DE102011003936A1

DE102011003936A1 - Verwendung von Proteinen/Peptiden, welche an GRP78 (BIP) binden, in Labormethoden zum Monitoring von Thrombozyten-Aggregationshemmern

Info

Publication number: DE102011003936A1
Application number: DE102011003936A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: OXPROTECT GmbH
Current assignee: OXPROTECT GmbH
Priority date: 2011-02-10
Filing date: 2011-02-10
Publication date: 2012-08-16
Also published as: WO2012107566A1

Abstract

Zur Untersuchung des Einflusses von Medikamenten auf die Thrombozytenfunktion werden erfindungsgemäß Proteine oder Peptide eingesetzt, welche an GRP78/BIP binden.

Description

Erfindungsgebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Labormethode zur Erfassung der individuellen Hemmung der Thrombozytenfunktion durch ASS und pegylierte Liposomen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Methode für das Monitoring von therapeutischen/prophylaktischen Konzentrationen von Aspirin. Die Methode beruht auf der Hemmung der durch Proteine/Peptide, welche an GRP78 (BiP) binden, ausgelösten Thrombozytenaktivierung.
Hintergrund der Erfindung:
Vaskuläre Erkrankungen wie Herzinfarkt, Schlaganfall, thrombotischer Verschluss peripherer Gefäße sind für eine vorzeitige Morbidität und Mortalität insbesondere ab der vierten Lebensdekade entscheidend mitverantwortlich. Die Prävalenz von arteriellen Erkrankungen wird auf 25–60% geschätzt ¹. Etwa 30% aller Männer und 15% aller Frauen in Deutschland erkranken im Laufe ihres Lebens an einer koronaren Herzkrankheit. Die Lebenszeit-Prävalenz für einen Schlaganfall in der deutschen Bevölkerung von 18–79 Jahren beträgt insgesamt 15,5% bei Männern und 17,3% bei Frauen ².
Herz-Kreislauf-Erkrankungen verursachen die höchsten Behandlungskosten, wobei vor allem die so genannte koronare Herzkrankheit sowie der Schlaganfall zu Buche schlagen. Arterielle Gefäßerkrankungen nehmen mit steigendem Lebensalter zu. Durch den demografischen Wandel in der Bevölkerung relativieren sich daher auch die positiven Gesundheitstrends der letzten Jahre. Auch in Ländern des nichtwestlichen Kulturkreises steigt die Rate der Patienten, welche an einer Herz-Kreislauf-Erkrankung leiden. Man geht davon aus, dass die Sterberate weltweit infolge von Herz-Kreislauf-Erkrankung incl. Schlaganfall bis 2020 auf 25 Millionen pro Jahr steigen wird ^3,4. Thrombozyten spielen bei den erwähnten Krankheitsprozessen eine Schlüsselrolle. Sie verursachen atherothrombotische Gefäßverschlüsse, sind aber auch schon in der frühen Phase der Arteriosklerose an der Auswanderung von Leukozyten in das entzündete Gewebe sowie an der Schaumzellbildung und Proliferation glatter Muskelzellen beteiligt, indem sie proinflammatorische Substanzen und Wachstumsfaktoren sezernieren und über spezifische Adhäsionsachsen interagieren ^5,6.
Entzündungsreaktionen und thromboembolische Erkrankungen sind in ihrer Genese eng miteinander verwoben. Libby und Simon 2001 ⁷ sowie Wagner und Burger ⁸ verdeutlichen in ihren Übersichtsartikeln die Bedeutung der Thrombozyten bei Entzündungsreaktionen und für thromboembolische Erkrankungen. Huo und Kollegen ⁹ beschrieben, dass aktivierte Thrombozyten arteriosklerotische Gefäßveränderungen verstärken.
Aspirin (Acetylsalicylsäure, ASS) ist das am häufigsten verordnete Medikament zur Verhinderung von Gefäßthromben. Der Nutzen einer Sekundärprophylaxe kardiovaskulärer Ereignisse mittels ASS ist unstrittig Die kardiovaskuläre Wirkung des Medikaments wird bisher allgemein auf die Blockierung der Synthese von Thromboxan A2 durch irreversible Inaktivierung der Cyclooxygenase-1 in Thrombozyten zurückgeführt ^10,11.
Trotz ASS-Prophylaxe erleiden viele Patienten ein erstes oder erneutes ischämisches oder thromboembolisches Gefäßereignis (wie Herzinfarkt, Schlaganfall, TIA, periphere Verschlusskrankeit). Dieses Phänomen wird allgemein als Aspirinresistenz oder «aspirin non-responsiveness» bezeichnet, obwohl es sich pharmakologisch nicht um eine Medikamentenresistenz handelt. Klinisch ist Aspirinresistenz das Unvermögen atherothrombotische Ereignisse trotz Behandlung zu verhindern. Seine Ursachen konnten bisher trotz mehrerer Theorien noch nicht eindeutig geklärt werden ^12,13.
Eine andere Gruppe von so genannten Thrombozytenaggregationshemmern sind die ADP-Rezeptor-Hemmer, wie zum Beispiel Clopidogrel und Prasugrel.
Auch für die Thrombozytenaggregationshemmer aus der Gruppe der ADP-Rezeptor-Hemmer mit Thienopyridinstruktur ist bei einigen Patienten ein schlechtes Ansprechen beobachtet worden ¹⁴. Das schlechte Ansprechen der Thrombozyten auf Thienopyridine in Patienten beruht in erster Linie auf einem Verlust von aktiven Metaboliten der Medikamente im Körper ¹⁵ Insbesondere Patienten mit Diabetes mellitus zeigen eine verstärkte Aktivierungsbereitschaft der Thrombozyten und ein schlechteres Ansprechen auf eine Therapie mit Thienopyridinen als Patienten, welche nicht an Diabetes leiden ¹⁶. Um diejenigen Patienten zu identifizieren, welche mit der üblichen Konzentration von ASS oder ADP-Rezeptorhemmern der Gruppe der Thienopyridine vermutlich nicht ausreichend vor thromboembolischen Ereignissen geschützt sind, wurden unterschiedliche, kommerziell genutzte Labormethoden entwickelt.
So existieren relativ unspezifische Globalmethoden wie

