ES2250378T3 - Ensayo funcional de lipoproteina de alta densidad. - Google Patents

Ensayo funcional de lipoproteina de alta densidad.

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ES2250378T3 ES01923023T ES01923023T ES2250378T3 ES 2250378 T3 ES2250378 T3 ES 2250378T3 ES 01923023 T ES01923023 T ES 01923023T ES 01923023 T ES01923023 T ES 01923023T ES 2250378 T3 ES2250378 T3 ES 2250378T3
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Abstract

Un método de evaluar el riesgo de ateroesclerosis en un mamífero, dicho método comprendiendo: poner en contacto una lipoproteína de alta densidad (HDL) contenida en una muestra biológica de dicho mamífero con un fosfolípido oxidado; y medir un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde la ausencia de cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado indica que el mamífero tiene un riesgo de ateroesclerosis.

Description

Ensayo funcional de lipoproteína de alta densidad.
La declaración como los derechos de invención se hicieron bajo el patrocinio federal de investigación y desarrollo
Esta invención se realizó con ayuda del Gobierno bajo la Concesión No: HL30568, concedida por el Instituto Nacional de la Salud. El Gobierno de los Estados Unidos de América puede tener ciertos derechos sobre esta invención.
Campo de la invención
Esta invención trata del diagnóstico de la ateroesclerosis. En particular esta invención proporciona pruebas mejoradas.
Antecedentes de la invención
La enfermedad cardiovascular es una causa importante de morbilidad y mortalidad, particularmente en los Estados Unidos y en los países occidentales de Europa. Varios factores causantes están implicados en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular incluyendo la predisposición hereditaria a la enfermedad, sexo, factores de estilo de vida como es el fumar y la dieta, la edad, la hipertensión, e hiperlipidemia, incluyendo la hipercolesterolemia. Varios de estos factores, particularmente la hiperlipidemia e hipercolesterolemia (concentraciones elevadas de colesterol sanguíneo) proporcionan un significante factor de riesgo asociado con la ateroesclerosis.
El colesterol está presente en la sangre como colesterol libre y colesterol esterificado dentro de partículas de lipoproteínas, conocidas comúnmente como quilomicrones, las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLs), las lipoproteínas de baja densidad (LDLs), y las lipoproteínas de alta densidad (HDLs).
La concentración de colesterol total en la sangre está influenciado por (1) la absorción del colesterol a partir del tracto digestivo, (2) la síntesis de colesterol a partir de los constituyentes de la dieta como son los carbohidratos, las proteínas, las grasas y el etanol, y (3) la eliminación del colesterol de la sangre por los tejidos, especialmente el hígado, y la conversión posterior del colesterol a los ácidos biliares, las hormonas esteroidales, y el colesterol biliar.
El mantenimiento de las concentraciones de colesterol sanguíneo está influenciado por ambos factores genéticos y ambientales. Los factores genéticos incluyen la concentración de enzimas limitantes de velocidad en la biosíntesis del colesterol, la concentración de receptores para las lipoproteínas de baja densidad en el hígado, la concentración de enzimas limitantes de velocidad para la conversión de los ácidos biliares de colesterol, las velocidades de síntesis y secreción de las lipoproteínas y el sexo de la persona. Los factores ambientales que influyen la hemostasis de la concentración de colesterol sanguíneo en humanos incluyen la composición de la dieta, la incidencia de fumar, la actividad física, y el uso de una variedad de agentes farmacéuticos. Las variables de la dieta incluyen la cantidad y el tipo de grasas (saturadas y ácidos grasos poliinsaturados), la cantidad de colesterol, la cantidad y tipo de fibra, y tal vez las cantidades de vitaminas como es la vitamina C y D y minerales como es el calcio.
Como se indicó anteriormente, la alta concentración de colesterol sanguíneo es uno de los principales factores de riesgo para las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades de corazón coronarias en los humanos. El elevado colesterol-lipoproteína de baja densidad ("Colesterol-LDL") y el colesterol total están directamente relacionados a un mayor riesgo de enfermedades de corazón coronaria (Anderson et al. (1987) JAMA, 257: 2176-80).
Aunque los niveles elevados de colesterol total y colesterol-LDL son factores de riesgo en el desarrollo de aterosclerosis y enfermedades vasculares, una deficiencia de colesterol lipoproteína de alta densidad (de aquí en adelante "colesterol-HDL") ha sido recientemente reconocida como un factor de riesgo para desarrollar estas condiciones. Varios ensayos clínicos sostienen un papel protector de colesterol-HDL contra la aterosclerosis. Un estudio ha demostrado que para cada 1 mg/dl de colesterol-HDL que se incrementa en sangre, el riesgo de enfermedad vascular coronaria disminuye un 3% en las mujeres (Gordon et al. (1989) Circulation, 79: 8-15).
Se cree ampliamente que la HDL es una lipoproteína "protectora" (Vega y Grundy (1996) Curr. Opin. Lipidology, 7: 209-216) y que incrementando los niveles de plasma de la HDL puede ofrecer una protección directa contra el desarrollo de la aterosclerosis. Numerosos estudios han demostrado que ambos riesgos de enfermedades del corazón coronarias (CHD) en humanos y la severidad de la aterosclerosis experimental en animales están inversamente relacionadas con las concentraciones de colesterol-HDL de suero (HDL-C) (Russ et al. (1951) Am. J. Med., 11: 480-493; Gofman et al. (1996) Circulation, 34: 679-697; Miller and Miller (1975) Lancet, 1: 16-19; Gordon et al. (1989) Circulation, 79: 8-15; Stampfer et al. (1991) N. Engl. J. Med., 325: 373-381; Badimon et al. (1989) Lab. Invest., 60: 455-461).
Mientras que las relaciones de HDL/LDL parecen proporcionar un buen indicador para el riesgo de la aterosclerosis y enfermedades del corazón en un nivel de población, las mediciones de HDL y/o LDL han probado ser indicadores de diagnóstico pobres a nivel individual. En particular se han observado individuos con altas relaciones de HDL: LDL con severa aterosclerosis, mientras a la inversa, individuos con muy bajas relaciones de HDL: LDL no se ha identificado evidencia de aterosclerosis.
La WO98/59248 describe inmunoensayos para proteínas de baja densidad malondialdehído-modificado y lipoproteínas de baja densidad oxidadas, anticuerpos monoclonales (y las líneas celulares para ellos) para uso en los ensayos, y un estándar de almacenado estable (que se puede usar como un calibrador y/o control).
Resumen de la invención
La invención proporciona nuevos ensayos que son de pronóstico y/o diagnóstico para la aterosclerosis o el riesgo de aterosclerosis de acuerdo con la reivindicación 1. Los ensayos se basaron, en parte, sobre la elucidación de un mecanismo por el cual la HDL ofrezca protección contra la formación de placas. En particular, fue un descubrimiento de esta invención que la HDL o los componentes puedan impedir la oxidación de los lípidos (por ejemplo lípidos presentes en LDLs) y también puedan reparar (reducir) los lípidos ya oxidados y por lo tanto reducir la respuesta inflamatoria asociada con y característica de la formación de placa aterosclerótica. Sin embargo fue un descubrimiento de esta invención que los individuos varían en la capacidad de su HDL para ofrecer dicha protección. Así, un ensayo de la actividad reparadora y/o protectora de la HDL proporciona un ensayo altamente efectivo para el riesgo de aterosclerosis y sus patologías asociadas.
En resumen, se cree que los componentes de la HDL que impiden la oxidación de lípidos o que reparan los lípidos ya oxidados y por lo tanto reducen una respuesta inflamatoria, pueden, en general, reducir la susceptibilidad a o la severidad de otras patologías asociadas con el proceso inflamatorio (por ejemplo, artritis reumatoide, fibrosis pulmonaria idiopática, lupus, y otras enfermedades inflamatorias crónicas).
Así, en una realización, esta invención proporciona métodos de evaluar el riesgo de aterosclerosis (u otras enfermedades inflamatorias) en mamíferos al evaluar la capacidad de la HDL de mamíferos para reparar (reducir) los fosfolípidos oxidados. Los métodos involucran preferiblemente el poner en contacto la lipoproteína de alta densidad contenida en una muestra biológica del mamífero donde la muestra comprende una lipoproteína de alta densidad (HDL) o un componente de ella (por ejemplo. apo A-I, la paraoxonasa, el factor de activación de plaquetas acetilhidrolasa, etc.), con un fosfolípido oxidado; y midiendo un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde la ausencia de cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado indica que el mamífero tiene un riesgo de ateroesclerosis.
El fosfolípido oxidado es de preferencia un fosfolípido oxidado que causa una reacción monocítica. Particularmente, los fosfolípidos que se prefieren incluyen, pero no se limitan a la forma oxidada de lípidos que se eligen del grupo que consiste de 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (Ox-PAPC), 1-palmitoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (POVPC), 1-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (PGPC), 1-palmitoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (PEIPC), 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SAPC), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SOVPC), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SGPC), 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (SEIPC), 1-estearoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (Ox-SAPE), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SOVPE), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SGPE), y 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SEIPE). En una realización particularmente preferida, el fosfolípido oxidado es un componente de (presente en) una lipoproteína de baja densidad.
El fosfolípido oxidado (o fosfolípido reducido) se puede determinar por cualquier método conveniente. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a la espectrometría de masas, a la cromatografía de líquidos, a la cromatografía de capa fina, a la fluorimetría, a la detección de radioisótopos, a la detección de anticuerpos, y detectando una señal a partir de un marcaje que indica un fosfolípido oxidado. Se prefieren particularmente los marcajes fluorescentes (por ejemplo. diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina, rodamina, ácido cis-parinarico, NBD, éster de colesterol del ácido cis-parinarico, ácido difenilhexatrieno propiónico).
En ciertas realizaciones, la detección comprende un método cromatográfico que se elige del grupo que consiste de la cromatografía de líquidos de rápido desarrollo (FPLC).
Las muestras que se prefieren incluyen los fluidos o muestras de tejidos que contienen la HDL.
Las muestras que se prefieren particularmente incluyen, pero no están limitadas a la sangre entera o a fracciones de sangre (por ejemplo, suero).
Se puede usar la muestra directamente, o alternativamente, la HDL puede ser aislada de la muestra. Se puede determinar el cambio y/o la cantidad de fosfolípido oxidado relativo a los niveles conocidos para la población sujeto y/o por referencia a varios controles. Dichos controles incluyen, pero no se limitan al cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado que se produce al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL conocida para reducir los niveles de fosfolípido oxidado, el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL conocida por ser deficiente en la capacidad de reducir los niveles de fosfolípido oxidado, y el cambio en fosfolípido producido en el mismo experimento realizado sin HDL o con HDL presente a una concentración más baja.
El mamífero puede ser un humano o un no-humano. Los mamíferos particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a los humanos, los primates no-humanos, los caninos, los felinos, los murinos, los bovinos, los equinos, los porcinos, y lagomorfos. El humano puede ser un humano diagnosticado por tener una baja relación HDL: LDL y/o que tiene riesgo de aterosclerosis.
En otra realización esta invención proporciona métodos de evaluar el riesgo de aterosclerosis en un mamífero al medir la capacidad de la HDL del mamífero para proteger los lípidos de la oxidación. Los métodos que se prefieren involucran poner en contacto la HDL contenida en una muestra biológica del mamífero donde la muestra comprende una lipoproteína de alta densidad (HDL), con un fosfolípido, sometiendo el fosfolípido a condiciones de oxidación; y midiendo un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado indica que el mamífero tiene riesgo de aterosclerosis. En una realización preferida el fosfolípido está proporcionado en una lipoproteína de baja densidad (LDL). Los fosfolípidos que se prefieren particularmente son fosfolípidos que, cuando se oxidan, los fosfolípidos causan una reacción monocítica. Dichos fosfolípidos incluyen, pero no están limitados al 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (Ox-PAPC), 1-palmitoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (POVPC), 1-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (PGPC), 1-palmitoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (PEIPC), 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SAPC), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SOVPC), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SGPC), 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (SEIPC), 1-estearoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (Ox-SAPE), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SOVPE), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SGPE), y 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SEI PE).
En ciertas realizaciones los fosfolípidos están sometidos a condiciones de oxidación al poner en contacto el fosfolípido con un agente oxidante, por ejemplo. un agente que se elige del grupo que consiste del peróxido de hidrógeno, 13(S)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE, y HETE. La detección del fosfolípido reducido u oxidado puede realizarse por cualquier método conveniente, con los métodos descritos aquí (por ejemplo. descritos anteriormente) que son los más preferidos. Los marcajes de detección que se prefieren particularmente incluyen pero no están limitados a diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina, rodamina, ácido cis-parinarico, NBD, éster de colesterol del ácido cis-parimico, ácido difenilhexatiseno propiónico. Las muestras que se prefieren son como se describen anteriormente y aquí. En el caso de sangre o muestras de fracción de sangre, el método puede involucrar el uso directo de la sangre o la fracción de sangre o el aislamiento de la HDL a partir de la sangre o la fracción de sangre.
Se pueden determinar el cambio y/o la cantidad de fosfolípido oxidado relativos a los niveles conocidos para la población sometida y/o por referencia a varios controles. Dichos controles incluyen, pero no están limitados al cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL conocida para reducir los niveles de fosfolípido oxidado, el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL conocida por ser deficiente en la capacidad para reducir los niveles de fosfolípido oxidado, y el cambio en el fosfolípido producido en el experimento realizado sin la HDL o con la HDL presente a más baja concentración.
Los mamíferos de ensayo que se prefieren de acuerdo a los métodos de esta invención incluyen los humanos y no humanos, por ejemplo. como se describió antes. Los sujetos que se prefieren particularmente son humanos diagnosticados que tienen una baja relación de HDL: LDL y/o que tienen riesgo de aterosclerosis.
Definiciones
Los términos "lipoproteína de baja densidad" o "LDL" se definen de acuerdo con el uso común de aquellos expertos en la técnica. Generalmente, la HDL se refiere al complejo lípido-proteína el cual cuando se aísla por ultracentrifugación se encuentra en el rango de densidad d = 1,019 a d = 1,063.
Los términos "lipoproteína de alta densidad" o "HDL" se definen de acuerdo con el uso común de aquellos expertos en la técnica. Generalmente, la HDL se refiere al complejo lípido-proteína el cual cuando se aísla por ultracentrifugación se encuentra en el rango de densidad d = 1,063 a d = 1,21.
El término "Grupo HDL I" se refiere a una lipoproteína de alta densidad o a los componentes de ella (por ejemplo. la apo A-I, la paraoxonae, el factor de activación de plaquetas acetilhidrolasa, etc.) que reduce los lípidos oxidados (por ejemplo en lipoproteínas de baja densidad) o que protegen los lípidos oxidados de la oxidación por agentes oxidantes.
El término "Grupo HDL II" se refiere a una HDL que ofrece actividad reductora o no actividad en proteger los lípidos de la oxidación o en reparar los lípidos oxidados (por ejemplo reducirlos).
El término "componente HDL" se refiere a un componente (por ejemplo moléculas) que comprenden una lipoproteína de alta densidad (HDL). Los ensayos para la HDL que protege los lípidos de la oxidación o que repara (por ejemplo reduce los lípidos oxidados) incluyen también los ensayos para los componentes de la HDL (por ejemplo la apo A-I, la paraoxonasa, el factor de activación de plaquetas acetilhidrolasa, etc.) que demuestran dicha actividad.
Una "reacción monocítica" como se usa aquí se refiere a la actividad monocítica característica de la "respuesta inflamatoria" asociada con la formación de placa ateriosclerótica. La reacción monocítica se caracteriza por la adhesión de monocitos a células de la pared vascular (por ejemplo las células del endotelio vascular), y/o la quimiotaxis en el espacio subendotelial, y/o la diferenciación de monocitos en macrófagos.
El término "ausencia de cambio" cuando refiriéndose a la cantidad de fosfolípidos oxidados se refiere a la pérdida de una cantidad detectable, de mayor preferencia la pérdida de un cambio estadísticamente significante (por ejemplo al menos en el 85%, de preferencia al menos en el 90%, y de mayor preferencia al menos en el 95%, y más preferiblemente al menos en el 98% o 99% en el nivel de confianza). La ausencia de una cantidad detectable (por ejemplo cuando marca un resultado positivo para el Grupo HDL I) se puede referir también a los ensayos en los que el nivel de colesterol oxidado cambia, pero no tanto como en la ausencia de la HDL o con referencia a otros controles positivos o negativos.
Se usan las siguientes abreviaciones aquí: PAPC: L-\alpha-1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina;
POVPC: 1-palmitoil-2-(5-oxovaleril)-sn-glicero-3-fosfocolina; PGPC: 1-palmitoil-2-glutaril-sn-glicero-3-fosfocolina; PEIPC: 1-palmitoil-2-(5,6-epoxiisoprostano E_{2})-sn-glicero-3-fosfocolina; ChC18:2: linoleato de colesterilo;
ChC18:2-OOH: hidroperóxido de linoleato de colesterilo; DMPC: 1,2-ditetradecanoil-rac-glicerol-3-fosfocolina;
PON: paraoxonasa; HPF: alto campo de poder estandarizado; PAPC: L-\alpha-1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina; POVPC: 1-palmitoil-2-(5-oxovaleril)-sn-glicero-3-fosfocolina; PGPC: 1-palmitoil-2-glutaril-sn-glicero-3-fosfocolina; PEIPC: 1-palmitoil-2-(5,6-epoxiisoprostano E_{2})-sn-glicero-3-fosfocolina; PON: paraoxonasa; HPF: campo de alto poder estandarizado; BL/6: C57BL/6J; C3H: C3H/HeJ.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra un método de llevar a cabo la invención por medio de un ensayo para probar la actividad de la HDL en proteger los lípidos de la oxidación.
