CN107106706B

CN107106706B - lmo4基因表达的抑制剂在制备银屑病外用型治疗药物中的用途

Info

Publication number: CN107106706B
Application number: CN201580072725.4A
Authority: CN
Inventors: 周海胜; 张学军
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: WO2016115671A1; CN107106706A

Abstract

提供了人LIM domain only 4基因(lmo4)在制备银屑病(牛皮癣)外用型治疗药物中的应用。该药物的活性成分是抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体或抑制lmo4基因表达的重组慢病毒。

Description

lmo4基因表达的抑制剂在制备银屑病外用型治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域中lmo4基因的新用途，具体涉及抑制lmo4基因的表达以干预和抑制银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化，依此可用于制备外用型局部治疗银屑病(牛皮癣)治疗药物。

背景技术

银屑病(俗称“牛皮癣”)，以红斑、鳞屑为主要表现，奇痒，易感染，易复发。银屑病是一种常见的皮肤慢性炎症性疾病，有较强的遗传性并伴有自身免疫性特征，多见于青壮年。目前，我国银屑病发病率达到0.12％，患者已接近1,000万；就世界范围统计而言，银屑病的发病率占世界总人口的0.1％～3％，其中，欧洲发病率为4％；美国发病率已经高达2.6％，亚洲国家患病率大约为0.3％。通过对患者的调查发现，他们之中大约有55％的人有家族患病史。目前，临床上尚无治愈银屑病的药物，约10～40％的患者具有关节损伤，常伴发肿瘤、自身免疫系统疾病及与之相关的复杂疾病，如糖尿病、心血管、代谢性疾病等，而且多数患者终身患病，严重影响工作效率，患者的生存质量和生活质量极差。此外，银屑病具有明显的家族遗传特征，患者家庭中尚未患病的成员因担心和恐惧患病，带来极大的心理障碍。

银屑病的病因和发病机制还不清楚。已知正常人皮肤细胞更新依赖于皮肤基底层的角质形成细胞的增殖和分化，其分化过程需要经历基底层、棘层、颗粒层和角化层等，一般30天左右更新一代。每层细胞均有标志性分子，基底层细胞标记分子如：角蛋白5(Keratin 5，K5)、角蛋白14(K14)、转谷氨酰胺酶2(Transglutaminase 2，TG2)；棘层细胞标记分子如：TG5、TG1；颗粒层细胞标记分子如：TG3、K9、K10；角化层细胞标记分子如：S100A蛋白、外皮蛋白(Involucrin，IVL)等。目前，研究人员认为银屑病是一种以表皮过度增生伴随异常分化为特征的慢性复发性非感染性炎症性复杂皮肤病，也是一种在多基因遗传背景下由多种致病因子刺激机体免疫系统而引起的由T细胞介导为主的免疫相关性自身免疫紊乱性皮肤病，其可通过免疫介导人体免疫系统、神经系统和炎症介质等的平衡失调，产生多种细胞因子，最终作用并促使皮损部位炎症细胞浸润及炎症网络逐级放大，造成局部角质形成细胞异常分化和增生，表皮细胞的更新速度由正常人的30天左右缩短至1～3天。表皮角质细胞过度增殖、真皮炎性细胞浸润和真皮乳头微血管增生等是银屑病主要病理改变。由此可见，银屑病发生是各种因素导致最终的作用对象为局部的角质形成细胞异常分化和增生。目前认为银屑病发生、发展的三个主要环节是：多种致病因素协同作用-免疫、神经体液等失衡-角质形成细胞过度增殖和异常分化，导致银屑病的发生、发展。

银屑病的治疗方法很多，但是由于其病因错综复杂，目前许多治疗方法的疗效并不能确定，仅以改善患者症状为主。多年来，银屑病的传统治疗方法如局部治疗、光照疗法等在一定程度上可以改善银屑病的症状，但是疗效不佳、或无效。抗银屑病的生物制剂以单一受体或细胞因子(可能影响免疫系统的多个组件)为发病的中间标靶，中和、封闭和调节各个银屑病免疫异常环节，使其临床疗效得到一定改善，主要有单克隆抗体、融合蛋白、重组人源细胞因子或生长因子等，具体包括：促使T细胞凋亡的阿法西普(Elefacept、阿法赛特)；抑制T细胞活化或减少T细胞迁移的依法珠单抗(Efalizumab、依法利珠单抗)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)拮抗剂，如依那西普(Etanercept)、英利昔单抗(Infliximab、英夫利西单抗、英夫利昔单抗)、阿达木单抗(Adalimumab)、戈利木单抗(Golimumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab)等；IL12/IL23拮抗剂，如优特克单抗(Ustekinumab、乌司奴单抗、优斯它单抗)、布雷奴单抗(Briakinumab、ABT-874)等。其中依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、阿法西普和优特克单抗是经FDA批准应用的5种生物制剂，在中度至重度银屑病的治疗上使用越来越多。然而，由于这些生物制剂作用的靶标主要集中在银屑病发病的免疫环节，在用药的过程中，可能造成患者免疫系统的干预，针对中度、重度银屑病患者，有较多的不良反应而难以耐受，同时这些药物价格比较高，从而限制了这些药物的使用。

因此，现有银屑病的治疗主要集中在前两个环节，治疗效果不尽人意，缺乏针对其发病最后(第三个)环节(靶点)，即缺乏对角质形成细胞的过度增殖和异常分化进行干预和治疗的方法及药物。本发明就是通过干预和抑制银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化，达到综合治疗银屑病的目的。

lmo4基因的英文名称为LIM domain only 4，定位于人染色体1p22.3，Gene ID：8543。lmo4基因表达产物(LM04蛋白)最初是被定义为乳腺癌的免疫抗原，lmo4基因在超过50％的原腺癌中过度表达，提示lmo4基因具有维持乳腺上皮增生、抑制其分化的作用，它的异常表达与乳腺肿瘤的形成有关。临床实验表明，抑制lmo4基因的表达即可以抑制癌细胞的增殖，促进乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞的凋亡，且两者之间的分子机制没有明显差异。现有研究证实lmo4基因的功能是：在人胚胎发育阶段，lmo4基因的表达产物LM04蛋白可以介导上皮细胞的增殖、分化和迁移，促进神经管的闭合及皮肤组织的形成，同时还参与调控正常人皮肤组织的损伤修复(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，(95)：15418-15423；Developmental Biology.2006，(299)：122-136；Developmental Biology.2008，(321)：263-272)。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学、药物靶点筛选、细胞信号传导通路分析、疾病治疗等。

