440 445 450 455

gag aaa tgt gac tct ttg ggt tct gga gtg gcc aca gtg aaa gtg gct 1567

Glu Lys Cys Asp Ser Leu Gly Ser Gly Val Ala Thr Val Lys Val Ala

460 465 470

tta cct gat gac cac ctg aaa gat gaa atg gac tgg cag agc tct gca 1615

Leu Pro Asp Asp His Leu Lys Asp Glu Met Asp Trp Gln Ser Ser Ala

475 480 485

ttg gga gaa atc aca gaa gct gat agt tct ggt gag tct gat gac aca 1663

Leu Gly Glu Ile Thr Glu Ala Asp Ser Ser Gly Glu Ser Asp Asp Thr

490 495 500

gta ata gag gac atc aca gca gat aca tca ttt gaa aat aac aaa att 1711

Val Ile Glu Asp Ile Thr Ala Asp Thr Ser Phe Glu Asn Asn Lys Ile

505 510 515

cag gct gaa aaa cct gtt tcc att cca agt gct gtt gta aaa aca ggt 1759

Gln Ala Glu Lys Pro Val Ser Ile Pro Ser Ala Val Val Lys Thr Gly

520 525 530 535

gaa aga gaa atc aaa gag att ccc agt tgt gag aga gaa gaa aaa aca 1807

Glu Arg Glu Ile Lys Glu Ile Pro Ser Cys Glu Arg Glu Glu Lys Thr

540 545 550

tct aaa aac ttt gaa gaa ttg gtc agt gac tct gag ctg cat caa gat 1855

Ser Lys Asn Phe Glu Glu Leu Val Ser Asp Ser Glu Leu His Gln Asp

555 560 565

cag cct gat att ctt gga agg agt cca gct agt gag gca gca tgt tca 1903

Gln Pro Asp Ile Leu Gly Arg Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ala Cys Ser

570 575 580

aaa gta ccc gat acg aat gtc tcc tta gaa gat gtg agt gaa gtt gct 1951

Lys Val Pro Asp Thr Asn Val Ser Leu Glu Asp Val Ser Glu Val Ala

585 590 595

cct gaa aag cct att act act gag aac ccc aaa ctt cct rca aca gtg 1999

Pro Glu Lys Pro Ile Thr Thr Glu Asn Pro Lys Leu Pro Ser Thr Val

600 605 610 615

tct cca aat gtt ttt aat gag aca gaa ttc tca tta aat gtg aca aca 2047

Ser Pro Asn Val Phe Asn Glu Thr Glu Phe Ser Leu Asn Val Thr Thr

620 625 630

tct gcc tat ttg gag tca tta cat ggg aaa aat gtt aaa cat ata gat 2095

Ser Ala Tyr Leu Glu Ser Leu His Gly Lys Asn Val Lys His Ile Asp

635 640 645

gat tcc tcc cca gag gac ctg ara gca gcc ttt aca gaa acc aga gat 2143

Asp Ser Ser Pro Glu Asp Leu Ile Ala Ala Phe Thr Glu Thr Arg Asp

650 655 660

aaa gga ata gta gat agt gaa aga aat gct ttt aaa gca ata tca gag 2191

Lys Gly Ile Val Asp Ser Glu Arg Asn Ala Phe Lys Ala Ile Ser Glu

665 670 675

aag atg aca gac ttt aaa aca act cct cct gta gaa gtc tta cat gaa 2239

Lys Met Thr Asp Phe Lys Thr Thr Pro Pro Val Glu Val Leu His Glu

680 685 690 695

aat gag tcc ggt ggt tct gaa att aaa gac att gga agc aaa tac agt 2287

Asn Glu Ser Gly Gly Ser Glu Ile Lys Asp Ile Gly Ser Lys Tyr Ser

700 705 710

gaa caa agc aaa gaa aca aat gga agt gag cct cta ggt gtt ttc cct 2335

Glu Gln Ser Lys Glu Thr Asn Gly Ser Glu Pro Leu Gly Val Phe Pro

715 720 725

acc caa ggt act cca gta gca tct ctt gac tta gaa caa gaa cag ctc 2383

Thr Gln Gly Thr Pro Val Ala Ser Leu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Leu

