CN103013902B - 产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAP5融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。方法：一、融合蛋白CGRP/AcAP5基因的合成；二、重组表达载体的构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明用于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。
背景技术
降钙素基因相关肽（CGRP）是Rosenfeld等于1983年发现的一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是迄今发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。
犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）是犬钩虫吸血时，其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前应用的有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白。其中rAcAP5由77个氨基酸组成，含10个半胱氨酸，形成5对二硫键(C6-C50，C15-C42，C21-C37，C25-C69，C50-C63)，主要由二硫键决定其二级结构，从而决定其生物活性。它是Xa因子（凝血因子）的高效特异性抑制剂，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用，使其在临床上成为一种新的抗凝剂和抗血栓药物。
然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAP5融合蛋白，CGRP-AcAP5融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。
本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAP5）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAP5；
三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。
本发明的有益效果：本发明基因工程菌株可以生产CGRP-AcAP5融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5之间作用互补且协同增效，CGRP-AcAP5融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
具体实施方式二：具体实施方式一所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
具体实施方式三：具体实施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAP5）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAP5；
三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德莱生物科技有限公司）提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌；其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到；
步骤二中pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| pUC（CGRP/AcAP5）载体 | 20μL |
| 10×M buffer | 6μL |
| BamHI | 3μL |
| EcoRⅠ | 3μL |
| ddH2O | 28μL |
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
步骤二中表达载体pGEX-6P-1双酶切的体系如下：
| 成分 | 用量 |
| pGEX-6P-1 | 20μL |
| 10×M buffer | 6μL |
| BamHI | 3μL |
| EcoRⅠ | 3μL |
| ddH2O | 28μL |
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
步骤二中连接反应体系如下：
| 成分 | 用量 |
| 目的基因CGRP/AcAP5 | 13μL |
| 酶切后pGEX-6P-1载体 | 3μL |
| T4 DNA连接酶 | 2μL |
| 10×T4 DNA连接酶buffer | 2μL |
连接反应条件：16℃水浴，8～12h。所述T4 DNA连接酶，购买自TaKaRa公司。
将本实施方式获得的阳性重组菌置于LB培养基28℃培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，获得降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白。本实施方式获得的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。
由生物工程公司将融合蛋白CGRP/AcAP5基因克隆到pUC57载体上。
为验证本实施方式基因工程菌株所产融合蛋白的效果，进行以下实验：
CGRP-AcAP5融合蛋白抗血栓实验：
取SD大鼠，随机分为11组，每组8只，每组给药剂量如下：阴性对照组给予同体积的生理盐水；阳性对照组选用肝素钠注射液，给药剂量为1650 U/kg；CGRP低剂量组给药40μg/kg；CGRP中剂量组给药200μg/kg；CGRP高剂量组给药1mg/kg；AcAP5低剂量组给药40μg/kg；AcAP5中剂量组给药200μg/kg；AcAP5高剂量组给药1mg/kg；CGRP-AcAP5融合蛋白低剂量组给药40μg/kg；CGRP-AcAP5融合蛋白中剂量组给药200μg/kg；CGRP-AcAP5融合蛋白高剂量组给药1mg/kg。全部由静脉注射给药。经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS-14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度（测量的时间间隔为4 s，以百分数表示数据，全部过程持续5 min）。结果如表1所示：
表1 CGRP-AcAP5融合蛋白抗大鼠颈总动脉血栓的效果[n,( )%]
| 组别 | n | 给药剂量 | 颈总动脉的堵塞程度(%) |
| 阴性对照组 | 8 | 0μg/kg | 100.00±0.00 |
| 阳性对照组 | 8 | 1650U/kg | 49.26±41.98 |
| CGRP低剂量组 | 8 | 40μg/kg | 51.12±34.74* |
| CGRP中剂量组 | 8 | 200μg/kg | 36.43±24.64* |
| CGRP高剂量组 | 8 | 1mg/kg | 26.74±23.25* |
| AcAP5低剂量组 | 8 | 40μg/kg | 48.31±36.74* |