慢病毒(Lentivirus)载体系统具有如下特点：(1)安全，病毒大部分基因被删除或替换，所以病毒不具备自身复制能力，而且因为删除了LTR 3’U3使病毒不能产生病毒RNA，病毒具有自身灭活作用；(2)宿主范围广，由于用VSV-G替代HIV的胞膜糖蛋白，人、鼠等多种属多类型细胞都能高效感染；(3)不仅保留了普通逆转录病毒稳定整合宿主基因组的特点，而且增加了高效感染静止期细胞以及高表达外源蛋白并且能逃避甲基化抑制的特点；(4)结合RNA干涉(RNA interference，RNAi)技术，可制备用于下调特定基因表达的病毒感染液，以原位感染靶细胞而达到局部治疗的目的。慢病毒载体系统的这些特点使得其在分子生物学、细胞生物学等多学科和多领域中均得到广泛应用。

发明内容

LMO4蛋白是lmo4基因的表达产物，为研究LMO4是否与银屑病的皮肤组织细胞过度增殖和异常分化有关，本发明的发明人进行了以下实验：1)通过免疫组织化学方法检测银屑病病人的皮损组织标本和正常人皮肤组织标本中lmo4基因表达产物LMO4蛋白的表达水平，发现LMO4蛋白在银屑病皮损部位的皮肤组织细胞中的表达水平均明显高于正常皮肤组织细胞；2)原代培养正常人皮肤基底层的角质形成细胞进行体外细胞分化实验证实，lmo4基因的表达在分化过程中逐渐降低；3)通过对皮肤基底层的角质形成细胞过量表达LMO4蛋白，导致其增殖速度和分化速度均明显增加；4)通过慢病毒介导的基因敲低技术抑制lmo4基因的表达，降低LMO4蛋白量，可以抑制角质形成细胞的增殖和分化。

基于以上实验结果，可以证实在银屑病皮损部位的皮肤基底层角质形成细胞及其分化的棘层、颗粒层、角化层等各层表皮细胞中，lmo4基因发生了过量表达；lmo4基因的过量表达导致皮肤基底层的角质形成细胞的过度增殖和异常分化，引起皮肤各层细胞更新速度增加；抑制人皮肤角质形成细胞内lmo4基因的表达，可以有效降低角质形成细胞的增殖速度，延长其分化时间。

基于以上研究成果，本发明的一个目的是提供人LIM domain only 4基因(简称lmo4)的新用途，lmo4基因与银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化相关，抑制人皮肤组织细胞中lmo4基因的表达水平可干预和抑制银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化，因此，可以抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体或抑制lmo4基因表达的重组慢病毒为活性成分制备银屑病(牛皮癣)治疗药物，特别是外用型药物，通过抑制银屑病患者皮损部位的皮肤组织细胞中lmo4基因的表达，抑制角质形成细胞的过度增殖和异常分化，达到局部治疗银屑病的目的。

所涉及的“抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体”是基于慢病毒载体而构建的，能够表达小干涉RNA(small interference RNA，siRNA)并可以特异抑制lmo4表达的重组慢病毒载体。具体来讲，其构建可包括以下步骤：

1)利用Invitrogen公司提供的软件进行设计特异干涉人lmo4基因的小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)序列；

2)根据设计的shRNA序列，合成相应的单链OligoDNA及其互补链的Oligo DNA单链，将合成的Oligo DNA及其互补链按照分子数1∶1比例混合，进行退火处理，以形成双链Oligo DNA；

3)根据慢病毒载体的多克隆位点内切酶，将双链Oligo DNA与慢病毒RNAi干涉载体进行连接，得到抑制lmo4基因表达的重组慢病毒RNAi干涉载体。

在上述构建方法中，所述步骤1)中可利用Invitrogen公司提供的在线软件(https：//rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)，针对人lmo4 mRNA的开放阅读密码框(ORF)序列(序列表中序列1，GenBank号：NM_006769)，设计抑制lmo4基因表达的shRNA，是下述RNA序列之一：

(1)序列表中序列2，命名为shRNA1；

(2)序列表中序列3，命名为shRNA2。

所述步骤2)中编码抑制lmo4基因表达的shRNA的双链Oligo DNA，可为下述双链DNA序列之一：

(1)shRNA1的Oligo DNA单链为序列表中序列4，其互补链为序列表中序列5；

(2)shRNA2的Oligo DNA单链为序列表中序列6，其互补链为序列表中序列7。

将(1)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为shRNA1，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA1，其序列为：5’-AUUGAUGUAGUGAAACCGA-3’(序列表中序列8)，该siRNA1是人lmo4 mRNA开放阅读密码框(ORF)序列(序列表中序列1，GenBank号：NM_006769)中自5’端第1158～1176bp位置序列5’-tcggtttcactacatcaat-3’的同源序列，与5’-tcggtttcactacatcaat-3’通过互补配对方式结合，从而诱导lmo4 mRNA降解；将(2)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为shRNA2，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA2，其序列为：5’-AUGAUACACAUUGCCUUGC-3’(序列表中序列9)，该siRNA2是人lmo4mRNA开放阅读密码框(ORF)序列(序列表中序列1，GenBank号：NM_006769)中自5’端第1089～1107bp位置序列5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’的同源序列，与5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’通过互补配对方式结合，从而诱导lmo4 mRNA降解。

所述步骤3)中的慢病毒RNAi干涉载体为pGV248，含有编码抑制lmo4基因表达的shRNA的双链OligoDNA的重组慢病毒RNAi干涉载体命名为pGV248-shRNA1和pGV248-shRNA2(统称为pGV248-shRNA)。

