CN107034194A - Yap的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及YAP的用途。本发明研究结果表明，YAP能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有YAP基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。

Description

YAP的用途
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及YAP的用途。
背景技术
间充质干细胞是最初从骨髓中分化而来的多向分化潜能干细胞，可分化为多种不同种类的细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞以及脂肪细胞等。越来越多的证据证明间充质干细胞可存在于非骨髓组织中。多数成人的间充质干细胞可用于细胞介导的组织工程。源于骨髓、骨膜、以及脂肪组织等不同组织的间充质干细胞拥有相似的表面标记特征，但是不同组织来源的间充质细胞在分化、增殖以及迁移等方面存在着显著差异。在过去的几十年里，基于其干细胞的特性，一类新的干细胞从口腔颌面组织中分离出来，包括源于牙周膜、牙髓以及根尖乳头等组织的干细胞。这些细胞具有多向分化潜能、成骨/成牙本质分化及自我更新能力。将其移植到小鼠或小型猪体内，可以生成骨样/牙本质样矿化组织并具有修复牙体组织缺损的能力。相比较源于骨髓的间充质干细胞，这类干细胞更易获得，而且与牙体组织有着更紧密的联系。因此牙源性间充质干细胞为牙齿组织的再生提供了可靠的细胞来源，但是其成牙定向分化的分子机制尚未明确，限制了其潜在的应用。
YAP蛋白(Yes associated protein)是Hippo信号通路中一个起中心作用的开关蛋白，Yap作为一种基因转录共抑制因子，在维持干细胞自我更新及分化方面起着重要作用。然而，YAP在牙源性间充质干细胞中的作用及作用机制尚不明确。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供提供YAP的用途，本发明研究表明，YAP基因能够调控通过调控与成骨、成牙相关基因的表达，实现对间充质干细胞成骨/成牙定向分化的调控。
本发明提供了YAP在制备调控间充质干细胞成牙相关基因表达的制剂中的应用。本发明实施例中，成牙相关基因为DSPP、DMP1和/或OSX。一些实施例中，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
本发明还提供了YAP在制备调控间充质干细胞内成骨相关基因的制剂中的应用。本发明实施例中，所述成骨相关基因为BSP和/或OSX。一些实施例中，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
本发明所述调控具体为：过表达YAP基因，抑制BSP基因、OSX基因、DSPP基因和/或DMP1基因的表达。敲除YAP基因，促进BSP基因、OSX基因、DSPP基因和/或DMP1基因的表达。
本发明所述YAP为YAP蛋白、YAP基因序列、能够过表达间充质细胞中YAP基因的物质，或者能够敲除间充质细胞中YAP基因的物质。
所述YAP基因核苷酸序列的登录号为GeneID:10413，所述YAP蛋白氨基酸序列有登录号为GeneID:10413的核苷酸序列翻译而来。
所述能够过表达间充质细胞中YAP基因的物质为包含YAP基因的表达载体；或者由包含YAP基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pQCXIH。
所述能够敲除间充质细胞中YAP基因的物质为BAXR1的siRNA，序列为GCTTCAGGTCCTCTTCCTGAT。或者为将BAXR1的siRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成BAXR1的shRNA质粒。
本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的YAP基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mRNA水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞BSP基因、DSPP基因、OSX基因和DMP1基因的表达。结果中，所述抑制与未经过表达的正常根尖牙乳头间充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。
本发明实施例中，敲除脐带间充质干细胞中的YAP基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mRNA水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，敲除YAP促进脐带间充质干细胞BSP基因、DSPP基因、OSX基因和DMP1基因的表达。结果中，所述促进与未经敲除的正常脐带充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。
本发明实施例中，敲除骨髓间充质干细胞中的YAP基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，2～3周后，在mRNA水平检测与成骨相关、成牙相关基因。结果表明，敲除YAP促进骨髓间充质干细胞BSP基因、DSPP基因、OSX基因和DMP1基因的表达。结果中，所述促进与未经敲除的正常骨髓充质干细胞相比，具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。
本发明还提供了YAP在制备调控间充质干细胞内BARX1基因表达的制剂中的应用。