La Figura 2 la eliminación de moléculas sembradas de LDL por la apo A-I. Se agregó hidroxitolueno butilado (BHT) a plasma recién aislado a una concentración de 20 \muM y se fraccionó por cromatografía de filtración en gel usando un sistema FPLC con dos columnas Superose 6 conectadas en serie y eluyendo con solución salina normal. Las fracciones que contienen LDL fueron reunidas. Se agregó la apo A-I purificada (100 \mug/ml) a la LDL (1 mg/ml) y se incubó por 2 h a 37ºC con agitación suave en solución salina normal. Se re aislaron entonces la LDL y la apo A-I por FLPC o por centrifugación. La LDL re aislada se designó "LDL después A-I" y la apo A-I re aislada se designó "A-I después de LDL".
La Figura 3A, la Figura 3B, y la Figura 3C ilustran la resistencia de la LDL a la oxidación siguiendo la incubación con apo A-I. Se aisló rápidamente la LDL por FPLC de siete donadores humanos normales y 1 mg/ml de LDL se incubó con 100 \mug/ml de apo A-I seguido por el re aislado de la LDL y la apo A-I como se describió en la Figura 2. Se incubaron los cocultivos de las células de pared arterial con LDL placebo tratada (LDL placebo) o con LDL que se incubó con apo A-I y se re aisló (LDL después de A-I), o con apo A-I placebo tratada (A-I placebo). Se les agregó a los otros pozos del cocultivo la LDL reconstituida que se preparó al incubar "LDL después de A-I" más los lípidos que se extrajeron de "A-I después de LDL" (lípidos A-I después de LDL + LDL después de A-I). Se incubaron los cocultivos durante 8 h. a 37ºC en la presencia del 10% de LPDS. Se reunieron los sobrenadantes y se analizaron para determinar los niveles de hidroperóxido de lípido.
Se determinó la adhesión de monocitos en un conjunto de los cocultivos y los otros se lavaron e incubaron con medios de cultivo sin suero o LPDS durante 16 h. Se reunió este medio acondicionado y se analizó para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos. La Figura 3A demuestra los niveles de hidroperóxido de lípidos de los sobrenadantes. La Figura 3B demuestra la adherencia de monocitos y la Figura 3C contiene los valores de actividad quimiotáctica de monocitos. La figura es una representación de siete experimentos separados usando la LDL de los 7 diferentes donadores normales y los cocultivos y los monocitos de diferentes donadores. Los valores son la media \pmSD de los cocultivos cuadruplicados. Los asteriscos indican p<0,0004.
La Figura 4A y la Figura 4B ilustran el efecto del pre tratamiento de la LDL con péptido miméticos de apo A-I sobre la oxidación de la LDL y la actividad quimiotáctica. Se incubaron 250 \mug/ml de la LDL recién aislada con solución tampón (LDL placebo), con 100 \mug/ml de 37pA el péptido mimético de la apo A-I o con 100 \mug/ml del péptido control 40P. La incubación se realizó en M199 durante 2 h. a 37ºC con agitación moderada. Se re aislaron posteriormente la LDL y los péptido como en la Figura 1. Se incubaron los cocultivos de las células de pared arterial con la LDL placebo tratada (LDL placebo), o la LDL que se incubó con el péptido mimético de la apo A-I (LDL después de 37pA), o con el péptido control (LDL después de 40P), el 37pA placebo tratada (37pA placebo), o 40PA placebo tratada (40PA placebo). Se agregó a otros pozos del cultivo la LDL reconstituida que se preparó al incubar "LDL después de 37pA" más los lípidos que se extrajeron de "37pA después de LDL" (lípidos 37pA después de LDL + LDL después de 37pA). Se incubaron estos agregados con cocultivos de pared arterial humana durante 8 h. en la presencia del 10% de LPDS. Se reunieron los sobrenadantes y se analizaron para determinar los niveles de hidroperóxido de lípidos (Figura 4A). Se lavaron entonces los cocultivos y se incubaron con medio de cultivo sin suero o LPDS durante 8 h. Se reunió entonces el medio acondicionado y se analizó para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 4B). Los datos indican una media \pmSD de los valores obtenidos a partir de los cocultivos cuadruplicados en los tres experimentos separados. Los asteriscos indican p<0,0014.
La Figura 5A, la Figura 5B, la Figura 5C, y la Figura 5D demuestran la bio actividad de los lípidos extraídos por la apo A-I. Se incubó la HDL recién aislado (1 mg/ml) con apo A-I (100 \mug/ml) y se re aisló como se indica en la Figura 1. Los lípidos se extrajeron de "A-I después de LDL" por extracción con cloroformo metanol y se separó con cromatografía de extracción en fase sólida como se describió en Métodos. Se evaporaron a sequedad los ácidos grasos (FA) o las fracciones de lípidos neutros (NL) y se incubaron con 200 \mul de M199 que contiene 10% de LPDS a 37ºC durante 5 minutos con intermitente vortexing moderado. Se incubaron entonces los ácidos grasos (FA-A-I después de LDL, Figura 5A y Figura 5B), o los lípidos neutros (NL-A-I después de LDL, Figura 5C y Figura 5D), en las cantidades indicadas con ya sea 100 \mug de PAPC o 250 \mug de "LDL después de A-I" en un volumen total de 1 ml de M199 que contiene 10% de LPDS a 37ºC durante 3h. Se incubó entonces este PAPC tratado o LDL en M199 que contiene 10% de LPDS con HAEC a 37ºC durante 4 h. Se retiraron los sobrenadantes y se probaron para determinar el contenido de hidroperóxido de lípidos (Figura 5A y Figura 5C) como se describió aquí. Se lavaron las células y se determinó la adhesión de monocitos (Figura 5B y Figura 5D) como se describió aquí.
La Figura 6A hasta la Figura 6H ilustra la eliminación de 13-HPODE y el 15-HPETE por la apo A-I de la LDL. Se incubó solo la LDL recién aislada (1 mg/ml) (LDL simulada), o con la apo A-I (100 \mug/ml) en M199 durante 2h., con agitación moderada. Para los controles, se incubó solo 100 \mug/ml de apo A-I en M199 durante 2h. (A-I placebo, Figura 6A y Figura 6E) o se incubó solo 1 mg/ml de LDL recién aislado en M199 durante 2 h. (LDL placebo, Figura 6B y Figura 6F) con agitación moderada a 37ºC. Se re aislaron entonces la LDL y la apo A-I por centrifugación usando filtros de corte de peso molecular Millipore (100 kDa). Los lípidos se extrajeron de la apo A-I y de la LDL y se analizaron por HPLC de fase reversa. Las Figuras 6C y 6G demuestran la disminución en el 13-HPODE y los picos 15-HPETE en la LDL siguiendo la incubación con la apo A-I (LDL después de A-I) y la Figura 6D y la Figura 6H demuestran el incremento en 13-HPODE y 15-HPETE respectivamente en la extracción de lípidos del apo A-I después de la incubación con y la separación de la LDL (A-I después de LDL).
La Figura 7A y Figura 7B ilustran las moléculas sembradas en la LDL de las razas de ratones C57BL/6 y C3H/HeJ con una dieta chow. Se aisló la LDL del plasma obtenido de grupos (n= 5 cada grupo) de los ratones susceptibles a lesión C57BL/6 (BL/6) y de los ratones resistentes a lesión C3H/HeJ (C3H). Se incubó la LDL (100 \mug/ml) con la apo A-I humana (100 \mug/ml) con agitación moderada a 37ºC y entonces se re aisló por FPLC como se indicó en la Figura 2. La reconstitución de la LDL con lípidos eliminados por la apo A-I se realizó como se describió en la Figura 3 y se incubó con cocultivos de células de pared aortica. Las abreviaciones son las mismas como en la Figura 3. La Figura 7A muestra los datos sobre los hidroperóxidos de lípidos formados y la Figura 7B demuestra la actividad quimiotáctica que se indujo. Los valores mostrados son la media \pmSD de los cocultivos cuadruplicados. Los asteriscos indican p<0,0015.
La Figura 8A y la Figura 8B muestran que la inyección de apo A-I (pero no apoA-II) en los ratones hace la LDL del ratón resistente a la oxidación por las células humanas de pared arterial. Se inyectaron los grupos de ratones C57BL/6 (n = 5) en la vena del rabo con 100 \mug por animal de la apo A-I, la apo A-II o con solución salina únicamente. Se extrajeron las muestras de sangre en puntos de tiempo, se aisló la LDL y se incubó con cocultivos por 8 h. Se probaron los sobrenadantes de los cultivos para hidroperóxidos de lípidos (Figura 8A) y para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 8B) como se describió en Métodos. La figura representa la media \pmSD de muestras cuadruplicadas de un experimento representativo. Los asteriscos indican p<0,0001 como se comparó en el tiempo 0. Se obtuvieron resultados idénticos en dos de los dos experimentos separados.
La Figura 9A y 9B muestran que la inyección de apo A-I humana en humanos hace a su LDL resistente a la oxidación por células humanas de pared arterial. Se inyectaron seis individuos (descritos aquí) con discos de 50 mg de apo A-I/Kg de peso corporal de apo A-I humana/fosfatidilcolina durante un periodo de 4 h. Se preparó el plasma 2 h. antes y 6 h. siguiendo el inicio de la inyección (es decir 2 h. después del término de la inyección). Se aisló la HDL por FLPC y se incubó (100 \mug/ml) con cocultivos por 8 h. Se reunieron los sobrenadantes del cultivo y se sometieron a la extracción de lípidos y se probaron para determinar el contenido de hidroperóxido (Figura 9A). Se lavaron los cocultivos y se incubaron en medio de cultivo sin suero o LPDS durante 8 h. y se analizó el medio acondicionado para la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 9B). Se presenta la media \pmSD de los cocultivos cuadruplicados y el asterisco indica p<0,0173 para el Panel A; p <0,0077 para el Panel B.
La Figura 10A y Figura 10B muestran que la HDL o la HDL asociada a enzimas hace a la LDL resistente a la oxidación por células humanas de la pared arterial. Se incubaron 250 \mug/ml de la LDL recién aislada con solución tampón (LDL placebo tratada), con 350 \mug/ml de la HDL (HDL tratado LDL) o con PON purificada a 1 X 10^{-2} U/ml (PON tratado LDL). Se llevó acabo la incubación en M199 durante 3 h. a 37ºC con agitación moderada. Posteriormente se re aisló la HDL por centrifugación utilizando filtros de corte de peso molecular Millipore (100 KDa) y se incubó con cocultivos de pared arterial humana durante 8 h. en la presencia de 10% de LPDS. Se retiraron los sobrenadantes y se analizaron para determinar los hidroperóxidos de lípido (Figura 10A); se lavaron los cocultivos y se incubaron con medio de cultivo sin suero o LPDS. Se reunió el medio después de 8 h. y se analizó para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 10B). Los datos indican la media \pmSD de los valores obtenidos de los cocultivos cuadruplicados en tres experimentos separados. Los asteriscos indican significancia al nivel de p<0,0008.
La Figura 11A y Figura 11B muestran que la Apo A-I elimina sustancias de las células humanas de pared arterial y hace a las células incapaces de oxidar la HDL. Se incubaron los cocultivos con 50 \mug/ml de la apo A-I o la apo A-II o fueron placebo tratadas durante 8 h. Se removieron los medios acondicionados que contienen ya sea apo A-I o apo A-II y en algunos casos se transfirieron a otros cocultivos que han sido tratados de forma idéntica y sirvieron como cocultivos blanco. Se agregaron 250 \mug/ml de la LDL a los cocultivos blanco que han sido placebo tratado (cultivos de placebo tratado), o a cocultivos blanco que han sido tratados con apo A-I la cual ha sido retirada (cultivos después de A-I), o tratados con la apo A-II la cual ha sido retirada (cultivos después de A-II). También se agregaron 250 \mug/ml de la LDL a cocultivos blanco que han sido tratados con la apo A-I o la apo A-II y a los que se le agregó el medio acondicionado que contiene ya sea apo A-I o apo A-II del primer conjunto de cocultivos (cultivos después de A-I + A-I después de cultivos), (cultivos después de A-II + A-II después de cultivos), respectivamente. Se incubaron los cocultivos blanco por 8 h. en M199 que contiene 10% de LPDS y la LDL con o sin las adiciones (medio acondicionado) del primer conjunto de cocultivos. Algunos cocultivos recibieron 250 \mug/ml de la LDL más 50 \mug/ml de la apo A-I al inicio de las 8 h. de incubación y continuó durante un total de 16 h. (A-I co-incubada). Se retiraron los sobrenadantes y se probaron para determinar los hidroperóxidos de lípido (Figura 11A) y se lavaron los cocultivos y se les agregó M199 fresco sin suero o LPDS y se incubaron por 8 h y se probaron para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 11B). Los valores son una media \pmSD de los tres experimentos separados que usan LDL de diferentes donadores. Los asteriscos indican significancia al nivel de p<0,001
La Figura 12A y Figura 12B muestran que un péptido mimético apo A-I elimina sustancias de las células humanas de pared arterial y hace a las células incapaces de oxidar la LDL. Se incubaron los cocultivos de pared aórtica humana solo con medio (placebo tratado), con 100 \mug/ml de un péptido mimético de la apo A-I (37pA tratado ) o con 100 \mug/ml de un péptido control (40P tratado) por 8 h. Se lavaron entonces los cocultivos y se agregó la LDL recién aislada y se incubaron en M199 que contiene 10% de LPDS por 8 h. adicionales. Se retiró el medio y se probó para hidroperóxidos de lípido (Figura 12A). Se lavaron los cocultivos y se incubaron con medio de cultivo sin suero o LPDS por 8 h. adicionales y se probó para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 12B). Los datos representan una media \pmSD de los valores obtenidos de los cocultivos cuadruplicados en tres experimentos separados. Los asteriscos indican significancia al nivel de p = 0,011.
La Figura 13A y Figura 13B muestran que la HDL y su enzima asociada PON hace a las células humanas de pared arterial incapaces de oxidar LDL. Se incubaron los cocultivos de pared aórtica humana solo con medio (placebo tratado), con 350 \mug/ml de la HDL (HDL tratada), o con 1X 10^{-2} U/ml de paraoxonasa purificada (PON tratada) por 8 h. Se lavaron entonces los cocultivos y se les agregó 250 \mug/ml de la LDL recién aislada y se incubaron en M199 que contiene 10% de LPDS por 8 h. adicionales. Se reunió el medio y se analizó para determinar los hidroperóxidos de lípido (Figura 13A). Se lavaron entonces los cocultivos y se incubaron con medio de cultivo sin suero o LPDS por 8 h. y se reunieron los sobrenadantes y analizaron para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 13B). Los datos representan una media \pmSD de los valores obtenidos de los cocultivos cuadruplicados en tres experimentos separados. Los asteriscos indican significado al nivel de p<0,011.
La Figura 14A, Figura 14B, y Figura 14C muestran que el pre tratamiento de células humanas de pared arterial con ácido linoleico ocasiona un incremento en los niveles de hidroperóxidos de lípido, la actividad quimiotáctica de monocitos y la eliminación de 13-HPODE por apo A-I. Se incubaron dos conjuntos de cocultivos por 18 h. a 37ºC con 100 \muM de ácido oleico (C18:1), o ácido linoleico (C18:2) en M199 con 10% de LPDS. Se retiró el medio y se lavaron los cultivos tres veces. Se les agregó medio fresco sin ácidos grasos y se incubaron los cultivos a 37ºC por 3 h. adicionales. Se agregaron entonces 250 \mug/ml de la LDL a un conjunto de los cocultivos en M199 que contiene 10% de LPDS y se incubó por 8 h. Se retiró entonces el medio y se determinaron los hidroperóxidos de lípido (Figura 14A) y la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 14B). Se agregó al segundo conjunto de cocultivos (Figura 14C) 100 \mug/ml de la apo A-I y se incubó por tres horas más con agitación moderada a 37ºC. Se retiró el sobrenadante, se separó la apo A-I por FLPC, y se determinó el contenido del hidroperóxido del extracto del lípido de los sobrenadantes que no recibieron apo A-I (sobrenadante del cultivo) y el extracto de lípido de apo A-I ((Extracto de lípido Apo A-I) como se describe en Métodos que se expresaron como ng por pozo. Los valores son una media \pmSD de las determinaciones por triplicado. Los asteriscos indican p<0,001.