抑制lmo4基因表达的重组慢病毒，是将上述抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体pGV248-shRNA与慢病毒载体系统中的辅助质粒混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有抑制lmo4基因表达的小干扰RNA编码基因的重组慢病毒。

所述慢病毒载体系统中的辅助质粒为含有gag、pol、或/和rev基因的包装质粒，该包装质粒主要起到病毒包装作用，其转录表达后形成病毒衣壳结构蛋白及聚合酶蛋白；另外的辅助质粒为含有包膜蛋白基因vsvg的包膜质粒，该包膜质粒转录表达后形成病毒包膜蛋白。抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体与慢病毒载体系统中的包装质粒和包膜质粒需按3～10∶3～10∶1的质量比混合，通过脂质体转染慢病毒包装细胞293-T细胞，转染后收集293-T细胞上清液并离心得到浓缩病毒。

上述抑制lmo4基因表达的shRNA(具体可为序列2或序列3)、编码抑制lmo4基因表达的shRNA的双链Oligo DNA(具体可为序列4和序列5，或序列6和序列7)、抑制lmo4基因表达的重组慢病毒RNAi干涉载体(具体可为pGV248-shRNA)、以及抑制lmo4基因表达的重组慢病毒均为本发明内容。

本发明另一目的是提供一种银屑病(牛皮癣)的外用型治疗药物，其活性成分为以抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体或抑制lmo4基因表达的重组慢病毒。基于lmo4基因在银屑病皮损部位的皮肤角化层以下的细胞高表达，这种高表达导致细胞过度增殖及异常分化，从而引起银屑病的皮损加剧、鳞屑增加。通过干预或抑制银屑病病人皮损部位的皮肤细胞中lmo4基因的表达，在细胞水平的实验中证实可以抑制角质形成细胞的分化及其各层细胞的增殖，适合开发作用于银屑病发病最后靶点(角质形成细胞)的治疗银屑病的外用药物。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明采用RNA干涉技术，筛选出有效的干涉序列，在对角质形成细胞中lmo4基因进行有效干涉后，可以抑制角质形成细胞的过度增殖及异常分化；

2)基于银屑病的主要病变是体表的皮损部位，适合用外用药治疗，本发明可以制成作用于银屑病局部皮损部位的外用型药物，给药方便，适用性强；

3)由于外源的干涉序列难以进入皮损部位的角化层以下细胞，本发明采用了慢病毒介导的RNA干涉技术，在银屑病的皮损部位较易感染角化层以下的细胞，获得了较好的疗效；

4)本发明以慢病毒介导的RNA干涉外用型药物，仅用于银屑病皮损部位的局部治疗，慢病毒不易感染正常皮肤组织，且相对于全身用药，此类外用药具有较高的安全性。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为免疫组织化学检测lmo4基因表达产物LMO4蛋白在正常皮肤组织和银屑病皮损组织的表达情况

图2为原代培养正常人皮肤基底层的角质形成细胞的形态

图3为原代培养的角质形成细胞体外诱导分化的形态变化

图4为正常人皮肤角质形成细胞体外诱导分化分子标记的荧光定量RT-PCR检测结果

图5为正常人皮肤角质形成细胞体外诱导分化分子标记的Western Blot检测结果

图6为HaCaT细胞模拟角质形成细胞体外分化分子标记的荧光定量RT-PCR检测结果

图7为HaCaT细胞模拟原代角质形成细胞体外分化分子标记的Western Rlot检测结果

图8为抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体的物理图谱

图9为为抑制LMO4蛋白表达的HaCaT细胞系的Western Blot检测结果

图10为荧光定量RT-PCR检测抑制lmo4基因表达对HaCaT细胞分化的各层细胞标记分子表达水平的影响

图11Western Blot检测抑制表达lmo4基因对HaCaT细胞分化的各层细胞标记分子表达水平的影响

图12为抑制lmo4基因表达能够抑制HaCaT细胞增殖(MTT实验)

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用以达到可实施要求。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、免疫组织化学检测银屑病病人皮损部位lmo4基因表达产物LMO4蛋白情况

收集临床和病理确诊银屑病皮损标本34例为实验样本，均为进行期或稳定期，其中女性15例，男性19例，有家族史的5例；收集临床包皮环切手术的正常皮肤组织4例为正常样本。用免疫组织化学方法检测lmo4基因表达产物LMO4蛋白在正常皮肤组织中及银屑病患者皮损组织中的表达情况。

具体方法包括以下步骤：

1)制作组织蜡块：将实验样本和正常样本立即浸泡在4％(V/V)甲醛溶液中，24h后用流水冲洗组织10h，然后将其放入脱水机进行脱水，脱水后再置入二甲苯溶液中浸泡15min使组织透明，最后将组织浸蜡包埋制作成组织蜡块并做好标记，室温保存。

2)制作组织切片：用组织切片机切取厚度约3mm的石蜡切片，用毛笔将切片从刀上轻轻移到45℃～50℃的温水中，待切片平整后，用载玻片将切片捞起，晾干后放置60℃烘箱中烘片30min。

3)免疫组化检测：

a.脱蜡入水：将实验样本组织切片与正常样本组织切片放在玻片架上，然后依次放入二甲苯I中15min，置于58℃恒温箱中；二甲苯II中15min，置于恒温箱中；无水酒精I中10min；无水酒精II中5min；90％(V/V)酒精3min；80％(V/V)酒精3min；70％(V/V)酒精3min；去离子水30min。

b.抗原修复：配制0.01M pH6.0的柠檬酸盐溶液(配方：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g，溶入1000mL蒸馏水)，将组织切片完全浸没其中，置于微波炉高火7min，自然冷却2min，再微波炉高火2min，最后置于水盆中自然冷却。将组织切片平放在湿盒中，用PBS(配方：pH 7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄4.3mmol/L，KH₂PO₄1.4mmol/L)从切片一侧轻微润洗3min，重复3次。