– der Plättchenreaktivitätsindex nach Grotemeyer ^17,18,
– die residuale Arachidonsäure oder ADP induzierte Thrombozytenaggregation nach Born (Prinzip Lichttransmission) ¹⁹,
– die durch ASS oder Thienopyridine vermittelte Verhinderung der durch Thrombozytenaggregation (Agonisten ADP oder Arachidonsäure) ausgelösten Abnahme von singulären Thrombozyten (z. B. ”plateletworks”) oder als Impedanzmethode, z. B. mit dem ”Multiplate” („ASPItest” Pentapharm GmbH, München),
– die Verminderung der Adhäsion/Aggregation von Thrombozyten an die Wände einer mit Kollagen plus Adrenalin oder Kollagen plus ADP beschichteten Kapillare unter Scherstressbedingungen im PFA 100 (Siemens Healthcare Diagnostics),
– das ASS bzw. Thienopyridin inhibierte Zusammenballen von mit Fibrinogen beschichteten Kügelchen durch mit Arachidonsäure, bzw. ADP aktivierte Thrombozyten (Ultegra^®-RPFA-ASA, Ultegra^®-RPFA-ADP, Accumetrics^® VerifyNow, Accumetrics, San Diego, CA, USA),
– die ASS oder Thienopyridin induzierte Reduktion der Adhäsion und Aggregation durch Arachidonsäure bzw. ADP voraktivierte Thrombozyten und
– die Hemmung der Reduktion durch ASS im Impact „Cone and Plate(let) Analyzer” (Matis Medical Inc, Beersel, Belgium).

