CN107050454A

CN107050454A - 一种miRNA‑483‑5p抑制剂药物及其在治疗骨关节炎药物中的用途

Info

Publication number: CN107050454A
Application number: CN201611128312.6A
Authority: CN
Inventors: 白晓春; 王�华; 张海严; 孙秋怡; 蔡道章
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Guangzhou South Medical University Science Park Co.,Ltd.
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: CN107050454B

Abstract

本发明涉及一种miRNA‐483‐5p抑制剂及其在骨关节炎疾病治疗中的用途。具体地，本发明公开了一种miRNA‐483‐5p抑制剂在制备治疗骨关节炎疾病的药物中的用途。其中miRNA‐483‐5p抑制剂选自细胞中特异抑制miRNA‐483‐5p作用的核酸序列。

Description

一种miRNA-483-5p抑制剂药物及其在治疗骨关节炎药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种miRNA-483-5p抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的用途。

背景技术

骨关节炎(OA,osteoarthritis)为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。

对于骨关节疾病的治疗方法主要为减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程。肥胖患者应减轻体重，减少关节的负荷。下肢关节有病变时可用拐杖或手杖，以求减轻关节的负担。理疗及适当的锻炼可保持关节的活动范围，必要时可使用夹板支具及手杖等，对控制急性期症状有所帮助。消炎镇痛药物可减轻或控制症状，但应在评估患者风险因素后慎重使用且不宜长期服用。软骨保护剂如硫酸氨基葡萄糖具有缓解症状和改善功能的作用，同时长期服用可以延迟疾病的结构性进展。对晚期病例，在全身情况能耐受手术的条件下，行人工关节置换术，目前是公认的消除疼痛、矫正畸形、改善功能的方法。

目前治疗方法仅能有限地减轻骨关节疾病的症状，无法从生理结构上进行治疗和预防。因此，亟需研发一种能够治疗和预防骨关节疾病的药物。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种miRNA-483-5p抑制剂药物及其在骨关节疾病药物中的用途。

本发明一个方面提供了一种miRNA-483-5p抑制剂在制备治疗骨关节疾病的药物中的用途。

其中，miRNA-483-5p抑制剂选自细胞中特异抑制miRNA-483-5p作用的核酸序列。

其中miRNA-483-5p抑制剂选自细胞中特异抑制miRNA-483-5p作用的物质、或者特异抑制miRNA-483-5p与Matn3或TIMP2相互作用的物质。

其中，miRNA-483-5p抑制剂序列为：CUCCCUUCUCUUCUCCCGUCUU。

其中，骨关节疾病选自膝骨关节炎，不排除身体其他部位的骨关节炎。

本发明另一个方面提供了一种用于预防和/或治疗骨关节疾病的药物，所述药物含有有效量的miRNA-483-5p抑制剂。

其中，所述药物的制剂为注射剂，优选为关节腔注射剂。

有益效果

本发明以关节腔注射miRNA-483-5p抑制剂antagomiR-483-5p，可有效延缓骨关节疾病进程；并发现了Matn3与Timp2是miR-483-5p调控骨关节炎发生、发展的直接作用靶点；同时为临床上骨关节炎防治提供了新靶点。

附图说明

图1抑制关节软骨miR-483-5p可有效延缓OA的疾病进程。(A)DMM小鼠关节腔注射antagomiR-483-5p后膝关节处组织学染色及HC/CC和OARSI评分的定量分析(n＝10)。标尺＝50μm。(B)免疫组织化学染色及定量分析上述膝关节组织切片中Runx2的表达情况，标尺＝20μm。红色箭头表示染色阳性细胞。