c.免疫反应：用卫生纸轻轻拭去组织周围的水迹，滴加3％(V/V)过氧化氢，完全覆盖组织，37℃放置15min，最后用PBS洗3min，重复3次。用卫生纸拭去组织周围的水迹，滴加山羊血清(购自美国GIBCO公司)至完全覆盖组织，37℃孵育30min。甩去血清，滴加一抗anti-LMO4(购自美国Abcam公司)，4℃过夜(8～12h)，用一抗稀释液(购自日本TOYOBO公司)按照1∶200稀释抗体。PBS洗3次，每次3min。拭去周围残留的水迹，滴加生物素化二抗工作液(购自日本TOYOBO公司)，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次3min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次3min。

d.DAB显色：配制0.05％DAB显色液(配方：0.005g DAB溶入pH 7.2Tris-HCl溶液，同时加入3％H₂O₂0.1mL)，注意避光，向组织块上滴加1滴DAB显色剂，立即放到显微镜下观察，待看到棕黄色颗粒后用蒸馏水终止显色，将切片放入流水中冲洗30min。注意：冲洗的过程中，不能直接对着水流冲洗，以免组织脱落。洗好后放入0.5％苏木素染色液(配方：0.5g苏木素溶入100mL蒸馏水中)中染色1～3min，再用流水冲洗30min，放入烘箱中直至组织切片完全干燥，最后用中性树胶(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)封片，常温保存。

e.荧光显微镜观察：看到实验样本细胞浆中棕黄色颗粒即为阳性反应区域并拍照，同时拍取正常样本对照组图片。

结果如图1所示，可以看出，在4例正常皮肤组织样本中，仅仅在皮肤基底层细胞中可见lmo4基因表达产物LMO4蛋白(细胞核内棕黄色颗粒)，但在所有检测的银屑病皮损组织实验样本中，从基底层、棘层、颗粒层及角化层的细胞中均可见LMO4蛋白，说明在银屑病的皮损组织中，各层细胞均存在lmo4基因的异常表达。

实施例2、正常人皮肤角质形成细胞分离、培养和体外分化及其分化细胞标记分子、lmo4基因表达的检测

实施例1用免疫组织化学方法检测出lmo4基因表达产物LMO4蛋白在银屑病的组织水平上为高表达，用下述方法进一步检测lmo4基因在正常皮肤角质形成细胞的分化过程中的表达水平变化情况。

一、角质形成细胞的原代培养

从人正常皮肤组织样本中分离基底层的角质形成细胞，进行原代培养。

原代培养方法包括以下步骤：

1)实验前准备：鼠尾胶原制作方法以及培养皿的预处理：取大鼠尾巴4根，用洗洁精清洗表皮，然后用75％(V/V)酒精浸泡30min，在超净工作台内，用无菌生理盐水冲洗，无菌操作将尾巴剪成小段，剪开并去掉皮毛，抽出银色的尾腱置于生理盐水中，剪碎尾腱，放入经高压灭菌(120℃高压20min)的三角烧瓶中，加入300mL经高压灭菌的去离子水配制的0.3％(V/V)醋酸溶液，置4℃并不时摇晃，48h后1500rpm离心20min，取上层黏稠的上清液分装后置于-20℃保存。在分离包皮原代细胞前，用鼠尾胶原平铺在皿底，然后置于37℃细胞培养箱中30min，在接种原代细胞前，吸取皿底残留的鼠尾胶原，用PBS轻柔的洗涤2遍，每次3min。

2)组织处理：实验前用75％(V/V)酒精擦拭超净台面，打开紫外灯照射30min；取出经高压灭菌的手术器械放置在75％(V/V)酒精缸内，用镊子取出浸泡在生理盐水或PBS中的包皮，最外层的表皮朝下放入含有生理盐水或PBS的10cm细胞培养皿中，拿出镊子、剪刀在酒精灯上烧灼数秒后自然冷却10sec，助手用镊子撑开皮面，操作者一手持镊子，一手持剪刀，剪去包皮内表面的脂肪、结缔组织、筋膜、血管等，尽量剪除干净，最后留下一层薄的表皮；将处理过的包皮转移到另一个含有生理盐水或PBS的10cm细胞培养皿中，继续剪去多余的组织，然后将表皮剪成0.5×1cm大小的条块，在生理盐水或PBS中漂洗数次；将经高压灭菌的无菌纱布平铺在另一个干净的10cm细胞培养皿中，吸取4mL 0.25％(V/V)胰酶(购自Hyclone公司)放入皿中至纱布刚好浸没，将包皮条块内表面朝下平铺在纱布上，4℃放置4h。

3)原代细胞分离：打开经紫外杀菌的超净台，取出已消化4h的包皮，拿出一个新的10cm细胞培养皿，加入3～5mL 0.25％(V/V)胰酶，取出在酒精缸中浸泡的镊子，在酒精灯上烧灼后稍微冷却10～15sec，然后一手用镊子夹住皮块的一端，一手用镊子从上往下刮取组织，连续刮3次后，将黏有表皮组织的镊子在胰酶中轻漂几次，以使组织转移到胰酶中继续室温消化，重复刮取3～4次后，将皮块上下颠倒，再刮取3～4次，直至皮块松软变形，弃去皮块；取好表皮组织后，用眼科剪在胰酶中反复剪，大约200次，4min，直至剪成组织匀浆；然后向该皿中加入与胰酶等量的含10％(V/V)FBS的DMEM培养液(购自Hyclone公司)终止胰酶继续消化，剪去1mL枪头头部，反复吹打，保证细胞不粘连组织被晒网滤过；最后用100目筛网过滤，将滤液转移到15mL离心管中，1000rpm离心10min；倾去上清，用PBS洗涤1次，1000rpm离心10min；弃去上清，加入5mL角质形成细胞专用培养基(K-SFM购自美国Gibco公司)，将细胞转移到已用鼠尾胶原处理过的培养皿中在37℃培养。表皮细胞在24h内开始贴壁，细胞成圆形为主，随着时间的延长，细胞伸展成椭圆型，体积变大。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇，并以此为中心向外生长，7～10d细胞汇合连接成片，原代培养正常人皮肤基底层的角质形成细胞的形态如图2所示。