La Figura 15A, Figura 15B, y Figura 15C muestran que el 13(S)-HPODE acelera la formación de fosfolípidos oxidados bio activos de PAPC. Se mezclaron diez \mug de PAPC con 1,0 \mug del 13(S)-HPODE (barras punteadas) o solo con un vehículo (barras abiertas) y se evaporaron formando una película delgada y se dejaron oxidar al aire durante los tiempos mostrados. Siguiendo la extracción con cloroformo-metanol, se analizaron las muestras por ESI-MS en el modo de ión positivo. Los datos representan los niveles de 1-palmitoil-2-oxovaleril-sn-glicero-3-fosfocolina (POVPC, m/z 594, Figura 15A), 1-palmitoil-2-glutaril-sn-glicero-3-fosfocolina (PGPC, m/z 610, Figura 15B), y 1-palmitoil-2-(5,6-epoxiisoprostano E_{2})-sn-glicero-3-fosfocolina (PEIPC, m/z 828, Figura 15C) relativo a un estándar interno (0,1 \mug DMPC) que se agregó con el PAPC. Los valores son la media \pmSD de las muestras por triplicado. Los asteriscos indican p<0,01. El 13(S)-HPODE solo no dio una señal para m/z 594, 610 o 828 (datos no mostrados).
La Figura 16A, Figura 16B, y Figura 16C muestran que el 13(S)-HPODE, el 15(S)-HPETE o el H_{2}O aceleran en una forma de dosis dependiente la formación de fosfolípidos oxidados de PAPC. Se mezclaron diez \mug de PAPC con los microgramos indicados del 13(S)-HPODE (Figura 16A), o el 15(S)-HPETE (Figura 16B) y se evaporaron formando una película delgada y se dejaron oxidar al aire durante 8 h. En la Figura 16C, se evaporaron diez \mug de PAPC formando una película delgada y se agregó H_{2}O_{2} en las concentraciones indicadas y se dejó oxidar por 8 h. Siguiendo la extracción con cloroformo-metanol, se analizaron las muestras por ESI-MS en el modo de ión positivo. Los datos representan los niveles de PAPC, m/z 782; POVPC, m/z 594; PGPC, m/z 610; y PEIPC, m/z 828 relativo a un estándar interno (0,1 \mug DMPC) que se agregó con el PAPC. Los valores son la media \pmSD de las muestras por triplicado. El 13(S)-HPODE solo, el 15(S)-HPETE solo o H_{2}O_{2} no dieron una señal para m/z 594, 610 o 828 (datos no mostrados). Los asteriscos indican diferencias significantes a p<0,001.
La Figura 17A, Figura 17B, y Figura 17C muestran que el 13(S)-HPODE estimula la formación no enzimática de hidroperóxido de linoleato de colesterilo (Ch 18:2-OOH). Se agitaron brevemente 0,5 \mug/ml de 13(S)-HPODE (Figura 17A) o 10 \mug/ml de linoleato de colesterilo (Figura 17B) o 10 \mug/ml de linoleato de colesterilo junto con 0,5 \mug/ml de 13(S)-HPODE (Figura 17C) en cloroformo/metanol (2:1, v/v) que contiene 0,01% de BHT para mezclar y evaporar a sequedad bajo argón y dejar llevar acabo la oxidación por el aire en una campana de flujo laminar por 6 h. Se solubilizaron los lípidos en 50 \mul de cloroformo y se analizaron para determinar la presencia de hidroperóxido de linoleato de colesterilo (Ch 18:2-OOH) por RP-HPLC como se describió aquí.
La Figura 18 muestra que la paraoxonasa purificada destruye la bioactividad de los fosfolípidos oxidados. Se incubaron el PAPC oxidado, (Ox-PAPC), POVPC (m/z 594), PGPC (m/z 610) o PEIPC (m/z 828) en tubos prueba en M199 sin, o con 1 X 10^{-2} U/ml de paraoxonasa humana purificada (+PON) durante 3 h. con agitación moderada a 37ºC. Se retiró la paraoxonasa de la mezcla y se incubaron los lípidos con cocultivos de pared aórtica humana en M199 con 10% de LPDS por 8 h. a 37ºC. Se lavaron entonces los cocultivos y se incubaron con medio fresco sin suero o LPDS por 8 h. adicionales a 37ºC. Se retiraron los sobrenadantes y se analizaron para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos. Los datos son la media \pmSD de los cocultivos por cuadruplicado. Los asteriscos indican diferencias significantes a nivel p<0,0001.
La Figura 19A, Figura 19B, Figura 19C, y Figura 19 D muestran que la HDL de pacientes con ateroesclerosis coronaria angiográficamente documentada a pesar de los niveles normales de colesterol-HDL que es deficiente en la actividad de paraoxonasa, no protege la HDL de la oxidación por las células de pared arterial, y no destruye la actividad biológica de los fosfolípidos oxidados. Estos pacientes tienen ateroesclerosis coronaria angiográficamente documentada, a pesar de los niveles normales de colesterol total, triglicéridos, colesterol-LDL y colesterol-HDL. Los pacientes no fueron diabéticos ni con medicación hipolipidémica. Se determinó la actividad paraoxonasa como se describe en Métodos para 24 pacientes y 29 sujetos normales de edad y sexo elegidos (Figura 19A). Los datos de los 14 pacientes previamente reportados y de los 19 sujetos normales previamente reportados se incluyen en la Figura 19A junto con datos de 10 pacientes adicionales y sujetos normales de edad y sexo elegido. La capacidad de la HDL de los 10 pacientes adicionales y los controles para proteger una LDL control contra la oxidación por las células de pared arterial se muestra en la Figura 19B como se determinó por la formación de hidroperóxido de lípido como se describió aquí y en la Figura 19C para la actividad quimiotáctica de monocitos que se determinó como se describe aquí. Los datos en el panel C incluyen los datos previamente reportados para 5 pacientes y 4 sujetos normales junto con datos de los 10 pacientes adicionales y sus sujetos normales de edad y sexo elegido. Los datos en la Figura 19D representan una nueva propuesta, concretamente la capacidad de pacientes y la HDL normal (n= 10 para cada grupo) de inhibir la actividad biológica de PAPC oxidado (Ox-PAPC). Se incubaron en cada ejemplo 100 \mug/ml de Ox-PAPC con 250 \mug/ml de HDL en tubos prueba en 10% de LPDS en M199 a 37ºC con agitación moderada durante 4 h. Se agregó entonces la mezcla HDL-Ox-PAPC a monocapas endoteliales y se determinó la unión de los monocitos. Los datos son la media \pmSD de los cocultivos por cuadruplicado y los asteriscos indican una diferencia significante en el nivel de p<0,01 para el Panel A; p<0,001 para LDL vs LDL + HDL de paciente, p<0,0001 para LDL + cont. HDL vs LDL + HDL de paciente en el Panel B; p<0,009 para la LDL control vs LDL + HDL Control, p<0,000008 para LDL + HDL Control vs LDL + HDL de paciente en el Panel C; p<0,009 para Ox-PAPC vs Ox-PAPC + HDL de paciente, p<0,0001 para Ox-PAPC + HDL control vs Ox-PAPC + HDL de paciente en el Panel D.
La Figura 20 ilustra un modelo de tres pasos para la oxidación de la LDL por células de pared arterial: Paso 1-Se siembra la LDL. Paso 2-Se atrapa la LDL en la pared arterial y recibe moléculas de sembrado adicionales. Paso 3-Cuando se alcanza un nivel crítico de moléculas de sembrado relacionadas a los fosfolípidos en la LDL, un proceso de oxidación no enzimático genera POVPC, PGPC, y PEIC. La LDL que se forma a partir de la hidrólisis de VLDL en la circulación puede contener "moléculas de sembrado". Alternativamente, la LDL puede penetrar el espacio endotelial (A), donde se siembra con especies de oxígeno reactivo (ROS) liberadas de las células de la pared arterial (Paso 1). Mientras el esquema representa que esto ocurre en el espacio subendotelial, el Paso 1 puede en realidad ocurrir en la microcirculación. Si la LDL se siembra en el espacio subendotelial ésta podría permanecer ahí quedándose atrapada en la matriz extracelular (B) o la LDL sembrada podría salir a la circulación (C) y re-entrar al espacio subendotelial en otro sitio donde sería atrapado en la matriz extracelular (D). En el Paso 2 las células de la pared arterial generan y transfieren ROS adicional o diferente a la LDL sembrada atrapada. Esta transferencia podría ocurrir dentro de la célula, en la superficie celular, o en un microdominio colindante protegido. Siguiendo esta transferencia de especies de oxígeno reactivo a la LDL sembrada y atrapada, ocurre una propagación no enzimática de oxidación de lípido (Paso 3). Esto da como resultado la formación de fosfolípidos oxidados específicos que inducen la activación de NF-kB, la unión de monocitos, la producción de MCP-1, y la producción de M-CSF y las cuales están presentes en la LDL ligeramente oxidada (LDL mínimamente modificado; MM-LDL). Como se indicó, la HDL normal es capaz de bloquear todos y cada uno de los pasos en la formación de MM-LDL.
La Figura 21 ilustra el aislamiento de HDL por inmuno-afinidad. Se sometió la HDL a SDS-PAGE seguido por tinción con azul brillante de Coomassie. Además de los indicadores de peso molecular, plasma de inicio y HDL purificada por inmuno-afinidad, se incluyó la apo A-I purificada comercialmente disponible. Carril 1: indicadores MWT, Carril 2: Plasma, Carril 3: Apo A-I pura, Carril 4: HDL purificado.
La Figura 22 ilustra la capacidad protectora de la HDL. Se enlazaron anticuerpos policlonales de la principal proteína de la HDL la apo A-I a perlas de Sepharose 4B CNBr activadas. Se agregó plasma humano normal (200 \mul) a 1,0 ml de apo A-I empacada en perlas de Sepharose en 0,15 M de Tris/salina, pH 7,4 + 0,02% de NaN_{3} y se agitó a temperatura ambiente por 2 h. Se lavó entonces la mezcla con Tris 0,015 M, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,4 diluiyendo las perlas y plasma a 15 ml y granular por centrifugación a 1500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Se resuspendió la pastilla con solución salina normal hasta un volumen final de 2,0 ml (50% de perlas empacadas). Se suministró DCF (10 \mul conteniendo 20 \mug) por criovíal y se evaporó bajo argón. Se agregaron 20 \mug por tubo de palmitoil-araquidonoil-fosforilcolina (PAPC) y 1,0 \mug de ácido 13(s)-hidroperoxididecaenoico (13(s)-HPODE) por tubo y se evaporaron bajo argón. Esto fue seguido de la adición en un rango de concentraciones de la HDL unida a perlas de Sepharose o la adición de perlas tratadas con la solución tampón sola. Se leyó la fluorescencia siguiendo 4 h. de incubación a temperatura ambiente. Los datos son la media \pmSD de las muestras por triplicado.
Descripción detallada
Esta invención proporciona nuevos ensayos que son de pronóstico y/o diagnóstico para la ateroesclerosis o riesgo de ateroesclerosis. Estos ensayos se basan, en parte, en la elucidación de un mecanismo por el que la HDL proporciona protección contra la formación de la placa.
Se ha anotado que la lipoproteína de baja densidad (LDL) recién aislada contiene hidroperóxidos de lípido (Sevanian et al. (1997) J. Lipid Res., 38: 419-428). Creemos que la oxidación de la LDL requiere que la LDL sea "sembrada" con especies reactivas antes de que pueda ser oxidada. La presencia de lípidos oxidados da como resultado una "respuesta inflamatoria"; la inducción de unión de monocitos, la quimiotaxis, y la diferenciación en macrófagos. Este proceso forma base de la formación de placa característica de la aterosclerosis.
Más particularmente, sin estar unido a una teoría, se cree que los lípidos biológicamente activos en la LDL ligeramente oxidada (m/z 594, 610 y 828) se forman en una serie de tres pasos. El primer paso es el sembrado de la LDL con productos del metabolismo del ácido linoleico y araquidónico así como con hidroperóxidos de colesterilo. El segundo paso involucra atrapar la LDL en el espacio subendotelial y la liberación a esta LDL atrapada de especies de oxígeno reactivas adicionales derivadas de las células de pared arterial cercanas. El tercer paso es la oxidación no-enzimática de fosfolípidos de LDL que ocurre cuando se alcanza un umbral crítico de "moléculas sembradas" (por ejemplo ácido 13-hidroperoxioctadecadienoico [13(S)-HPODE] y ácido 15-hidroperoxieicosatetraenoico [15(S)-HPETE] en la LDL. Esto da como resultado la formación de lípidos oxidados específicos (m/z 594, 610, 828) que inducen la unión de monocitos, la quimiotaxis, y la diferenciación en macrófagos. Nosotros presentamos evidencias que indican que cuando las "moléculas sembradas" alcanzan un nivel crítico, ellas son aproximadamente dos órdenes de magnitud más potentes que el peróxido de hidrógeno al causar la oxidación no-enzimática de un fosfolípido principal de la LDL, el 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PAPC) que da como resultado en la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (m/z 594,610, y 828) (Watson et al. (1997) J Biol Chem 272: 13597-13607; Watson et al. (1999) J Biol Chem 274: 24787-24798).
Los experimentos descritos aquí indican también que, en contraste al caso para HDL normal, la HDL tomada de un subconjunto de pacientes relativamente raro, aquellos con enfermedad arterial coronaria angiográficamente documentada que tienen niveles perfectamente normales de colesterol-LDL, colesterol-HDL, y triglicéridos y que no son diabéticos y que no tomaban medicación hipolipidémica no protegieron la LDL contra la oxidación por células humanas de pared arterial y fallaron al inhibir la actividad biológica del PAPC oxidado.
Así, hemos identificado dos conjuntos de sujetos: 1) Aquellos sujetos cuyo HDL ofrece protección contra la formación de lípidos oxidados y/o reduce o elimina estos lípidos oxidados y de ahí que proteja contra el proceso inflamatorio que se relaciona a la aterosclerosis (designado aquí como Grupo de HDLs I); y 2)Aquellos sujetos cuyo HDL no ofrece protección contra la formación de lípidos oxidados, y/o no reduce o elimina estos lípidos oxidados, particularmente la LDL oxidada (designado aquí como Grupo de HDLs II). Se cree que las diferencias en la actividad de la HDL entre estos dos conjuntos de sujetos explica, al menos en parte, la pérdida de previsibilidad ofrecida por pruebas de HDL convencionales. Se cree también que los sujetos en este segundo subconjunto tienen un riesgo considerablemente mayor para la aterosclerosis y sus complicaciones asociadas. Una prueba que distingue entre estos dos conjuntos de sujetos (es decir, entre sujetos que tienen HDLs de Grupo I y sujetos que tienen HDLs de Grupo II) es de significante valor profiláctico y diagnóstico.
Como una prueba profiláctica, los métodos de esta invención permiten la identificación de individuos con riesgo de ateroesclerosis particularmente elevado. A dicha identificación, estos sujetos pueden adoptar pruebas más frecuentes, ajustes de dietas, monitoreo y regulación de la presión sanguínea, y semejantes. Como una prueba de diagnóstico, los métodos de esta invención suplementan los métodos de prueba tradicionales (por ejemplo relaciones de HDL:LDL, etc.) para identificar los sujetos que se sabe tienen un riesgo quienes pueden probar resistencia a regímenes terapéuticos convencionales y alterar el tratamiento prescrito. Así, por ejemplo, cuando se diagnostica un sujeto en estados tempranos de ateroesclerosis, una prueba positiva usando el ensayo de esta invención puede indicar una intervención adicional de fármacos más que simples cambios de dieta/estilo de vida.
Esta invención proporciona dos realizaciones preferidas de dichos ensayos. En una realización el ensayo explota el descubrimiento de que las "HDLs Grupo I" pueden reducir en realidad y/o eliminar los fosfolípidos oxidados. Así, el Grupo I de HDLs se puede identificar al proporcionar una muestra biológica de dicho mamífero donde la muestra biológica comprenda una lipoproteína de alta densidad (HDL), poniendo en contacto la lipoproteína de alta densidad con un fosfolípido oxidado; y midiendo un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde la ausencia de cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado indica que el mamífero tiene HDLs del Grupo I y, de ahí, que tenga un riesgo más bajo para la ateroesclerosis.
A la inversa, donde no se observa un cambio significante en el fosfolípido oxidado, el sujeto tiene HDLs del Grupo II y tiene un riesgo incrementado de ateroesclerosis.
En una segunda realización, la prueba de esta invención explota el descubrimiento de que los HDLs del Grupo I pueden evitar la oxidación de LDLs y/o componentes de LDLs que contienen fosfolípidos. Estas pruebas involucran de preferencia proporcionar una muestra biológica de un mamífero donde la muestra comprende una lipoproteína de alta densidad (HDL), poniendo en contacto la lipoproteína de alta densidad con un fosfolípido (por ejemplo fosfolípido aislado o con una lipoproteína de baja densidad), sometiendo el fosfolípido a condiciones de oxidación; y midiendo un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado. Un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado indica que la HDL es una HDL del Grupo II y no está protegiendo al lípido de la oxidación. Así, el sujeto mamífero tiene un mayor riesgo de ateroesclerosis. Donde no hay cambio sustancial en el fosfolípido oxidado o sin oxidar, la HDL ofrece protección contra la oxidación del lípido y el sujeto tiene un menor riesgo de ateroesclerosis y sus patologías asociadas.