图2软骨细胞中miR-483-5p直接靶向Matn3参与OA病理。(A)MiR-483-5p与野生或突变的Matn3mRNA的3′UTR序列。(B)荧光素酶实验检测ATDC5细胞中野生或突变的Matn3 3'UTR与miR-483-5p的结合情况。(C)免疫印迹及RT-PCR检测ATDC5细胞转染miR-483-5pmimics或inhibitor 48小时后Matn3的mRNA及蛋白水平。(D)原代软骨细胞转染NC,miR-483-5p mimics或miR-483-5p mimics与Matn3过表达质粒共转48小时后RT PCR分析Col2a1、Ihh和Runx2的mRNA水平。(E)TG483(n＝10)小鼠喂食强力霉素12个月后，免疫组织化学检测其膝关节处Matn3的表达情况。标尺＝20μm。(F)H&E、番红O-快速绿染色及免疫组织化学分析过表达Matn3对小鼠软骨细胞miR-483-5p过表达所导致的骨关节炎表型的逆转情况(n＝10)。

图3软骨细胞中miR-483-5p直接靶向Tinp2。(A)MiR-483-5p与野生或突变的Timp2mRNA的3′UTR序列。(B，C)荧光素酶实验检测ATDC5细胞中野生或突变的Timp2 3'UTR与miR-483-5p的结合情况。(D)免疫印迹及RT-PCR检测ATDC5细胞转染miR-483-5p mimics或inhibitor 48小时后Timp2的mRNA及蛋白水平。(E)免疫荧光检测健康及OA病人软骨中Timp2的表达情况。标尺＝20μm。(F，G)免疫荧光检测DMM OA小鼠膝关节腔注射LV3-miR-483-5p(F)或antago-miR-483-5p(G)(n＝10)后膝关节组织切片Timp2的表达情况。标尺＝40μm。(H)免疫荧光检测TG483小鼠经DMM手术诱导 OA发生五周后膝关节处Timp2的表达情况。(I)免疫荧光检测TG483小鼠喂食强力霉素12个月后膝关节组织切片中Timp2的表达情况。红色箭头指示染色阳性细胞。

图4软骨细胞中miR-483-5p通过负调控Timp2来促进软骨血管形成及OA的发生发展。(A)DMM OA小鼠关节腔注射LV3-miR-483-5p或antago-miR-483-5p(n＝10)后，免疫组织化学及定量分析软骨下骨基质中血管形成情况(每平方毫米软骨下骨基质中的血管数量)。标尺＝100μm。(B)原代软骨细胞转染NC、miR-483-5p mimics或inhibitor 48小时后取其上清，用于重悬HVECs细胞并进行成小管实验，小管形成12小时后进行拍照及小管长度的计算。(C)H&E、番红O-快速绿染色及免疫组织化学分析过表达Timp2对小鼠软骨细胞miR-483-5p过表达所导致的骨关节炎表型的逆转情况(n＝10)。(D)依据上述番红O-快速绿染色进行的OARSI评分。(E)体内成小管实验分析过表达Timp2对小鼠软骨细胞miR-483-5p过表达所导致的血管形成增多的逆转情况。(F)定量分析(E)中所成小管的长度。(G)本研究所展示的OA发生发展过程中miR-483-5p所介导的信号路径。

具体实施方式

下列实施例用于进一步说明本发明，将易于为本领域普通技术人员所理解。实施例并不意味着以任意方式限定本发明。

以下实验所用材料

实验动物

MiR483转基因小鼠(TG483)由广州赛业生物科技有限公司构建，采用Tet-on系统启动pri-miR-483基因的表达，rtTA小鼠购自美国Jackson实验室，编号为006965。骨关节炎模型构建、保种及繁殖用的野生型C57BL/6J小鼠均购自南方医科大学实验动物中心。

细胞系

成软骨细胞系ATDC5、人脐静脉血管内皮细胞HVECs由本实验室保存。

菌种和质粒

E.coli DH5α为本实验室保存菌种；

质粒psiCHECK^TM-2由本实验室保存。

实施例1骨关节炎模型的建立

本实验中，选择半月板失稳术(DMM，destabilisation of the medial meniscus)方法作为实验性骨关节炎小鼠模型。选取8-10周龄的野生型雄性C57Bl/6J以及 TG483小鼠用于造模。实验组小鼠的右膝关节行内测副韧带及前交叉韧带切除后，切除内测半月板。假手术组仅进行右侧膝关节的切皮手术。通常情况下，术后五周处死小鼠，切取关节标本进行后续检测。

