CN109224130A - 长链非编码RNA lnc-HCAR在制备骨修复体系中的应用及骨修复体系和制备方法 - Google Patents
长链非编码RNA lnc-HCAR在制备骨修复体系中的应用及骨修复体系和制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了长链非编码RNA lnc‑HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，所述lnc‑HCAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述lnc‑HCAR可促进Vegfa基因和Mmp13基因的表达，可竞争性结合miR‑15b‑5p，从而可促进软骨细胞肥大分化，可促进软骨内成骨中的血管形成，可促进软骨内成骨中的基质重塑。基于长链非编码RNA lnc‑HCAR的骨修复体系包括lnc‑HCAR、基因运载体系、间充质干细胞和多孔骨支架材料。本发明在组织工程骨构建及骨缺损修复中有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，涉及长链非编码RNA lnc-HCAR在制备骨修复体系中的应用及骨修复体系和制备方法。
背景技术
软骨内成骨是一种基础的骨形成方式，是长骨形态发生的方式。软骨内成骨是一个软骨逐渐被骨替代的过程。在这个替换的过程中，无血管的软骨逐渐转化为血管化程度很高的骨组织。这种转换依赖于软骨基质的降解和软骨内血管生成。由肥大化软骨细胞表达的Mmp13 所介导的基质降解是血管，前体破骨细胞和成骨祖细胞侵入生长软骨的先决条件。被Mmp13 降解的软骨基质里面形成运河和空腔。此后，血管才可能侵入软骨基质，并将前体破骨细胞和成骨祖细胞带到这里，为骨重塑做准备。与此同时，肥大软骨细胞的分化伴随着血管生成生长因子(特别是Vegfα)的表达，从而允许血管侵入软骨。许多证据证明肥大软骨细胞分泌的 Vegfα精密地偶联肥大化软骨重塑，骨化和血管生成。在骨骺中，这种血管侵入严格限于最后一排与血管直接接触的肥大软骨细胞中的骨化。软骨内骨化的进程取决于新血管形成。
多种原因导致的大段骨缺损，如创伤、骨感染和肿瘤切除，是骨科临床长期以来的棘手问题。当骨缺损长度大于周径1.5倍时，骨缺损不能完成自我修复，必须进行植骨。现有的植骨材料主要是自体骨、同种异体骨、异种骨、钙磷陶瓷无机材料和组织工程骨。自体骨是骨缺损植骨最理想的材料，但是当缺损过大时容易造成供区的二次创伤。同种异体骨的来源也较少，且容易造成疾病传播。异种骨的免疫原性是限制其应用的因素。钙磷陶瓷等无机材料不具有生物活性，成骨效果不甚理想。近年来，组织工程技术为骨修复提供了新的思路，组织工程骨(tissue engineering bone,TEB)在骨科临床得到广泛应用。传统组织工程骨的构建类似于膜内成骨的过程，即通过间充质干细胞与支架材料复合后进行成骨诱导分化。当传统类型组织工程用于治疗大段骨缺损时，因为组织工程骨不能良好的血管化，由于血管不足和对营养物质的需求而导致组织工程骨中心区的坏死。
为了解决这个问题，最近研究人员提出了“发育工程(developmentalengineering)”的概念，利用成人BMSCs与支架材料相复合，然后对其进行软骨诱导分化和肥大化分化4周，然后将其植入裸鼠皮下8周。利用这种方法，研究者在体外成功得重现了软骨内骨形成的过程。上述证据证明，可以利用基于软骨内成骨的方法进行骨修复。基于软骨内成骨的骨修复方法在治疗大段骨缺损方面具有很大的优势。在此方法中，通过对软骨基质的重塑而产生新骨[9]，因为成年个体骨修复方式几乎全部是软骨内成骨过程，利用软骨内成骨的骨修复方法更能贴近生理的骨修复方式，因此这种方法可以更广泛的用于骨修复的骨组织。更为重要的是，基于软骨内成骨的骨修复方法是对软骨基质的重塑，而软骨组织对早期血管化要求低，能够形成更大的软骨基质，为后期软骨基质重塑和骨形成时的矿化提供模板，从而使其能够更好的应用于大段骨缺损的修复。还有，肥大软骨细胞能够分泌的基质重塑因子(Mmp13)和血管生成因子(Vegfa)，这些因子能够刺激血管的侵入，这对于骨形成是十分重要的。但是利用基于软骨内成骨的骨修复方法进行大段骨缺损的修复依然存在许多挑战。