Mittels Durchflusszytometrie sind nach Aktivierung von Thrombozyten mit Arachidonsäure, bzw. ADP Aktivierungsmarker, wie z. B. Fibrinogenbindung, Aktivierungszustand des GPIIb/IIIa Rezeptors, Presentation von Granulamembranproteinen auf der Plasmamembran, wie DC63 und CD62P, Assoziation von Thrombozyten mit Leukozyten, messbar. Die Hemmung der Aktivierung durch ASS kann quantitativ evaluiert werden. US 2005255534 beschreibt ein Methode Thrombozyten mit einem Cyclooxygenase abhängigen Agonisten, wie die Arachidonsäure, zu aktivieren und dann sezerniertes ATP zu bestimmen.
Bisher genutzte „spezifische” Messmethoden beruhen auf der Hemmung der Thromboxan A2 Bildung durch ASS. Dabei wird der stabile Stoffwechselmetabolit des A2, das Thromboxan B2, im Serum oder im Urin bestimmt. Die Bildung von TXB2 wird bei über 98% der Menschen durch ASS gehemmt. US 2010227417 beschreibt die Methode, Zusammensetzung und einen Kit für die Messung von TXB2 zum Monitoring einer Aspirintherapie.
In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden, dass eine hohe verbleibende Plättchenaggregationsbereitschaft oder TXB2 Konzentration im Urin mit einer schlechten klinischen Prognose vergesellschaftet ist ^20–22.
Es ist daher wichtig, die Wirkung von ASS im individuellen Patienten zu monitoren. Es gilt aber noch wichtige Probleme zu klären. Unterschiedliche Tests zur Wirkung von Aspirin korrelieren nur schwach miteinander. Die Rate der mit diesen Labormethoden identifizierten Patienten schwankt stark. So wurden ASS-Resistenzraten zwischen 5% ²³ optische Thrombozytenaggregationsanalyse mit Arachidonsäure und ADP als Agonisten) und über 50% ²⁴. PFA 100) berichtet. Auch gibt es eine Gruppe von Patienten, deren Thrombozyten trotz kompletter Inhibition der TXA2 Bildung aggregierbar sind (Pseudo-Aspirin-Resistenz) ²⁵.
Der Mechanismus, welcher der „Aspirinresistenz” zugrunde liegt, ist bis heute nicht gefunden worden. Ein multifunktionelles Geschehen wird diskutiert.
Bei der Auswahl von Labormethoden zur Erfassung der Wirkung von ASS auf Thrombozyten wird aber bisher stets auf die Hemmung des Arachidonsäure/Thromboxane Stoffwechselweges abgezielt. So empfehlen Svenstrup et al., dass ”Zitat: bei allen Untersuchungen des Thrombozyteninhibitorischen Effekts von Aspirin der Agonist und dessen Konzentration mit größter Sorgfalt gewählt werden. Mehr spezifisch sollten Arachidonsäure, Kollagen, Epinephrin (Adrenalin) und niedrig-dosiertes Adenosin-Diphosphat (ADP) gewählt werden” ^26,27
Auch der Mechanismus der Thienopyridinresistenz, oft auch nach einem Vertreter der Medikamentenklasse ”Clopidogrelresistenz” genannt, ist trotz großer Bemühungen noch nicht beschrieben worden.
Analog wie für Aspirin/ASS beschrieben, ist auch das Monitoring von Patienten, welche Thienopyridine zur Prophylaxe oder Therapie einnehmen, zur optimalen Behandlung hilfreich.
Um die Wirkung der Therapie mit Aspirin/ASS und Thienopyridine auf Thrombozyten besser monitoren zu können, muss eine Methode gefunden werden, welche auf einem neuen zusätzlichen Wirkmechanismus von ASS und von Thienopyridinen beruht.
Probleme, welche durch die Erfindung gelöst werden:
Thromboembolische Erkrankungen stehen an der Spitze der Ursachen für Morbidität und Mortalität in der westlichen Welt. Aktivierung von Thrombozyten führt zur Thrombusbildung. Thromboembolische Erkrankungen im Sinne der Erfindung umfasst alle Erkrankungen, die auf eine erhöhte Bereitschaft zur Thrombozytenaktivierung und zur Thrombusbildung zurückzuführen sind. Aspirin/ASS ist eine Substanz, welche die Thrombozytenaktivierung hemmt. Aufgrund der zur Zeit gültigen Vorstellung über den Wirkmechanismus von ASS wird das Ansprechen eines Patienten auf eine ASS-Prophylaxe oder -Therapie über Labormethoden gemonitort, welche als Thrombozyten Agonisten Substanzen einsetzen, welche in ihrem Hauptaktivierungsweg direkt oder indirekt von der Cyclooxygenase abhängig sind, wie dies direkt bei der Arachidonsäure und indirekt beim Kollagen der Fall ist.
Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe war es, Thrombozytenagonisten und Labormethoden zu finden, welche in ihrer überwiegenden Wirkung Cyclooxygenase unabhängig sind, weil die Thromboztenaktivierung nicht ausschließlich über Thromboxan A2 verläuft. Der Teil des Aktivierungsweges, welcher TXA2 unabhängig ist, muss durch Aspirin auf einem alternativen Weg gehemmt werden. Mit Hilfe der Thrombozytenagonisten dieser Erfindung sollen Kits zur Anwendung der Methode beschrieben werden.