实施例2关节腔注射给药

采用33-gauge和微量注射器进行关节腔注射，给药组注射的病毒滴度为1×10⁹TU/ml，antagomiR-483-5p(SEQ ID No.1)的浓度为250μM，每次注射体积为10μl，分术后第7天及第14天两次注射。

实施例3组织的固定与石蜡切片的制备

①剥取完整的右膝关节组织，置于4％的多聚甲醛固定液中4℃摇床上固定20-22小时；

②PBS冲洗固定的组织每次5分钟，共两次。随后进行脱钙处理，脱钙液为0.5MEDTA，pH 7.4。每2-3天更换一次脱钙液，脱钙总时长为三周。

③自动脱水机脱水、透明、浸蜡。乙醇溶液逐级脱水，具体程序为：50％乙醇溶液，2小时；70％乙醇溶液，2小时；80％乙醇溶液，2小时；95％乙醇溶液，2小时；100％乙醇I，1小时；100％乙醇II，1小时；

④透明，即二甲苯置换乙醇溶液，具体程序为：二甲苯I，30分钟；二甲苯II，30分钟；

⑤浸蜡，即石蜡置换二甲苯溶液，具体程序为：二甲苯和石蜡的混合溶液(1:1比例)，65℃处理1小时；石蜡I，65℃处理1小时；石蜡II，65℃再处理1小时，随后冷却至室温；

⑥采用LEICA EG1160石蜡包埋机包埋组织，包埋时需保证蜡块完整无裂痕；

⑦将蜡块边缘修整后，采用LEICA RM2235切片机切片，切片时应用力均匀、切片匀速，切忌用力过猛、速度过快。切片厚度为5μm；

⑧将切好的石蜡切片在42℃水上进行展片、挑选关节面完好无损的片子，用粘附载玻片捞片及贴片。切片完成后于烤箱中55℃烤片过夜。

实施例4免疫组织检测

A、烤片：挑取关节面完好的石蜡切片，于65℃恒温箱中烤片1-2小时；

B、脱蜡，即二甲苯置换石蜡：二甲苯I，10分钟；二甲苯II，10分钟；

C、水化，即乙醇置换二甲苯，具体过程为：100％乙醇I，10分钟；100％乙醇II，10分钟；95％乙醇溶液，8分钟；80％乙醇溶液，8分钟；70％乙醇溶液，5分钟；50％乙醇溶液，5分钟；

D、清洗去除乙醇：PBS冲洗3次，每次5分钟；

E、抗原修复：置于0.01M枸橼酸缓冲液(pH＝6.0)中进行修复，修复温度为60℃，时间为18-24小时。待修复结束，取出切片(置于修复液中)，自然冷却至室温；

F、清洗去除抗原修复液：PBS冲洗3次，每次5分钟；

G、灭活内源性过氧化物酶：3％H₂O₂溶液(去离子水配置)覆盖标本，室温避光孵育10分钟；

H、清洗去除H₂O₂：PBS冲洗3次，每次5分钟；

I、封闭：正常山羊血清专用封闭液覆盖标本，室温孵育30分钟；

J、一抗孵育：轻轻擦去封闭液，将稀释好的一抗溶液(用抗体稀释液(1％BSA，0.2％Trixton X-100，PBS配制)配制)覆盖标本，于湿盒中4℃孵育过夜；

K、次日，置于37℃孵箱复温30分钟；

L、清洗富余的一抗：PBS冲洗3次，每次5分钟；

M、二抗孵育：同样采用上述抗体稀释液配制所需浓度的二抗，本实验所用于免疫组化检测的二抗均为辣根过氧化物酶标记，于湿盒中37℃孵育1小时；

N、清洗富余二抗：PBS冲洗3次，每次5分钟；

O、显色：滴加DAB显色液(现配现用)，于显微镜下实时观察染色状态，以掌握合适的染色度，对照组与实验组必须严格保证显色时间一致。显色结束立即于去离子水中终止反应；