一个挑战是确保BMSC来源的软骨细胞的充分的肥大分化。Ivan Matin等人的研究发现，同时将未肥大化的软骨雏形和完全肥大化的软骨雏形植入裸鼠体内8周之后，发现完全肥大化组的相关成骨标志物、血管化程度以及骨形成指标均好于未肥大化组。EricFarrell等将成人BMSC分别与支架材料符合并进行软骨诱导、肥大化诱导和成骨诱导后进行裸鼠皮下异位成骨实验，发现软骨诱导和成骨诱导组的血管化和骨形成指标均弱于肥大化诱导组。以上研究表明软骨内成骨的起始需要成熟的肥大软骨的基质模板。已知的研究证据与上述认识一致，体内骨形成的进展受到体外培养的BMSCs肥大阶段的调节。
综上所述，软骨内成骨过程中肥大软骨细胞的基因调控对最后骨形成的效果起到了重要作用。因此研究肥大化软骨细胞分化中的关键基因新的调控方式，可以为我们优化基于软骨内成骨的骨修复提供新的思路和方法。目前在基因调控领域研究火热的长链非编码RNA是新颖的基因调控方式。长非编码RNA(lncRNA)是长于200个核苷酸的转录物，其不翻译成蛋白质并参与多个水平的生物调节。已经发现lncRNA在生物发育和基因表达中发挥许多复杂和精确的调节功能，并参与调节各种细胞过程，包括X染色体失活，基因组印记，细胞周期和分化，以及基因转录和转录后调节。最近的研究表明，lncRNA在间充质干细胞增殖，软骨细胞分化和骨关节炎发展中起着重要的调节作用。如ROCR是软骨特异性表达的lncRNA，可调节SOX9的表达。在ROCR不存在的情况下SOX9的表达显着降低，并且SOX9的过表达增强了MSC向软骨细胞的分化。lncRNAs CIP调节OA软骨细胞的细胞外基质的降解。敲除lncRNA-CIP后，软骨ECM中胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的形成增加，Mmp13和ADAMTS5 等相关基因在基质降解中的表达下降。这些表明lncRNA参与软骨细胞的肥大分化。但是，将lncRNA应用到基于软骨内成骨方式的骨修复体系的研究尚未报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对目前应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，易导致修复失败的问题，提供一种长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用及其骨修复体系，以解决大块组织工程骨血管化和细胞活力缺乏的难题。本发明提供如下技术方案：
1、长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，所述 lnc-HCAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述lnc-HCAR可促进Vegfa基因和Mmp13基因的表达。
进一步，所述lnc-HCAR可竞争性结合miR-15b-5p。
进一步，所述lnc-HCAR可促进软骨细胞肥大分化。
进一步，所述lnc-HCAR可促进软骨内成骨中的血管形成。
进一步，所述lnc-HCAR可促进软骨内成骨中的基质重塑。
2、基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系，所述体系包括lnc-HCAR、基因运载体系、间充质干细胞和多孔骨支架材料。
进一步，所述基因运载体系为慢病毒包装体系、腺病毒包装体系、逆转录包装体系或裸质粒；所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞，所述多孔骨支架材料为脱细胞骨基质或脱钙骨基质。
3、基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系的制备方法，通过lnc-HCAR过表达的基因运载体系将lnc-HCAR导入间充质干细胞，再将过表达lnc-HCAR的间充质干细胞种植于多孔骨支架材料上，在体外进行成软骨分化诱导培养，再进行成肥大化软骨分化诱导培养，得到骨修复体系。
进一步，所述成软骨分化诱导培养的时间为10～14天，所述成肥大化软骨分化诱导培养的时间为10～14天。
具体步骤为：
1、通过lncRNA芯片在软骨细胞肥大分化阶段鉴定出一个高表达的 lncRNA—NONMMUT038035，并将其命名为肥大化软骨细胞-血管新生相关RNA，简写为 lnc-HCAR(Hypertrophic chondrocyte-angiogenesis related RNA)，并且通过原位杂交检测(FISH) 观察到其分布在细胞质中。使用qPCR检测软骨细胞肥大期间的HCAR表达，结果显示肥大软骨细胞增加4.3倍。在软骨诱导后7、14、21和28天，lnc-HCAR表达水平与软骨细胞肥大化标志基因Col10a1高度相关。涉及软骨内成骨中软骨基质重塑的两个必需基因Vegfa和Mmp13在干预lnc-HCAR表达后在RNA和蛋白质水平上都发生了变化。lnc-HCAR过表达时，软骨内成骨中软骨基质重塑的两个必需基因Vegfa和Mmp13的表达水平(RNA和蛋白质) 均显著高于对照组。相比之下，与对照组相比，敲除lnc-HCAR导致Vegfa和Mmp13基因表达的降低。