二、原代角质形成细胞体外分化

用步骤一得到的原代培养的角质形成细胞，通过钙离子刺激，诱导这些角质形成细胞在体外进行细胞分化，这一分化过程可以模拟体内皮肤组织中细胞分化进程：即从基底层细胞、棘层细胞、颗粒层细胞，最后分化为角化层细胞。

诱导分化方法包括以下步骤：

1)培养细胞：将培养4～7d的原代角质形成细胞的培养基从K-SFM更换至添加2mmol/L钙离子的DMEM培养液；

2)诱导分化：用含2mmol/L钙离子的DMEM培养液在37℃下诱导角质形成层细胞分化，诱导分化的时间点为0h、6h、12h、24h、48h，观察其分化过程。

原代培养的角质形成细胞体外诱导分化的形态变化如图3所示，分化24h后，可见细胞形态呈鹅卵石样，细胞间连接紧密，表明成功建立体外诱导角质形成层细胞分化体系。

三、逆转录-荧光定量PCR(RT-PCR)检测正常人皮肤角质形成细胞体外诱导分化分子标记及lmo4基因表达水平

收集步骤二中各个时间点的分化细胞，用常规方法提取总RNA，使用大连宝生物公司AMV进行逆转录(逆转录体系和操作过程按照说明书进行)。用大连宝生物公司的荧光定量PCR方法分别检测基底层细胞标记分子K14、棘层细胞标记分子TG5、颗粒层细胞标记分子K10和角化层细胞标记分子IVL及lmo4基因的表达水平，以β-actin为参照。参照试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR分析，PCR引物序列如表1所示。

表1引物序列

检测结果如图4所示，原代培养的角质形成细胞经钙离子诱导6h、12h、24h，lmo4基因表达水平逐渐降低，与基底层细胞标记分子K14逐渐降低基本一致，但48h后lmo4基因表达水平略有升高(可能与分化后期细胞增殖有关)；而棘层细胞标记分子TG5、颗粒层细胞标记分子K10和角化层细胞标记分子IVL的表达水平均随分化时间延长而增加。表明原代培养的人皮肤角质形成细胞在体外通过钙离子诱导，可以模拟角质形成细胞在体内的经历的棘层、颗粒层和角化层的分化；在此分化过程中，lmo4基因的表达随分化时间及分化程度而逐步降低。

四、Western blot检测正常人皮肤角质形成细胞体外诱导分化分子标记及LMO4蛋白表达水平

收集步骤二中各个时间点的分化细胞，用常规方法提取总蛋白。用Western blot检测基底层细胞标记分子K14、棘层细胞标记分子TG5、颗粒层细胞标记分子K10和角化层细胞标记分子IVL及LMO4蛋白的表达水平，以GAPDH为参照，使用的抗体、稀释倍数见表2。

表2使用抗体列表

抗体名称	说明	公司名称	来源	应用
					Cytokeratin 10 Antibody(VIK-10)	检测keratin 10	SANTA CRUZ	鼠	WB 1∶400
Cytokeratin 14 Antibody(C-14)	检测keratin 14	SANTA CRUZ	山羊	WB 1∶400
					Involucrin Antibody(sY5)	检测Involucrin	SANTA CRUZ	鼠	WB 1∶200
Rabbit monoclonal to LMO4	检测LMO4	Abcam	兔	WB 1∶2000IHC 1∶200
					Mouse monoclonal to GAPDH	检测GAPDH	Abcam	鼠	WB 1∶5000
goat anti rabbit IgG-HRP	HRP标记二抗	SANTA CRUZ	山羊	WB 1∶2000
					goat anti mouse IgG-HRP	HRP标记二抗	SANTA CRUZ	山羊	WB 1∶5000
donkey anti goat IgG-HRP	HRP标记二抗	SANTA CRUZ	驴	WB 1∶5000

结果如图5所示，原代培养的角质形成细胞经钙离子诱导6h、12h、24h，LMO4蛋白和K14的表达水平随分化时间增加而降低，棘层细胞标记分子TG5、颗粒层细胞标记分子K10和角化层细胞标记分子IVL的表达水平则表现为逐步增加。

由此可见，lmo4基因在正常皮肤角质形成细胞中表达，但随角质形成细胞的分化而逐渐降低；实施例1的实验结果表明在银屑病的皮损组织中各层细胞均存在lmo4基因的异常过量表达，对比本实施例的实验结果表明lmo4基因异常过量表达可能与银屑病的发病有关。

实施例3、人皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞培养和体外分化

为了进一步探讨lmo4基因在角质形成细胞中异常表达对其增殖和分化的影响，选用人皮肤来源角质形成细胞系HaCaT细胞进行后续实验。

人皮肤来源角质形成细胞系HaCaT细胞培养和体外分化方法，包括以下步骤：

1)在42℃水浴复苏人皮肤角质形成细胞系HaCaT(购自美国Life Technologies)，待细胞完全贴壁后，给细胞更换不含钙离子的K-SFM培养基；

2)诱导分化：待细胞变成未分化状态的长梭形形态后，用含2mmol/L钙离子的含10％小牛血清(FBS，购自Gibco公司)DMEM培养液在37℃下诱导细胞分化，诱导分化的时间点为0～5d。

结果如图6和图7可以看出，lmo4和keratin l4的表达水平随分化时间增加而降低，颗粒层细胞标记分子keratin l0和角化层细胞标记分子ivl的表达水平则表现为逐步增加，表明HaCaT在该体系中可以模拟人正常角质形成细胞体内分化的过程。

实施例4、构建抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体、慢病毒及建立抑制lmo4基因表达的HaCaT细胞系

一、构建抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体

1、设计抑制lmo4基因表达的shRNA及对照shRNA-scramble

根据GenBank公布的人lmo4 mRNA的开放阅读密码框(ORF)序列(序列表序列1，GenBank号：NM_006769)以及慢病毒RNAi干涉载体pGV248(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)的使用要求，按照Invitrogen公司提供的在线软件(https：//rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/)设计两对以lmo4基因编码区为靶点的特异性lmo4小发夹RNA(smallhairpin RNA，shRNA)序列，分别命名为shRNA1和shRNA2；同时，拟设计对照shRNA(命名为shRNA scramble)，根据文献(Science.2008Jun 13.320(5882)：1496-501)报道，选择绿色荧光蛋白基因(GFP)开放阅读密码框序列(序列表中序列10)中的自5’端第122～143bp位置序列5’-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3’作为对照的shRNA靶序列。具体序列如下：