P、洗涤：去离子水冲洗，5分钟；

Q、复染：即细胞核染色。于苏木精染液中染色10-30秒，自来水冲洗10分钟；

R、分化：分化液为70％酒精中添加1％的盐酸，分化1-3秒；

S、蒸馏水：冲洗5分钟；

T、脱水：具体程序为50％乙醇溶液，3分钟；70％乙醇溶液，3分钟；80％乙醇溶液，3分钟；90％乙醇溶液，3分钟；100％乙醇I，3分钟；100％乙醇II，3分钟；

U、透明，即二甲苯置换乙醇：具体步骤为二甲苯I，3分钟；二甲苯II，1分钟；

V、封片：用中性树脂封片，注意不要产生气泡，随后在奥林巴斯显微镜(BX51)下观察拍照。

实施例5免疫荧光染色

挑取合适的石蜡切片，从实验开始到一抗孵育的操作与免疫组织化学一致。一抗孵育结束后，所有操作须在暗室中进行。配置相应浓度的Alexa 488绿色荧光染料标记的二抗，于湿盒中37℃避光反应30分钟。PBS洗涤富余的二抗，用含DAPI的封片剂封片，注意不要产生气泡，于Olympus FluoView FV1000共聚焦显微镜观察并拍照。

实施例6番红O-快速绿染色

(1)番红O-快速绿染色

试剂配制：

1％番红O染液及0.2％快速绿染液均用去离子水配置，粉末溶解后须经滤纸过滤。

实验步骤：

①切片标本经烤片、脱蜡、梯度酒精水化步骤同免疫组化；

②苏木素染核30sec，去离子水漂洗数次，分化液分化3sec，再于去离子水中漂洗数次；

③0.2％快速绿染液染色20sec，切勿漂洗；

④分化液分化15sec，不漂洗；

⑤1％番红O染液染色30sec，切勿漂洗；

⑥梯度酒精脱水、二甲苯透明步骤参照免疫组化；

⑦中性树胶封片，观察拍照。

染色结果分析：通过番红O-快速绿染色，可观察到小鼠膝关节软骨的形态学结构变化，软骨细胞的数量、大小以及排列规律的变化，潮线位置的变化以及软骨基质中蛋白聚糖成分的改变等等。就染色结果而言，染成蓝色的是细胞核，染成红色的是生长板软骨和关节软骨，染成绿色的是骨、软骨下骨以及其他组织。

为进一步量化染色结果以便统计分析，我们通过骨关节炎的组织学-组织化学评分方法评估骨关节炎的严重程度。评分时至少由三名不同的实验人员独立进行，每组至少取6份不同个体的膝关节染色切片，评分结束后，取三人所得评分的平均分作为最终得分。评分标准参照改良的OARSI评分系统，分数越高，表示骨关节炎病情越严重。

实施例7蛋白免疫印迹(western blot)检测

①经液氮研磨及超声破碎的组织样品或收集的细胞样品于上样缓冲液中95℃裂解10分钟，冷却后离心去沉淀，即为总蛋白样品。制备好的样品加样，进行10-12％的SDS-PAGE凝胶电泳，约1.5-2h(恒流，16mA/gel)。

②将SDS-PAGE凝胶电泳分离的蛋白用Bio-Rad微型电转移系统，于冰上转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上(电转移时间和电压因检测蛋白分子量而定)。

③转膜结束后，将NC膜置于平缓摇动的摇床上，以封闭缓冲液覆盖室温下封闭1小时或4℃封闭过夜。

④封闭结束后用TBST洗膜以洗净封闭液。

⑤按特定浓度要求稀释目的蛋白的特异性抗体，与湿盒中4℃孵育过夜(平缓摇动)，确保抗体稀释液能完全覆盖NC膜。

⑥TBST洗膜3次以洗净富余的一抗，每次5min。

⑦加入特定稀释浓度的HRP标记的山羊抗兔、羊抗小鼠或者驴抗山羊二抗，室温下再孵育1h(平缓摇动)，确保抗体稀释液能完全覆盖NC膜。

⑧TBST振荡洗膜3次，每次5min以去除富余的二抗。

⑨含有目的蛋白的NC膜稍沥干后加入化学发光试剂，于暗室内曝光，曝光时间依发光信号强弱而调整，可从1sec到30min甚至更长。X胶片经显影、定影、晾干后，扫描图片并保存。