进一步，为了研究lnc-HCAR是否调节软骨内成骨中的软骨细胞肥大，分别使用慢病毒载体对lnc-HCAR进行过表达和敲低。细胞微团培养法用于体外诱导软骨细胞肥大分化，不同组的间充质干细胞在离心后第二天开始软骨诱导，并且在软骨诱导后第14天进行肥大诱导。诱导肥大后14天收集细胞团块。发现lnc-HCAR对软骨细胞肥大分化和基质矿化没有影响，但促进软骨内成骨过程中软骨细胞肥大分化中Vegfa和Mmp13的表达。显示lnc-HCAR可通过提高Vegfa和Mmp13的表达促进软骨内成骨中的血管形成和基质重塑。
在机制上，向肥大软骨细胞内转染miR-15b-5p mimics和anti miR-15b-5p后Vegfa和 Mmp13表达变化有显著差异，表明miR-15b-5p对软骨基质重塑关键基因Vegfa和Mmp13具有负性调节作用。双荧光素酶报告基因分析结果表明，lncRNA竞争性结合miR-15b-5p增加 Vegfa和Mmp13的表达。
2、基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系
通过软骨内成骨方式的骨修复体系的体内修复实验，利用Balb/c小鼠构建股骨缺损模型，使用间充质干细胞种植于多孔骨支架材料上构建骨修复复合体，再在体外对其进行成软骨分化诱导培养2周，继而进行成肥大化软骨分化诱导培养2周，即得基于软骨内成骨方式的原位骨修复模型。上调lnc-HCAR表达可促进lnc-HCAR对Vegfa和Mmp13表达，促进血管化和骨修复效果。
上调lnc-HCAR表达，为能够上调lnc-HCAR表达水平，增强lnc-HCAR活性和稳定性，或增加lnc-HCAR有效作用时间的物质，可以利用慢病毒包装体系、腺病毒包装体系、逆转录包装体系以及裸质粒转染等。所述上调lnc-HCAR为利用慢病毒包装体系。
本发明的有益效果：软骨内成骨是骨重建的重要方式之一，影响基于软骨内成骨方式的骨修复效果的因素有两个，一个是宿主有害微环境对移植物中肥大软骨细胞的活性的损伤，另一个是肥大软骨细胞中软骨内成骨关键基因的表达。软骨内成骨是软骨组织逐渐被骨替代的过程。针对目前应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，易导致修复失败的问题，本发明主要实现如下有益的技术效果：
1)肥大软骨细胞中软骨重塑关键基因的表达影响软骨内成骨进程。这种重塑依赖于软骨基质降解和软骨基质内血管生成。在软骨基质重塑的过程中，由肥大软骨细胞表达的Mmp13 和Vegfα发挥了关键作用。Mmp13对软骨基质内的胶原进行降解，使软骨基质松散，血管容易侵入。同时，肥大软骨细胞的分化进入终末后，血管生成生长因子Vegfα开始表达，促进血管侵入软骨，血管的侵入带来了成骨和破骨细胞前体，两者的相互作用使新骨形成。
2)MSCs可在软骨诱导条件下自然分化为肥大化软骨细胞，符合软骨内成骨的自然发展历程。用本发明方法，软骨内成骨方式的原位骨修复模型中，上调lnc-HCAR可促进Vegfa 和Mmp13表达，成功促进血管化和骨修复效果，从而本发明在组织工程骨构建及骨缺损修复中有着良好的应用前景。因此，本发明通过上调lnc-HCAR，促进MSCs来源软骨细胞促进 Vegfa和Mmp13表达，调控其肥大化进程，进而促进基于软骨内成骨方式的骨修复效果。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为实时定量PCR检测lnc-HCAR在软骨细胞肥大化分化阶段的表达变化结果(a：lnc-HCAR在软骨肥大化分化阶段的14d、21d和28d的表达变化；b：lnc-HCAR与肥大化标志基因Col10a1在7d、14d、21d和28d表达的相关性)。
图2为过表达和沉默lnc-HCAR后，检测软骨内成骨过程中相关基因及软骨基质矿化变化结果(a：实时定量PCR检测软骨内成骨关键基因的表达变化；b：Western blot分析检测软骨内成骨关键基因的表达变化的代表性图像；c：茜素红染色分析各组软骨基质矿化的代表性图像)。