730 735 740

aca att aag gct ctt aaa gaa tta ggt gaa aga cag gtt gag aag tca 2431

Thr Ile Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Arg Gln Val Glu Lys Ser

745 750 755

act tct gca cag cgt gac gca gaa ttg cct tct gaa gaa gta ctg aag 2479

Thr Ser Ala Gln Arg Asp Ala Glu Leu Pro Ser Glu Glu Val Leu Lys

760 765 770 775

caa act ttc aca ttt gct cca gaa tct tgg cca cag aga tca tat gac 2527

Gln Thr Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ser Trp Pro Gln Arg Ser Tyr Asp

780 785 790

atc cta gaa cgt aat gtc aag aat gga tct gat ctt ggg att tcc cag 2575

Ile Leu Glu Arg Asn Val Lys Asn Gly Ser Asp Leu Gly Ile Ser Gln

795 800 805

aag ccc atc act atc aga gaa act act agg gta gat gct gtt tcc agc 2623

Lys Pro Ile Thr Ile Arg Glu Thr Thr Arg Val Asp Ala Val Ser Ser

810 815 820

ctt agc aag act gaa ttg gta aaa aag cat gtc cta gca aga ctt ctg 2671

Leu Ser Lys Thr Glu Leu Val Lys Lys His Val Leu Ala Arg Leu Leu

825 830 835

aca gac ttc tca gtg cac gat ctg att ttc tgg aga gat gtg aag aag 2719

Thr Asp Phe Ser Val His Asp Leu Ile Phe Trp Arg Asp Val Lys Lys

840 845 850 855

act ggg ttt gtc ttt ggc acc acg ctg atc atg ctg ctt tcc ctg gca 2767

Thr Gly Phe Val Phe Gly Thr Thr Leu Ile Met Leu Leu Ser Leu Ala

860 865 870

gct ttc agt gtc atc agt gtg gtt tct tac ctc atc ctg gct ctt ctc 2815

Ala Phe Ser Val Ile Ser Val Val Ser Tyr Leu Ile Leu Ala Leu Leu

875 880 885

tct gtc acc atc agc ttc agg atc tac aag tcc gtc atc caa gct gta 2863

Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Ser Val Ile Gln Ala Val

890 895 900

cag aag tca gaa gaa ggc cat cca ttc aaa gcc tac ctg gac gta gac 2911

Gln Lys Ser Glu Glu Gly His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Asp Val Asp

905 910 915

att act ctg tcc tca gaa gct ttc cat aat tac atg aat gct gcc atg 2959

Ile Thr Leu Ser Ser Glu Ala Phe His Asn Tyr Met Asn Ala Ala Met

920 925 930 935

gtg cac atc aac agg gcc ctg aaa ctc att att cgt ctc ttt ctg gta 3007

Val His Ile Asn Arg Ala Leu Lys Leu Ile Ile Arg Leu Phe Leu Val

940 945 950

gaa gat ctg gtt gac tcc ttg aag ctg gct gtc ttc atg tgg ctg atg 3055

Glu Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Leu Ala Val Phe Met Trp Leu Met