前期研究表明，AP2a可以促进间充质干细胞成骨/成牙分化。本发明通过实时定量RT-PCR检测结果表明，基因敲除YAP，能够促进BARX1在间充质干细胞的表达，染色质免疫共沉淀(CHIP)结果证实了YAP和AP2a在间充质干细胞可以形成蛋白复合体，通过AP2a结合到BARX1基因启动子序列，共同抑制BARX1基因的表达，从而调节间充质干细胞的分化功能。具体的，所述YAP通过与AP2a形成蛋白复合体，抑制BARX1表达。
本发明还提供了YAP基因在制备调控间充质干细胞矿化能力的制剂中的应用。
所述调控具体为敲除YAP基因促进骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞的体外矿化能力；所述矿化指钙化结节的形成。
本发明实施例中，过表达根尖牙乳头间充质干细胞中的YAP基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明过表达YAP促进根尖牙乳头间充质干细胞体外矿化能力。
本发明实施例中，敲除脐带或骨髓间充质干细胞中的YAP基因，培养后以成骨诱导培养液诱导干细胞分化，定期在光镜下观察钙结节形成情况。结果表明敲除YAP促进脐带或骨髓间充质干细胞体外矿化能力。
本发明还提供了YAP在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。
本发明实施例中，间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
如前所述，本发明实验表明，过表达YAP基因能够抑制间充质干细胞内成牙相关基因的表达；且抑制成骨相关基因的表达。而敲除YAP基因能够促进间充质干细胞内成牙相关基因的表达；且促进成骨相关基因的表达。最终结果表明，过表达YAP基因能够抑制间充质干细胞成牙分化，抑制成骨分化。敲除YAP基因能够促进间充质干细胞成牙分化，促进成骨分化。
为了验证过表达YAP对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，将SCAPs与HA/TAP混合，植入裸鼠皮下，观察过表达YAP后在体内环境中对SCAPs分化的影响。结果显示，实验组根尖牙乳头干细胞成矿化组织能力显著弱于对照组，实验组矿化组织形成面积较对照组明显减小。
本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其包括YAP表达抑制剂或能够敲除YAP基因的物质。本发明实施例中，该制剂包括能够敲除YAP基因的物质；具体为YAP的siRNA插入慢病毒的shRNA载体上构建而成YAP的shRNA质粒。
本发明还提供了一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其包括YAP蛋白或能够过表达YAP基因的物质。本发明实施例中，钙制剂包括能够过表达YAP基因的物质，具体的为：由包含YAP基因的表达载体转染的逆转录病毒。所述逆转录病毒的表达载体为pQCXIH。
本发明还提供了一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其为敲除间充质干细胞的YAP基因，或以含有YAP表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。
本发明还提供了一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其为过表达间充质干细胞的YAP基因，或以含有YAP的诱导液对间充质干细胞进行诱导。
促进间充质干细胞成牙分化亦可称为促进牙组织再生；促进间充质干细胞成骨分化可称为促进骨组织再生。
本发明研究结果表明，YAP能够通过调控成骨、成牙基因的表达，影响间充质干细胞向成骨、成牙的分化，从而影响间充质干细胞体外内矿化能力。本发明为制备含有YAP基因的骨组织或牙组织再生药物提供技术支持。
附图说明
图1是过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化、抑制成牙分化；其中图1-a示qRT-PCR结果显示OSX的表达；图1-b示qRT-PCR结果显示BSP的表达；图1-c示qRT-PCR结果显示DSPP的表达；图1-d示qRT-PCR结果显示DMP1的表达；
图2是基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；其中图2-a示基因敲除YAP的qRT-PCR结果；图2-b示茜素红染色；图2-c示钙离子定量分析；图2-d示qRT-PCR结果显示OSX的表达；图2-e示qRT-PCR结果显示BSP的表达；图2-f示qRT-PCR结果显示DSPP的表达；图2-g示qRT-PCR结果显示DMP1的表达；
图3是基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成牙分化；其中图3-a示基因敲除YAP的qRT-PCR结果；图3-b示茜素红染色；图3-c示qRT-PCR结果显示BARX1的表达；图3-d示qRT-PCR结果显示OSX的表达；图3-e示qRT-PCR结果显示BSP的表达；图3-f示qRT-PCR结果显示DSPP的表达；图3-g示qRT-PCR结果显示DMP1的表达；
图4是过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞体内成骨/成牙分化，标尺100μm；4-a示HE染色显示HA/TCP复合空载体根尖牙乳头干细胞(SCAPs-pQCXIH+HA/TCP)裸鼠背部皮下回植结果，图4-b示HE染色显示HA/TCP复合过表达YAP根尖牙乳头干细胞(SCAPs-Myc-YAP+HA/TCP)裸鼠背部皮下回植结果；图4-c示实验组与对照组的新生矿化组织面积与回植物总面积的百分比；
图5是AP2a或YAP在间充质干细胞抑制BARX1的表达；其中图5-a示Flag-BCOR的Western Blot结果；图5-b示qRT-PCR结果显示BARX1的表达；图5-c示Flag-AP2a的WesternBlot结果；图5-d示qRT-PCR结果显示BARX1的表达；图5-e示Myc-YAP的Western Blot结果；图5-f示qRT-PCR结果显示BARX1的表达；图5-g示qRT-PCR结果显示YAP的表达；图5-h示qRT-PCR结果显示BARX1的表达；图5-i示CHIP结果显示BARX1启动子上AP2a蛋白的结合；