图3为lnc-HCAR能够充当miR-15b-5p海绵作用的检测结果(a：过表达和沉默lnc-HCAR 后，实时定量PCR检测肥大软骨细胞中miR-15b-5p的表达变化；b：利用双荧光素酶报告基因检测miR-15b-5p与lnc-HCAR结合关系载体构建示意图；c：双荧光素酶报告基因检测结果)。
图4为miR-15b-5p调控Mmp13和Vegfa表达的结果(a：Vegfa和Mmp13 mRNA的3’UTR中与miR-15b-5p序列重合关系示意图；b：加入miR-15b-5p mimics与anti-miR-15b-5p后Vegfa 和Mmp13 mRNA表达变化；c：加入miR-15b-5p mimics与anti-miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13 蛋白表达变化)。
图5为lnc-HCAR通过充当miR-15b-5p海绵负向调控Vegfa和Mmp13的表达结果(a：在稳定过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中，转染miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13 mRNA qPCR检测结果；b：在稳定过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中，转染miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13Western blot检测结果；c：利用双荧光素酶报告基因检测miR-15b-5p与Vegfa和Mmp13 3’UTR 结合关系载体构建示意图)。
图6为软骨内成骨方式的原位骨修复模型中促进软骨基质降解和骨修复效果对比图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
实施例1、lnc-HCAR在软骨内成骨过程中的表达上调
1、骨髓MSCs成软骨分化诱导继而成肥大化软骨分化诱导
采用密度离心法进行骨髓MSCs的原代培养，待骨髓MSCs融合至90％左右时，用0.25％胰蛋白酶消化，再用不完全软骨诱导培养基(即DMEM低糖培养基中添加1％ITS+premix， 100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素、50μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)重悬并调整细胞密度至5.0×105/mL，所得细胞悬液按每个15mL离心管中0.5mL细胞悬液(2.5×105个细胞)进行分装，然后500g离心10min使细胞凝集成团，离心结束后无需弃上清或重悬细胞，将离心管轻柔地放置于恒温培养箱中，静置24h，然后更换为完全软骨诱导培养基(即DMEM低糖培养基中添加10ng/mL TGF-β3，1％ITS+premix，100mg/mL 链霉素、100U/mL青霉素、50μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)，每个离心管加入完全软骨诱导培养基500μL，换液完成后轻弹离心管壁使细胞团处于自由悬浮状态，之后每隔3天换液，培养14天。从第15天开始，将离心管分为肥大组和对照组，肥大组更换为肥大化软骨诱导完全培养基(即从前述完全软骨诱导培养基中去除TGF-β3，降低地塞米松浓度至1nM，并添加20-100ng/mL的三碘甲状腺原氨酸(T3))，对照组仍然使用完全软骨诱导培养基，继续培养14天。
分别取诱导14天、21天、28天的细胞团，提取总RNA，逆转录为cDNA，PCR检测X 型胶原(Col X)的表达。使用All-in-One TM qRT-PCR Mix分别配制real-time PCR反应体系，按照八连管每管中包含SYBR 5ul、CDNA 1ul、Forward Primer 0.5ul、Reverse Primer0.5ul、 RNase Free dH2O 3ul共10ul配制，均匀混合后离心10s，将八连管放入PCR仪上，按照之前设置的程序：预变性95℃，lmin循环(40次)；95℃-15s；58℃-20s；72℃-20s；末段延伸72℃ 5min；最后每20s升温1℃最后从72℃缓慢加热到99℃。
2、lnc-HCAR在软骨细胞肥大分化中表达上调