实施例8组织原位杂交

用于原位杂交的探针序列为/5DigN/CTCCCTTCTCTTCTCCCGTCTT/3Dig_N/SEQ IDNo.21，该探针为地高辛标记。组织从取材开始就要求在在无RNa se的环境中进行，切片需保存于-80℃。所有耗材及试剂必须经过无RNase处理。组织切片烤片、脱蜡、水化步骤同免疫组化染色。

①用0.5M PBS稀释蛋白酶K至终浓度为20μg/ml，于37℃处理标本10min，处理结束后继续用0.5M PBS洗涤3次，每次5min；

②预杂交，即将杂交液覆盖标本，于60℃预杂交2-3小时；

③杂交：首先用杂交液稀释探针至25nM浓度，随后置90℃处理5min后冰上放置备用。准备好的探针覆盖标本，于60℃杂交过夜；

④洗涤：于37℃中进行，2×SSC洗涤两次，每次5min；

⑤RNase A(1:500，稀释液为2×SSC)处理30min后，0.5×SSC洗涤15min，0.2×SSC再洗涤15min，本步骤均于37℃中进行；

⑥封闭：封闭液为3％的封闭用普通山羊血清，室温封闭30mim；

⑦抗地高辛的绿色荧光抗体按1:2000稀释，稀释液为0.5M PBS+2％普通山羊血清，37℃孵育60min；

⑧0.5M PBS常温洗涤标本共4次，每次5min

⑨共聚焦显微镜观察染色情况。

实施例9细胞培养

ATDC5细胞培养用DMEM/F12(1:1)培养基、添加5％胎牛血清及青链霉素混合双抗(100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)，于37℃、CO2浓度为5％，相对湿度为95％的细胞培养箱内培养，观察细胞生长密度适时更换培养基。细胞消化或传代用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA工作液处理。

miRNA及外源性质粒的转染

选择生长状态良好的细胞传代至24或12孔培养板，正常过夜培养，待细胞处于对数生长期，细胞融合密度达30％(miRNA序列见表1-1)或70％(外源性质粒)左右，采用Invitorgen公司Lipofactemine 2000转染试剂进行转染，具体操作参考试剂说明书，转染48小时后，提取RNA或细胞总蛋白等进行后续实验操作。

表1-1miRNA及siRNA序列

实施例10总RNA的提取及Real-Time PCR

总RNA的提取采用TRizol试剂，miRNA的RT-PCR采用吉玛公司试剂盒，U6为内参miRNA。普通基因采用TaKaRa公司的试剂盒，GAPDH(引物序列见表1-2)为内参基因。所有操作及体系配置严格按照试剂盒说明书进行。

表1-2Real-Time PCR中的引物序列

实施例11荧光素酶分析miR-483-5p的作用靶点

(1)生物信息学分析

本实验分别运用四个miRNA靶点分析软件Target Scan、miRWalk、miRanda和PITA预测miR-483-5p的下游作用靶点，最后取交集选取其中软骨、关节发育相关基因作为对象进行筛选。

(2)质粒简介

用于荧光素酶分析实验的质粒为Promega公司的质粒psiCHECKTM-2。本试验中，我们将预测出来的靶基因的3'-UTR区与miR-483-5p结合位点序列克隆入质粒的多克隆位点，通过荧光信号强度的改变判断该位点与miR-483-5p是否直接作用。

(3)PCR扩增片段:

以小鼠cDNA为模板，扩增miR-483-5p潜在靶基因matrilin(Matn3，NM_010770)、TIMP2(NM_011594)的3'UTR，引物信息如表1-3。反应体系如下：

反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如电泳条带单一且符合预期大小，按照Fermenas公司PCR产物回收试剂盒进行目的片段回收。

表1-3荧光素酶分析中用到的引物信息

(4)质粒载体和PCR产物的双酶切

反应体系于37℃反应3小时，酶切产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，按照Fermenas公司胶纯化试剂盒操作说明进行目的片段回收，并应用琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。