图6是YAP和AP2a在间充质干细胞形成蛋白复合体；其中图6-a示Co-IP结果显示过表达YAP后YAP-AP2a蛋白复合体的形成；图6-b示Co-IP结果显示基因敲除YAP后YAP-AP2a蛋白复合体的形成；图6-c示Co-IP结果显示过表达AP2a后YAP-AP2a蛋白复合体的形成；图6-d示qRT-PCR结果显示AP2a在非牙源性间充质干细胞(WJCMSCs、ADSCs、BMSCs)与牙源性间充质干细胞(SCAPs、DPSCs、PDLSCs)中的表达；图6-e示qRT-PCR结果显示YAP在非牙源性间充质干细胞(WJCMSCs、ADSCs、BMSCs)与牙源性间充质干细胞(SCAPs、DPSCs、PDLSCs)中的表达；图6-f示Co-IP结果显示WJCMSCs与SCAPs中YAP-AP2a蛋白复合体的形成；
图7是RUNX2与AP2a竞争性结合YAP；其中图7-a示Co-IP结果显示过表达YAP后YAP-RUNX2蛋白复合体的形成；图7-b示Co-IP结果显示基因敲除YAP后YAP-RUNX2蛋白复合体的形成；图7-c示Co-IP结果显示过表达AP2a后YAP-RUNX2蛋白复合体的形成。
具体实施方式
本发明提供了YAP的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1)干细胞的分离、培养与鉴定
人体组织的利用得到首都医科大学伦理委员会的批准，志愿者均知情同意术前签订知情同意书。获取了人恒牙根尖牙乳头组织，按照以往文献报道的方法分离和培养根尖牙乳头干细胞。
将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷PBS的离心管，移送进细胞室，在24h内分离培养根尖牙乳头干细胞。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取根尖牙乳头组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和Dispase(4g/L)的消化液，37℃下消化1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO2培养，每2～3天换液1次。
每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1:2消化传代。通过检测间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90、CD146、STRO-1和干细胞的多向分化能力、克隆形成能力等方法鉴定间充质干细胞。购买脐带间充质干细胞。购买脐带间充质干细胞。
2)构建病毒质粒
通过NCBI数据库查询YAP的基因序列(GeneID:10413)，应用Whitehead提供的程序设计YAP的SiRNA(序列为GCTTCAGGTCCTCTTCCTGAT)，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成YAP的shRNA的质粒。设计YAP基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到YAP的全长并加表面标记Myc，将其连接到逆转录病毒的表达载体(pQCXIH)上，测序鉴定，最终构建成Myc-YAP的质粒。然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在-80度冰箱。
3)稳定转染细胞系的建立
对照Scramble的shRNA，YAP的shRNA转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞，转染48小时后，用puromycin筛选7天后得到对照Scramble和YAP基因敲除的稳定转染干细胞，提取细胞的mRNA和蛋白，在mRNA水平和蛋白水平检测shRNA的敲除效果。
对照质粒及Myc-YAP的病毒转染根尖牙乳头干细胞、脐带干细胞，转染48小时后，用药物筛选得到YAP过表达的稳定转染干细胞，在mRNA和蛋白水平检测Myc的表达鉴定外源性YAP的表达。结果表明YAP基因敲除及过表达稳定转染细胞的建立。
本实施例中所采用的具体方法：
1)实时反转录聚合酶链式反应的过程为：
1.引物设计，Primer 3及oligo 6等生物软件；
2.RNA提取：
2.1培养皿细胞弃上清，PBS冲洗2遍，加700ul QIAZOL，吹打混匀，收于EP管，室温孵育5min，加140ul氯仿，强力震荡混匀15s，室温孵育3min，4℃12000g离心15min，收上清于新EP管；
2.2取700ul样本至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
2.3加700ul Buffer RWT至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
2.4加500ul Buffer RPE至RNeasy Mini column，4℃8000g离心15s，弃下层液体；
2.5重复步骤2.4；
2.6转移RNeasy Mini column至一新2ml collection tube，4℃1000g离心1min，弃下层液体；
2.7转移RNeasy Mini column至一新2ml collection tube，加30-50ul RNase-free water，4℃8000g离心15s，收集下层液体于新EP管，测RNA浓度，-80℃保存。
3.反转录PCR
3.1Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液：模板RNA：1ng～5ug；Oligo(dT)(500μg/ml)：1μl；10mM dNTP：1μl；加入灭菌蒸馏水至12ul。
3.2 65℃保温5分钟后迅速在冰上冷冻1分钟以上。
3.3离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