使用lncRNA芯片检测在软骨分化和肥大分化中差异表达的lncRNA，并且对它们的潜在信号传导途径进行了生物信息学分析。发现lnc-HCAR(NONMMUT038035)，其在肥大性软骨分化中显着增加，表明其可能在软骨细胞的肥大分化中起作用。为了验证lncRNA芯片结果的准确性，使用qPCR检测软骨细胞肥大期间的lnc-HCAR表达。lnc-HCAR核苷酸序列：
5'-ATGGCGGATTCTGAGCGTCTCTCGGCCCCCGGCTGCTGGTTAGCCTGTACCAGCTTCT CGAGCACCAAAAAGGGAATTCTCCTGTTTGCTGAGATTATACTGTGCCTGGTGATTTTGA TTTGCTTCAGTGCATCTACAACATCGGCCTACTCCTCCCTGTCGGTGATTGAGATGATCT GCTGCTGTCTTACTTGTCTTCTACACGTGTGACCTGCACTCCAAGATATCATTCATCAACT GGCCTTGGACTGACTTCTTCAGATCCCTCATAGCAACCATCCTGTACCTGATCACCTCCA TTGTTGTCCTTGTAGAAGGAAGAGGCAGCTCCAGAGTTGTTGCTGGGATACTGGGCTTA CTTGCTACGTTGCTCTTTGGCTACGATGCATACATCACCTTCCCTCTAAAGCAGCAAAGA CATACAGCAGCCCCCACTGACCCCACTGATGGCCCATGA-3'，(SEQ ID NO.1)；
lnc-HCAR 3'端引物序列：5'-GATGACTGCTGCTGTCT-3'，(SEQ ID NO.2)；
lnc-HCAR 5'端引物序列：5'-GCTGCCTCTTCCTTCTAC-3'，(SEQ ID NO.3)。
图1为实时定量PCR检测lnc-HCAR在软骨细胞肥大化分化阶段的表达变化。图1a为lnc-HCAR在软骨肥大化分化阶段的14d、21d和28d的表达变化。每组n＝3。图1b为lnc-HCAR与肥大化标志基因Col10a1在7d、14d、21d和28d表达的相关性。每组n＝3。**，P<0.01。
图1a的PCR结果与lncRNA微阵列一致，显示肥大软骨细胞增加4.3倍。此外，为了研究HCAR表达是否与软骨细胞肥大相关，进一步检测了HCAR和Col10a1(软骨细胞肥大软骨细胞的标志物)之间的相关性，图1b结果表明，在软骨诱导后7,14,21和28天，lnc-HCAR表达水平与Col10a1高度相关。
实施例2、lnc-HCAR在软骨内成骨过程中调节肥大软骨细胞中的Vegfa和Mmp13表达
为了研究lnc-HCAR是否调节软骨内成骨中的软骨细胞肥大，分别使用慢病毒载体对 lnc-HCAR进行过表达和敲低。细胞微团培养法用于体外诱导软骨细胞肥大分化，这是体外软骨细胞增生分化为软骨内成骨的理想模型。不同组的MSCs在离心后第二天开始软骨诱导，并且在软骨诱导后第14天进行肥大诱导。诱导肥大后14天收集细胞团块。用多聚甲醛固定细胞沉淀提取总RNA，总蛋白等，并用茜素红染色。然后，使用qPCR和western印迹分析检测软骨细胞肥大分化的标志物。
图2为过表达和沉默lnc-HCAR后，检测软骨内成骨过程中相关基因及软骨基质矿化变化。图2a为实时定量PCR检测软骨内成骨关键基因的表达变化，每组n＝3。图2b为Western blot分析检测软骨内成骨关键基因的表达变化的代表性图像，每组n＝3。
图2a、b的qPCR结果显示，在lnc-HCAR过表达或敲低后，软骨细胞肥大分化相关基因如Runx2，Hoxa2，Mef2c和Osx没有显著差异。上述标记基因的Western blot结果与qPCR一致，并且在过表达或敲低lnc-HCAR后没有观察到显著差异。然而，涉及软骨内成骨中软骨基质重塑的两个必需基因Vegfa和Mmp13在干预lnc-HCAR表达后在RNA和蛋白质水平上均发生了变化。lnc-HCAR过表达时，RNA和蛋白质中Vegfa和Mmp13的表达水平均显著高于对照组。相比之下，与对照组相比，敲除lnc-HCAR导致Vegfa和Mmp13基因表达的降低。
此外，为了研究lnc-HCAR在软骨内成骨过程中基质矿化的作用，我们在细胞团的载玻片上进行了茜素红染色。图2c为茜素红染色分析各组软骨基质矿化的代表性图像。每组n＝3。 *，P<0.01，**，P<0.01。shNC，对照组沉默慢病毒组；shHCAR，沉默lnc-HCAR慢病毒组； NC，过表达慢病毒对照组；HCAR，过表达lnc-HCAR慢病毒组。
图2c的茜素红染色结果显示，在过表达和敲低lnc-HCAR表达后，实验组和对照组的茜素红染色强度没有显着差异。