构建psiCHECK–Matn3为例，双酶切体系如下：

(5)目的片段与载体的连接

反应体系于22℃反应1小时，连接产物用于后续细菌转化或储存于-20℃。

连接体系如下：

(6)感受态细菌的制备

①LB培养液的配制：5.0g酵母提取物，10.0g胰蛋白胨，10.0g NaCI，先溶于900ml去离子水中，再用10M NaOH调pH至7.0，最后加去离子水定容至1L，高压灭菌。LB固体培养基配制：10.0g胰蛋白陈，5.0g酵母提取物，10.0g NaCI，15.0g琼脂粉，亦先溶于900ml去离子水中，再用10M NaOH调pH至7.0，最后加去离子水至1L，高压灭菌后，室温放置待温度下降至50-60℃左右时，加入抗生素，混匀，随后缓缓铺入10cm细菌培养板；

②将冻存的DH5a菌种画线接种于LB培养基平板，于37℃倒置过夜培养；

③挑取单个菌落接种到5ml LB液体培养基中于37℃250rpm振荡过夜。转接lml过夜培养物至100ml LB液体培养基中于37℃继续培养2-3小时，使细菌进入对数生长期，OD600约为0.3；

④将菌液加入50ml离心管(离心管需事先冰上预冷)中，冰上放置30分钟后，4℃下4,000g离心5分钟；

⑤弃去上清，用0.1mol/L的CaCl2溶液(预冷)20ml轻轻悬浮菌体，4℃下4,000g离心10分钟；

⑥弃去上清，再加入0.1mol/L的CaCl2溶液(预冷)，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即得到感受态细胞悬液；

⑦感受态细胞悬液分装后可马上进行后续的转化实验，也可4℃保存(可存放2周)。如需长期保存，需加入甘油，使其终浓度为15％，于-70℃冰箱中可保存半年左右。

(7)转化

①取100μl感受态细胞悬液，置冰上放置；

②加入连接产物(DNA含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；

③将反应体系置于42℃水浴中热激90秒，随后迅速冰上冷却3-5分钟；

④向反应体系中加入0.6ml LB液体培养基(不含抗生素)，37℃缓慢振荡培养45分钟，使细菌恢复正常生长状态，同时表达质粒编码的抗生素抗性基因；

⑤将上述菌液摇匀后取适量均匀涂于含Amp的筛选平板上，37℃倒置培养16-24小时。

(8)重组质粒的鉴定

①菌落PCR鉴定：挑取生长良好的单个菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，225转/分钟，振荡培养4-5小时。取lμl菌液于9μl ddH₂O，100℃加热10分钟裂解细菌。待冷却至室温后高速离心2分钟，上清即为模板，用上述扩增引物进行PCR扩增，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆；

②酶切鉴定：采用Fermenas公司质粒小提试剂盒提取质粒，酶切(酶切体系同上)后琼脂糖凝胶电泳检测载体中是否有目的片段插入；

③核酸序列测定及BLAST分析：经上述鉴定为阳性的重组质粒送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI BLAST在线软件中进行序列同源性分析鉴定。

(9)靶点突变载体的构建(重叠延伸PCR法)

①实验原理：重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)采用具有互补末端的多对引物，使PCR产物存在了重叠链，从而在第二轮的PCR扩增反应中通过重叠链的退火、延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该项技术能够在体外进行有效的基因重组和突变引入，而不需要内切酶和连接酶的传统处理；

②引入突变的引物设计：设计2对引物(表1-3)。其中A引物在目的片段的最上游，为forward引物，D引物位于目的片段的末端，为reverse引物，B、C引物序列重叠，可引入突变的序列；

③以之前筛选到的重组质粒为模板，分别用A、B和C、D两对引物进行第一轮PCR反应，分别得到产物片段1和片段2；

④将上述所得PCR产物片段1和片段2分别切胶回收，然后以1:1比例混合作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR应用A、D两条引物进行扩增，得到含有突变位点的片段。