Thienopyridine sind Inhibitoren des P2Y12-ADP-Rezeptors der Thrombozyten ²⁸. Daher wird in bisher genutzten Testmethoden zur Wirkung der Thienopyridine ADP als Thombozytenaktivator eingesetzt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, Thrombozytenagonisten zu finden, welche direkt mit den Thienopyridienen oder ihren aktiven Metaboliten wechselwirken und mit diesen Thrombozytenagonisten Labormethoden zu entwickeln, die für das Monitoring von Clopidogrel und Prasugrel geignet sind.
Die Agonisten sollten im Blut oder Plättchen reichem Plasma von Menschen und/oder Säugetieren eine Thrombozytenaktivierung hervorrufen und die Labormethode sollte mit Blut von Menschen und/oder Saugetieren angewendet werden können.
Offenbarung der Erfindung:
Gelöst wird die vorstehend aufgezeigte Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, dass Proteine/Peptide, welche an GRP78 (BiP) binden, als Thrombozytenagonisten in Methoden und Kits zum Monitoring der Wirkung von ASS anstelle der klassischen Thrombozytenagonisten (wie Arachidonsäure, ADP, Adrenalin, Kollagen und Gemischen daraus) verwendet werden.
Geeignete Substanzen können dadurch leicht identifiziert werden, dass sie an GRP78 binden, dass sie Thrombozyten aktivieren und dass zusätzlich die Thrombozytenaktivierung durch die ausgewählte Substanz durch Zusatz von löslichem GRP78 gehemmt werden kann.
Im Sinne der Erfindung reicht die Hemmung der Aktivierung mit löslichem GRP78 durch eine der vielen Methoden.
Für das Monitoring der Therapie mit Thienopyridinen müssen die geeigneten Agonisten zusätzlich chemische Gruppen, wie aber nicht beschränkt auf FDP-Lysin tragen, welche an freie Thiolgruppen binden.
Die Thrombozytenaktivierung kann dabei mit der ganzen Palette der Methoden zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion, welche dem Fachmann bekannt ist ²⁹ untersucht werden. Im Sinne der Erfindung reicht die Hemmung der Aktivierung mit löslichem GRP78 durch eine der vielen Methoden aus.
Als Beispiele für derartige Substanzen wurden von uns HOCI-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiele modifiziertes Albumin, Antithrombin III, IgG), ein C-terminales Thrombospondin-1 Peptid mit der Sequenz RFYVVMWK, Amyloid beta (1–42) Peptid, HNP-1 bis HNP-3, das Adhäsionsprotein EAP von S aureus, AGE-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiel AGE-BSA), KSCN-modifiziertes IgG, und Harnstoff (Ures)-modifiziertes IgG gefunden. Die Erfindung beschränkt sich aber nicht auf diese Beispiele. Eine Vielzahl derartiger Proteinen/Peptide kann sehr leicht vom Fachmann identifiziert werden.
Die US-Patentanmeldung US 20080220446 beschreibt die Identifizierung von Proteinen mit einer „Cross-beta” Struktur.
Herczenik et al. zeigte 2007, dass Thrombozyten durch die in Ihrer Konformation veränderten Proteine Amyloid-beta (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV; 1–40), amyloidogenic peptide of Herpes simplex virus, genannt glycoprotein B, (GDVGRAVGKVVMGIVGGVVSA), Glyciertes Haemoglobin (Hb-AGE) and Rinderserumalbumin (BSA-AGE Hb-AGE, BSA-AGE), Fibrin alpha Kettenpeptid 12 (148KRLEVDIDIKIR15), aktiviert werden können³⁰.
Die Autoren beschreiben eine Aktivierung der Thrombozyten über die Rezeptoren CD36 und GPIb.
Außerdem wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Aktivierung von Thrombozyten durch missgefaltete Proteine/Peptide durch pegylierte Liposomen inhibiert werden kann.
Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten zeigen, dass Proteine/Peptide, welche an GRP78/BIP binden, Thrombozyten aktivieren können und dass lösliches GRP78/BIP oder andere GRP78/BIP Inhibitoren wie spezifische Antikörper gegen GRP78/BIP oder ATP diese Aktivierung zu hemmen vermögen. So identifizierten wir EAP und alpha Defensin als neue Thrombozytenaktivatoren ^{31, 32}. GRP78/(BIP) konnte von uns auf der Plasmamembran der Thrombozyten lokalisiert werden (siehe Beispiele). Die Thrombozytenaktivierung durch die oben genannten Agonisten wurde durch lösliches GRP78/BIP gehemmt (siehe Beispiele).
Die Freisetzung von Entzündungsmediatoren und vasoaktiven Substanzen sind für die Entstehung von thrombotischen und thromboembolischen Gefäßverschlüssen von entscheidender Bedeutung. Auch eine Unterversorgung des Gewebes mit Blut und anschließende Öffnung der Gefäße führt zu Entzündungsreaktionen und verursacht die Ischämie-Reperfusionsverletzung. Dabei kommt es zu einer Anflutung von toxischen Sauerstoffverbindungen (ROS), die von den Entgiftungsenzymen Superoxiddismutase (SOD) und Katalase nicht mehr vollständig neutralisiert werden können. Die Myeloperoxidase ist ein Enzym der azurophilen Granula der neutrophilen Granulozyten ³³ ^,34. Bei Entzündungsreaktionen wird Myeloperoxidase auch ins Blutplasma sezerniert. So fanden Baldus und Kollegen und Brennan und Kollegen, dass eine erhöhte Konzentration von Myeloperoxidase im Serum ³⁵, bzw. Plasma ³⁶ ein ausgezeichneter prognostischer Marker für ein bevorstehendes thrombotisches Koronarereignis ist. Bei Patienten mit Entzündungen in periphären Gefäßen hat sich die Myeloperoxidase als prognostischer Marker für Herzinfarkte und Schlaganfälle herausgestellt ³⁷ und erhöhte Myeloperoxidasekonzentrationen im Plasma zeigen eine Schädigung des Endothels an ³⁸. Der Übersichtsartikel von Libby ³⁹ zeigt die molekularen Mechanismen zur Entstehung von arteriellen Thrombosen auf.