3.4在上述Microtube管中配制加入下列反转录反应液：5×first strandbuffer：4ul；0.1M DTT：2ul；RNase OUT：1ul。
3.5混匀各组分，37℃保温2分钟后冰上冷却。
3.6加入1ul M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀。
3.7 37℃保温2分钟，70℃保温15分钟，4℃保温，样本收于-20℃。
4.实时定量荧光PCR
配置Real-time PCR反应体系如下：5×SYBR Mix：5μl；PCR Primer(5pmol)：0.5μl；ddH2O：5μl；cDNA：10.5μl；Total 21μl。
反应体系如表1：
表1反应体系
2)Western Blot的过程为：
1.细胞总蛋白的提取
1.1弃培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，加入5ml PBS后，用细胞刮下培养皿中的细胞，收于15ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min；
1.2弃上清，以1:5(细胞：裂解液)体积比加裂解液(100ul RIPA+1ul PMSF+1ulPIC)，冰上15min，每2-3min混悬一次；
1.3 4℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中，-80℃保存。
2.Bradford法测定蛋白浓度
2.1 BSA蛋白标准品按说明依次用双蒸水稀释，使终浓度分别为1000μg/ml，750μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，0μg/ml；
2.2根据样品和标准品数量，按每孔加200ul 1X考马斯亮蓝液，取1ul样品和标准品加入96孔板中，室温孵育5min，设副孔和空白孔；
2.3测定595nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白浓度；
2.4根据蛋白浓度计算上样体积，每组蛋白的上样量为25μg。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.1准备预成胶；
3.2变性：每孔25μg蛋白量上样,用蒸馏水将待测样本体积稀释至20ul，每样本加入5ul loading buffer(溴酚蓝)，95℃加热10min；
3.3上样，以80V电压电泳至溴酚蓝电泳至分离胶，将电压调到100V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，终止电泳。
4.转膜
4.1准备预成膜；
4.2将电泳胶转移至预成膜中，使用BioRad半干转进行转膜；
4.3取出PVDF膜，TBST漂洗5min。
5.Western blot滤膜杂交
5.1将转印后的PVDF膜用5％脱脂奶粉室温摇床封闭1小时；
5.2 TBST漂洗10min×3次；
5.3将滤膜取出，放入5％脱脂奶粉稀释的一抗稀释液中，4℃摇床过夜；
5.4 TBST洗膜，10min×3次；
5.5将滤膜放入5％脱脂奶粉稀释的HRP标记的二抗中，室温摇床孵育1小时；
5.6 TBST洗膜，10min×3次。
6.显色
将PVDF膜胶面朝上放在保鲜膜上，加入1:1混合的显影液，使其均匀覆盖膜，暗室曝光，扫描。
实施例2 YAP对间充质干细胞成骨/成牙分化功能影响的体外研究
1)取实施例1构建的过表达YAP的根尖牙乳头间充质干细胞，以2×103/cm2的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液。
在mRNA水平检测相关核心转录因子OSX，结果表明过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞OSX的表达(图1-c)。
并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨分化指标-骨涎蛋白(BSP，图1-d)，结果表明过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞BSP的表达。
在mRNA水平检测成牙本质分化指标-牙本质涎蛋白(DSPP，图1-e)、牙本质基质酸性磷酸化蛋白1(DMP1，图1-f)，结果表明过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞DSPP和DMP1的表达。
上述结果表明过表达YAP抑制根尖牙乳头间充质干细胞成骨分化，抑制成牙分化。
2)取实施例1构建的敲除YAP的脐带间充质干细胞被使用慢病毒介导shRNA(YAPsh)感染，2μg/mL嘌呤霉素筛选后，实时定量RT-PCR检测结果表明，YAP可以被YAPsh有效的敲除(图2-a)；取脐带干细胞以2×103/cm2的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。
3周后检测茜素红染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞体外矿化能力(图2-b,2-c)。在mRNA水平检测相关核心转录因子OSX，结果表明基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞OSX的表达(图2-d)。
并在诱导0，3，7，14和21天的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨分化指标-BSP(图2-e)，结果表明基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞BSP的表达。
在mRNA水平检测成牙本质分化指标-DSPP(图2-f)、DMP1(图2-g)，结果表明基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞DSPP和DMP1的表达。