⑤将含有突变位点的片段与载体通过酶切、连接、转化等方法(同上)获得序列突变的阳性克隆。

(10)荧光素酶报告基因检测

细胞于24孔细胞培养板中同时转染miR-483-5p mimics、psiCHECK-Matn3或psiCHECKTIMP2，同时设阴性对照组。转染60小时后，吸尽细胞培养液，加入稀释好的细胞裂解液，室温摇床上充分裂解细胞15min；随后采用dual-luciferase reporter assaysystem(Promega)试剂盒试剂于荧光测定仪上检测荧光信号。

实施例12小管形成实验

取96孔细胞培养板，每孔铺20μl growth factor-reduced Matrigel，尽量铺均匀，随后置于37℃固化30min。HVECs细胞胰酶消化离心后，细胞沉淀用实验所需的液体重悬至5×10⁴/ml的细胞密度，每孔加入100μl细胞悬液，继续置于37℃细胞培养箱中培养12小时后，用倒置显微镜观察小管形成情况。小管长度的计算在NIH Image J 1.31v Program软件中进行。

实施例13统计学处理

本实验所有数据以均值±标准差表示。数据的统计学分析采用SPSS13.0分析软件：两组数据之间的差异比较采用独立样本t检验(Independent-samples ttest)进行；RT-PCR结果的分析均采用单样本t检验(One-samples t test)进行。p<0.05则表明组间的差异有统计学意义。

实验结果

1.关节腔注射antagomiR-483-5p可延缓OA的疾病进程

以miR-483-5p的抑制剂antagomiR-483-5p进行关节腔注射。实验结果显示antagomiR-483-5p可有效延缓DMM实验小鼠膝骨关节炎表型，如番红O-快速绿染色的结果可看出软骨丢失和软骨基质降解的进程得以缓解(图1A)，OARSI评分显著减少，关节表面Runx2阳性染色细胞数比率显著减少(图1B)。

2.Matn3是miR-483-5p的功能性靶点

已知miRNA是在基因转录后水平参与细胞的生理病理过程，为深入探讨miR-483-5p在骨关节炎病理中的具体作用机制，通过miRNAs靶点预测软件Target Scan、miRWalk、miRanda以及PITA共同预测miR-483-5p的靶基因，最终选择Matn3(图2A)和Timp2作为候选靶点。Matn3是软骨细胞分泌的软骨基质蛋白，可通过调控软骨细胞肥大参与OA病理。本实验中，我们通过荧光素酶分析实验确定Matn3是miR-483-5p的直接作用靶点，即在共转染了miR-483-5pmimics和Matn3基因3'UTR序列后，荧光信号有显著降低(图2B)。另外，通过套叠PCR定点突变掉miR-483-5p与Matn3基因3'UTR序列的结合位点后，这种直接作用信号消失(图2B)。在蛋白水平上，ATDC5细胞转染了miR-483-5pmimics后，免疫印迹检测发现Matn3的蛋白水平受到明显抑制(图2C)，同理，在ATDC5细胞转染了miR-483-5p inhibitors后，Matn3的蛋白水平有所上调，但mRNA水平没有明显变化。这些实验结果证明在软骨细胞中Matn3是miR-483-5p的直接作用靶点。在TG483(miR-483-5p持续过表达)小鼠中，我们发现miR-483-5p的持续上调可明显下调Matn3的表达水平(图2 2E)。另外，体内体外试验均证明过表达Matn3可逆转miR-483-5p上调所引起的骨关节炎样的表型改变(图2D，F)。总而言之，以上实验结果证实了软骨细胞miR-483-5p上调，通过特异性调控Matn3的表达水平实现了其在骨关节炎病理中的调控作用。

3.Timp2是miR-483-5p的又一功能性靶点

通过miRNAs靶点预测软件预测miR-483-5p的靶基因中还包括Timp2(图3A)。Timp2是金属蛋白酶组织抑制子家族(TIMPs)中的一员，该家族的蛋白可抑制金属蛋白酶的催化活性。与健康正常关节软骨相比，在骨关节炎软骨中Timp2的表达是减少的。