基于上述观察，得出结论：lnc-HCAR对软骨细胞肥大分化和基质矿化没有影响，但促进软骨内成骨过程中软骨细胞肥大分化中Vegfa和Mmp13的表达。故而，lnc-HCAR可通过提高Vegfa和Mmp13的表达促进软骨内成骨中的血管形成和基质重塑。
实施例3、lnc-HCAR充当miR-15b-5p分子海绵的作用，从而调控Vegfa和Mmp13表达
1、lnc-HCAR充当miR-15b-5p海绵的作用
为了证实lnc-HCAR在肥大软骨细胞中调节miR-15b-5p，在lnc-HCAR过表达和敲低肥大软骨细胞中检测到miR-15b-5p表达。
图3为lnc-HCAR能够充当miR-15b-5p海绵的作用。图3a为过表达和沉默lnc-HCAR后，实时定量PCR检测肥大软骨细胞中miR-15b-5p的表达变化。每组n＝3。图3b为利用双荧光素酶报告基因检测miR-15b-5p与lnc-HCAR结合关系载体构建示意图。图3c为双荧光素酶报告基因检测结果。每组n＝3。**P<0.01。shNC，对照组沉默慢病毒组；shHCAR，沉默lnc-HCAR慢病毒组；NC，过表达慢病毒对照组；HCAR，过表达lnc-HCAR慢病毒组。 HCAR-mut，lnc-HCAR上miR-15b-5p结合位点突变型。
图3a的qPCR结果显示，miR-15b-5p在lnc-HCAR敲除的肥大软骨细胞中显着增加。相反，过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中miR-15b-5p显着降低。此外，miR-15b-5p表达与NC组相比没有显著差异，当转染用于肥大软骨细胞的lnc-HCAR-miR15b-mut载体时。
为了进一步证明miR-15b-5p直接结合lnc-HCAR，进行双荧光素酶报告基因测定。图3b 中显示了双荧光素酶报告载体(psiCheck2.0)和lnc-HCAR野生型和miR-15b-结合位点突变型的序列。将lnc-HCAR野生型或lnc-HCAR-miR-15b-mut突变体克隆到psiCheck2.0载体中。当转染进miR-15b-5p mimics后lnc-HCAR野生型组中的萤火虫/海肾荧光强度比显着增加。相反，在lnc-HCAR-mut组中萤火虫/海肾比率没有显著变化。
综合起来，上述结果表明miR-15b-5p直接与lnc-HCAR结合，并且在肥大软骨细胞中， lnc-HCAR能够作为miR-15b-5p海绵。
2、miR-15b-5p对肥大化软骨细胞中Vegfa和Mmp13基因表达的作用
为了研究miR-15b-5p是否调节Vegfa和Mmp13，将抗miR15b和miR15b模拟物转染到肥大的软骨细胞中。
图4为miR-15b-5p调控Mmp13和Vegfa表达的情况。图4a为Vegfa和Mmp13 mRNA的3’UTR中与miR-15b-5p序列重合关系示意图。图4b为加入miR-15b-5p mimics与 anti-miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13 mRNA表达变化。每组n＝3。图4c为加入miR-15b-5p mimics与anti-miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13蛋白表达变化。每组n＝3。*，P<0.01，**，P <0.01。anti-NC，沉默miRNA对照组；anti-miR15b，沉默miR-15b-5p组；NC，过表达miRNA 对照组；miR-15b，过表达miR-15b-5p组。
图4b表明：用抗miR15b转染的肥大软骨细胞中Vegfa和Mmp13的mRNA水平显着高于miR15b模拟物转染的细胞中的mRNA水平。此外，Western blot分析结果(图4c)显示 miR-15b-5p可抑制肥大软骨细胞中Mmp13和Vegfa蛋白的表达，这与qPCR(图4b)结果一致。上述结果表明miR-15b-5p负向调节Vegfa和Mmp13。
3、lnc-HCAR通过作为miR-15b-5p海绵负向调控Vegfa和Mmp13的表达
通过Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测分析，显示miR-15b-5p可结合Vegfa 和Mmp13 3'UTR。为了证明lnc-HCAR是否通过miR-15b-5p调节Vegfa和Mmp13，将抗 miR15b转染到过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中。