Das Häm-Enzym Myeloperoxidase generiert in Gegenwart von Wasserstoff-Peroxid (H₂O₂) und im Plasma reichlich vorhandenen Chlorid-Ionen Hypochlorite, hypochlorige Säure oder auch HOCI; im weiteren vereinfacht als HOCI zusammengefasst.
Durch HOCI modifizierte Proteine, welche unter mehreren Namen beschrieben wurden, wie z. B. „advanced oxidised protein products” und „immune defense altered proteins (Idea-Ps)”, wirken prothrombotisch.
HOCI modifizierte Proteine, insbesondere HOCI-oxLDL, werden in arteriosklerotischen Läsionen gefunden ⁴⁰. Re und Kollegen ⁴¹ zeigten, dass Patienten mit venösen Thrombosen vermehrt HOCI-modifizierte Proteine systemisch im Plasma aufweisen. Aus EP 1 328 289 ⁴² ist bekannt, dass HOCI modifizierte Proteine Thrombozyten aktivieren.
Thrombozytenaktivierung führt zur Aggregation der Thrombozyten und zur Thrombusbildung.
HOCI modifizierte Proteine induzieren die aktivierungsabhängige Adhäsion von Thrombozyten und die Fibrinogenbindung an Thrombozyten. Sie induzieren die Freisetzung der Speichergranulainhaltsstoffe, die Präsentation von Granulamembranproteinen, wie CD62 und CD63 auf der Plasmamembran der Thrombozyten, die Plättchenaggregation und die Assoziation zwischen Thrombozyten und Leukozyten. Der oxidative Burst in neutrophilen Granulozyten wird angeregt und so kommt es zu einem Teufelskreis der gegenseitigen Aktivierung von Leukozyten und Thrombozyten. All diese Reaktionen sind an der Entstehung von thromboembolischen Ereignissen beteiligt ⁴³. Die Aggregation von Thrombozyten durch HOCI modifiziertes Albumin wurde von Volf und Kollegen ⁴⁴ gezeigt und die Arbeitsgruppe von Adrian Gear ⁴⁵ bestätigte die Thrombozytenaktivierung durch HOCI modifiziertes LDL. HOCI-modifizierte Proteine aktivieren Thrombozyten und hemmen den Eintritt von HI-Viren in Wirtszellen. WO0232445 und WO0222150 lehren die Thrombozytenaktivierende Wirkung von HOCI modifiziertem Albumin bzw. von HOCI modifiziertem Antithrombin. WO2004096368 zeigt die Hemmung des HI-Virus Eintritts in die Wirtszelle durch ein Gemisch aus HOCI modifizierten Plasmaproteinen.
Die Ausführungen zeigen, dass HOCI-modifizierte Proteine in vivo an der Entstehung von thrombotischen Ereignissen beteiligt sind.
Wie in dieser Erfindungsmeldung gezeigt, bindet HOCI-modifiziertes Protein an GRP78/BIP. GRP78/BIP wurde von uns aus der Plasmamembran von Thrombozyten entdeckt. Die Thrombozytenaktivierung durch HOCI-modifizierte Proteine wird, wie in den Beispielen zu dieser Erfindung gezeigt, durch lösliches GRP78/BIP gehemmt.
Überraschenderweise konnte die Aktivierung von Thrombozyten durch alle getesteten GRP78 bindende Proteine/Peptide durch ASS vollständig gehemmt werden. Diese Hemmung beruht zum überwiegenden Teil darauf, dass ASS die Bindung dieser Proteine an GRP78 verdrängt.
Durch Ersatz des/der konventionellen Thrombozytenagonisten in Methoden und Kits zum Monitoring der ASS-Therapie und ASS-Prophylaxe durch Proteine/Peptide, welche an GRP78/Bip binden, konnten die Wirkung von ASS auf den neu entdeckten Mechanismus gemessen und so neue Methoden zum Monitoring von ASS entwickelt werden. Die aktiven Metabolite der Thienopyridine tragen freie SH-Gruppen, welche irreversibel an den P2Y12 ADP-Rezeptor der Thrombozyten binden. (Metabolism and disposition of the thienopyridine antiplatelet drugs ticlopidine, clopidogrel, and prasugrel in humans. Farid NA, Kurihara A, Wrighton SA. J Clin Pharmacol. 2010 Feb; 50(2): 126–42.)
Wir konnten zeigen, dass HOCI-modifizierte Proteine mit freien SH-Gruppen reagieren. So hemmt zugesetztes Glutathion dosisabhängig und vollständig die Thrombozyten aktivierende Wirkung von HOCI-modifizierten Proteinen (siehe Beispiel).
Zum Monitoring von Thienopyridintherapien eignen sich daher HOCI-modifizierte Proteine als Thrombozytenagonisten in ganz besonderer Weise.
Beispiele
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele, die in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen, beschrieben. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Sie schließen für den Fachmann geläufige Abwandlungen ein.
1. Beispiel
Identifizierung von geeigneten Thrombozyten-Agonisten gemäß Erfindung