En resumen, se cree que los componentes de la HDL que evitan la oxidación de lípidos o que reparan los lípidos ya oxidados y por lo tanto reducen una respuesta inflamatoria, pueden, en general, reducir la susceptibilidad hacia o la severidad de otras patologías asociadas con el proceso inflamatorio (por ejemplo, artritis reumatoide, fibrosis pulmonar idiopática, lupus, y otras enfermedades inflamatorias crónicas). Así, las pruebas de esta invención proporcionan un indicador o medida de riesgo de un sujeto a una patología caracterizada por la inflamación crónica.
Las pruebas de esta invención necesitan no ser dispositivo de la existencia o del riesgo de una patología particular para tener valor diagnóstico/pronóstico. Típicamente se usan los resultados de ensayos como son aquellos proporcionados por la presente invención como un componente de un diagnóstico diferencial que puede utilizar otros indicadores de enfermedad/factores de riesgo conocidos por aquellos expertos en la técnica. La determinación del estado de la enfermedad o pronóstico puede entonces permitir tomar decisiones en lo que respecta el estilo de vida, el régimen de tratamiento (por ejemplo la decisión de utilizar o no ciertos fármacos profilácticos, y sus semejantes).
Los ensayos de esta invención son rápidos, simples, económicos y pueden ser rápidamente formateados como un "equipo de prueba casero".
I. Pruebas de actividad de la HDL
Como se indicó antes, en las realizaciones preferidas, las pruebas de esta invención toman uno o dos formatos preferidos. En el primer formato, se prueba la capacidad de la HDL de reducir el nivel de fosfolípidos oxidados (por ejemplo en una lipoproteína de baja densidad). En un segundo formato, se prueba la HDL para determinar la capacidad de proteger un fosfolípido de la oxidación por un agente oxidante.
Ambos formatos de ensayo requieren la provisión de una muestra biológica que contiene la HDL (o componentes de ella) poniendo en contacto la HDL (o componentes de HDL) con un lípido (oxidado o no dependiendo de la prueba), y detectar la cantidad de lípido oxidado o lípido que no está oxidado. Las pruebas difieren en que la primera prueba pone en contacto la HDL (o componente de HDL) con un lípido oxidado (o la LDL que contiene dicho lípido), mientras que la segunda prueba pone en contacto la HDL con un lípido que no está oxidado, y pone en contacto el lípido con un agente oxidante para evaluar la protección de la oxidación ofrecida por la HDL.
A) Proporcionar una muestra biológica conteniendo la HDL
En realizaciones preferidas se desarrollan las pruebas usando una muestra biológica del organismo/sujeto de interés. Mientras las pruebas son de gran uso en humanos, ellas no están limitadas así. Se cree que subtipos de HDL similares existen esencialmente en todos los mamíferos y así se contemplan las pruebas de esta invención para aplicaciones veterinarias también. Así, los sujetos apropiados incluyen, pero no están limitados a humanos, primates no-humanos, caninos, equinos, felinos, porcinos, ungulates, largomorphs, y los semejantes.
Una muestra biológica apropiada incluye una muestra de cualquier material biológico (por ejemplo fluido, células, tejido, órgano, etc.) comprendiendo las lipoproteínas de alta densidad (HDLs) o los componentes de ellas. Un tejido particularmente preferido es el tejido del hígado. En una realización más preferida, la muestra biológica es una muestra de sangre. Como se usa aquí una muestra de sangre incluye una muestra de sangre entera o una fracción de sangre (por ejemplo suero). La muestra puede ser sangre fresca o sangre almacenada (por ejemplo en un banco de sangre) o fracciones de sangre. La muestra puede ser una muestra de sangre obtenida expresamente para las pruebas de esta invención o una muestra de sangre obtenida por otro propósito que puede ser sub muestreada para las pruebas de esta invención.
Se puede pre tratar la muestra como sea necesario por dilución en una solución tampón apropiada, heparinizada, concentrada si se desea, o fraccionada por cualquier número de métodos que incluyen pero no limitan a la ultracentrifugación, el fraccionamiento por cromatografía líquida de rápido desarrollo (FLPC), o la precipitación de la apolipoproteína B que contiene proteínas con sulfato de dextrano u otros métodos. Se puede usar cualquiera del número de soluciones tampón acuosas estándar, empleando una de una variedad de soluciones tampón, como es la de fosfato, de Tris, o las semejantes, a pH fisiológico.
En ciertas realizaciones la muestra se prueba directamente. En otras realizaciones, la HDL es aislada de la muestra. Los métodos de aislar la HDL son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, Patentes americanas 4.883.765; 5.118.613; 5.215.886 y las semejantes). Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo anti-apo-A-I se acopla aun soporte sólido (por ejemplo vidrio o resina o perlas magnéticas). El anticuerpo que porta el sustrato se agrega al plasma en un pozo, se retira el plasma y se agregan los reactivos para la prueba y se detecta una señal.
B) Poner en contacto la HDL con un lípido
La HDL de la muestra biológica se pone entonces en contacto con un lípido (oxidado o no dependiendo de la prueba como se describe antes) o conjunto de lípidos (lípido(s) aislados o presentados como una LDL). La HDL puede ser aislada completamente, aislada parcialmente, o la muestra biológica entera (por ejemplo sin fraccionar) se puede poner en contacto con el lípido. Los métodos de aislar parcial o completamente la HDL son conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, Havel, et al. (1955) J Clin Invest 43:1345-1353; Navab et al. (1997) J Clin Invest 99:2005-2019; Carroll and Rudel (1983) J Lipid Res 24:200-207, McNamara et al. (1994) Clin Chem 40:233-239, Grauholt et al. (1986) Scandinavían J Clin Lab Invest 46 :715-721 ; Warnick et al. (1982) Clin Chem 28 :1379-1388 ; Talameh et al., (1986) Clin Chimica Acta 158 :33-41).
En una realización preferida, el lípido que se pone en contacto comprende uno o más lípidos (de preferencia fosfolípidos) capaces de ser oxidados. Los lípido(s) preferidos incluyen, pero no se limitan a reducir al 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (Ox-PAPC), 1-palmitoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (POVPC), 1-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (PGPC), 1-palmitoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (PEIPC), 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SAPC), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SOVPC), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SGPC), 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (SEIPC), 1-estearoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (Ox-SAPE), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SOVPE), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SGPE), y 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SEI PE).
Estos lípidos son ilustrativos y no se desea sean limitativos. Otros lípidos apropiados pueden ser rápidamente identificados por aquellos de conocimientos ordinarios en la técnica. Esto se logra simplemente al poner en contacto el (los) lípido(s) en cuestión con un agente oxidante (por ejemplo peróxido de hidrógeno, HPODE, HPETE, HODE, HETE, etc.) y midiendo la cantidad de lípido oxidado producido. Alternativamente, se puede probar la capacidad del "lípido oxidado/LDL" de inducir una respuesta característica de formación de placa aterosclerótica (por ejemplo inducción de la adhesión de monocitos y/o la quimiotaxis, y/o la diferenciación en un cultivo de células endoteliales vasculares).
Se pueden presentar el (los) lípido(s) como "aislados" o "parcialmente aislados" el/los lipido(s) o se pueden presentar/poner en contacto en la forma de una lipoproteína de baja densidad (LDL). La LDL puede ser una LDL aislada a partir de un organismo o una LDL ensamblada/creada sintéticamente. Los medios de aislar o sintetizar los lípidos (por ejemplo fosfolípidos), y/o las LDLs son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Havel, et al. (1955) J Clin Invest 43:1345-1353; Navab et al. (1997) J Clin Invest 99:2005-2019; Carroll and Rudel (1983) J Lipid Res 24:200-207, etc.).
C) Detección del nivel de lípido oxidado
Como se indicó antes, las pruebas involucran la detección de la cantidad de lípido oxidado, o a la inversa el lípido que no está oxidado. Ya que, en realizaciones preferidas, el contenido de lípido de la prueba es esencialmente constante, una medida de lípido oxidado o un cambio en el lípido oxidado proporciona una medida de lípido que no está oxidado o un cambio en la cantidad de lípido que no está oxidado y viceversa.
Los métodos de medir lípidos oxidados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Vigo-Pelfrey et al. Membrane Lipid Oxidation, Volume I-III. CRC Press). Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a la espectrometría de masas, la espectrometría de absorción (por ejemplo, usando absorbancia de UV a 234 nm), la cromatografía líquida, la cromatografía de capa fina, y el uso de varios reactivos sensibles a "estados de oxidación", por ejemplo en varias reacciones redox.
Los métodos conocidos previamente para medir los lípidos oxidados (por ejemplo los peróxidos de lípidos), incluyen el método Wheeler, el método de tiocianato de hierro, el método del ácido tiobarbitúrico, y otros. El método de Wheeler (Wheeler (1932) Oil and Soap, 9: 89-97) es aquel en el que el lípido oxidado reacciona con yoduro de potasio para aislar yodo, que es entonces titulado con una solución estándar de tiosulfato de sodio. En el método del tiocianato de hierro (Stine et al. (1954) J. Dairy Sci., 37:202) se mezcla el peróxido del lípido oxidado con tiocianato de amonio y cloruro ferroso, y el color azul del tiocianato de hierro resultante se determina colorimétricamente. En el método del ácido tiobarbitúrico (Tappel and Zalkin (1959) Arch. Biochem. Biophys., 80: 326) el peróxido de lípido se calienta bajo condiciones ácidas y el malondialdehído resultante se condensa con el ácido tiobarbitúrico para formar un tinte de color rojo, que se mide entonces colorimétricamente.
En otra aproximación, se ha demostrado que la peroxidasa descompone los peróxidos de lípido y que el sistema de reacción resultante colorea intensamente con el incremento de cantidades de peróxido de lípido, si un adecuado donador de hidrógeno está presente en el sistema de reacción (ver, por ejemplo Patente de los Estados Unidos 4.367.285). Así, en una realización, las pruebas de esta invención pueden utilizar una peroxidasa y un donador de hidrógeno.
Muchas peroxidasas son apropiadas. En realizaciones preferidas, la peroxidasa empleada en la presente invención es preferiblemente cualquiera de las peroxidasas de rábano comercialmente disponibles.
En realizaciones preferidas, el donador de hidrógeno que se emplea en la presente invención es cualquiera de los compuestos oxidables conocidos los cuales, de preferencia, generan color, fluorescencia o luminiscencia en la oxidación. Se pueden utilizar los reactivos colorantes, fluorescentes, o luminiscentes convencionales. Los reactivos colorantes conocidos que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan al guaiacol, 4-aminoantipirina con fenol, 4-aminoantipirina con N,N-dimetilanilina, 3-metil-2-benzotiazolinona con dimetilanilina, orto-dianisidina, y los semejantes. Típicamente, los reactivos fluorescentes útiles incluyen, pero no se limitan al ácido homovanillico, el ácido p-hidroxifenilacético, y los semejantes. Los reactivos luminiscentes apropiados incluyen pero no se limitan al luminol y los semejantes. Todos estos reactivos se mencionan simplemente para ejemplificar, y no para limitar, al donador de hidrógeno de la presente invención.
La cantidad de donador de hidrógeno empleado es de preferencia al menos equimolar, de preferencia no menor de dos moles, por mol de peróxido de lípido contenido en la muestra prueba. La cantidad puede variar dependiendo hasta del tamaño de la muestra y el contenido del peróxido de lípido en la muestra.
Los medios apropiados de reacción que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a la solución tampón de hidróxido de sodio-dimetilglutarato, la solución tampón de fosfato y, la solución tampón del ácido Tris-hidroclórico que está normalmente de cerca de un pH 5 a cerca de pH 9.
Una prueba (3 ml) típica (elevado volumen) puede contener una solución tampón de hidróxido de sodio-dimetilglutarato 50 mM (pH 6,0) que contiene 0.03% (W/V) de 4-aminoantipirina, 0,04% (V/V) de N,N-dimetilanilina y 4,5 unidades de peroxidasa. En una medición típica, la solución problema se calienta preliminarmente a 37ºC. y se agregan 50 \mul de una muestra prueba que contiene peróxido de lípido. Se incuba la mezcla a 37ºC por 15 minutos y, se mide la intensidad del color generado suing un espectrofotómetro a una longitud de onda de, por ejemplo, 565 nm. Se calcula la cantidad del peróxido de lípido en la muestra a partir del valor de extinción.
Tales factores como es el pH en el tiempo de reacción, el periodo de la reacción, la longitud de onda medida, etc., pueden variar dependiendo de los reactivos empleados. Se pueden elegir las condiciones apropiadas de acuerdo a las circunstancias.
Otra clase de pruebas para lípidos oxidados se describe en la Patente de los Estados Unidos 4.900.680. En esta aproximación, se hace reaccionar un lípido oxidado (por ejemplo un hidroperóxido) con una sal o hidróxido de un metal de transición que tiene una valencia de 2, un hemo, un péptido hemo, una proteína hemo, o una enzima hemo. El oxígeno activo resultante y los radicales oxígeno reaccionan con una sustancia luminiscente, y la luz emitida por esta reacción se mide ópticamente. Ejemplos de un catalizador que actúa sobre un hidroperóxido de lípido para producir especies oxígeno como es el oxígeno activo o los radicales de oxígeno son: una sal de metal de transición que produce un catión que tiene una valencia de 2 (por ejemplo, cloruro ferroso, sulfato ferroso, ferrocianuro de potasio, cada uno de estos produce Fe^{+2}; el cloruro manganoso o el sulfato manganoso, cada uno de estos produce Mn^{+2}; o el cloruro de cobalto o el sulfato de cobalto, cada uno de estos produce Co^{+2}); un hidróxido de los metales de transición descritos antes; un complejo de un metal de transición que tiene una valencia de 2 (por ejemplo, Fe^{II}-complejo de porfirina); una proteína hemo (por ejemplo, citocromo C, hemoglobina, o mioglobina); un péptido hemo (por ejemplo, un compuesto que se obtiene por descomposición de una proteína hemo por una proteasa como es la quimotripsina o la tripsina); y una enzima hemo (por ejemplo, peroxidasa de rábano o peroxidasa de prostaglandina).
Los compuestos catalizadores que se prefieren incluyen, pero no limitan a, una proteína hemo, un péptido hemo, o una enzima hemo. Más usualmente, la proteína hemo como es un citocromo C se usa debido a su fácil manejo. La concentración del compuesto catalizador de preferencia oscila de cerca de 0,1 \mug/ml a cerca de 1,000 \mug/ml y usualmente cae dentro del rango de cerca de 1 \mug/ml a cerca de 200 \mug/ml. Por ejemplo, se puede obtener la mejor eficiencia luminosa cuando la concentración es de cerca de 10 \mug/ml para el citocromo C, cerca de 120 \mug/ml para el citocromo C péptido hemo; y cerca de 10 \mug/ml para la peroxidasa de rábano.
La sustancia luminiscente no se limita a una específica, siempre y cuando esta reaccione con oxígeno activo o un radical oxígeno para emitir luz. Ejemplos de dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a polihidroxifenoles (por ejemplo, pirogalol, perprogalina etc.), derivados de ftaladina (por ejemplo, luminol, isoluminol, etc.), derivados del indol (por ejemplo, ácido indol acético, skatole, triptófano, etc.); derivados de tiazolidina (por ejemplo, Cypridinacea luciferin, lofina, etc.), un derivado de acridina (por ejemplo, lucigenina), derivados del ácido oxálico (por ejemplo, bistriclorofeniloxalato); y derivados 1,2-dioxa-4,5-azina. La concentración de la sustancia luminiscente varía dependiendo del compuesto usado. La concentración es de preferencia 0,1 \mug/ml o más. Cuando se usa luminol, su concentración es preferiblemente 1\mug/ml.
Las mediciones se desarrollan de preferencia en una solución básica débil de un reactivo luminiscente como es una proteína hemo y luminol. Un valor de pH preferido abarca de cerca de pH 9 a cerca de pH 10. Son apropiadas muchas soluciones tampón. Sobre el tampón que se prefiere es un tampón de borato (H_{3}BO_{3}-KOH), un tampón de carbonato (Na_{2}CO_{3}-NaHCO_{3}), un tampón de glicina (NH_{2}CH_{2}COOH-NaOH)), o los semejantes. El que más se prefiere es el tampón de borato.
Para evitar que el oxígeno disuelto en la solución del reactivo luminiscente interfiera en el análisis de una muy pequeña cantidad de lípido oxidado, es deseable que la solución del reactivo luminiscente se purgue con un gas inerte para eliminar el oxígeno y obtener un valor de medición estable. Los ejemplos de gas inerte son el gas nitrógeno y el gas argón.
La concentración del lípido oxidado en la muestra se calcula basándose en una curva de calibración. Se puede formar la curva de calibración de acuerdo a los métodos estándar, por ejemplo, al usar un material que se elige del hidroperóxido de linolato de metilo, hidroperóxido del ácido araquidónico, hidroperóxido de fosfatidilcolina, hidroperóxido de fosfatidiletanolamina, e hidroperóxido de triacilglicerol.
En realizaciones preferidas, las pruebas de esta invención utilizan materiales fluorescentes cuya fluorescencia se altera por el estado de oxidación. Dichos materiales fluorescentes son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no están limitados al diacetato de 2'7'-diclorodihidrofluoresceína, rodamina, ácido cis-parinarico, NBD, esteres colesterilo del ácido cis-parinimico, ácido propiónico difenilhexatrieno, y los semejantes. El uso de tales indicadores se ilustra en los ejemplos.