图5为lnc-HCAR通过充当miR-15b-5p海绵负向调控Vegfa和Mmp13的表达。图5a为在稳定过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中，转染miR-15b-5p后Vegfa和Mmp13 mRNA的qPCR检测结果。图5b为在稳定过表达lnc-HCAR的肥大软骨细胞中，转染miR-15b-5p后 Vegfa和Mmp13的Western blot检测结果。每组n＝3。图5c为利用双荧光素酶报告基因检测 miR-15b-5p与Vegfa和Mmp13 3’UTR结合关系载体构建示意图。*，P<0.01，**，P<0.01。 HCAR，过表达lnc-HCAR慢病毒组。HCAR-mut，lnc-HCAR上miR-15b-5p结合位点突变型。
图5a的qPCR结果显示，当引入抗miR-15b时，Vegfa和Mmp13 mRNA的水平与对照组相比显著增加。类似地，Western blot(图5b)分析的结果与qPCR(图5a)一致。
使用双荧光素酶报告基因测定法来研究miR-15b-5p是否直接结合Vegfa和Mmp133'UTR。将野生型和突变体Vegfa和Mmp13 3'UTR分别克隆到双荧光素酶报道基因载体中。双荧光素酶报道基因构建体显示在图5c中。当引入miR-15b-5p时，野生型Vegfa组中的萤火虫/海肾显着增加，并且在Vegfa组中未发现相同的结果。类似地，miR-15b-5p显着增加野生型Vegfa 组中的萤火虫/海肾，但不在Mmp13-mut组中。这些结果证明miR-15b-5p直接结合Vegfa和 Mmp13 3'UTR。
以上证实了lnc-HCAR通过作为miR-15b-5p海绵负向调控Vegfa和Mmp13的表达。
实施例4、在软骨内成骨方式的原位骨修复模型中，上调lnc-HCAR可增强Vegfa和Mmp13表达，促进血管化和骨修复效果
1、lnc-HCAR干预的基于软骨内成骨方式的组织工程骨构建
将lnc-HCAR过表达慢病毒进行MSCs转染，感染指数20-50，感染24h后更换为基础培养基。24小时后，加入2μg/mL嘌呤霉素进行抗性筛选，将未被嘌呤霉素杀死的细胞进行传代扩增。将脱细胞骨基质(DBM)进行辐照消毒后放入24孔细胞培养板，每孔加入1mL MSCs完全培养基中浸泡24小时。细胞计数，将细胞悬液浓度调整为2×107个/mL，然后接种于DBM上。将其放入37℃细胞培养箱静置2小时，然后加入软骨诱导完全培养基，进行 2周软骨诱导，而后更换软骨诱导完全培养基为肥大化诱导完全培养基继续培养2周。MSCs 细胞经过了lnc-HCAR过表达慢病毒处理的，称为HCAR组；未经过lnc-HCAR过表达慢病毒处理的，称为对照组。
2、小鼠股骨中段大段骨缺损模型的构建
取8周龄Balb/c小鼠，通过腹膜内注射0.5％戊巴比妥钠(10mL/kg)将Balb/c小鼠麻醉。股骨暴露并进行内固定，麻醉后将小鼠四肢固定在手术台。在双侧下肢碘伏消毒后，在股骨远端髁上侧外侧做1cm皮肤切口。在股直肌和半腱肌的肌肉间隙进行钝性分离，直至股骨中间轴完全暴露。从转子到髁骨膜仔细解剖，暴露股骨。然后将自行设计的内固定板置于股骨干外侧。使用0.4mm的钻头，穿透整个股骨的四个孔沿板上的孔钻出，在钻孔的同事使用生理盐水冲洗以避免钻孔处热损伤，并用螺钉将板紧紧固定在股骨上。使用带有盐水冲洗装置的牙科磨光机将大约2mm的中间股骨干磨掉，并且将制造的骨缺损用无菌盐水溶液洗涤三次。之后，将基于软骨内成骨的组织工程骨(包括HCAR组和对照组)植入骨缺损处，使用手术缝线打结固定于骨缺损处。植入后，肌肉和皮肤逐层封闭。手术后每天给予切口消毒和肌肉注射抗生素直到术后第三天。术后2周和8周取材观察。解剖股骨并在PBS中的4％多聚甲醛中固定两天。股骨用10％EDTA(Sigma)溶液脱钙两周并包埋在石蜡中。分别取骨断端标本进行组织学、组织化学、microCT扫描等检测。利用Masson染色观察缺损区新生骨的形成。图6为软骨内成骨方式的原位骨修复模型中，上调lnc-HCAR可促进Vegfa和Mmp13表达，成功促进软骨基质降解和骨修复效果。
图6的结果表明：在植入后两周，过表达lnc-HCAR组中可见有肥大的软骨细胞和矿化基质。植入8周后，HCAR组的移植区域组织学显示还存在少量软骨基质，大部分已通过软骨内成骨矿化成骨。而过表达空白对照组NC仍有大部分软骨组织没有矿化。总之，体内实验结果显示，lnc-HCAR在基于软骨内成骨方式的骨修复中的应用，可以有效促进软骨基质的重塑和骨形成，从而有效的实现骨修复。