955 960 965

acc tat gtt ggt gct gtt ttt aac gga atc acc ctt cta att ctt gct 3103

Thr Tyr Val Gly Ala Val Phe Asn Gly Ile Thr Leu Leu Ile Leu Ala

970 975 980

gaa ctg ctc att ttc agt gtc ccg att gtc tat gag aag tac aag acc 3151

Glu Leu Leu Ile Phe Ser Val Pro Ile Val Tyr Glu Lys Tyr Lys Thr

985 990 995

cag att gat cac tat gtt ggc atc gcc cga gat cag acc aag tca 3196

Gln Ile Asp His Tyr Val Gly Ile Ala Arg Asp Gln Thr Lys Ser

1000 1005 1010

att gtt gaa aag atc caa gca aaa ctc cct gga atc gcc aaa aaa 3241

Ile Val Glu Lys Ile Gln Ala Lys Leu Pro Gly Ile Ala Lys Lys

1015 1020 1025

aag gca gaa taa gtacatggaa accagaaatg caacagttac taaaacacca 3293

Lys Ala Glu

1030

tttaatagtt ataacgtcgt tacttgtact atgaaggaaa atactcagtg tcagcttgag 3353

cctgcattcc aagctttttt tttaatttgg tgttttctcc catcctttcc ctttaaccct 3413

cagtatcaag cacaaaaatt gatggactga taaaagaact atcttagaac tcagaagaag 3473

aaagaatcaa attcatagga taagtcaata ccttaatggt ggtagagcct ttacctgtag 3533

cttgaaaggg gaaagattgg aggtaagaga gaaaatgaaa gaacacctct gggtccttct 3593

gtccagtttt cagcactagt cttactcagc tatccattat agttttgccc ttaagaagtc 3653

atgattaact tatgaaaaaa ttatttgggg acaggagtgt gataccttcc ttggtttttt 3713

tttgcagccc tcaaatccta tcttcctgcc ccacaatgtg agcagctacc cctgatactc 3773

cttttcttta atgatttaac tatcaacttg ataaataact tataggtgat agtgataatt 3833

cctgattcca agaatgccat ctgataaaaa agaatagaaa tggaaagtgg gactgagagg 3893

gagtcagcag gcatgctgcg gtggcggtca ctccctctgc cactatcccc agggaaggaa 3953

aggctccgcc atttgggaaa gtggtttcta cgtcactgga caccggttct gagcattagt 4013

ttgagaactc gttcccgaat gtgctttcct ccctctcccc tgcccacctc aagtttaata 4073

aataaggttg tacttttctt actataaaat aaatgtctgt aactgctgtg cactgctgta 4133

aacttgttag agaaaaaaat aacctgcatg tgggctcctc agttattgag tttttgtgat 4193

cctatctcag tctggggggg aacattctca agaggtgaaa tacagaaagc ctttttttct 4253

tgatcttttc ccgagattca aatctccgat tcccatttgg gggcaagttt ttttcttcac 4313

cttcaatatg agaattcagc gaacttgaaa gaaaaatcat ctgtgagttc cttcaggttc 41032

tcactcatag tcatgatcct tcagagggaa tatgcactgg cgagtttaaa gtaagggcta 4433

tgatatttga tggtcccaaa gtacggcagc tgcaaaaagt agtggaagga aattgtctac 4493

gtgtcttgga aaaattagtt aggaatttgg atgggtaaaa ggtacccttg ccttactcca 4553

tcttattttc ttagccccct ttgagtgttt taactggttt catgtcctag taggaagtgc 4613

attctccatc ctcatcctct gccctcccag gaagtcagtg attgtctttt tgggcttccc 4673

ctccaaagga ccttctgcag tggaagtgcc acatccagtt cttttctttt gttgctgctg 4733

tgtttagata attgaagaga tctttgtgcc acacaggatt tttttttttt ttaagaaaaa 4793

cctatagatg aaaaattact aatgaaactg tgtgtacgtg tctgtgcgtg caacataaaa 4853

atacagtagc acctaaggag cttgaatctt ggttcctgta aaatttcaaa ttgatgtggt 4913

attaataaaa aaaaaaaaaa cac 4936

<210>2

<211>1032

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Met Ala Glu Pro Ser Ala Ala Thr Gln Ser His Ser Ile Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Phe Gly Ala Glu Pro Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly

20 25 30

Ala Cys Pro Ala Leu Gly Thr Lys Ser Cys Ser Ser Ser Cys Ala Asp

35 40 45

Ser Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gln Pro Val Ser Leu Phe Ser Thr