Se apreciará que los métodos precedentes de detectar/cuantificar los lípidos oxidados se desea sean ilustrativos pero no limitantes. Se conocen otros numerosos métodos de probar los lípidos oxidados por aquellos expertos en la técnica y están dentro del ámbito de esta aplicación.
D) Poner en contacto el lípido con un agente oxidante
En el "segundo" formato de prueba descrito antes, un lípido o conjunto de lípidos (aislados o presentes en una LDL) se ponen en contacto con un agente oxidante y se prueba la capacidad de la HDL para proteger los lípidos de la oxidación. Esencialmente cualquier agente capaz de oxidar de un fosfolípido es apropiado para usarse en esta invención. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a varios peróxidos, y en las realizaciones preferidas el agente oxidante es un peróxido de hidrógeno, el 13(s)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE (ácido hidroperoxioctadecadienoico), HPETE (ácido hidroperoxieicosatetraenoico), HODE, HETE, y los semejantes.
Se puede determinar rápidamente que tan adecuados son otros agentes oxidantes. Esto se logra fácilmente al poner en contacto una LDL y/o el (los) fosfolípido(s) aislados de interés con el agente oxidante y medir la cantidad producida de lípido oxidado. Alternativamente, se puede probar la capacidad el ``lípido oxidado/LDL para inducir una respuesta característica de formación de placa ateroesclerótica (por ejemplo, inducción de la adhesión de monocitos y/o la quimiotaxis, y/o la diferenciación en un cultivo de células endoteliales vasculares).
E) Puntuar la prueba
Las pruebas se marcan como positivas para el "Grupo I" de la HDL (negativo para el "Grupo II" de HDL) donde la HDL reduce la cantidad de lípido oxidado o evita que el lípido se oxide en la prueba. A la inversa, las pruebas se marcan como negativas para el "Grupo I" de HDL (positivas para el "Grupo II" de HDL) donde la HDL no reduce la cantidad de lípido oxidado o fracasa al evitar que el lípido sea oxidado en la prueba.
Mientras estudios iniciales indican que algunas HDLs ofrecen protección y otras no lo hacen, esto ni se requiere ni se espera que, en un nivel de población, la distribución de respuesta sea bi-modal. Al contrario, se espera que el grado de protección contra la oxidación de lípidos o la reparación de lípidos oxidados por HDL varíe con los parámetros como es la genética, el sexo, la edad, la madurez fisiológica, el origen étnico, (el estado gestacional para las mujeres), la salud en general, la inmunocompetencia del sujeto, y los semejantes.
Para facilitar el uso de una realización comercial de las pruebas de esta invención, los efectos de estos (y otros) parámetros en la protección ofrecida por la HDL se pueden determinar rutinariamente. Así, por ejemplo, se puede probar la protección de la HDL en individuos ancianos que se diagnostican por otros métodos como muy bajos en riesgo de ateroesclerosis. Esto proporcionará una medida de la actividad de "HDL protectora" o la pérdida de actividad en "HDL no-protectora" entre los ancianos y permite comparaciones de actividad de HDL con los jóvenes. Se pueden determinar similarmente los efectos de estos otros parámetros y a partir de dichos estudios se puede determinar los niveles de "actividad" de la línea base de la población para la HDL protectora y no-protectora.
Se enfatiza que dichas medidas no necesitan producir una escala "absoluta" para ser de uso considerable. Una evaluación de riesgos relativos es de gran uso. Por que una indicación de riesgo "elevado" de ateroesclerosis puede ser dirigido con relativamente poca inversión (por ejemplo, incremento de ejercicio, cambios en la dieta, mayor monitorización, etc.) el riesgo inconveniente de un falso positivo (es decir una indicación de que el individuo tiene un riesgo mas elevado de ateroesclerosis) es menor. Similarmente, con la presencia de otros factores de riesgo/diagnóstico para la ateroesclerosis (por ejemplo, relaciones de HDL:LDL, monitorización de la presión sanguínea, conducta y factores generales de salud, etc.) el riesgo inconveniente de un falso negativo (es decir, una indicación de que la HDL del individuo ofrece protección contra la oxidación de lípidos) es también relativamente leve.
La prueba se puede puntuar como positiva, negativa, o asignar una puntuación sobre continuo (por ejemplo, un nivel de riesgo particular que va desde muy bajo riesgo a riesgos bajos a riesgos moderados a riesgos altos a riesgos muy altos, etc.) por comparación o la prueba da como resultado niveles determinados para la población relevante (por ejemplo, corregido para los varios parámetros descritos antes) y/o por referencia directa a un control positivo o negativo. Así, por ejemplo, los resultados de una prueba de cambio en lípidos oxidados causado por poner en contacto el (los) lípido(s) con la HDL del sujeto se puede comparar con una prueba "control" realizada sin la HDL (o con la HDL a baja concentración). En este caso, una disminución en el lípido oxidado en la presencia del HDL como se comparó a la prueba con ausencia de la HDL indica que la HDL ofrece protección/reparación de los lípidos oxidados (es decir es positivo para el "Grupo I" de la HDL).
Similarmente en un ensayo donde se prueba la capacidad de la HDL de proteger los lípidos de un agente oxidante, se pueden comparar los resultados del ensayo con una prueba control que es idéntica pero faltando la HDL (o teniendo HDL presente a muy baja concentración). Donde el ensayo muestra más lípido oxidado en la ausencia de la HDL o la HDL reducida, la prueba se marca como positiva para el Grupo I de la HDL.
Los ensayos se puntuados como positivos, como se describió antes, donde es detectable la diferencia entre el ensayo prueba y el ensayo control, y de más preferencia donde la diferencia es estadísticamente significante (por ejemplo, al menos en el 85%, de preferencia al menos en el 90%, y más preferiblemente al menos en el 95%, y aún mas preferible en el 98 o 99% del nivel de confianza).
II. Formato de Pruebas
Se pueden practicar las pruebas de esta invención en casi una variedad ilimitada de formatos dependiendo de las necesidades particulares en mano. Dichos formatos incluyen, pero no están limitados a la "química acuosa" (por ejemplo, como se puede desarrollar en un laboratorio de investigación), formatos de pruebas de alto rendimiento (por ejemplo, como se puede desarrollar en un laboratorio de patología u otros laboratorios clínicos), y formatos "prueba de tira", (por ejemplo, como se pueden desarrollar en casa o en el consultorio médico).
A) Química acuosa tradicional
Se pueden desarrollar las pruebas de esta invención usando aproximaciones de "química acuosa" tradicional. Básicamente esto involucra desarrollar las pruebas como se desarrollarían en un laboratorio de investigación. Típicamente las pruebas se realizan en fase líquida (por ejemplo, en un tampón con reactivos apropiados (por ejemplo, los lípidos, los lípidos oxidados, los agentes oxidantes, etc.) que se agregan a la mezcla de reacción como sea necesario. Se prueban las concentraciones de lípidos oxidados usando procedimientos e instrumentos estándar, por ejemplo, como se describió en los ejemplos.
B) Formatos de pruebas de alto rendimiento
Donde se desarrollan estudios de población, y/o en laboratorios clínicos/comerciales donde decenas, cientos o aún miles de muestras son procesadas (algunas veces en un solo día) se prefiere a menudo desarrollar las pruebas usando formatos de alto rendimiento. Las modalidades de pruebas de alto rendimiento son pruebas altamente instrumentadas que minimizan la intervención humana en el procesamiento de las muestras, sacando la muestra, adquiriendo los datos de la muestra, y (a menudo) analizando los resultados. En realizaciones preferidas, se diseñan sistemas de alto rendimiento como sistemas continuos de "flujo continuo", y/o como sistemas altamente paralelos.
Los sistemas de flujo contínuo proporcionan típicamente una vía de fluido continuo con varios reactivos/operacio-
nes localizados en diferentes ubicaciones a lo largo de la vía. Así, por ejemplo se puede aplicar una muestra de sangre a una muestra que recibe area donde está se mezcla con una solución tampón, la vía puede entonces conducir a una célula más corta que retira grandes sustancias particulares (por ejemplo, las células), el fluido resultante puede entonces fluir posteriormente varios reactivos (por ejemplo, donde se agregan los reactivos en "estaciones de entrada" o son simplemente fijadas a la pared del canal a través del cual el fluido fluye. Así, por ejemplo, la muestra puede ser posteriormente combinada con un lípido (por ejemplo, proporcionado como una LDL), entonces un agente oxidante, un agente para detectar la oxidación, y un detector donde se lee una señal (por ejemplo, una señal colorimétrica o fluorescente) proporcionando una medida de lípido oxidado.
En sistemas altamente paralelos de alto rendimiento las muestras se procesan típicamente en formatos de placas microtiter (por ejemplo, placas de 96 pozos, placas de 1536 pozos, etc.) con robots controlados por ordenador regulando el proceso de la muestra y el manejo de reactivos y la adquisición de datos. En dichas pruebas, los varios reactivos pueden proporcionarse todos en solución. Alternativamente algunos o todos los reactivos (por ejemplo, los lípidos oxidados, los indicadores, los agentes oxidantes, etc.) se pueden proporcionar fijados a las paredes de las placas microtiter.
Los sistemas de revisión de alto rendimiento que pueden adaptarse fácilmente a las pruebas de esta invención están disponibles comercialmente (ver, por ejemplo, Zymark Corp. Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Natick, MA, etc.). Estos sistemas automatizan típicamente procedimientos completos incluyendo todas las muestras y pipeteo de reactivos, dispensador de líquidos, incubaciones temporizadas, y lecturas finales de las microplacas en
detector(es) apropiado(s) para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan un alto rendimiento y la rápida puesta en funcionamiento así como un alto grado de flexibilidad y adaptación. Los fabricadores de dichos sistemas proporcionan protocolos detallados de varios rendimientos elevados. Así, por ejemplo, Zymark Corp. proprociona comunicados técnicos describiendo los sistemas de revisión para detectar la modulación de la trascripción de gen, el enlace de ligando, y los semejantes.
C) Formatos de pruebas de "Tira de prueba"
Se pueden proporcionar los ensayos de esta invención en formatos de "pozos prueba" o "tira de prueba". En los formatos "pozo de prueba" o "tira de prueba", la muestra biológica es típicamente colocada en un pozo o es aplicada en una zona de aplicación sobre la tira y entonces un indicador fluorescente o colorimétrico aparece el cual, en este caso, proporciona una medida de la protección o reparación ofrecida por la HDL del sujeto o los componentes de ella.
Se han emitido muchas patentes que describen las varias disposiciones físicas para las pruebas de sangre. Estos incluyen sistemas que involucran el movimiento lateral u horizontal de la sangre, así como pruebas de plasma. Por ejemplo, las Patentes americanas Nos: 4.876.067, 4.861.712, 4.839.297, y 4.786.603 describen acarreadores de prueba y los métodos para la determinación analítica de los componentes de fluidos corporales, incluyendo el plasma separado de la sangre usando fibras de vidrio y los semejantes. Estas patentes, todas enseñan sistemas que requieren algún tipo de rotación de almohadillas de prueba o una porción de las almohadillas de prueba durante el uso. La patente americana 4.816.224 describe un dispositivo para separar el plasma o el suero de la sangre entera y analizar el suero usando una capa de fibra de vidrio que tiene dimensiones específicas y absorción para separar el plasma de la sangre entera para una reacción posterior. Similarmente, la patente americana 4.857.453 describe un dispositivo para desarrollar un ensayo que usando la acción capilar y una tira de prueba que contiene reactivos líquidos sellados que incluyen indicadores visibles. La Patente americana 4.906.439 describe un dispositivo para analizar eficientemente y con exactitud una muestra de fluido corporal que usa fluido liberado en un movimiento lateral vía flujo continuo de canales o de hendiduras.
Además de las patentes anteriores que son representativas de las técnicas previas que mostrando varios tipos físicos de sistemas para pruebas de sangre y semejantes, se han emitido patentes recientes que están dirigidas a la química particular para la detección de colesterol HDL. Así, la Patente americana 4.851.335 y 4.892.815 también de Kerscher et al, describe tipos específicos de procesos y reactivos para la determinación de colesterol HDL.
La Patente americana 5.135.716 describe un dispositivo para determinar colesterol-HDL al obtener plasma de la sangre entera y determinar el nivel de colesterol-HDL del plasma.
La invención se puede llevar a cabo por un dispositivo en donde el procesamiento de la muestra, incluyendo la separación del plasma, el contador de HDL (si se desea), el poner en contacto con un lípido (oxidado o no oxidado), el contacto opcional con un agente oxidante, y la detección de lípidos oxidados se construye en una tira en la que las manipulaciones por el usuario se minimizan y la actividad protectora de la HDL se puede medir en uno a dos minutos directamente de la sangre entera y/o suero. En una realización preferida, el método mide el punto final de la reacción y por lo tanto el tiempo preciso y los controles de temperatura no son necesarios.
El dispositivo puede ser similar a aquel descrito en la Patente americana 5.135.716. Así, por ejemplo, (ver, por ejemplo, Figura 1), el dispositivo puede incluir un soporte (1) de sustrato activo o inerte. Un área receptora/cavidad receptora (11) y/o una membrana filtrante, puede estar presente opcionalmente. Se colocan en el dispositivo de prueba los reactivos para la prueba típicamente un lípido oxidado o un lípido que no está oxidado y un agente oxidante. El lípido y/o el y una membrana portadora/membrana de detección. La membrana de prueba (6) tiene reactivos que reaccionarán con el lípido oxidado e indican la cantidad del lípido oxidado, el lípido que no está oxidado, o una relación de lípido oxidado al lípido que no está oxidado.
Al usarse, la sangre se agrega al área de aplicación de la sangre (11) del medio de transporte físico (3). Este viaja a través de los canales (2) y el medio de transporte físico (3) (por ejemplo, una hoja que es una malla tejida de un monofilamento poliéster con micro malla de abertura (17) (Tetko, Briarcliff, N. Y.) y teniendo un grosor de cerca de 75 micrones). Entre las muchas elecciones para la hoja de membrana de transporte están el género del tejido, el género no tejido, la gasa y el mono filamento de hilo como medio de transporte físico (3). La separación del plasma así como la precipitación se pueden manipular por una membrana de separación de plasma micro porosa (4), en este caso, nitrocelulosa de 5 micrones (Schleicher and Schuell, Keene, N. H.).
Una membrana opcional de filtro (5) filtra la LDL y la VLDL precipita y les impide alcanzar la membrana de prueba (6). Cuando está presente, en una realización, la membrana de filtro (5) es una membrana de policarbonato hidrofílico de 0,4 micrones (Poretics Corp., Livermore, C. A.) que se usa sin tratamiento o nailon de 0,2 micrones (Micron Separations, Inc., Westboro, M. A.) o polisulfona de 0,8 micrones (Gelman Sciences, Ann Arbor, M. I.). Los últimos dos se saturaron con una solución acuosa al 5% o 10% de polietilenglicol (peso molecular de 1000 daltons) y se secaron. Se usa opcionalmente el polietilenglicol (PEG) como un agente humificador.
En un dispositivo preferido, la membrana de prueba (6), como se mencionó, contiene enzimas y/o cromógenos y/o fluorescentes que prueban el lípido oxidado de manera que la HDL que contiene la muestra alcanzando ésta (carece ahora de LDL y componentes de VLDL) reaccione con la concentración de los reactivos (por ejemplo, lípido oxidado, lípido que no está oxidado y agente(s) oxidantes) en la membrana de prueba (6), produciendo una reacción coloreada, la intensidad del color siendo proporcional a la concentración del lípido oxidado y/o al lípido no oxidado (reducido).
En un dispositivo preferido la membrana de prueba (6) es una membrana de nailon de 0,45 micrones (Micron Separations, Inc, Westboro, M. A.). La parte superior de la hoja (7) con el orificio (12) y el área transparente (29) se adhiere sobre la parte alta de los otros componentes como se muestra por las flechas (8) y (9). El área transparente (29) comprende una abertura cubierta con una membrana transparente que puede o no ser permeable al oxígeno.
Se puede aplicar una gota de sangre al área de la aplicación de la sangre (11) del medio de transporte físico (3) a través del orificio (12) y se puede ver la reacción colorimétrica a través del área transparente (29). Alternativamente, una o más de las capas pueden ser lo suficientemente fuertes para soportar el dispositivo en la ausencia de un soporte de sustrato inerte.
Uno apreciará que dicho dispositivo laminado se puede diseñar como una tira de prueba a la que se le aplica una muestra, como una "varilla" para la inmersión en una muestra, o como un componente de una muestra recibiendo un recipiente (por ejemplo, un pozo en una placa microtiter). Se apreciará también que esta realización desea ser ilustrativa y no limitante. Siguiendo las enseñanzas proporcionadas aquí y el amplio cuerpo de literatura que está relacionado con el diseño de "tiras de prueba" dichos ensayos para determinar la actividad de la HDL de acuerdo a los métodos de esta invención se pueden recopilar fácilmente por aquellos expertos en la técnica.