a) Bindung von HOCI-modifiziertem Protein (hier als Unterbeispiele Human-Albumin, RinderSerumalbumin, Antithrombin III) an GRP78/BIP

1 zeigt: Bindung von HOCI-modifiziertem HSA an die BiP.
2 zeigt: Bindung von HOCI-modifiziertem ATIII an die BiP.
Biacore
Elisa-Verfahren
Affinitätschromatographie

b) Bindung von AGE (advanced glycation end-products)-modifiziertem Protein (hier als Unterbeispiele AGE-BSA, AGE-Hämoglobin, AGE-Kollagen) an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie
c) Bindung von Thrombospondin-1 Peptid mit der Sequenz RFYVVMWK an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

3 zeigt: GRP78/BiP bindet an das TSP-1 Peptid RFYVVMWK.

d) Bindung von S.aureus Protein EAP an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

4 zeigt: Bindung von EAP an die BiP.

e) Bindung von humanem alpha Defensin (HNP-1) an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

5 zeigt: Defensiv bindet an GRP78/BiP.

f) Bindung von KSCN-modifiziertem Immunglubulin an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

6 zeigt: SCN^–-verändertes IgG bindet an GRP78/BiP

g) Bindung von Urea-modifiziertem Immunglobulin an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

7 zeigt: Harnstoff (Urea)-verändertes IgG bindet an GRP78/BiP.

h) Bindung von amyloid beta peptid (1–42) an GRP78/BIP Biacore Elisa-Verfahren Affinitätschromatographie

2. Beispiel
Verwendung von GRP78/BIP bindenden Proteinen/Peptiden als Thrombozytenagonisten und Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS.
HOCI-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiele Human-Albumin, RinderSerumalbumin, Antithrombin III) sind Thrombozytenagonisten. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS.
8 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes Albumininduzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
9 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes Albumininduzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.
10 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes ATIII-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
11 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes ATIII-induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten
12 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes BSA-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
13 zeigt: Aspirin inhibiert die durch HOCI-modifiziertes BSA-induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.
14 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch HOCI-modifiziertes Albumininduzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
15 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch HOCI-modifiziertes Albumininduzierte P. Selektin Expression von Thrombozyten.
16 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch HOCI-modifiziertes ATIII-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
17 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch HOCI-modifiziertes BSA induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
18 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch HOCI-modifiziertes BSA induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.

b) AGE-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiele AGE-BSA, AGE-Hämoglobin, AGE-Kollagen) sind Thrombozytenagonisten. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS. Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion
c) Thrombospondin-1 Peptid mit der Sequenz RFYVVMWK ist ein Thrombozytenagonist. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS. Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion

19 zeigt: Aspirin hemmt die TSP-1 Peptid-induzierte Fibrinogen-FITC-Bindung an Thrombozyten.
20 zeigt: GRP78/BiP verhindert die RFYWMWK-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.

d) S.aureus Protein EAP ist ein Thrombozytenagonist. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS.

21 zeigt: Aspirin inhibiert die EAP induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
22 zeigt: Aspirin inhibiert die EAP-induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.
23 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die EAP-induzierte Fibrinogenbindung an Plättchen.

e) Humanes alpha Defensine (hier als Unterbeispiel HNP-1) sind Thrombozytenagonisten. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS. Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion

24 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die Defensin-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.

f) KSCN-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiel Immunglobulin) sind Thrombozytenagonisten. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS. Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion

25 zeigt: Aspirin inhibiert die SCN^–-IgG induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten
26 zeigt den Einfluss von Aspirin auf die SCN^--IgG induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.
27 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch SCN^–-verändertes IgG induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.

g) Urea-modifizierte Proteine (hier als Unterbeispiel Immunglobulin) sind Thrombozytenagonisten. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS.

28 zeigt: Aspirin inhibiert die Urea-IgG induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
29 zeigt: Aspirin inhibiert die Urea-IgG-induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.
30 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch Harnstoff-verändertes IgG induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
31 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch Harnstoff-verändertes IgG induzierte P-Selektin Expression von Thrombozyten.

Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion

h) Amyloid beta peptid (1–42) ist ein Thrombozytenagonist. Hemmung der Aktivierung durch lösliches GRP78/BIP. Hemmung der Aktivierung durch Aspirin/ASS. Aktivierungsmarker: als Beispiele Fibrinogenbindung an Thrombozyten, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran als Marker für die Granulasekretion

32 zeigt: Aspirin inhibiert die β-Amyloid-Peptid 1–42-induzierte Fibrinogen-FITC-Bindung an Thrombozyten.
33 zeigt: GRP78/BiP inhibiert die durch β-Amyloid-Peptid-induzierte Fibrinogenbindung an Thrombozyten.
3. Beispiel
Darstellung der Hemmung der Thrombozytenaktivierung durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide mittels Aspirin/ASS in unterschiedlichen Analysemethoden und Analysegeräten
Allgemeines: Bei Verwendung von Proteinen/Peptiden, welche an GRP78/BIP binden, gemäß dieser Erfindung eignen sich insbesondere Antikoagulantien, welche die Ca⁺⁺-Konzentration im Blut nicht verändern. Citrat, EDTA, Heparin, Heparinderivate und Heparinoide sind für Anwendungen in Methoden gemäß Erfindung nicht geeignet. Als Antikoagulanz besonders geeignet sind dagegen direkte Thrombininhibitoren wie Hirudin (25 μg/ml), Melagatran, Dabigatran. Hirudin-Blutentnahmeröhrchen sind für gängige Blutentnahmesysteme verfügbar, z. B. von Sarstaedt.