50 55 60

Ser Gln Glu Gly Leu Ser Ser Leu Cys Ser Asp Glu Pro Ser Ser Glu

65 70 75 80

Ile Met Thr Ser Ser Phe Leu Ser Ser Ser Glu Ile His Asn Thr Gly

85 90 95

Leu Thr Ile Leu His Gly Glu Lys Ser His Val Leu Gly Ser Gln Pro

100 105 110

Ile Leu Ala Lys Glu Gly Lys Asp His Leu Asp Leu Leu Asp Met Lys

115 120 125

Lys Met Glu Lys Pro Gln Gly Thr Ser Asn Asn Val Ser Asp Ser Ser

130 135 140

Val Ser Leu Ala Ala Gly Val His Cys Asp Arg Pro Ser Ile Pro Ala

145 150 155 160

Ser Phe Pro Glu His Pro Ala Phe Leu Ser Lys Lys Ile Gly Gln Val

165 170 175

Glu Glu Gln Ile Asp Lys Glu Thr Lys Asn Pro Asn Gly Val Ser Ser

180 185 190

Arg Glu Ala Lys Thr Ala Leu Asp Ala Asp Asp Arg Phe Thr Leu Leu

195 200 205

Thr Ala Gln Lys Pro Pro Thr Glu Tyr Ser Lys Val Glu Gly Ile Tyr

210 215 220

Thr Tyr Ser Leu Ser Pro Ser Lys Val Ser Gly Asp Asp Val Ile Glu

225 230 235 240

Lys Asp Ser Pro Glu Ser Pro Phe Glu Val Ile Ile Asp Lys Ala Ala

245 250 255

Phe Asp Lys Glu Phe Lys Asp Ser Tyr Lys Glu Ser Thr Asp Asp Phe

260 265 270

Gly Ser Trp Ser Val His Thr Asp Lys Glu Ser Ser Glu Asp Ile Ser

275 280 285

Glu Thr Asn Asp Lys Leu Phe Pro Leu Arg Asn Lys Glu Ala Gly Arg

290 295 300

Tyr Pro Met Ser Ala Leu Leu Ser Arg Gln Phe Ser His Thr Asn Ala

305 310 315 320

Ala Leu Glu Glu Val Ser Arg Cys Val Asn Asp Met His Asn Phe Thr

325 330 335

Asn Glu Ile Leu Thr Trp Asp Leu Val Pro Gln Val Lys Gln Gln Thr

340 345 350

Asp Lys Ser Ser Asp Cys Ile Thr Lys Thr Thr Gly Leu Asp Met Ser

355 360 365

Glu Tyr Asn Ser Glu Ile Pro Val Val Asn Leu Lys Thr Ser Thr His

370 375 380

Gln Lys Thr Pro Val Cys Ser Ile Asp Gly Ser Thr Pro Ile Thr Lys

385 390 395 400

Ser Thr Gly Asp Trp Ala Glu Ala Ser Leu Gln Gln Glu Asn Ala Ile

405 410 415

Thr Gly Lys Pro Val Pro Asp Ser Leu Asn Ser Thr Lys Glu Phe Ser

420 425 430

Ile Lys Gly Val Gln Gly Asn Met Gln Lys Gln Asp Asp Thr Leu Ala

435 440 445

Glu Leu Pro Gly Ser Pro Pro Glu Lys Cys Asp Ser Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Val Ala Thr Val Lys Val Ala Leu Pro Asp Asp His Leu Lys Asp Glu