V. Equipos
Se puede proporcionar la invención como un equipo para practicar uno o más de los ensayos descritos aquí. Un equipo de ensayo comprende de preferencia contenedores que contienen uno o más lípidos oxidados (aislados o proporcionados en una LDL), y/o lípidos reducidos (no oxidados) y un agente oxidante (por ejemplo, peróxido de hidrógeno, 13(S)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE, HODE, HETE, HPETE, etc,). El equipo incluye de preferencia uno o más reactivos para la detección de lípidos oxidados (por ejemplo, diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina, rodamina, ácido cis-parinarico, NBD, éster de colesterilo del ácido cis-parinarico, ácido propiónico de difenilhexatrieno, y otros materiales fluorescentes). Estos equipos pueden incluir opcionalmente uno o más de los dispositivos y/o reactivos para practicar los ensayos como se describen aquí. Dichos dispositivos y/o reactivos incluyen, pero no están limitados a placas microtiter, soluciones tampón, filtros para la cuantificación de fluorescencia, etc.
Además, los equipos incluyen opcionalmente materiales de marcaje y/o de instrucciones que proporcionan direcciones (es decir, protocolos) para la práctica de los métodos de ensayo. Los materiales de instrucción que se prefieren describen la revisión de la HDL (o los componentes de ella) para determinar la capacidad de proteger los lípidos de la oxidación o de reducir los lípidos oxidados. Los materiales de instrucción incluyen opcionalmente una descripción del uso de dichos ensayos para evaluar el riesgo de ateroesclerosis.
Mientras los materiales de instrucción comprenden típicamente los materiales escritos o impresos ellos no están limitados a dichos materiales. Se contempla cualquier medio capaz de almacenar dichas instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios incluyen, pero no se limitan a medios de almacenaje electrónico, (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, fichas), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y los semejantes. Dichos medios pueden incluir dirigirse a un sitio de Internet que proporcionan dichos materiales de instrucción.
Ejemplos
Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no limitan la invención que se reivindica.
Ejemplo 1 La HDL normal inhibe los tres pasos en la formación de la LDL ligeramente oxidada- Paso 1
La Apo A-I y un péptido mimético de la Apo A-I eliminaron "moléculas sembradas" de la LDL humana e hicieron a la LDL resistente a la oxidación por células humanas de pared arterial. Las Apo A-I asociadas a "moléculas sembradas" incluyen al ácido 13-hidroperoxioctadecadienoico [13-HPODE] y al ácido 15-hidroperoxieicosatetraenoico [15-HPETE]. La LDL de ratones susceptibles genéticamente a la formación de lesiones de estría adiposa fue elevadamente susceptible a la oxidación por las células de pared arterial y la hizo resistente a la oxidación después de la incubación con Apo A-I in vitro. La inyección de apo A-I (pero no de apo A-II) en los ratones hizo su LDL resistente a la oxidación en 3 h. La inyección de apo A-I en humanos hizo su LDL resistente a la oxidación en 6 h. La HDL y su enzima asociada la paraoxonasa (PON) hicieron también a la LDL resistente a la oxidación. Concluimos que: (1) la oxidación de LDL por las células de pared arterial requiere "moléculas sembradas" que incluyen el 13-HPODE y el 15-HPETE; (2) la LDL de los ratones susceptibles genéticamente a aterogenesis se oxida más rápidamente por las células de la pared arterial; (3) la HDL normal y sus componentes pueden eliminar o inactivar lípidos en la LDL recién aislada que se requieren para la oxidación por células humanas de pared arterial.
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Introducción
La HDL y su apolipoproteína principal, la apo A-I, se sabe que eliminan el colesterol y los fosfolípidos de las células (Oram and Yokoyama (1996 J. Lipid. Res. 37: 2473-2491; Forte et al. (1995) J. Lipid. Res. 36: 148-157; Bruce et al. (1998) Ann. Rev. Nutr. 18 : 297-330 ; Phillips et al. (1998) Atheroscler. 137 Suppl : S13-S-17). Stocker y colegas (Christison et al. (1995) J. Lipid. Res. 36: 2017-2026) y Fluiter et al. (1999) J Biol. Chem. 274: 8893-8899, han informado que los hidroperóxidos de ésteres colesterilo se pueden transferir de la LDL a la HDL, en parte, mediados por la proteína de transferencia del éster colesterilo. Fluiter y sus colegas (Id.) demostraron también que hubo una respuesta selectiva de ésteres de colesterilo oxidados de la HDL por células parenquimales de hígado de rata. Stocker y sus colegas (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6080-6087) informaron que ambas apo A-I y apo A-II pueden reducir los hidroperóxidos de éster colesterilo vía un mecanismo que involucra la oxidación de residuos de metionina específicos (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095). Sin embargo, no se ha informado previamente un papel directo de la apo A-I en eliminar los lípidos oxidados de las lipoproteínas y las células.
Sevanian y sus colegas anotaron que una subpoblación de LDL recién aislada que ellos han descrito como LDL que contiene hidroperóxidos de lípido (Sevanian et al. (1997) J. Lipid Res. 38: 419-428). Parthasarathy (Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R. G. Landes Co. pp. 91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Editado por H. Nohl, H. Esterbauer, y C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp. 163-179), Witztum y Steinberg (1991) J. Cli. Invest. 88: 1785-1792; Witztum (1994) Lancet 344: 793-795; Chisolm (1991) Clin. Cardiol. 14: 125-130; Thomas y Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256: 1182-1188; Shwaery et al. (1999) Meth. Enz. 300: 17-23; Polidori et al. (1998) Free Rad. Biol. Med. 25: 561-567; Thomas et al. (1994) Arch. Biochem, Biophys. 315: 244-254; han estudiado la oxidación de la LDL in vitro por iónes metálicos e hicieron la hipótesis de que la LDL debe ser "sembrada" con especies de oxígeno reactivo antes de que sea oxidada. Jackson y Parthasarathy sugirieron un papel para las lipoxigenasas (LO) en el "sembrado" de la LDL (Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Editado por H. Nohl, H. Esterbauer, y C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp. 163-179; Thomas y Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256: 1182-1188). Ellos postularon también la posibilidad de que el peróxido de hidrógeno o su equivalente lipoperóxido (Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Editado por H. Nohl, H. Esterbauer, y C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp. 163-179; Thomas y Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256: 1182-1188) puedan jugar un papel importante en el "sembrado" de la LDL. Nosotros reportamos previamente que la albúmina des-engrasada era capaz de eliminar los lípidos biológicamente activos de la LDL ligeramente oxidada (Watson et al. (1995) J. Cli. Invest. 95: 774-782). Basadas en las conocidas propiedades de unión de lípidos de la apo A-I (1-4), razonamos que la apo A-I fuera probable de ser más efectiva que la albúmina degrasada al enlazar y retirar los lípidos. Nosotros, por lo tanto, usamos la apo A-I y los péptidos miméticos de la apo A-I para tratar la LDL. Hicimos la hipótesis de que si la apo A-I pudiera enlazar los lípidos oxidados y si las "moléculas sembradas" fueran lípidos oxidados, entonces incubando apo A-I y LDL seguidas de la separación de las dos, podría resultar la transferencia de las "moléculas sembradas" de la LDL a la apo A-I a partir de las cuales ellas se pueden extraer e identificar. Encontramos que ambos el lípido neutro y las fracciones de ácidos grasos de los lípidos extraídos a partir de la apo A-I después de la incubación con LDL contenían "moléculas sembradas". La fracción de lípidos neutros es la fracción donde se encontrarían los hidroperóxidos de éster de colesterilo. Debido a que hay evidencia de que la vía de la lipoxigenasa puede actuar en buena parte para formar hidroperóxidos de éster de colesterilo como resultado de un proceso no enzimático mediado por los productos de la oxidación de ácidos grasos y alfa tocoferol (Neuzil et al. (1998) Biochem. 37: 9203- 9210; Upston et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 30067-30074; Upston et al. (1999) FASEB J. 13: 977-994), concentramos nuestros esfuerzos en la fracción de los ácidos grasos de los lípidos extraídos de la apo A-I después de la incubación con LDL recién aislada. Presentamos evidencia en este ejemplo de que las "moléculas sembradas" presentes en la LDL recién aislada se derivan, en parte, del metabolismo celular del ácido linoleico (ácido 13-hidroperoxioctadecadienoico [13-HPODE] y el ácido araquidónico (ácido 15-hidroperoxieicosatetraenoico [15-HPETE] como se predijo originalmente por Parthasarathy (10,11) y de acuerdo con los recientes conclusiones de Cyrus et al. que el trastorno del gen de lipoxigenasa 12/15 disminuye la aterosclerosis en los ratones deficientes de apo E (Cyrus et al. (1999) J. Clin. Invest. 103: 1597-1604; Steinberg (1999) J Clin. Invest. 103: 1487-1488).
Los experimentos presentados en este ejemplo indican también que se puede eliminar y/o inactivar las "moléculas sembradas" en la LDL recién aislada por la HDL normal y sus componentes (es decir la apo A-I, y la paraoxonasa). Los experimentos detallados en este ejemplo y en el ejemplo 2 nos han conducido a proponer que se forman los lípidos biológicamente activos (Watson et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607; Watson et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798) en la LDL ligeramente oxidada en una serie de tres pasos. El primer paso es el sembrado de la LDL con productos del metabolismo del ácido linoleico y araquidónico así como con hidroperóxidos de colesterilo. El segundo paso es el atrapar la LDL en el espacio subendotelial y la acumulación de especies de oxígeno reactivo adicionales que derivan de células de pared arterial cercanas. Proponemos que el tercer paso es la oxidación no enzimática de los fosfolípidos de la LDL que ocurre cuando se alcanza un umbral crítico de especies de oxígeno reactivo resultando la formación de lípidos oxidados específicos que inducen la unión de monocitos, la quimiotaxis, y la diferenciación en macrófagos. Los experimentos en este ejemplo se enfocan en el primero de estos tres pasos y el ejemplo 2 presenta datos sobre el segundo y tercer paso.
Métodos Materiales
Se obtuvieron los materiales de cultivos de tejidos y otros reactivos de fuentes previamente descritas (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; Navab et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 1225-1230; Navab et al. (1997) J. Clin. Invest, 99: 2005-2019). Se obtuvieron el acetonitrilo, cloroformo, metanol, acetato de etilo, anhídrido acético, trietilamina, tert-butanol, polipropilen glicol, formato de amonio, ácido fórmico y agua (todos grado Optima) de Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. Se obtuvieron L-\alpha-1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PAPC) auténtico, y el ácido linoleico de Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL). Se prepararon y se aislaron los fosfolípidos oxidados derivados del PAPC incluyendo el Ox-PAPC, y los fosfolípidos oxidados 1-palmitoil-2-(5)oxovaleril-sn-glicero-3-fosfocolina (POVPC, m/z 594), 1-palmitoil-2-glutaril-sn-glicero-3-fosfocolina (PGPC, m/z 610), y 1-palmitoil-2-(5,6-epoxiisoprostano E_{2})-sn-glicero-3-fosfocolina (PEIPC, m/z 828) como se describió previamente (25,26). Se obtuvieron la 13(S)-HPODE y 15(S)-HPETE de Biomol (Plymouth Meeting, PA). Se obtuvieron la apo A-I y la apo A-II humanas y la lipoxigenasa de soja de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) y se usaron para estudios in vitro y para inyectar en ratones.
Los análisis SDS-PAGE demostraron una pureza de aproximadamente 90% para las preparaciones de apo A-I y apo A-II. Se sintetizaron los péptido miméticos de apo A-I como se describió previamente (30-32). Se prepararon los discos de apo A-I humana/Fosfatidilcolina para la inyección en humanos como se describió previamente por ZLB Central Laboratory (Bern, Switzerland) (33-35). La paraoxonasa purificada fue un generoso regalo del Profesor Bert La Du de la Universidad de Michigan. Además se utilizaron dos preparaciones de paraoxonasa recombinante mutante, que no fueron capaz de hidrolizar paraoxon (Sorenson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7187-7191).
Lipoproteínas
Se aislaron la lipoproteína de baja densidad (LDL, d= 1,019 a 1,063 g/ml) y la lipoproteína de alta densidad (HDL, d= 1,063 a 1,21 g/ml) basándose en el protocolo descrito por Havel y colegas (Havel et al. (1955) J. Clin. Invest. 43: 1345-1353) de la sangre de voluntarios normales en ayuno después de obtener el consentimiento escrito bajo un protocolo acreditado por el comité de protección al sujeto en la investigación humana de la Universidad de California, Los Ángeles. Se preparó el suero deficiente en lipoproteína al retirar los gránulos siguiendo el aislamiento de la HDL, la diálisis y el reajuste de la concentración de la proteína a 7,5 g/100 ml. En algunos experimentos se agregaron 20 mM de hidroxitolueno butilado (BHT) en etanol a plasma recién aislado a una concentración de 20 \muM y se separaron las lipoproteínas por FPLC usando métodos previamente descritos (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest, 99: 2005-2019). Las LDL, HDL y LPDS tuvieron niveles de endotoxinas por debajo de 20 pg/ml lo cual está muy por debajo del límite necesario para la inducción de adhesión de monocitos o la actividad quimiotáctica. La concentración de las lipoproteínas que se informa en este estudio se basa en el contenido proteico.
Cocultivos
Se aislaron las células humanas endoteliales aórticas (HAEC), y las células de músculo liso (HASMC) como se describió previamente (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). Se trataron los pozos de las placas microtiter con 0,1% de gelatina a 37ºC durante toda la noche. Se agregó HASMC a una densidad confluente de 1X10^{5} células/cm^{2}. Se cultivaron las células por 2 d y en este tiempo ellas cubrieron la superficie completa del pozo y produjeron una cantidad sustancial de matriz extracelular. Se agregó posteriormente HAEC a 2X10^{5} células/cm^{2} y se les permitió crecer formando una mono capa completa de HAEC confluente en 2 d. Se usó en todos los experimentos, las HAEC y HASMC autotransplante (del mismo donador) al pasar del nivel cuatro al seis.
Aislamiento de monocitos
Se aislaron los monocitos usando una modificación del método de Recalde como se describió previamente (Fogelman et al. (1988) J. Lipid Res. 29: 1243-1247) de la sangre de voluntarios normales después de obtener por escrito el consentimiento bajo un protocolo acreditado por el comité de protección de sujetos de investigación humana de la Universidad de California, Los Ángeles.
Prueba de quimiotaxis de monocitos
En general, se trataron los cocultivos con LDL nativo (250 \mug/ml) en la ausencia o presencia de la HDL durante 8 h. Se reunieron los sobrenadantes y se usaron para determinar los niveles de hidroperóxido de lípidos. Posteriormente se lavaron los cocultivos y se agregó medio de cultivo fresco 199 (M199) sin ningún añadido y se incubó por 8 h adicionales. Esto permitió al conjunto de monocitos liberar la actividad quimiotáctica por las células como resultado de la estimulación por la LDL oxidada. Al final de la incubación, se colectaron los sobrenadantes de los cocultivos, se diluyeron a 40, y se probó para determinar la actividad quimiotáctica de monocitos. Brevemente, se agregó el sobrenadante a una cámara Neuroprobe estándar (NeuroProbe, Cabin John, MD), con monocitos agregados en la parte superior. Se incubó la cámara durante 60 m a 37ºC. Después de la incubación, se desmontó la cámara y se sacaron los monocitos no migrados. Se secó entonces al aire la membrana y se fijó con 1% de glutaraldehído y se tiñó con 0,1% de tintura de cristal violeta. Se determinó microscópicamente el número de monocitos que migraron y se expresó como la media \pmSD de 12 campos de alto poder estandarizados contados en pozos por cuadruplicado.
Prueba de adhesión de monocitos
En síntesis, se incubaron las monocapas HAEC, en placas de cultivo de tejidos de 48-pozos con la LDL deseado o fosfolípido por 4 h a 37ºC como se describió (Watson et al. (1995) J. Clin. Invest. 96: 2882-2891). Después de lavar, se agregó una suspensión de monocitos de sangre periférica humana y se incubó por 10 m. Se lavaron entonces los monocitos de adherencia poco rígida, y se fijaron las monocapas y el número de monocitos adheridos se contó en 9 campos de alto poder microscópico.
Efecto de 13(S)-HPODE en la oxidación de la LDL
Se incubó la LDL recién aislada (250 \mug) con 13(S)-HPODE puro (1,0 \mug) en 10% de LPDS en M199 por 4 h a 37ºC con agitación moderada. Se re aisló la LDL por centrifugación y se incubó con monocapas de células humanas endoteliales de aorta. Se retiraron los sobrednadantes en puntos de tiempo que van de cero a 5 h y se probaron para determinar el contenido de hidroperóxido de lípidos. Se lavó la monocapa endotelial después de cada punto de tiempo y se agregó una suspensión de monocitos, se incubó, se lavó, y se determinó el número de monocitos adherentes.
Tratamiento de LDL con lipoxigenasa de soja
Se incubó la LDL recién aislada (250 \mug) con 10 unidades de lipoxigenasa de soja pura unida a perlas de sepharosa por 4 h a 37ºC con agitación moderada. Se re aisló la LDL por centrifugación y se incubó con monocapas de HAEC. Se retiraron los sobrednadantes en puntos de tiempo que van de cero a 4 h y se probaron para determinar el contenido de hidroperóxido de lípidos. Se lavó la monocapa endotelial después de cada punto de tiempo y se determinó la adhesión de monocitos.