a) ASS hemmt die durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide ausgelöste Thrombozytenaggregation im Plasma (Lichttransmission, Thrombozytenaggregation nach Born)

34 zeigt: Thrombozytenaggregation induziert durch EAP; Inhibition durch ASS
35 zeigt: Thrombozytenaggregation induziert durch das TSP-1 Peptid RFYVVMWK; Inhibition durch ASS
36 zeigt: Kontrolle: Thrombozytenaggregation induziert durch Arachidonsäure; Inhibition durch ASS

b) ASS hemmt die durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide ausgelöste Thrombozytenaggregation im Plasma und Vollblut (Impedanzmethode, Multiplate)

37 zeigt: Ergebnisse für EAP
38 zeigt: Ergebnisse für modifiziertes Albumin
39 zeigt: Ergebnisse für SCN^–-IgG
40 zeigt: Ergebnisse für Urea-IgG
41 zeigt: Ergebnisse für Kontrolle: Arachidonsäure
Bei der Messung werden Elektroden in Hirudin-antikoaguliertes Vollblut eingebracht. Die Aktivierung der Thrombozyten erfolgt im klassischen Test auf das Ansprechen auf Aspirin/ASS durch Arachidonsäure. Gemäß dieser Erfindung erfolgt die Aktivierung durch Proteine/Peptide, welche an GRP78/BIP binden. Anhaftung der aktivierten Thrombozyten an die Elektrode erhöht den elektrischen Widerstand. Der Impedanzanstieg wird in „Aggregation Units” (AU) angegeben, kontinuierlich aufgezeichnet und gegen die Zeit aufgetragen. Dadurch entsteht eine Aggregationskurve.
Vorgehensweise:
Testzelle in die Messposition des „Multiplate„ einsetzen. Sensorkabel anbringen. Je 300 μl physiologische Kochsalzlösung und Hirudinantikoaguliertes Vollblut in die Testzelle einbringen. 3 Minuten für Kalibrierung und Temperaturstabilisierung warten. Thombozytenaktivator (gemäß Erfindung Substanz aus der Gruppe der Proteine/Peptide, welche an GRP78/BIP binden. Beispiele: 20 μg/ml EAP, 10 μg/ml modifiziertes Albumin, 100 μg/ml SCN^–-behandeltes IgG, 100 μg/ml Harnstoff-behandeltes IgG) einbringen. Über sechs Minuten den Aggregationskurvenverlauf aufzeichnen.

c) ASS hemmt die Agglutination von Fibrinogen ummantelten Kügelchen mit Thrombozyten, welche durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide aktiviert worden sind.

(Prinzip: Accumetrics Der „VerifyNow^TM Aspirin Assay” ist ein turbidimetrisches optisches System, welches die Agglutination von mit Fibrinogen-beschichteten Beads durch stimulierte Plättchen in citratantikoaguliertem Vollblut misst. In den verwendeten Kartuschen fungiert Arachidonsäure als Agonist und die Resultate werden in „Aspirin Reaction Units” (ARU) angegeben.
Gemessen wird die Änderungsrate und der Umfang der Turbidität, die durch Thrombozytenaggregation in Vollblutproben auftritt In einer bevorzugten Ausführung dieser Erfindung wird die Arachidonsäure durch ein Protein/Peptid ausgetauscht, welches an GRP78/BIP bindet.
Da die Accumetrics Testsysteme den nachträglichen Austausch des Agonisten nicht möglich machen, wurde das Prinzip der Methode in einem Turbidimeter nachgestellt.

d) ASS hemmt die Freisetzung von Granulainhaltstoffen aus durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide aktivierten Thrombozyten. (hier als Unterbeispiele: ATP-Lumineszenz-Assay, PF4-ELISA, TSP-1 ELISA)
e) ASS hemmt die Aktivierung von durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide aktivierte Thrombozyten und erhöht damit die Zahl der anschließend adhärierten/aggregierten Thrombozyten im Impact Cone and Plate(let) Analyser.

Es wurden zwei unterschiedliche Methoden gewählt:

1) 10 μg/ml HOCI-modifiziertes Albumin, oder 10 μg/ml EAP, oder 100 μg/ml Urea-behandeltes IgG wurden an den Boden der Cone-and-Plate-Wells für 1 h bei RT gecoatet und anschließend gewaschen. 200 μl Hirudinantikoaguliertes Vollblut in An- und Abwesenheit von 10 mM ASS wurden für 2 Minuten bei einer Scherrate von 1700 s^–1 geschert. Nach der Scherung wurde das Well dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und die Thrombozyten mit May-Grünwald-Färbung gefärbt. Ausgewertet wurde die prozentuale Oberflächenbedckung.
2) 200 μg/ml Hirudin-antikoaguliertes Vollblut wurde mit 10 μg/ml HOCI-modifiziertem Albumin +/– 20 mM ASS, oder 10 μg/ml EAP +/– 20 mM ASS, oder 100 μg/ml Urea-behandeltes IgG +/– 20 mM ASS für 3 Minuten vorinkubiert und anschließend in die Cone-and-Plate-Wells pipettiert. Das Blut wurde für 2 Minuten bei 1700 s^–1 geschert. Nach der Scherung wurde das Well dreimal mit PBS-Puffer gewaschen und die Thrombozyten mit May-Grünwald-Färbung gefärbt. Ausgewertet wurde die prozentuale Oberflächenbedckung.