465 470 475 480

Met Asp Trp Gln Ser Ser Ala Leu Gly Glu Ile Thr Glu Ala Asp Ser

485 490 495

Ser Gly Glu Ser Asp Asp Thr Val Ile Glu Asp Ile Thr Ala Asp Thr

500 505 510

Ser Phe Glu Asn Asn Lys Ile Gln Ala Glu Lys Pro Val Ser Ile Pro

515 520 525

Ser Ala Val Val Lys Thr Gly Glu Arg Glu Ile Lys Glu Ile Pro Ser

530 535 540

Cys Glu Arg Glu Glu Lys Thr Ser Lys Asn Phe Glu Glu Leu Val Ser

545 550 555 560

Asp Ser Glu Leu His Gln Asp Gln Pro Asp Ile Leu Gly Arg Ser Pro

565 570 575

Ala Ser Glu Ala Ala Cys Ser Lys Val Pro Asp Thr Asn Val Ser Leu

580 585 590

Glu Asp Val Ser Glu Val Ala Pro Glu Lys Pro Ile Thr Thr Glu Asn

595 600 605

Pro Lys Leu Pro Ser Thr Val Ser Pro Asn Val Phe Asn Glu Thr Glu

610 615 620

Phe Ser Leu Asn Val Thr Thr Ser Ala Tyr Leu Glu Ser Leu His Gly

625 630 635 640

Lys Asn Val Lys His Ile Asp Asp Ser Ser Pro Glu Asp Leu IIe Ala

645 650 655

Ala Phe Thr Glu Thr Arg Asp Lys Gly Ile Val Asp Ser Glu Arg Asn

660 665 670

Ala Phe Lys Ala Ile Ser Glu Lys Met Thr Asp Phe Lys Thr Thr Pro

675 680 685

Pro Val Glu Val Leu His Glu Asn Glu Ser Gly Gly Ser Glu Ile Lys

690 695 700

Asp Ile Gly Ser Lys Tyr Ser Glu Gln Ser Lys Glu Thr Asn Gly Ser

705 710 715 720

Glu Pro Leu Gly Val Phe Pro Thr Gln Gly Thr Pro Val Ala Ser Leu

725 730 735

Asp Leu Glu Gln Glu Gln Leu Thr Ile Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly

740 745 750

Glu Arg Gln Val Glu Lys Ser Thr Ser Ala Gln Arg Asp Ala Glu Leu

755 760 765

Pro Ser Glu Glu Val Leu Lys Gln Thr Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ser

770 775 780

Trp Pro Gln Arg Ser Tyr Asp Ile Leu Glu Arg Asn Val Lys Asn Gly

785 790 795 800

Ser Asp Leu Gly Ile Ser Gln Lys Pro Ile Thr Ile Arg Glu Thr Thr

805 810 815

Arg Val Asp Ala Val Ser Ser Leu Ser Lys Thr Glu Leu Val Lys Lys

820 825 830

His Val Leu Ala Arg Leu Leu Thr Asp Phe Ser Val His Asp Leu Ile

835 840 845

Phe Trp Arg Asp Val Lys Lys Thr Gly Phe Val Phe Gly Thr Thr Leu

850 855 860

Ile Met Leu Leu Ser Leu Ala Ala Phe Ser Val Ile Ser Val Val Ser

865 870 875 880

Tyr Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr

885 890 895

Lys Ser Val Ile Gln Ala Val Gln Lys Ser Glu Glu Gly His Pro Phe

900 905 910

Lys Ala Tyr Leu Asp Val Asp Ile Thr Leu Ser Ser Glu Ala Phe His

915 920 925

Asn Tyr Met Asn Ala Ala Met Val His Ile Asn Arg Ala Leu Lys Leu

930 935 940

Ile Ile Arg Leu Phe Leu Val Glu Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Leu

945 950 955 960

Ala Val Phe Met Trp Leu Met Thr Tyr Val Gly Ala Val Phe Asn Gly

965 970 975

Ile Thr Leu Leu Ile Leu Ala Glu Leu Leu Ile Phe Ser Val Pro Ile

980 985 990

Val Tyr Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Ile Asp His Tyr Val Gly Ile Ala

995 1000 1005

Arg Asp Gln Thr Lys Ser Ile Val Glu Lys Ile Gln Ala Lys Leu

1010 1015 1020

Pro Gly Ile Ala Lys Lys Lys Ala Glu

1025 1030

Claims

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包含SEQ ID No.1中从155-3253位的核苷酸序列；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID No.1中从核苷酸155-3253位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。

3.一种分离的RTN3L蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

6.一种用权利要求5所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它包括原核细胞和真核细胞。

7..一种产生具有RTN3L蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将权利要求1所述的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成RTN3L蛋白表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成RTN3L蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达RTN3L蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有RTN3L蛋白活性的多肽。

8.一种能与RTN3L蛋白多肽特异性结合的抗体，其特征在于，它包括单克隆抗体和多克隆抗体。

9.一种探针分子，其特征在于，它含有具有RTN3L多肽编码序列的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。