CN108118055B - 一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用 - Google Patents

一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用，属于分子生物学技术领域。编码所述shRNA的DNA序列，如SEQ ID NO 1～3所示。所述的抑制牛FABP4基因表达的shRNA构建于载体上，得到含有所述shRNA的重组载体；将含有所述shRNA的重组载体作用于细胞，达到抑制牛FABP4基因表达的目的。该shRNA能有效抑制牛FABP4基因在mRNA及蛋白水平的表达。

Description

一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用
技术领域
本发明涉及一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
脂肪酸结合蛋白4(Fattyacidbindingprotein4,FABP4)亦称aP2或A-FABP，属于脂肪酸结合蛋白超家族，编码132个氨基酸，相对分子质量约14.6kDa。它在脂肪组织中高表达，是成熟脂肪细胞中主要的胞质蛋白，约占细胞总蛋白的6％。研究表明FABP4能够可逆性地结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸的代谢和转运，调控脂类生成及降解，在介导胞内脂肪酸转运和能量代谢过程中起重要作用。猪和鸡的FABP4基因已被证实是肌内脂肪含量(IMF)的候选基因。
随着RNA干扰技术的不断深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径。shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能的有效途径之一。针对牛FABP4基因设计特异性的shRNA序列，构建相应的载体，为今后深入研究牛FABP4基因的功能奠定了基础，可广泛应用于牛FABP4基因相关的细胞及动物模型，具有重要的应用前景和经济价值。
发明内容
本发明的目的是：提供一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用。
技术方案是：
本发明的第一个方面，提供了：
一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
在一个实施例中，所述的shRNA优选核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个方面，提供了：
含有SEQ ID NO.1～3所示核苷酸序列的表达载体。
所述的表达载体是质粒或者病毒。
所述的表达载体，是指在HindIII和BamH1之间插入上述shRNA的pSilencer 4.1-CMV。
本发明的第三个方面，提供了：
上述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：将编码SEQ ID NO.1～3所示核苷酸序列DNA连接到载体中，构建表达载体。
本发明的第四个方面，提供了：
包含有上述表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个方面，提供了：
上述的表达载体在制备抑制牛FABP4基因表达的试剂中的应用。
有益效果
(1)本发明提供了两对能有效抑制牛FABP4基因表达的DNA序列。
(2)本发明构建了能稳定表达含有编码牛FABP4基因的shRNA序列的DNA序列的载体。
附图说明
图1是ACTB(内参)基因扩增曲线；
图2是FABP4基因扩增曲线；
图3是ACTB(内参)基因熔解曲线；
图4是FABP4基因熔解曲线；
图5是FABP4表达量的对比图；
图6是细胞存活率对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1ShRNA载体构建
根据pSilencer 4.1-CMV(市售质粒)的多克隆位点，结合FABP4基因全序列，在FABP4基因的编码区(Coding Sequence，CDS)中寻找靶序列，利用在线siRNA设计软件(WhiteHead)，参考小干扰RNA设计原则，进行初步设计挑选，并与NCBI genebank中进行BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)比对，去除与其他物种基因片段同源性高的序列；并查找相关文献原则，这样设计出来的成功率高。
根据以上步骤初步设计出如下三条shRNA序列：
ShRNA名称 ShRNA序列
bFABP4-shRNA1 GGGATGTGGTCACCATTAAAT
bFABP4-shRNA2 ATACTGAGATTTCCTTCAAAT
bFABP4-shRNA3 TGTCACTGCCACCAGAGTTTA
本发明以pSilencer4.1-CMV质粒作为载体，利用了pSilencer4.1-CMV质粒中的多克隆位点上的HindIII和BamH1这2种限制性内切酶。该质粒转化细菌扩大培养时为氨苄抗性，筛选细胞时含潮霉素抗性。
上述三组DNA序列均由公司合成，呈粉末状，分别加适量去核酸酶的水(nuclease-free water)稀释，并使用紫外分光光度计测DNA浓度，均稀释至浓度为1μg/μl。并按以下量以及程序进行退火反应：
退火体系：
正义链2μl
反义链2μl
1×DNA Annealing Solution补足至50μl
反应条件：90℃，3min，然后在37℃孵箱孵育1小时，即得退火产物，用去核酸酶的水将退火产物稀释至浓度为8ng/μl，备用。
1.酶切载体体系及反应条件
反应体系：
Figure BDA0001516806820000031
反应条件：37℃酶切过夜。
2.琼脂糖凝胶电泳