Ratones
Se adquirieron ratones C57BL/6J y C3H/HeJ de Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Todos los animales eran hembras (de 4-6 meses de edad en la época del experimento). Se mantuvieron los ratones con una dieta de lata, Purina Chow (Ralston-Purina Co., St. Louis, MO) que contiene 4% de grasa. Se aisló la LDL de la sangre obtenida de grupos de ratones susceptibles de lesión C57BL/6J y de los ratones resistentes a lesión C3H/HeJ del seno retroorbital usando heparina como anticoagulante (2,5 U/ml de sangre) y bajo suave anestesia de isoflurano, acogiéndose al conjunto de regulaciónes del Comité de Investigación Animal de la Universidad de California.
Inyección de la apo A-I en humanos
Después de obtener por escrito el consentimiento bien informado y con la aprobación del St. Bartholomew's y la Escuela Real Inglesa de Medicina y Odontología, se inyectaron discos de apo A-I/fosfotidilcolina en una dosis de 40 mg de apo A-I/Kg de peso corporal durante cuatro horas usando el material y protocolo descritos por Nanjee et al. (Nanjee et al. (1999) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 19: 979-989; Nanjee et al. (1996) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 16: 1203-1214) en seis sujetos masculinos sanos. Los niveles de lípidos para estos seis voluntarios, los sujetos 1, 2, 3, 4, 5, y 6 respectivamente, fueron: Colesterol Total: 149, 160, 164, 209, 153, 163; Triglicéridos: 176, 169, 95, 150, 121, 153; Colesterol-LDL: 69, 73, 88, 117, 73, 82; Colesterol-HDL: 45, 54, 56, 62, 59, 47 mg/dl. Se preparó el plasma 2 h. antes y 6 h siguiendo la inyección, se preservó por congelamiento como se describió (Havel et al. (1955) J. Clin. Invest. 43: 1345-1353) y se aisló la LDL por FPLC en el laboratorio de los autores en Los Ángeles antes de los experimentos. La LDL que se aisló de plasma de acuerdo a este protocolo funciona de manera que es indistinguible de la LDL recién aislada in vitro e in vivo (Rumsey et al. (1994) J. Lipid Res. 35: 1592-1598).
Cromatografía líquida de rápido desarrollo (FPLC)
Se desarrolló la cromatografía líquida de rápido desarrollo (FPLC) para el aislado rápido y suave de la LDL y para re aislar LDL y apo A-I después de la incubación como se mostró en la Figura 2 como se informó previamente (Navab et al. (1997) J Clin Invest, 99: 2005-2019).
Cromatografía de extracción en fase sólida
Se preformó la cromatografía de extracción en fase sólida como se describió previamente (Kaluzny et al. (1985) J. Lipid Res. 26: 135-140). En resumen, se re suspendió el extracto de lípido de no más de 2,0 mg de proteína LDL en 250 \mul de cloroformo. Se acondicionaron las columnas amino de extracción de fase sólida (Fischer) al agregar 3,0 ml de metanol seguido de 6,0 ml de hexano usando un colector Vac-Elut (Analytichem International, Harbor City, CA). Se agregaron los lípidos a la columna y se eluyeron los lípidos neutros (colesterol, ésteres de colesterilo, hidroperóxidos de ésteres de colesterilo, triglicéridos, diglicéridos, y monoglicéridos) con 3,0 ml de cloroformo/isopropanol (2:1, v/v). Se eluyeron los ácidos grasos libres con 3,0 ml de ácido acético al 3% en dietil éter, y se eluyeron los fosfolípidos con 3 ml de metanol. Se evaporaron los disolventes, se re suspendieron los lípidos en cloroformo/metanol (2:1, v/v con 0,01% de BHT, protegido con argón y almacenado a -80ºC. En estos análisis la recuperación del C17:0 agregado como estándar interno fue del 92\pm3%.
Cromatografía líquida de elevado desarrollo en fase reversa
Se llevó acabo la cromatografía líquida de elevado desarrollo en fase reversa (RP-HPLC) de acuerdo a los métodos de Ames y colegas (Yamamoto and Ames (19__) Free Rad. Biol. Med. 3:359-361), Kambayashi y colegas (Kambayashi et al. (1997) J. Biochem. 121: 425-431), y Alex Sevanian (comunicación personal). En resumen, se desarrollaron los análisis al inyectar los lípidos aislados re suspendidos en el disolvente móvil dentro de la columna y eluyendo con una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se desarrolló la detección de los productos de la oxidación de los ácidos grasos por absorbancia de UV con un detector de matriz de diodos (Beckman Instruments) analizando de 200 a 350 nm o con un detector de dispersión de luz evaporativa (SEDEX 55, Francia). Se usaron las columnas Hypersil MOS-1 C8 (Alltech) o Supelcosil LC-18-DB (Supelco) para la separación de los productos de oxidación de los ácidos grasos, y se usó una columna Alltima C18 (Alltech) para la separación de los productos de oxidación del éster de colesterilo. Se utilizó un sistema de disolventes compuesto de metanol/trietil amina (99,99/0,01, v/v) para eluir el 13-HPODE, se usó para eluir el 15-HPETE un sistema consistiendo de un gradiente de acetonitrilo/agua/ácido acético (60/40/0,1; v/v/v) a acetonitrilo/agua/ácido acético (98/2/0,1; v/v/v), y uno consistiendo de acetonitrilo/2-propanol/agua (44/54/2, v/v/v) para eluir el hidroperóxido de linoleato de colesterilo.
Espectrometría de masas de iónización por electrospray (ESI-MS)
Se desarrolló la espectrometría de masas de iónización por electrospray (ESI-MS) en el modo de ión positivo o negativo de acuerdo al protocolo y condiciones descritas previamente (Watson et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607).
Otros métodos
Se determinó el contenido de proteína de las lipoproteínas por una modificación (Lehman et al. (1995) in vitro Cell. Develop. Biol. Animal. 31: 806-810) de la prueba de Lowry (Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275). Se determinaron los niveles de la proteína 1 quimiotáctica de monocitos usando una ELISA como se describió previamente (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). Se midieron los niveles de hidroperóxido de lípido usando el informe de prueba de Auerbach et al. (1992) Anal. Biochem. 201: 375-380. Se extrajo con cloroformo-metanol en algunos experimentos donde se indicó los lípidos en el sobrenadante del cultivo conteniendo la LDL que fue oxidada por los cocultivos de células de pared arterial y se determinaron los hidroperóxidos por el método de Auerbach. Se midió la actividad de la paraoxonasa (PON) como se describió previamente (Gan et al. (1991) Drug Metab. Dispos. 19: 100-106). Se determinó el significado estadístico por el modelo 1 ANOVA. Se realizaron los análisis usando primero ANOVA en una aplicación EXCEL para determinar si las diferencias existidas entre la media de los grupos, seguida por una prueba doble de t-Student para identificar la media significativamente diferente, cuando es apropiado. Se definió la significancia como p<0,05.
Resultados La Apo A-I y un Péptido Mimético de la Apo A-I Elimina "Moléculas sembradas" de la LDL Humana Recién Aislada y Hace a la LDL Resistente a la Oxidación por las Células Humanas de la Pared Arterial
Nuestro sistema de co cultivo de pared arterial humana ha sido extensamente caracterizado (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; Navab et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 1225-1230; Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019; Shih et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1630-1639; Ishikawa et al. (1997) J. Clin. Invest. 100: 1209-1216; Castellani et al. (19__) J. Clin. Invest. 100: 464-474; Shih et al. (1998) Nature 394: 284-287). Cuando se agrega la LDL a este co cultivo esta es atrapada en el espacio subendotelial y es oxidada por las células de la pared arterial. Como resultado, se producen tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos-POVPC, PGPC, PEIPC con relaciones de m/z característicos de 594, 610, y 828, respectivamente (Watson et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607; Watson et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798). Estos tres fosfolípidos oxidados explican la capacidad de la LDL ligeramente oxidada de inducir a las células endoteliales de unir monocitos, segrega el potente quimio atractor de monocitos MCP-1, y el factor de diferenciación M-CSF (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; Berliner et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1260-1266; Rajavashisth et al. (1990) Nature 344: 254-257). Se encontró que contenía MCP-1 el medio acondicionado a partir de los cocultivos expuestos a la LDL (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). Cuando de agregan monocitos humanos a los cocultivos de LDL-tratado, los monocitos se unieron a las células endoteliales y emigraron al espacio subendotelial (Id.). La adición a los cocultivos de anticuerpos neutralizantes de MCP-1 suprimió completamente la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida (Id.). Así, la quimiotaxis de monocitos en los cocultivos es una prueba altamente sensible para la formación de los fosfolípidos oxidados biológicamente activos y la posterior inducción de MCP-1 (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; Navab et al. (1993) J. Clin. Invest. 91 : 1225-1230 ; Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99 : 2005-2019 ; Ishikawa et al. (1997) J. Clin. Invest. 1209-1216 ; Berliner et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1260-1266).
La apo A-I es el principal componente proteico de la HDL normal. Debido a su conocida capacidad de unir el colesterol y los fosfolípidos (Oram y Yokoyama (1996) J. Lipid Res. 37: 2473-2491; Forte et al. (1995) J. Lipid Res. 36: 148-157; Bruce et al. (1998) Ann. Rev. Nutr. 18: 297-330; Phillips et al. (1998) Atheroscler. 137 Suppl: S13-S-17) nosotros hacemos la hipótesis que la apo A-I podría también enlazar las "moléculas sembradas" en la LDL. Para probar esta hipótesis utilizamos el protocolo utilizado en la Figura 1. Se agregó hidroxitolueno butilado (BHT) a plasma recién extraído y se separó la LDL por FPLC y se incubó por dos horas con apo A-I a 37ºC. Se separaron entonces rápidamente la apo A-I y la LDL y se estudiaron. Nos referimos a la LDL y a la apo A-I después de la separación como "LDL después de A-I" y "A-I después de LDL", respectivamente.
La Figura 4A y la Figura 4B demuestran que la "LDL después de A-I" podría no ser oxidada por un co cultivo de células humanas de pared arterial. Los datos de la Figura 3A a la Figura 3C representan la media \pmSD de aquellos obtenidos en siete de los siete experimentos usando la LDL tomada de los siete diferentes individuos normales y usando diferentes cocultivos y monocitos tomados de diferentes donadores. Así, estos resultados son altamente reproducibles y demuestran en la Figura 4A que las células de pared arterial no fueron capaces de oxidar la "LDL después de A-I". Sin embargo, si el lípido extraído de "A-I después de LDL" se agrega a la "LDL después de A-I", este se oxidó rápidamente (Figura 3A). También, como se muestra en la Figura 2, la "LDL después de de A-I" no estimula la adherencia de monocitos (Figura 3B) o la quimiotaxis (Figura 3C). Sin embargo, cuando el lípido extraído de "A-I después de LDL" se agregó a la "LDL después de A-I" la LDL reconstituida induce la adherencia de monocitos (Figura 3B) y la quimiotaxis (Figura 3C) al mismo grado como la LDL placebo tratada. Los resultados que fueron altamente similares a aquellos mostrados en la Figura 3C se obtuvieron cuando los niveles de proteína 1 monocito quimiotáctica se midieron por ELISA (datos no mostrados).
Se ha determinado que la capacidad de la apo A-I de enlazar lípidos es una función de su estructura \alpha-helicoidal específica (Palgunachari et al. (1996) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 16: 328-338). Anantharamaiah y colegas han sintetizado los péptido miméticos de la apo A-I que han sido caracterizados exhaustivamente (Garber et al. (1992) Arterioscler. Thromb. 12: 886-894; Anantharamaiah (1986) Meth. Enz. 128: 627-647). Uno de estos péptido miméticos es conocido como 37pA con la secuencia de aminoácidos DWL KAF YDK VAE KLK EAF PDW LKA FYD KVA EKL KEA F (SEQ ID NO:1). También se ha construido por este grupo un péptido con la misma secuencia de aminoácidos como 37pA pero que contiene tres residuos de aminoácidos extra [ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), y prolina (P)] en la posición N-terminal que evita la formación de la hélice \alpha necesaria para el enlace de lípidos usando métodos previamente publicados (Anantharamaiah (1986) Meth. Enz. 128: 627-647). Este péptido control, conocido como 40P, enlaza lípidos pobremente comparado al 37pA. Como se muestra en la Figura 4A y Figura 4B, después de que la LDL ha sido incubada con y entonces separada del péptido mimético de apo A-I el 37pA, la LDL ("LDL después de 37pA") fue resistente a la oxidación por las células de la pared arterial (Figura 4A) y no indujo la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 4B). Sin embargo, si el lípido extraído del péptido después de la incubación con la lipoproteína ("37pA después de la LDL") fuera agregado a la "LDL después de 37pA", este sería oxidado rápidamente (Figura 4A). En contraste, la "LDL después de 40P" no mostró reducción en la oxidación de la LDL por las células de la pared arterial (Figura 4A) y no hubo reducción en la quimiotaxis de monocitos inducida por LDL (Figura 4B). Así, tanto apo A-I como su péptido mimético 37pA fueron capaces de eliminar lípidos de la LDL recién aislada que hizo a la LDL resistente a la oxidación por las células humanas de pared arterial y evitó la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida.
Las "Moléculas sembradas" en la LDL Recién Aislada que se Eliminan por la Apo A-I Incluyen el 13-HPODE y el 15-HPETE
Se extrajeron los lípidos de "A-I después de la LDL", para identificar los lípidos biológicamente activos asociados con la LDL que fue rápidamente aislado por FPLC en la presencia de 20 \muM de BHT como se indicó en la Figura 2. Se separaron estos lípidos por cromatografía de extracción en fase sólida. Se agregaron entonces los lípidos neutros o fracciones de ácidos grasos a cocultivos junto con PAPC un fosfolípido presente en la LDL o a la "LDL después de A-I". La adición a los cocultivos de PAPC o de "LDL después de A-I" no estimuló la formación de hidroperóxido de lípido o la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 5A-Figura 5C, barras abiertas). Sin embargo, la adición a PAPC o a "LDL después de A-I" de ya sea la fracción de los ácidos grasos (Figura 5A y Figura 5B, barras sólidas) o la fracción de lípidos neutros (Figura 5C y Figura 5D, barras sólidas) extraídas de "A-I después de LDL" indujo un incremento dosis dependiente en la formación de hidroperóxidos de lípidos y la quimiotaxis de monocitos. Estos experimentos indicaron que la apo A-I eliminó lípidos de la LDL recién aislada que fue requerida por las células de la pared arterial para oxidar ambas PAPC y la LDL. La adición de ya sea las fracciones de ácidos grasos o de lípidos neutros recuperadas de "A-I después de la LDL" resultó en la oxidación de PAPC y la "LDL después de A-I" por las células de la pared arterial.
Para identificar además los ácidos grasos, se incubó la LDL recién aislada con o sin apo A-I y se separó entonces por centrifugación. Siguiendo la incubación con apo A-I, se extrajeron los lípidos de la LDL y de la apo A-I. Se extrajeron también los lípidos de la apo A-I que se incubó sin la LDL (A-I placebo) y de la LDL que no se incubó con apo A-I (LDL placebo). Se fraccionaron entonces los lípidos extraídos por HPLC de fase reversa. La apo A-I que no había sido incubada con la LDL contuvo poco si algo del 13-HPODE (Figura 6A) o el 15-HPETE (Figura 6E). En contraste, la LDL recién aislada que había sido incubada sin apo A-I (LDL placebo) contuvo 13-HPODE y un pico cercano no identificado (Figura 6B), y también contuvo 15-HPETE (Figura 6F). La "LDL después de A-I" contuvo sustancialmente menos 13-HPODE relativo al pico no identificado cercano (comparar el pico 13-HPODE en relación al pico no identificado en la Figura 6B y la Figura 6C) y marcadamente menor 15-HPETE (Figura 6G). La Figura 6D, y la Figura 6H demuestran que el 13-HPODE y 15-HPETE, respectivamente, se transfirieron a la apo A-I. Análisis adicionales usando la espectrometría de masas confirmaron también la presencia de cantidades significantes de HPODE y HPETE en la LDL recién aislada, ambas se eliminaron eficazmente por la incubación con apo A-I (datos no mostrados). Los análisis del extracto de lípido de "A-I después de LDL" por ESI-MS en el modo de ión negativo demostró la presencia de un ión con m/z 311 indicando la presencia de HPODE (datos no mostrados). También se observó un ión presente en menos abundancia comparado con aquél para el HPODE y con m/z 335, indicando la presencia de HPETE en los lípidos de "A-I después de LDL" (datos no mostrados). El extracto de lípido de "A-I después de LDL" contuvo también una cantidad relativamente grande de un ión con m/z 317 indicando la presencia de un producto de deshidratación de HPETE es decir la pérdida de una molécula de agua (datos no mostrados). El análisis por MS/MS del extracto de lípido de la LDL recién aislada que no se trató con la apo A-I confirmó la presencia de HPODE (datos no mostrados). Sin embargo, no se detectó HPETE en estas muestras (datos no mostrados). Debido que se detectó rápidamente HPETE en "A-I después de LDL" por ambas técnicas HPLC y MS/MS, deducimos que: 1) el tratamiento de la apo A-I puede tener concentrado el HPETE siguiendo su detección; 2) el HPODE puede estar presente en concentraciones más elevadas en la LDL recién aislada que el HPETE.