| AcAP5中剂量组 | 8 | 200μg/kg | 32.64±65.56* |
| AcAP5高剂量组 | 8 | 1mg/kg | 22.74±23.79** |
| CGRP-AcAP5融合蛋白低剂量组 | 8 | 40μg/kg | 40.26±41.31* |
| CGRP-AcAP5融合蛋白中剂量组 | 8 | 200μg/kg | 26.39±42.63* |
| CGRP-AcAP5融合蛋白高剂量组 | 8 | 1mg/kg | 10.69±14.56** |
结果表明：注射AcAP5蛋白溶液和CGRP-AcAP5融合蛋白溶液虽然都有抗血栓的作用，但CGRP-AcAP5融合蛋白的抗血栓效果最佳，且比单独注射AcAP5蛋白溶液的效果有显著提高，说明CGRP和AcAP5融合可以增强犬钩虫抗凝肽AcAP5的作用。
由高血压实验和抗血栓实验结果可知，降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝肽（AcAP5）融合可以互相促进，协同增效。
CGRP-AcAP5融合蛋白治疗大鼠心肌缺血的实验：
取SD大鼠30只，造成心肌缺血模型；大鼠随机分成三组（对照组、实验A组和实验B组），实验A组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP蛋白；实验B组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP-AcAP5融合蛋白；对照组注射同等剂量的生理盐水。
实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域、坏死区及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表2所示，其中AAR（Area at risk）为危险区域，IS（Infarct size）为坏死区。
表2 梗死区大小（±S）
*P<0.05，**P<0.01
结果表明：实验A组和实验B组与对照组相比虽然都有治疗心肌缺血的作用，但是CGRP-AcAP5融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独注射CGRP蛋白的效果有显著提高，说明AcAP5和CGRP融合可以增强降钙素基因相关肽（CGRP）的作用。
由骨质疏松实验和心肌缺血实验结果可知，犬钩虫抗凝血肽（AcAP5）和降钙素基因相关肽（CGRP）融合可以互相促进，协同增效。
CGRP-AcAP5融合蛋白毒性实验：
哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。将小鼠随机分为2组：实验组和对照组，采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射CGRP-AcAP5融合蛋白，总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。
CGRP-AcAP5融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。
表3 血生化指标
CGRP-AcAP5融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。
表4 脏器病理观察结果
| 组别 | 天数 | 心 | 肝 | 脾 | 肺 | 肾 |
| 对照组 | 14 | 3.59±0.85 | 30.63±2.54 | 4.63±0.86 | 2.90±0.75 | 7.84±0.76 |
| 实验组 | 14 | 3.58±0.95 | 30.58±2.76 | 4.56±0.86 | 2.91±0.74 | 7.82±0.93 |
| 对照组 | 30 | 3.46±0.83 | 30.84±2.97 | 4.74±0.78 | 2.91±0.77 | 7.95±0.81 |
| 实验组 | 30 | 3.76±0.82 | 31.46±3.15 | 4.49±0.74 | 2.90±0.85 | 7.88±0.81 |
实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。
本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明CGRP-AcAP5融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明CGRP-AcAP5融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明CGRP-AcAP5融合蛋白具有较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。
本实施方式获得的CGRP-AcAP5融合蛋白在降钙素基因相关肽（CGRP）和犬钩虫抗凝血肽之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使AcAP5和CGRP丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAP5）内CGRP-AcAP5融合蛋白的表达量也比单一的AcAP5或CGRP在大肠杆菌中的表达量高。
本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。
构建本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAP5）时改变了CGRP和犬钩虫抗凝血肽AcAP5的二级结构，这种改变没有产生体内毒性，发酵产生的融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAP5）发酵CGRP-AcAP5融合蛋白具有分离纯化容易的特点。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
Claims (5)
1.产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因；其中所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、在CGRP和AcAP5融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAP5）载体；
二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAP5；
三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。
3.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中pUC（CGRP/AcAP5）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
4.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体pGEX-6P-1双酶切的体系如下：
酶切反应条件：37℃水浴，10h。
5.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系如下：
连接反应条件：16℃水浴，8～12h。
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