(1)配胶：根据DNA分子量选择琼脂糖凝胶的浓度，pSilencer4.1-CMV质粒分子量约5000bp，故选用1％琼脂糖凝胶，即0.5g固体琼脂粉+50ml 1×TAE；
(2)加热凝胶溶液约2min，使之沸腾，变清亮透明，为使琼脂粉充分溶解，可加热两次，电泳效果较好，拖尾少；
(3)待凝胶溶液冷却后(60℃左右)，加入3μl EB混匀；
(4)在凝胶板上插好梳子，灌胶；
(5)约半小时凝胶凝固后，放入电泳槽，倒入1×TAE，液面超过凝胶表面；
(6)上样，BM5000DNA Marker 5ul，酶切后的质粒加入10μl 6×loadingbuffer混匀，每孔上样20μl；
(7)电泳120V，15-20min；
(8)紫外照相，若需要回收质粒则在紫外(长波长UV 360nm)下直接切胶，为防止紫外线对DNA的损伤，应尽量缩短暴露于紫外线的时间；
(9)将酶切后的质粒切胶回收，按试剂盒说明书进行。
3.接载体与目的片段
Figure BDA0001516806820000041
24℃1-2小时，16℃连接过夜。
4.转化及扩大培养
(1)从-80℃冰箱中取出XL1-Blue MRF’感受态细胞冰浴融化约5min；
(2)向感受态细胞悬液中加入连接产物10μl混匀，冰浴中静置30min；
(3)将EP管置于42℃水浴中热激90秒；
(4)冰浴中冷却3min；
(5)向每个EP管中加入700μl无抗LB培养液，37℃摇床上震荡培养45min(150rpm/min)；
(6)5000rpm离心3min，弃上清，保留100μl，重悬感受态细胞；
(7)吸取100μl已转化的感受态细胞滴在含氨苄抗性的LB固体琼脂培养基上，将细胞均匀涂开，待平板上的液体被吸收后，倒置平板37℃培养12-16小时；
(8)挑选3-4个大小合适的单克隆菌落扩大培养，加入适量含氨苄抗性的LB培养液37℃摇床震荡培养16小时。
5.提取质粒
质粒的提取按照市售的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书进行；对提取的质粒使用紫外分光光度计检测浓度与纯度，得到的质粒的OD260/OD280比值为1.7-1.9。
6.酶切鉴定
将该质粒经HindIII和BamH1双酶切后，酶切产物得到pSilencer 4.1-CMV酶切片段(约5100bp)和FABP4 shRNA基因片段(55bp)，酶切后的琼脂糖凝胶电泳(使用BM2000DNAMarker)结果表明目的基因片段已成功并且正确插入pSilencer 4.1-CMV表达载体中。
7.测序
将提取的质粒10μl送往中美泰和公司进行DNA测序，使用DNAStar软件将测序结果与所设计的靶shRNA进行比对，质粒构建成功。
实施例2质粒转染
实验材料
1)洁净工作台、2)生物安全柜、3)研究级倒置显微镜、4)冷冻离心机、5)二氧化碳孵箱、6)体视镜、7)DMEM完全培养基、8)1×PBS、9)Trypsin-EDTA、10)4个shRNA慢病毒载体和空载对照慢病毒载体、11)FABP4的过表达载体、12)转染试剂、13)293T细胞。
1.铺板
将293T细胞铺到10cm培养皿，待细胞贴壁，转染前细胞密度60％-70％为宜，换上新鲜的培养基(DMEM+10％FBS)。
2.转染
2.1.质粒和转染试剂的混合：准备6个EP管，每个加入500μL生理盐水，分别对应加入过表达质粒、4个shRNA插入的质粒和1个空载质粒，每个质粒7-8μg，静止10min后，每管加入转染试剂FG 18μL(每1μg质粒加2.5μl转染试剂)，静止15min。
2.2.转染：将上一步准备的质粒转染试剂混合物，分别加到步骤1中的4个培养皿。6h后换上新鲜培养基。
3.荧光观察
转染48h后，293T的细胞荧光率有80％以上；可收集细胞。消化离心，pbs洗一遍，放入-80℃冰箱。
实施例3
实验材料
1)ABI7500荧光定量PCR仪(life technology公司)、2)TGL-16M低温冷冻离心机(湘仪)、3)SW-CJ-1D单人净化工作台(泸净净化)、4)HR40-ⅡA2生物安全柜(Haier)、5)SMA4000超微量分光光度计(Merinton)、6)96孔板(美国life technology)、7)5个细胞样本、8)引物(life technology公司合成)、9)BestarTM qPCR RT Kit(德国DBI货号：DBI-2220)、10)
Figure BDA0001516806820000061
SybrGreen qPCR mastermix(德国DBI货号：DBI-2043)。
1.RNA的抽提
RNA的提取按life technology公司提供的Triozol使用说明进行。程序如下：
(1)往细胞培养板中加入1ml TRIzol，反复吹打几次后吸出，置于1.5ml离心管；
(2)加入0.2mL氯仿，盖紧离心管管盖，上下颠倒混匀60s(请勿涡漩激烈振荡)，室温静置3min，12,000g，4℃离心15min，置于冰上；
(3)溶液分为三层，RNA溶解在水相中，小心吸取500μL水相至另一个新的RNasefree的EP管中；
(4)加入500μL异丙醇，-20度放置1h，12,000g，4℃离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清；
(5)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；
(6)超净工作台上吹干样品10min，加入40μLRnase Free水溶解沉淀。
2.去基因组DNA和cDNA的合成
将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。
把RNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却2min。
逆转录反应：
Figure BDA0001516806820000062