上述结果表明基因敲除YAP促进脐带间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。
3)取实施例1构建的敲除YAP的骨髓间充质干细胞被使用慢病毒介导shRNA(YAPsh)感染，2μg/mL嘌呤霉素筛选后，实时定量RT-PCR检测结果表明，YAP可以被YAPsh有效的敲除(图3-a)；
取骨髓干细胞以2×103/cm2的浓度接种于6孔板中，待细胞生长至80％融合后，用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨/成牙本质方向分化诱导，每3天换1次液，在光镜下观察钙结节形成情况。
3周后检测茜素红染色来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力，结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞体外矿化能力(图3-b)。
在mRNA水平检测下游基因BARX1，结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞BARX1的表达(图3-c)。
在mRNA水平检测相关核心转录因子OSX，结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞OSX的表达(图3-d)。
并在诱导0，3，7，10和14天的不同时间点收获细胞，在mRNA水平检测成骨分化指标-BSP(图3-e)，结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞BSP的表达。
在mRNA水平检测成牙本质分化指标-DSPP(图3-f)、DMP1(图3-g)，结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞DSPP和DMP1的表达。
上述结果表明基因敲除YAP促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进成牙分化。
具体过程为：
1.茜素红染色
1.1弃掉培养基，PBS洗2次；
1.2 70％乙醇固定，4℃，1h；
1.3双蒸水洗2次；
1.4 40mM茜素红溶液(pH 4.2)室温染色1-10min，肉眼观察着色情况；
1.5双蒸水洗5次，轻轻吹打；
1.6扫描仪透摄模式采集图像。
2.Ca2+浓度检测
2.1茜素红染色后，加入10％w/v CPC，室温放置30min(AR-S被溶解至CPC中)；
2.2以1:10稀释溶液，在酶标仪中以562nm波长测定其吸光度值(OD)；
2.3以AR-S标准曲线计算Ca2+的相对浓度。
3.Real-time RT-PCR
步骤同实施例1。RT-PCR引物序列为：
OSX-F：CCTCCTCAGCTCACCTTCTC(SEQ ID NO:1)；
OSX-R：GTTGGGAGCCCAAATAGAAA(SEQ ID NO:2)；
BARX1-F：CGCTTCGAGAAGCAGAAGTA(SEQ ID NO:3)
BARX1-R：CTTCATCCTCCGATTCTGGT(SEQ ID NO:4)
BSP-F：CAGGCCACGATATTATCTTTACA(SEQ ID NO:5)；
BSP-R：CTCCTCTTCTTCCTCCTCCTC(SEQ ID NO:6)；
DSPP-F：CGACATAGGTCACAATGAGGATGTCG(SEQ ID NO:7)；
DSPP-R：TTGCTTCCAGCTACTTGAGGTC(SEQ ID NO:8)；
DMP1-F：GACAGCCTCTCACTGGATTCGCTGTC(SEQ ID NO:9)；
DMP1-R：CTCGCACACACTCTCCCACTC(SEQ ID NO:10)；
GAPDH-F：CGGACCAATACGACCAAATCCG(SEQ ID NO:11)；
GAPDH-R：AGCCACATCGCTCAGACACC(SEQ ID NO:12)。
实施例3过表达YAP抑制根尖牙乳头干细胞体内矿化组织生成能力的研究
为了验证过表达YAP对根尖牙乳头干细胞牙向/骨向分化的影响，将SCAPs与HA/TAP混合，植入裸鼠皮下，观察过表达YAP后在体内环境中对SCAPs分化的影响。
取5只裸鼠，分别在其后肢皮下植入SCAPs与HA/TCP混合物，植入8周后，取出组织标本进行切片染色分析(图4)标尺100um。，图4-a为对照组(SCAPs-pQCXIH+HA/TCP)，图4-b示实验组(SCAPs-Myc-YAP+HA/TCP)。结果显示，实验组根尖牙乳头干细胞成矿化组织能力显著弱于对照组，实验组矿化组织形成面积较对照组明显减小(图4-c)。
具体过程为：
1.细胞移植
1.1分别取生长状态良好的第4代细胞，以1×105个/皿的密度接种于10cm培养皿，待细胞长至80％汇合度时弃掉培养基，用PBS漂洗(为保证细胞状态，细胞汇合度不宜过大)；
1.2每皿细胞加3ml不含EDTA的胰酶，于37℃孵育2min，将细胞从培养皿上洗脱，加入4ml含15％FBS、1％双抗和1％L-谷氨酰胺的α-MEM培养基中和胰酶作用，之后将细胞悬液转移至50ml的离心管中；
1.3于1000rpm，离心6min。
1.4用上述含15％FBS、1％双抗和1％L-谷氨酰胺的α-MEM培养基重悬细胞，计数，然后取1ml细胞悬液(约4×106个/ml)至含有40mg羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)的2ml圆底EP管中(要保证每组细胞量一致，约4×106个细胞/样本)。
1.5 37℃旋转摇床孵育1.5h。
1.6短时离心，使HA沉于管底，吸弃上清，细胞与HA混合物待用。
1.8裸鼠称重，4％水合氯醛腹腔注射麻醉。75％酒精消毒背部皮肤，在背部中线处剪一2-3cm的切口。
1.9钝性分离皮下结缔组织，将细胞与HA/TCP混合物植入裸鼠皮下，每只裸鼠可植入2个部位，左侧为对照组，右侧为实验组，缝合皮肤。
2.标本固定，脱钙，脱水包埋，制作石蜡切片