1)shRNA1：5’-Ccgg gaUCGGUUUCACUACAUCAAU CUCGAG AUUGAUGUAGUGAAACCGAUCUUUUUg-3’(序列表中序列2)；

2)shRNA2：5’-Ccgg gcGCAAGGCAAUGUGUAUCAU CUCGAG AUGAUACACAUUGCCUUGCGCUUUUUg-3’(序列表中序列3)；

3)shRNA-scramble：5’-Ccgggc GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU CUCGAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCGC UUUUUg-3’(序列表中序列11)。

2、抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体的构建

根据设计的shRNA1、shRNA2、shRNA-scramble以及慢病毒RNAi干涉载体pGV248的使用要求，由上海吉凯生物技术公司合成编码抑制lmo4基因表达的shRNA及对照的双链Oligo DNA。

编码抑制lmo4基因表达的shRNA及对照的双链Oligo DNA，为下述双链DNA序列之一：

1)shRNA1的OligoDNA单链：5’-Ccgg gaTCGGTTTCACTACATCAAT CTCGAGATTGATGTAGTGAAACCGATC TTTTTg-3’(序列表中序列4)，

其互补链；5’-aattcaaaaa TCGGTTTCACTACATCAAT CTCGAG ATTGATGTAGTGAAACCGAC-3’(序列表中序列5)；

2)shRNA2的OligoDNA单链：5’-Ccgg gcGCAAGGCAATGTGTATCAT CTCGAGATGATACACATTGCCTTGCGC TTTTTg-3’(序列表中序列6)，

其互补链：5’-aattcaaaaagc GCAAGGCAATGTGTATCAT CTCGAGATGATACACATTGCCTTGCGC-3’(序列表中序列7)；

3)shRNA-scramble的Oligo DNA单链：5’-Ccgggc GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCGAG ATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCGC TTTTTg-3’(序列表中序列12)，

其互补链：5’-aattcaaaaagc GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT CTCGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3’(序列表中序列13)。

将1)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为双链shRNA1，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA1，其序列为：5’-AUUGAUGUAGUGAAACCGA-3’(序列表中序列8)，该siRNA1是人lmo4 mRNA开放阅读密码框(ORF)序列(序列1，GenBank号：NM_006769)中自5’端第1158～1176bp位置序列5’-tcggtttcactacatcaat-3’的同源序列，与5’-tcggtttcactacatcaat-3’通过互补配对方式结合，从而诱导lmo4 mRNA降解；将2)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为双链shRNA2，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA2，其序列为：5’-AUGAUACACAUUGCCUUGC-3’(序列表中序列9)，该siRNA2是人lmo4mRNA开放阅读密码框(ORF)序列(序列1，GenBank号：NM_006769)中自5’端第1089～1107bp位置序列5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’的同源序列，与5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’通过互补配对方式结合，从而诱导lmo4 mRNA降解；将3)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为双链shRNA-scramble，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA-scramble，其序列为：5’-AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGC-3’(序列表中序列14)，该siRNA2是绿色荧光蛋白基因(GFP)开放阅读密码框序列(序列表中序列10)中的自5’端第122～143bp位置序列5’-gcaagctgaccctgaagttcat-3’的同源序列，与5’-gcaagctgaccctgaagttcat-3’通过互补配对方式结合，从而诱导GFP mRNA降解。

合成步骤1)中的具有互补的两对Oligo DNA，按照分子数比为1∶1的比例与48μl退火缓冲液(购自碧云天生物技术公司)混合，在95℃下温育4min后，再在70℃下温育10min，然后缓慢冷却至室温进行退火；取5μl退火后的双链寡核苷酸片段加到4μl T4DNA连接酶缓冲液(购自大连宝生物有限公司)中，加入10U T4多聚核苷酸激酶(大连宝生物公司)，在37℃下温育30min后，再在70℃下温育10min进行磷酸化反应；同时用限制性内切酶AgeI和EcoR I将慢病毒RNAi干涉载体pGV248(购自上海吉凯基因公司)线性化；再将线性化的慢病毒RNAi干涉载体pGV248与磷酸化后的双链寡核苷酸片段进行连接，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，细菌培养以扩增并提取质粒，对质粒用限制性内切酶AgeI和EcoR I进行双酶切鉴定，经酶切获得58bp和11.5kb DNA片段的为阳性质粒，然后对经初筛获得的阳性质粒用测序的方法进一步鉴定，结果获得了插入序列及位置均正确的分别携带有shRNA1、shRNA2、shRNA-scramble的重组慢病毒RNAi干涉载体，分别命名为pGV248-shRNA1、pGV248-shRNA2、pGV248-shRNA-scramble，物理图谱如图8所示。

二、慢病毒的包装

在10cm的培养皿中培养293-T慢病毒包装细胞，培养基为含有10％FBS、2mmol/LL-谷氨酰胺和1％青-链霉素的高糖DMEM(购自Hyclone公司)。用步骤一构建的含有shRNA1和shRNA2慢病毒载体pGV248-shRNA1、pGV248-shRNA2以及pGV248-shRNA-scramble(购自上海吉凯公司)分别和包装质粒pGAG-POL(购自Invitrogen公司)、包膜质粒pVSVG(购自Invitrogen公司)按质量比3～10∶3～10∶1的比例混合后加入1.5mL无血清