通过荧光素酶分析实验确定Timp2是miR-483-5p的直接作用靶点，即在共转染了miR-483-5p mimics和Timp2基因3'UTR序列后，荧光信号有显著降低(图3B)。另外，通过套叠PCR定点突变掉miR-483-5p与Timp2基因3'UTR序列的结合位点后，这种直接作用信号消失(图3C)。在蛋白水平上，ATDC5细胞转染了miR-483-5p mimics后，免疫印迹检测发现Timp2的蛋白水平受到明显抑制(图3D)，同理，在ATDC5细胞转染了miR-483-5p inhibitors后，Timp2的蛋白水平有所上调，但mRNA水平没有明显变化。这些实验结果证明在软骨细胞中Timp2亦是miR-483-5p的直接作用靶点。

免疫荧光检测人源标本的Timp2表达情况，结果如图3E所示，与正常人关节软骨相比，骨关节炎病人的关节软骨中Timp2阳性的软骨细胞数量显著减少。更重要的是，当DMM小鼠关节腔注射了慢病毒LV3-miR-483-5p后，膝关节软骨细胞中Timp2阳性的比率显著低于注射对照病毒组(图3F)；相反，DMM小鼠关节腔注射了antagomiR-483-5p后，膝关节软骨细胞中Timp2阳性的比率显著高于对照组(图3G)。在TG483小鼠中，无论是DMM诱发的OA模型(图3H)还是老年小鼠自发OA-like表型(图3I)，与对照组相比，过表达miR-483-5p均可导致Timp2水平的下调。综上所述，在骨关节炎病理过程中，miR-483-5p可负调控Timp2的水平。

4.miR-483-5p调控Timp2以诱发软骨血管形成参与OA病理

血管侵入关节软骨是骨关节炎疾病进程中的重要事件。已有报道Timp2参与该事件。本发明中，以CD31指示血管形成，通过检测DMM小鼠关节腔注射LV3-miR-483-5p和antago-miR-483-5p后的血管形成情况，发明人发现 antago-miR-483-5p可显著减少血管形成(图4A)。体内小管形成实验亦发现miR-483-5p inhibitor可明显减少血管的形成(图4B)。更重要的是，我们的体内体外试验均证实过表达Timp2可逆转miR-483-5p上调所引起的骨关节炎样的表型改变(图4C-F)。

综合以上实验结果可以认为(图4G)：

1、关节腔注射antagomiR-483-5p可有效延缓OA的疾病进程；

2、Matn3与Timp2是miR-483-5p调控OA发生发展的直接作用靶点；

3、antagomiR-483-5p可作为临床上OA防治的新靶点。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种miRNA-483-5p抑制剂药物及其在治疗骨关节炎药物中的用途

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

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<212> RNA

<213> 人工序列

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cucccuucuc uucucccguc uu 22

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagacgggag aagagaaggg ag 22

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

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cccuucucuu cucccgucuu uu 22

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acgugacacg uucggagaat t 21

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<212> RNA

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aaatggtgaa ggtcggtgtg aac 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcccttctc ttctcccgtc tt 22

Claims

1.一种miRNA‐483‐5p抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中miRNA‐483‐5p抑制剂选自细胞中特异抑制miRNA‐483‐5p作用的物质、或者特异抑制miRNA‐483‐5p与Matn3或TIMP2相互作用的物质。

3.根据权利要求1‐2任一项所述的用途，其中miRNA‐483‐5p抑制剂为SEQ ID No.1所示的序列，CUCCCUUCUCUUCUCCCGUCUU SEQ ID No.1。

4.根据权利要求1‐3任一项所述的用途，骨关节炎选自膝骨关节炎、肘关节炎、肩关节炎或胯关节炎。

5.一种用于预防和/或治疗骨关节炎的药物，所述药物含有有效量的miRNA‐483‐5p抑制剂。

6.根据权利要求5所述的用于预防和/或治疗骨关节炎的药物，其还包括药学上可接受的病毒、载体或辅料。

7.根据权利要求5或6所述的药物，所述药物的制剂为注射剂，优选为关节腔注射剂。