在体内移植8周后处死裸鼠，取出组织标本，置于4％多聚甲醛中固定，之后转至PH值等于7(7.4-7.6)的10％EDTA内，完全脱钙后流水冲洗24小时，随后将组织脱水包埋。
脱水步骤：75％乙醇Ⅰ：10min；75％乙醇Ⅱ：10min；85％乙醇Ⅰ：10min；85％乙醇Ⅱ：10min；95％乙醇Ⅰ：10min；95％乙醇Ⅱ：10min；无水乙醇Ⅰ：30min；无水乙醇Ⅱ：30min；二甲苯Ⅰ：30min；二甲苯Ⅱ：30min；浸蜡Ⅰ：30min；浸蜡Ⅱ：过夜。
包埋：浸蜡结束后，将组织转到预热的包埋框中，迅速倾入熔蜡，用温热的镊子调整组织块的位置，制冷机上放置，使熔蜡凝固。
切片：修整蜡块后在轮转切片机切5μm厚连续切片，将切片裱于多聚赖氨酸处理的玻片上，37℃干燥过夜。
石蜡切片HE染色步骤：二甲苯Ⅰ：10min；二甲苯Ⅱ：10min；无水乙醇Ⅰ：3min；无水乙醇Ⅱ：3min；95％乙醇Ⅰ：3min；95％乙醇Ⅱ：3min；85％乙醇：3min；75％乙醇：3min；流水冲洗：3min；蒸馏水洗：1min；苏木精液染色：2min；流水洗去苏木精液：30s；1％盐酸-乙醇：3s；流水冲洗返蓝：10min；蒸馏水洗：1min；0.5％伊红液染色：1min；蒸馏水稍洗：2s；80％乙醇：10s；95％乙醇Ⅰ：10s；95％乙醇Ⅱ：10s；无水乙醇Ⅰ：10s；无水乙醇Ⅱ：10s；二甲苯Ⅰ：2min；二甲苯Ⅱ：2min；中性树胶封固。
实施例4在间充质干细胞YAP和AP2a形成蛋白复合体调节BARX1基因表达
前期研究表明BCOR为AP2a上游基因，负向调控AP2a的表达，而AP2a可以促进间充质干细胞成骨/成牙分化。为了揭示YAP调节BARX1的分子机制，间充质干细胞利用表达FLAG标签的野生型BCOR和AP2a的逆转录病毒，在2微克/毫升嘌呤霉素筛选后，Western印迹结果表明BCOR、AP2a在间充质干细胞异位表达(图5-a、5-c)。实时定量RT-PCR结果显示，过表达BCOR促进BARX1在间充质干细胞的表达(图5-b)，过表达AP2a抑制BARX1在间充质干细胞的表达(图5-d)。
进一步，间充质干细胞利用表达Myc标签的野生型YAP的逆转录病毒，在2微克/毫升嘌呤霉素筛选后，Western印迹结果表明YAP在间充质干细胞异位表达(图5-e)；实时定量RT-PCR结果显示，过表达YAP抑制BARX1在间充质干细胞的表达(图5-f)。另外，间充质干细胞被使用慢病毒介导shRNA(YAPsh)感染，2μg/mL嘌呤霉素筛选后，实时定量RT-PCR检测结果表明，YAP可以被YAPsh有效的敲除(图5-g)；实时定量RT-PCR检测结果表明，基因敲除YAP促进BARX1在间充质干细胞的表达(图5-h)。
此外，生物信息学分析发现了BARX1的转录启动子上游2kb的保守序列区域存在着转录因子AP2a的蛋白结合位点，推测BARX1可能是转录因子AP2a的下游基因，其表达和功能受AP2a的调控，染色质免疫共沉淀(CHIP)结果证实了BARX1启动子上AP2a蛋白的结合(图5-i)(横坐标为AP2a binding site的缩写即AP2a BS，共有5个，5kb-down代表基因编码区下游5kb，作为阴性对照)。
对AP2a和YAP进行结构分析发现，AP2a存在PY结构域，YAP存在WW功能域，以往研究证实蛋白的PY结构域和WW功能域可以结合，免疫共沉淀(Co-IP)结果表明YAP和AP2a在间充质干细胞可以形成蛋白复合体(图6-a、6-b、6-c)。
在mRNA水平检测AP2a、YAP在非牙源性间充质干细胞(WJCMSCs、ADSCs、BMSCs)与牙源性间充质干细胞(SCAPs、DPSCs、PDLSCs)中的表达情况，结果显示相比牙源性间充质干细胞，AP2a在非牙源性间充质干细胞中表达升高(图6-d)，而YAP在两种间充质干细胞中表达没有明显差异(图6-e)，此外Co-IP结果显示YAP-AP2a蛋白复合体在非牙源性间充质干细胞WJCMSCs中多于牙源性间充质干细胞SCAPs(图6-f)。
上述结果表明在间充质干细胞中YAP和AP2a可以形成蛋白复合体，通过AP2a结合到BARX1基因启动子序列，共同抑制BARX1基因的表达，从而调节间充质干细胞的分化功能。
具体过程为：
1.Western Blot：
步骤同实施例1。
2.Real-time RT-PCR
步骤同实施例1。RT-PCR引物序列为：
YAP1-F：CACAGCATGTTCGAGCTCAT(SEQ ID NO:13)
YAP1-R：GACTACTCCAGTGGGGGTCA(SEQ ID NO:14)
AP2a-F：ACTGAGACTCCCGTCAATGG(SEQ ID NO:15)
AP2a-R：GCGTGTTCCTTAATCCGTGT(SEQ ID NO:16)
3.CHIP
3.1培养皿细胞中加入甲醛，终浓度为1％，37℃，15min；
3.2弃含甲醛的培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，加入5ml PBS后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，4℃2000rpm离心4min；
3.3弃上清，每样本加入含蛋白酶抑制剂的室温SDS裂解液200ul(100ul SDS裂解液+1ul PMSF+1ul PIC)，冰上10min；
3.4超声破碎，功率75％，3次，每次7-8s，间隔90s；
3.5 4℃，13000rpm离心10min，收集上清液于新EP管中；
3.6测DNA浓度，将各样本制成同浓度、同体积样本；
3.7用CHIP稀释缓冲液(含蛋白酶抑制剂)将上述样本稀释10倍；取1％稀释后的样本作为Input，加入20ul 5M NaCl，65℃，4h，-20℃保存待用；
3.8将剩余样本分组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入IgG2ug，4℃旋转摇床孵育1h；
3.9加入60ul蛋白A琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；