培养基(购自Invitrogen公司)中，轻轻混匀，在另一个无菌的5mL管中将60μL

2000(购自Invitrogen公司)稀释于1.5mL的无血清

I培养基中，室温静置5min，混合以上两种液体，室温孵育20min以形成

2000复合物。将3mL含有

2000复合物的培养基混匀后加入到生长有293-T慢病毒包装细胞的10em培养皿中，混匀，用不含抗生素的含有10％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基于37℃、5％CO₂孵箱中培养，次日更换培养基，并分别在48h、72h收集上清液于15mL的无菌离心管中，4℃、3000rpm离心15min去除细胞碎片，将此上清液(含有病毒颗粒)于4℃超速(19500rpm)离心4～6h以浓缩病毒。分别获得含有shRNA1或shRNA2的病毒颗粒，混合两种病毒颗粒的上清(做RNA干涉，一般都会使用两个以上的干涉序列，以防止脱靶现象。混合两种病毒液，目的是使含两种shRNA同时转入细胞，实现双重干涉，以增加干涉效果并有利于实现稳定干涉)，命名为LV-shRNA；同时收集含有对照shRNA-scramble的病毒颗粒。将含病毒液的上清冻存于-70℃备用。

三、建立抑制lmo4基因表达的HaCaT细胞株(HaCaT/sbRNA)及对照的HaCaT细胞株(HaCaT/shRNA-scramble)。

1)细胞病毒感染：10cm的培养皿培养HaCaT细胞，待细胞融合到90％时，直接用LV-shRNA病毒液或shRNA-scramble的病毒液感染细胞，每板加入9mL的正常培养基(含有5μg/mL Polybrene，购自Sigma公司)、1mL的LV-shRNA病毒液或shRNA-scramble的病毒液。24h后更换正常培养基。

2)稳定干涉细胞株建立：感染3～5d后，观察到部分细胞有绿色荧光，用含0.5μg/mL嘌呤霉素(Puromycin，购自Sigma公司)的筛选培养基基筛选细胞2～3周时间，获得抗嘌呤霉素并能抑制lmo4基因表达的HaCaT细胞以及对照细胞株，命名为HaCaT/shRNA细胞和HaCaT/shRNA-scramble细胞。

3)将筛选后获得的抑制lmo4基因表达的HaCaT细胞进行Western blot检测LMO4蛋白的表达。

结果如图9所示，与对照的HaCaT/shRNA-scramble细胞相比，HaCaT/sbRNA细胞中LMO4蛋白的表达水平明显降低，表明已经建立稳定干涉lmo4表达的HaCaT细胞株。

实施例5、HaCaT/shRNA-scramble细胞HaCaT/shRNA细胞体外诱导分化及其标记分子检测

一、体外诱导分化

将HaCaT/shRNA-scramble细胞和HaCaT/shRNA细胞按照实施例2中的方法进行体外诱导分化。由于HaCaT细胞分化时间点比原代培养的角质形成细胞相对较长，在选择分化时间点时选用了0d、1d、3d、5d等。

二、标记分子检测

在诱导分化各个时间点，分别收集总RNA和总蛋白。按照实施例2中的方法分别进行荧光定量RT-PCR以及Western blot检测。

荧光定量RT-PCR结果如图10所示，在抑制lmo4基因表达的细胞中，与对照组细胞相比，在每个诱导分化时间，lmo4基因的表达水平均下降，同时基底层细胞标记分子K14的表达水平明显比对照细胞增加；而角化层细胞标记分子IVL的表达水平比正常对照细胞中明显减少。抑制lmo4基因表达后，尽管颗粒层细胞标记分子K10的表达水平比对照组增加，但在蛋白水平检测中看，Western blot检测结果如图11所示，K10的表达水平还是比对照组表达低；同时K14、LMO4、IVL蛋白表达水平的变化与荧光定量RT-PCR结果一致。因此，HaCaT细胞模型证明，抑制lmo4基因表达，则抑制HaCaT细胞分化。

实施例6、细胞增殖实验

在银屑病发展过程中，往往伴随角质形成细胞的异常增殖。以HaCaT/shRNA-scramble细胞和HaCaT/shRNA细胞作为细胞模型，用MTT法检测抑制lmo4基因表达对细胞增殖的影响。

MTT检测方法包括以下步骤：

1)接种HaCaT/shRNA-scramble细胞和HaCaT/shRNA细胞：用含10％FBS的DMEM制成细胞悬液，以每孔2000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，其余孔用PBS填满。

2)待细胞贴壁后更换成K-SFM培养基培养1d，使细胞回归到为分化的长梭形状态，然后换用DMEM培养基细胞，培养5d。

3)呈色反应：在超净台内向每孔加入10μl 5mg/mL MTT(购自碧云天生物公司)，注意避光，在37℃温箱中继续孵育4h后小心弃去孔内培养液，加入100μl DMSO(购自美国Sigma公司)，在37℃温箱中放置5～10min，以使蓝紫色结晶物完全溶解。

4)比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。与Od的OD值相比，计算各组OD增加值，并作图。计算细胞增殖抑制率：[(对照组平均OD值-干涉组平均OD值)÷对照组平均OD值]×100％。

MTT实验结果如图12所示，抑制lmo4基因表达的HaCaT细胞，在诱导分化同时(1～5d)，OD的增加值从第1d开始，细胞的增殖速度较对照组细胞明显降低，抑制率分别为：1d(11.1％)、3d(26.7％)、5d(11.6％)。由此可见，抑制lmo4基因表达能抑制HaCaT细胞的增殖。

实施例7、制备治疗银屑病的外用药及其疗效

通过干预或抑制银屑病病人皮损部位的皮肤细胞中lmo4基因的表达，在细胞水平的实验(实施例5、6)中证实可以抑制角质形成细胞的分化及其各层细胞的增殖，适合开发作用于银屑病发病最后靶点(角质形成细胞)的治疗银屑病的外用药物。

基于外用药难以进入皮损部位的角化层以下细胞层，本发明采用了慢病毒感染技术，在皮损部位较易感染角化层以下的细胞，具有较好的疗效，同时，外用药物使用方便而且安全。

工业应用性

本发明通过实验证明lmo4基因与银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化相关，因此抑制人皮肤组织细胞中lmo4基因的表达水平可干预和抑制银屑病病人皮肤角质形成细胞的过度增殖和异常分化，据此通过得到抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体或抑制lmo4基因表达的重组慢病毒并以其为活性成分制备银屑病(牛皮癣)治疗药物，特别是外用型药物，用以抑制银屑病患者皮损部位的皮肤组织细胞中lmo4基因的表达，抑制角质形成细胞的过度增殖和异常分化，达到局部治疗银屑病的目的，具备工业应用性。