需要说明的是，本发明未描述的试验方法和条件均为本领域常规使用的方法和条件。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用及骨修复体系和制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 457
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcggatt ctgagcgtct ctcggccccc ggctgctggt tagcctgtac cagcttctcg 60
agcaccaaaa agggaattct cctgtttgct gagattatac tgtgcctggt gattttgatt 120
tgcttcagtg catctacaac atcggcctac tcctccctgt cggtgattga gatgatctgc 180
tgctgtctta cttgtcttct acacgtgtga cctgcactcc aagatatcat tcatcaactg 240
gccttggact gacttcttca gatccctcat agcaaccatc ctgtacctga tcacctccat 300
tgttgtcctt gtagaaggaa gaggcagctc cagagttgtt gctgggatac tgggcttact 360
tgctacgttg ctctttggct acgatgcata catcaccttc cctctaaagc agcaaagaca 420
tacagcagcc cccactgacc ccactgatgg cccatga 457
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgactgct gctgtct 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgcctctt ccttctac 18
Claims (10)
1.长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR可促进Vegfa基因和Mmp13基因的表达。
3.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR可竞争性结合miR-15b-5p。
4.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR可促进软骨细胞肥大分化。
5.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR可促进软骨内成骨中的血管形成。
6.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-HCAR在制备基于软骨内成骨方式的骨修复体系中的应用，其特征在于，所述lnc-HCAR可促进软骨内成骨中的基质重塑。
7.基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系，其特征在于，所述体系包括lnc-HCAR、基因运载体系、间充质干细胞和多孔骨支架材料。
8.如权利要求7所述于基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系，其特征在于，所述基因运载体系为慢病毒包装体系、腺病毒包装体系、逆转录包装体系或裸质粒；所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞，所述多孔骨支架材料为脱细胞骨基质或脱钙骨基质。
9.基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系的制备方法，其特征在于，通过lnc-HCAR过表达的基因运载体系将lnc-HCAR导入间充质干细胞，再将过表达lnc-HCAR的间充质干细胞种植于多孔骨支架材料上，在体外进行成软骨分化诱导培养，再进行成肥大化软骨分化诱导培养，得到骨修复体系。
10.根据权利要求9所述的基于长链非编码RNA lnc-HCAR的骨修复体系，其特征在于，所述成软骨分化诱导培养的时间为10～14天，所述成肥大化软骨分化诱导培养的时间为10～14天。
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