3.10轻柔离心，小心去除上清液，得到琼脂糖凝胶/抗体/组蛋白复合体，分别加入1ml下列缓冲液清洗上述复合体：
1)低盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；
2)高盐免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，3min/次，4℃5000rpm离心；
3)氯化锂免疫沉淀复合体清洗缓冲液，1次，1min/次，4℃5000rpm离心；
4)TE缓冲液，2次，1min/次，4℃5000rpm离心；
3.11在清洗后的复合体中加入250ul洗脱液(1％SDS，0.1M NaHCO3)，旋转摇床室温孵育15min，4℃5000rpm离心，将上清液转入新的EP管内，再重复一遍，共得到500ul洗脱后的样本；
3.12在洗脱样本中加入20ul 5M NaCl 65℃4h；
3.13 DNA纯化：
3.13.1在Input和洗脱样本中加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris-HCl(pH6.5)和1ul 20mg/ml蛋白酶K，45℃，1h；
3.13.2加入500ul酚/氯仿，涡旋混匀，静置5min，4℃14000rpm 5min离心；
3.13.3收集上清液至新EP管，加入1ml乙醇+1‰糖原，-20℃30min-1h，4℃14000rpm 10min离心；
3.13.4弃上清液，室温晾干，加入100-200ul双蒸水重悬。
3.14 Real-time PCR:
步骤同实施例1。Real-time PCR引物序列为：
BARX1-1-F：GGAGAGACAGTGGGCTCTTG(SEQ ID NO:17)
BARX1-1-R：GCCTGGAGTGAGGACAAAGA(SEQ ID NO:18)
BARX1-2-F：CAGGTGCCAGGGACTGAG(SEQ ID NO:19)
BARX1-2-R：AAGTCCTTTCTCCAGCTCCA(SEQ ID NO:20)
BARX1-3-F：TCCCACCAGAGTTTGGTCTT(SEQ ID NO:21)
BARX1-3-R：ACTGTTACTGGGCGGAGTTG(SEQ ID NO:22)
BARX1-4-F：CTCTGTGCCCTCCGTCAC(SEQ ID NO:23)
BARX1-4-R：AGACCAAAAGAGGCGTGAGA(SEQ ID NO:24)
BARX1-5-F：CTCCTTTTTGGCCTCCCTTC(SEQ ID NO:25)
BARX1-5-R：CCCAACCCCTAGGCTGAG(SEQ ID NO:26)
BARX1-NC-F：GGGATCTGACCAGCATCAGT(SEQ ID NO:27)
BARX1-NC-R：AAGATTCGCAAGGCAGCTAA(SEQ ID NO:28)
4.Co-IP
4.1弃培养基，用4℃预冷的5ml PBS漂洗细胞两次，加入5ml PBS后，用细胞刮刮下培养皿中的细胞，收于50ml离心管，1100rpm离心6min；弃上清，加入1ml PBS重悬细胞，收于EP管，7200rpm离心2min；
4.2弃上清，加入1ml IP裂解液，冰上15min，每2-3min混悬一次；
4.3 4℃，14000rpm离心15min，收集上清液于新EP管中；
4.4 Bradford法测定蛋白浓度，步骤同实施例1；
4.5根据蛋白样本的浓度将样本配制成同浓度同体积样本，取25ug蛋白样本作为Input，蛋白变性，步骤同实施例1；
4.6将剩余样本平均分为两组，目的蛋白组中加入免疫沉淀抗体2ug，阴性对照组中加入IgG 2ug，4℃旋转摇床孵育1h；
4.7加入40ul蛋白A琼脂糖珠子，4℃旋转摇床孵育过夜；
4.8轻柔离心，小心去除上清液，加入1ml 20％免疫共沉淀洗脱液清洗，4℃5000rpm离心30s，去除上清液，重复3-4次；
4.9加入30ul 2×loading buffer(溴酚蓝)，95℃加热5min变性；
4.10 Input与免疫共沉淀样本一起进行Western Blot，步骤同实施例1。
实施例5在间充质干细胞中，AP2a与RUNX2竞争性结合YAP形成蛋白复合体，调节间充质干细胞的分化
为了阐明YAP抑制间充质干细胞成骨分化的作用，通过查阅文献发现成骨相关转录因子RUNX2也存在PY功能域，在成骨细胞中可以和YAP形成蛋白复合体；过表达和基因敲除YAP的Co-IP结果表明YAP和RUNX2在间充质干细胞也是可以形成蛋白复合体的(图7-a、7-b)。此外，过表达AP2a的Co-IP结果显示YAP-RUNX2蛋白复合体减少(图7-c)，说明AP2a与RUNX2(成骨相关的转录因子)竞争性结合YAP。
以上结果说明在间充质干细胞中，YAP-RUNX2蛋白复合体调控干细胞成骨分化，而AP2a与RUNX2竞争性结合YAP，通过调控BARX1的表达，调节干细胞成牙分化。
具体过程为：
1.Co-IP
步骤同实施例4。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京口腔医院
<120> YAP的用途
<130> MP1619298
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctcctcagc tcaccttctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gttgggagcc caaatagaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcttcgaga agcagaagta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttcatcctc cgattctggt 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caggccacga tattatcttt aca 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcctcttct tcctcctcct c 21