序列表

<110> 安徽医科大学

<120> lmo4基因表达的抑制剂在制备银屑病外用型治疗药物中的用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgaatc cgggcagcag ctcgcagccg cccccggtga cggccggctc cctctcctgg 60

aagcggtgcg caggctgcgg gggcaagatt gcggaccgct ttctgctcta tgccatggac 120

agctattggc acagccggtg cctcaagtgc tcctgctgcc aggcgcagct gggcgacatc 180

ggcacgtcct gttacaccaa aagtggcatg atcctttgca gaaatgacta cattaggtta 240

tttggaaata gcggtgcttg cagcgcttgc ggacagtcga ttcctgcgag tgaactcgtc 300

atgagggcgc aaggcaatgt gtatcatctt aagtgtttta catgctctac ctgccggaat 360

cgcctggtcc cgggagatcg gtttcactac atcaatggca gtttattttg tgaacatgat 420

agacctacag ctctcatcaa tggccatttg aattcacttc agagcaatcc actactgcca 480

gaccagaagg tctgctaa 498

<210> 2

<211> 58

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgggaucgg uuucacuaca ucaaucucga gauugaugua gugaaaccga ucuuuuug 58

<210> 3

<211> 58

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgggcgcaa ggcaaugugu aucaucucga gaugauacac auugccuugc gcuuuuug 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgggcgcaa ggcaaugugu aucaucucga gaugauacac auugccuugc gcuuuuug 58

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattcaaaaa tcggtttcac tacatcaatc tcgagattga tgtagtgaaa ccgac 55

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgggcgcaa ggcaatgtgt atcatctcga gatgatacac attgccttgc gctttttg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aattcaaaaa gcgcaaggca atgtgtatca tctcgagatg atacacattg ccttgcgc 58

<210> 8

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

auugauguag ugaaaccga 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

augauacaca uugccuugc 19

<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 11

<211> 64

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgggcgcaa gcugacccug aaguucaucu cgagaugaac uucaggguca gcuugcgcuu 60

uuug 64

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgggcgcaa gctgaccctg aagttcatct cgagatgaac ttcagggtca gcttgcgctt 60

tttg 64

<210> 13

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aattcaaaaa gcgcaagctg accctgaagt tcatctcgag atgaacttca gggtcagctt 60

gc 62

<210> 14

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

augaacuuca gggucagcuu gc 22

Claims

1.人lmo4基因在制备银屑病外用型治疗药物中的应用；

所述药物中活性成分为可以抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体或抑制lmo4基因表达的重组慢病毒；所述抑制lmo4基因表达的重组慢病毒是将所述抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体与慢病毒载体系统中的辅助质粒混合后，用脂质体介导法转染慢病毒包装细胞，得到携带有抑制lmo4基因表达的shRNA编码基因的重组慢病毒；

所述抑制lmo4基因表达的重组慢病毒载体是基于慢病毒载体而构建的，能够表达小干涉RNA，简称siRNA，并可以特异抑制lmo4表达的重组慢病毒载体，其构建包括以下步骤：

1)设计特异干涉人lmo4基因的小发夹RNA序列，简称shRNA序列；

2)根据设计的shRNA序列，合成相应的单链Oligo DNA及其互补链的Oligo DNA单链，将合成的Oligo DNA及其互补链按照分子数1：1比例混合，进行退火处理，形成双链OligoDNA；

3)根据慢病毒载体的多克隆位点内切酶，将双链Oligo DNA与慢病毒RNAi干涉载体进行连接，得到抑制lmo4基因表达的重组慢病毒RNAi干涉载体；

步骤1)中针对人lmo4 mRNA的开放阅读密码框序列设计的抑制lmo4基因表达的shRNA，是下述RNA序列之一：

(1)序列表中序列2，命名为shRNA1；

(2)序列表中序列3，命名为shRNA2；

步骤2)中的双链Oligo DNA，为编码抑制lmo4基因表达的shRNA，是下述双链DNA序列之一：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将(1)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为双链shRNA1，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA1，其序列为：5’-AUUGAUGUAGUGAAACCGA-3’，该siRNA1是人lmo4 mRNA开放阅读密码框序列中自5’端第1158～1176bp位置序列5’-tcggtttcactacatcaat-3’的同源序列，与5’-tcggtttcactacatcaat-3’通过互补配对方式结合，诱导lmo4 mRNA降解；将(2)双链Oligo DNA编码的shRNA命名为双链shRNA2，在细胞内产生shRNA通过Dicer酶切割后形成siRNA2，其序列为：5’-AUGAUACACAUUGCCUUGC-3’，该siRNA2是人lmo4 mRNA开放阅读密码框序列中自5’端第1089～1107bp位置序列5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’的同源序列，与5’-gcaaggcaatgtgtatcat-3’通过互补配对方式结合，诱导lmo4 mRNA降解。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤3)中的慢病毒RNAi干涉载体为pGV248，抑制lmo4基因表达的重组慢病毒RNAi干涉载体对应命名为pGV248-shRNA1和pGV248-shRNA2，统称为pGV248-shRNA。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述慢病毒载体系统中的辅助质粒为含有gag、pol或rev基因的包装质粒，另外的辅助质粒为含有包膜蛋白基因vsvg的包膜质粒；抑制lmo4基因表达的慢病毒RNAi干涉载体与慢病毒载体系统中的包装质粒和包膜质粒按3～10：3～10：1的质量比混合，通过脂质体转染慢病毒包装细胞293-T细胞，转染后收集293-T细胞上清液并离心得到浓缩病毒。

5.一种银屑病外用型治疗药物，其活性成分为权利要求1至3任一提及的抑制lmo4基因表达的重组慢病毒RNAi干涉载体，或权利要求1提及的抑制lmo4基因表达的重组慢病毒。