反应条件：
37℃,15min.
98℃,5min.
4℃,hold
反应结束后，用灭菌去离子水将cDNA稀释5倍，-20℃保存。
3.RNA质量检测
紫外分光光度计测定RNA浓度。
Sample ID Sample Type 260/280 Conc.(ng/ul)
FABP4-shRNA1 RNA 1.815 394.68
FABP4-shRNA2 RNA 1.875 295.8
FABP4-shRNA3 RNA 1.859 386.92
FABP4阴性对照 RNA 1.877 307.72
4.实时荧光定量PCR
每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL，根据表1配置。反应条件为：
Figure BDA0001516806820000071
循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。
20μl荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0001516806820000072
使用的引物
Figure BDA0001516806820000073
在不同样本中，为了检测待测基因的表达差异，需要将样本量，实验误差等因素均一化，这就需要通过内参基因(表达量均一的基因)的CT值来平衡这些实验差异，获得-△CT值。对于一个样本待测基因的-△CT，计算如下：
-△CT＝-【Mean(检测基因CT值)-Mean(内参基因CT值)】
即：检测基因CT值的平均数-内参基因CT值的平均数。
对于两个样本间同一个检测基因表达量差异的计算公式为：
-△△CT＝-(△CT样本1-△CT样本2)＝-【样本1(检测基因CT-内参基因CT)】-【样本2(检测基因CT-内参基因CT)】。
如果提供对照组，则对照组相对表达量为1。各样本相对表达量F计算公式如下：
Figure BDA0001516806820000081
注：如果不提供对照组，我们把(对照样品的目的基因的CT值的平均—对照样本的看家基因的CT的平均)作为零来计算。此时待测组相对表达量F则为：
Figure BDA0001516806820000082
名词解释：
CT：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数
CT Mean：平均CT值
Qty：绝对定量拷贝数
Qty Mean：绝对定量平均拷贝数
-△CT：-(样本平均CT值-内参平均CT值)
2-△CT：2的-△CT指数次方
ACTB(内参)和FABP4基因扩增曲线图1和图2所示，ACTB(内参)和FABP4基因熔解曲线如图3和图4所示，各组试验中FABP4表达量的抑制率对比如图5所示。
抑制率如下表所示：
对照 FABP4 shRNA1 FABP4 shRNA2 FABP4 shRNA3
抑制率％ 100 47 13 61
实施例4细胞存活率
将实施例2中转染了4个shRNA慢病毒载体和空载对照慢病毒载体的细胞消化下来接种于96孔板中，每孔8000个细胞，加入TRAIL蛋白至终浓度100ng/ml，刺激24h，去掉培养基，每孔加入110μl含CCK-8的培养基(100μl培养基加10μlCCK-8)，37℃温育，每隔一小时于MD/SPECTRAMAX340分光光度仪上读取450nm处光吸收值，计算细胞成活率(细胞成活率＝实验组光吸收值/对照组光吸收值×100％)。每一组设定五个样品孔，每组实验重复三次。
结果如图6所示，上述各个慢病毒对细胞的存活率影响较小，其中FABP4shRNA1构建的质粒具有较高的细胞存活率。
对照 FABP4 shRNA1 FABP4 shRNA2 FABP4 shRNA3
存活率％ 98.3 86.9 97.9 91.5
序列表
<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120> 一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA、构建载体及其应用
<130> none
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos gaurus
<400> 4
gggatgtggt caccattaaa t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos gaurus
<400> 5
atactgagat ttccttcaaa t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos gaurus
<400> 6
tgtcactgcc accagagttt a 21

Claims (7)

1.一种抑制牛FABP4基因表达的shRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达载体，其特征在于，其含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体是质粒或者病毒。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，是指在HindIII和BamH1之间插入上述shRNA的pSilencer 4.1-CMV。
5.权利要求2～4任一项所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：将编码SEQ IDNO.2所示核苷酸序列DNA连接到载体中，构建表达载体。
6.包含权利要求2～4任一项所述的表达载体的宿主细胞。
7.权利要求2～4任一项所述的表达载体在制备抑制牛FABP4基因表达的试剂中的应用。
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