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgacataggt cacaatgagg atgtcg 26
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttgcttccag ctacttgagg tc 22
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gacagcctct cactggattc gctgtc 26
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctcgcacaca ctctcccact c 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cggaccaata cgaccaaatc cg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agccacatcg ctcagacacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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cacagcatgt tcgagctcat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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gactactcca gtgggggtca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
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actgagactc ccgtcaatgg 20
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<211> 20
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ggagagacag tgggctcttg 20
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gcctggagtg aggacaaaga 20
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<400> 19
caggtgccag ggactgag 18
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 20
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
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<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agaccaaaag aggcgtgaga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctcctttttg gcctcccttc 20
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cccaacccct aggctgag 18
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gggatctgac cagcatcagt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aagattcgca aggcagctaa 20

Claims (12)

1.YAP在制备调控间充质干细胞成牙相关基因表达的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成牙相关基因为DSPP、DMP1和/或OSX。
3.YAP在制备调控间充质干细胞内成骨相关基因的制剂中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述成骨相关基因为BSP和/或OSX。
5.YAP在制备调控间充质干细胞内BARX1基因表达的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述YAP通过与AP2a形成蛋白复合体，抑制BARX1表达。
7.YAP在制备调控间充质干细胞成牙和/或成骨分化的制剂中的应用。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为根尖牙乳头间充质干细胞、脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
9.一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括YAP表达抑制剂或能够敲除、敲低YAP基因的物质。
10.一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的制剂，其特征在于，包括YAP蛋白或能够过表达YAP基因的物质。
11.一种促进间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，敲除或敲低间充质干细胞的YAP基因，或以含有YAP表达抑制剂的诱导液对间充质干细胞进行诱导。
12.一种抑制间充质干细胞成骨分化，或成牙分化的方法，其特征在于，过表达间充质干细胞的YAP基因，或以含有YAP的诱导液对间充质干细胞进行诱导。
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