f) ASS hemmt die Thrombusbildung bei Durchfluss von Blut durch eine beschichtete Kapillare unter Scherstressbedingungen (Adhäsion und Aggregation an einer Aparatur einer Kollagenmembran PFA-100 Prinzip) – ASS hemmt die durch Thrombozytenaggregation (Agonisten GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide) ausgelöste Abnahme von singulären Thrombozyten – ASS hemmt die durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide ausgelösten aktivierungsbedingten Veränderungen an Thrombozyten, welche mit Hilfe der Durchflusszytometrie messbar sind

4. Beispiel
ASS-Therapie hemmt die ex vivo Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide

a) Proband 1 Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide vor Einnahme von ASS, nach 325 mg Einstiegsdosis, nach 3 Tagen mit einer Dosis von 100 mg/Tag
b) Proband 2 Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide vor Einnahme von ASS, nach 325 mg Einstiegsdosis, nach 3 Tagen mit einer Dosis von 100 mg/Tag
c) Proband 3 Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide vor Einnahme von ASS, nach 325 mg Einstiegsdosis, nach 3 Tagen mit einer Dosis von 100 mg/Tag

5. Beispiel
Thienopyridin-Therapie hemmt die ex vivo Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide, welche chemische Gruppen tragen, die mit freien Thiolgruppen wechselwirken.
Proband 1 Aktivierung von Thrombozyten durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide, welche mit freien Thiolen wechselwirken (hier als Unterbeispiel HOCI-modifiziertes Albumin) vor Einnahme von Clopidogrel, nach 300 mg Ladedosis, nach Behandlung über 10 Tage mit einer Dosis von 75 mg/Tag
6. Beispiel
Ein anderes Medikament, welches die Thrombozytenaktivierung durch GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide hemmt, sind Pegylierte Liposomen (Patentantrag Nr. 10 2010 043 733.6)
Auch die Hemmung der GRP78/BIP bindende Proteine/Peptide induzierten Thrombozytenaktivierung durch Pegylierte Liposomen ist durch Nutzung von GRP78/BIP bindenden Proteinen/Peptiden in Methoden und Kits zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion messbar.

a) Proband 1 Vor Applikation von pegylierten Liposomen, 30 min nach Applikation von pegylierten Liposomen, 60 min nach Applikation von Pegylierten Liposomen Marker der Thrombozytenaktivierung (Fibrinogenbindung, CD62P Präsentation auf der Plasmamembran, Impedanzaggregometrie, Transmissionsaggregometrie)

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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US 2010227417 [0012]
EP 132828942 [0039]
WO 0232445 [0041]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verwendung von Proteinen/Peptiden, welche an GRP78/BIP binden, zur Untersuchung des Einflusses von Medikamenten auf die Thrombozytenfunktion.
Verwendung nach Anspruch 1 in Methoden und Kits zur Untersuchung des Einfluß von Medikamenten auf die Thrombozytenfunktion
Verwendung von Proteinen/Peptiden, welche an GRP78/BIP binden, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Methoden und Kits zur Untersuchung des Einflusses von ASS/Aspirin auf die Thrombozytenfunktion genutzt werden.
Verwendung von Proteinen/Peptiden, welche an GRP78/BIP binden, nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Methoden und Kits zur Untersuchung des Einflusses von Pegylierten Liposomen auf die Thrombozytenfunktion genutzt werden.
Verwendung nach Anspruch 2 als Thrombozytenagonist in der Aggregometrie.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmissionsaggregometrieverfahren, Impedanzaggregometrieverfahren oder Verfahren mittels Zählung der nicht aggregierten Thrombozyten handelt.
Verwendung nach Anspruch 2 als Thrombozytenagonist für das Monitoring von Medikamentem in einer Vorrichtung, welche nach dem Prinzip des „Cone and plate(let) analysers” funktioniert.
Verwendung nach Anspruch 2 als Thrombozytenagonist für das Monitoring von Medikamenten in einem Gerät mit dem Analyseprinzip des PFA-100.
Verwendung nach Anspruch 2 als Thrombozytenagonist für das Monitorng von Medikamenten mittels Durchflusszytometrie.
Verwendung nach Anspruch 2 als Thrombozytenagonist für das Monitoring von Medikamenten durch die Quantifizierung von aus aktivierten Thrombozyten freigesetzten Inhaltsstoffen.