La adición de 13(S)-HPODE auténtico a la LDL recién aislada como se describió en Métodos incrementó la formación de hidroperóxidos de lípido cuando se agregó la LDL a HAEC y también incrementó la adherencia de monocitos a HAEC (datos no mostrados).
El 13(S)-HPODE es el producto de la actividad de la lipoxigenasa sobre el ácido linoleico (55, 56). Debido que el principal ácido graso insaturado en la LDL es el ácido linoleico, se incubó la LDL recién aislada con o sin lipoxigenasa de soja. Después de la incubación con ésta y entonces su separación de la lipoxigenasa de soja como se describió aquí, se agregó la LDL a HAEC. La LDL que se incubó con la lipoxigenasa y entonces se separó de ésta incrementó significativamente la formación de hidroperóxidos de lípidos en los sobrenadantes del cultivo y también incrementó la adherencia de monocitos en HAEC al compararse con la LDL incubada sin lipoxigenasa de soja (datos no mostrados).
Tomando juntos estos experimentos indican que las "moléculas sembradas" en la LDL recién aislada que no son eliminadas por la apo A-I pueden incluir el HPODE y el HPETE.
La LDL Recién Aislada de Ratones que son Genéticamente Susceptibles a Ateroesclerosis son Elevadamente Susceptibles a la Oxidación por Células Humanas de Pared Arterial y se Hacen Resistentes a la Oxidación por Apo A-I Humana
Cuando se alimentó con una dieta aterogénica, los ratones C57BL/6J (BL/6) desarrollan lesión de fatty streak en su aorta mientras que los ratones C3H/HeJ (C3H) no lo hacen, a pesar de niveles equivalentes de apo B contienendo lipoproteínas (Paigen et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3763-3767; Ishida et al. (1991) J. Lipid Res. 32: 559-568). Hemos presentado previamente evidencia para sugerir que los ratones BL/6 susceptibles a lesión están bajo estrés oxidativo Shih et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1630-1639; Shih et al. (1998) Nature 394: 284-287; Liao et al. (1994) J. Clin. Invest. 94: 877-884). Una consecuencia lógica de esta hipótesis podría ser incrementar la susceptibilidad a la oxidación de la LDL de los ratones BL/6 comparada a la LDL de los ratones C3H resistentes a la lesión. Con una dieta chow baja en grasa las dos líneas de ratones tienen similares niveles bajos de LDL y los ratones BL/6 susceptibles a lesión tienen niveles más altos de HDL (Paigen et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3763-3767). Para probar nuestra hipótesis incubamos la LDL recién aislada de las dos líneas de ratones, ambos estaban en dieta chow baja en grasa, con y sin apo A-I humana y entonces se separó la LDL y la apo A-I y se incubaron con los cocultivos de células humanas de pared arterial. Como se muestra en la Figura 7A y la Figura 7B, se oxidó más rápidamente la LDL incubada sin la apo A-I (LDL placebo) de los ratones BL/6 sensibles a lesión por las células de la pared arterial que en el caso de la LDL de los ratones C3H resistentes a lesión (Figura 7A). En contraste, las "LDL después de A-I" de ambos ratones BL/6 sensibles a lesión y los C3H resistentes a lesión fueron resistentes a la oxidación por las células de la pared arterial (Figura 7A). Por otro lado, si los lípidos se extrajeron de la "A-I después de LDL", y se agregaron nuevamente a la "LDL después de A-I" la LDL reconstituida se oxidó por las células de la pared arterial al mismo grado como sucedió con la LDL placebo-tratada (Figura 7A). Se obtuvieron resultados similares para la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida (Figura 7B). Los datos en la Figura 7A y 7B indican que la diferencia en la capacidad de las células de la pared arterial de oxidar la LDL de los ratones BL/6 sensibles a lesión comparada a la LDL de los ratones C3H se debe a los lípidos en su LDL que puede ser eliminada por la apo A-I. Estos datos indican también que esta diferencia está presente mientras los animales están en dieta chow baja en grasa.
La Inyección de Apo A-I Humana (pero no Apo A-II Humana) en los Ratones Hace a la LDL de los Ratones Resistente a la Oxidación por Células Humanas de Pared Arterial
Para probar la capacidad de la apo A-I de alterar el potencial del estado de oxidación de la LDL in vivo, inyectamos 100 \mug de Apo A-I o Apo A-II o solución salina sola a ratones vía la vena de la cola. Se extrajo inmediatamente sangre (0 h) o a las 3, 6, o 24 horas después de la inyección. Se aisló la LDL por FPLC y se incubó con cocultivos de pared humana arterial y se determinó la formación de hidroperóxidos de lípido y la actividad quimiotáctica de monocitos. La Figura 8A demuestra que la LDL recién aislada de los ratones BL/6 que fueron inyectados con apo A-I de tres a seis horas de anticipación fue resistente a la oxidación por células humanas de pared arterial y esta resistencia persistió hasta 24 horas (Figura 8A). En contraste, la LDL obtenida inmediatamente después de la inyección (0 h) o 6 horas después de la inyección salina sola, o 6 horas después de la inyección de apo A-II no hizo a la LDL de ratón resistente a la oxidación por las células de la pared arterial (Figura 8A). Se obtuvieron resultados similares para la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 8B). La actividad de PON en plasma y HDL incrementó en aproximadamente 20% seis horas después de la inyección de apo A-I pero no cambió después de la inyección de apo A-II (datos no mostrados). Así, como fue el caso para los estudios in vitro anteriores, la apo A-I inyectada in vivo (pero no apo A-II) fue capaz de disminuir drásticamente la oxidación de la LDL.
La Inyección de Apo A-I Humana en Humanos Hace a su LDL Resistente a la Oxidación por Células Humanas de Pared Arterial
Como se indicó antes en la Figura 8, la inyección de apo A-I en ratones hizo a su LDL resistente a la oxidación por las células de pared arterial. La Figura 9A y Figura 9B describe un estudio paralelo en humanos. Se tomó la sangre de seis sujetos sanos (uno con niveles ligeramente incrementados de triglicéridos, 176 mg/dl, como se indicó en Métodos) dos horas antes y seis horas después de la inyección de la apo A-I. Se aisló la LDL del plasma en cada punto de tiempo y se incubó con cocultivos de células humanas de pared arterial. Como se mostró en la Figura 9A, en seis de los seis sujetos, la LDL aislada seis horas después de la inyección de apo A-I fue mucho más resistente a la oxidación por las células de pared arterial comparada a la LDL dos horas antes de la inyección. Se obtuvieron resultados similares para la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida (Figura 9B) aunque la disminución en la oxidación para el sujeto 4 fue menor que la disminución en la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida. La actividad de la PON en plasma y la HDL se incrementó en aproximadamente 20% seis horas después de la inyección comparada a dos horas antes de la inyección (datos no mostrados). Estos datos indican que como fue en el caso de los ratones, la inyección de la apo A-I en humanos hizo a su LDL resistente a la oxidación por células humanas de pared arterial.
La HDL o HDL Asociada a Enzimas Hace a la LDL Resistente a la Oxidación por Células Humanas de Pared Arterial
Para probar la capacidad de la HDL entera y sus componentes aparte de la apo A-I, como es la PON, de hacer a la LDL resistente a la oxidación por células de pared arterial, se incubó la LDL con o sin HDL, o PON, como se describió aquí y entonces se separó de éstos y se incubó con cocultivos de células humanas de pared arterial. La incubación con HDL, o PON, hizo a la LDL resistente a la oxidación por las células de pared arterial comparadas a la LDL placebo tratada (Figura 10A). Se obtuvieron resultados similares de la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida (Figura 10B). Así, la HDL y su enzima asociada PON hacen a la LDL resistente a la oxidación por células de pared arterial.
Discusión
Los datos presentados en este ejemplo demuestran un papel para la HDL y sus componentes, la apo A-I y la PON al regular el primer paso en un proceso de tres pasos que conduce a la formación de LDL ligeramente oxidada. Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R. G. Landes Co. pp. 91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Editado por H. Nohl, H. Esterbauer, y C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp. 163-179; Witztum and Steinberg (1991) J. Clin. Invest 88: 1785-1792; Witztum (1994) Lancet 344: 793-795; Chisolm (1991) Clin. Cardiol. 14: 125-130; y Thomas y Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256: 1182-1188, hipotizaron que la LDL debe ser "sembrada" con especies de oxígeno reactivas antes de que pueda ser oxidada. Spector y colegas (Spector et al. (1988) Prog. Lipid Res. 27: 271-323; Alexander-North et al. (1994) J. Lipid Res. 35: 1773-1785) han demostrado que la vía de la lipoxigenasa es activa en células de la pared arterial, y Parthasarathy enfatiza la posibilidad de que el peróxido de hidrógeno o su equivalente lipoperoxido (Parthasarathy et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1046-1050; Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R. G. Landes Co. pp. 91-119; Parthasarathy (1994) Free Radicals in the Environment, Medicine and Toxicology. Editado por H. Nohl, H. Esterbauer, y C. Rice Evans. Richelieu Press, London. pp. 163-179) podrían jugar un papel importante al "sembrado" la LDL. Los recientes descubrimientos de Cyrus et al. (1999) J. Clin. Invest 103: 1597-1604) que el trastorno del gen de la lipoxigenasa 12/15 disminuyó la ateroesclerosis en ratones deficientes de apo E son consistentes con esta hipótesis y los datos en este ejemplo.
Encontramos que la LDL recién aislada de los ratones con una dieta chow que son genéticamente susceptibles al desarrollo de la ateroesclerosis fue más rápidamente oxidada por las células de pared arterial que fue el caso de la LDL tomada de los ratones que son genéticamente resistentes al desarrollo de la ateroesclerosis. La LDL de ambas líneas de ratones se hizo resistente a la oxidación por las células de la pared arterial después del tratamiento con apo A-I (Figura 7A y Figura 7B), y los niveles de oxidación de la LDL después del tratamiento con la apo A-I no fueron significativamente diferentes para las dos líneas (Figura 7A y Figura 7B). Esto puede indicar que la diferencia genética en susceptibilidad a desarrollar la ateroesclerosis puede deberse, en parte, a una diferencia en el nivel de "moléculas sembradas" en la LDL de estas dos líneas de ratones.
La capacidad in vitro de la apo A-I (Figura 3 y Figura 7) y un péptido mimético de la apo A-I (Figura 4A y B) de hacer a la LDL resistente a la oxidación por células de la pard arterial se demostró también al aplicar in vivo en ambas líneas de ratones (Figura 8A y B) y en humanos (Figura 9A y B). En los ratones, en las tres horas de inyección de la apo A-I, la LDL se hizo resistente a la oxidación por células de la pared arterial y su estado de protección persistió hasta 24 horas (Figura 8A y B). En contraste al caso para la apo A-I, la inyección de la apo A-II no protegió a la LDL contra la oxidación por las células de la pared arterial (Figura 7A). En humanos, la inyección de apo A-I en seis de los seis hombres hizo a su LDL resistente a la oxidación por células de la pared arterial en las seis horas de la inyección (Figura 8A).
No solo la apo A-I fue capaz de alterar favorablemente la susceptibilidad de la LDL a la oxidación por células de la pared arterial sino también fue la HDL por sí misma y la HDL asociada a la enzima PON. Aviram y colegas demostraron recientemente que la PON tiene actividad de peroxidasa (Aviram et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1581-1590; Aviram et al. (1998) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 18: 1617-1624) que en parte puede explicar el papel de la PON en la protección contra la arteroesclerosis en modelos de ratones (Shih et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1630-1639; Shih et al. (1998) Nature 394: 284-287) y en estudios epidemiológicos (Serrato y Marian (1995) J. Clin. Invest. 96: 3005-3008; Mackness et al. (1998) Curr. Opin. Lipidol. 9: 319-324; Heinecke y Lusis (1998) Amer. J. Hum. Genet. 62: 20-24). El artículo reciente de Dansky y colegas (Dansky et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 31-39) sugirió que hubo beneficio en la sobre expresión de la apo A-I en ratones deficientes de apo E sin un incremento en la actividad de la PON. Sin embargo, como se reconoce por los autores de este estudio (Id.), ellos limitan sus experimentos a las primeras 8 semanas de vida. Aviram y colegas informaron que la actividad de la PON en suero declinó en ratones deficientes de apo E después de 3 meses de edad, coincidiendo con el incremento en el área de la lesión aórtica y la peroxidación de lípidos en suero (Aviram et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1581-1590). Se sacrificaron los ratones estudiados por Plump y colegas (Plum et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9607-9611) a los 4 o 6 meses de edad cuando los datos de Aviram sugerían que la actividad de PON sería reducida. Dansky y colegas (Dansky et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 31-39) informaron también que la retención de lípidos en la pared arterial y la adherencia de monocitos al endotelio no fueron diferentes a las seis semanas y concluyeron que el beneficio de la apo A-I se limitó a un tiempo después en el desarrollo de la lesión. Se debe comentar que Dansky y colegas (Id.) no midieron la adherencia a monocitos pero midieron en vez de ésta la adherencia de CD1, que no es específica para monocitos. Además, Dansky y colegas (Id.) usaron ratones con un antecedente genéticamente mezclado para la mayoría de sus experimentos y no midieron los monocitos/macrófagos en el espacio subendotelial. Basados en nuestros datos, podríamos predecir que la sobre expresión de la apo A-I podría reducir la susceptibilidad de la LDL a la oxidación independiente de cualquier cambio en la actividad de la PON. Sin embargo, nosotros vimos aproximadamente un incremento del 20% en la actividad de PON seis horas después de la inyección de la apo A-I (pero no de apo A-II) en ratones y un pequeño incremento similar en humanos seis horas después de la inyección de apo A-I.
Sevanian y colegas (Sevanian et al. (1997) J. Lipid Res. 38: 419-428) informaron de niveles incrementados de óxidos de colesterol en la LDL. Nuestras conclusiones (Figura 5) de que el lípido neutro extraído de "A-I después de LDL" podría devolver la capacidad de las células de la pared arterial de oxidar a la "LDL después de A-I" coinciden con las observaciones de Sevanian. Nuestros resultados sobre las fracciones de ácidos grasos extraídos de "A-I después de LDL" (Figura 5A-C, y Figura 6A-H) indican que los metabolitos del ácido linoleico y los ácidos araquinoicos pueden actuar también como "moléculas sembradas" de la LDL. La revisión de la Figura 6A-6H revela que la "LDL después de A-I" contuvo aún un nivel detectable del 13-HPODE. Sin embargo, este nivel no fue suficiente para permitir a la "LDL después de A-I" de ser oxidada por células humanas de pared arterial (Figura 3, Figura 5, Figura 7, Figura 8, y Figura 9). Debido que la adición paso a paso del lípido neutro o de las fracciones de ácidos grasos de la "A-I después de la LDL" a la "LDL después de A-I" restableció su capacidad de ser oxidada por las células de la pared arterial (Figura 5), concluimos que hay un límite crítico para las "moléculas sembradas" que sea necesario para la oxidación.
Stocker y colegas (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6080-6087; Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095) demostraron que ambas apo A-I y apo A-II pueden reducir los hidroperóxidos de éster de colesterilo vía un mecanismo que involucra la oxidación de residuos de metionina específicos (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095). En nuestros experimentos solo la apo A-I y no la apo A-II fue capaz de reducir la oxidación de la LDL después de la inyección en ratones (Figura 8). Estos resultados sugieren que el mecanismo de protección de la apo A-I en nuestros estudios fue diferente de aquellos investigados por Stocker y colegas (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6080-6087; Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095). Se ha demostrado que la HDL pronostica fuertemente de forma inversa el riesgo para la ateroesclerosis (Miller and Miller (1975) Lancet 1(7897): 16-19). Se ha mostrado que la HDL reduce la ateroesclerosis en modelos de animales cuando se inyectó (Badimon et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1234-1241) y cuando se asoció con la sobre expresión de la apo A-I (Plum et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9607-9611). Sin embargo, se ha demostrado que la sobre expresión de la apo A-II aumenta la ateroesclerosis (Castellani et al. (19__) J. Clin. Invest. 100: 464-474; Warden et al. (1993) Science. 261: 469-472; Hedrick et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 20676-20682). Los estudios que se reportan aquí coinciden con estos informes publicados e indican que la apo A-I pero no la apo A-II es capaz de eliminar moléculas "sembrado" de la LDL recién aislada.
En el ejemplo 2 presentamos la evidencia que la HDL normal y sus componentes pueden también inhibir el segundo y tercer paso en la formación de la LDL ligeramente oxidada.
Ejemplo 2 La HDL Normal Inhibe los Tres Pasos en la Formación de la LDL ligeramente Oxidada- Pasos 2-3
En este ejemplo, el tratamiento de células humanas de pared arterial con la apo A-I (pero no la apo A-II), con un péptido mimético de la apo A-I, o con la HDL, o la paraoxonasa, hacen a las células incapaces de oxidar a la LDL. La adición del ácido 13(S)- hidroperoxioctadecadienoico [13(S)-HPODE] y el ácido 15(S)-hidroperoxieicosatetraenoico [15(S)-HPETE] aumentan dramáticamente la oxidación no enzimática de ambos el 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PAPC) y el linoleato de colesterilo. En una base molar el 13(S)-HPODE y el 15(S)-HPETE fueron aproximadamente dos órdenes de magnitud más grandes en potencia que el peróxido de hidrógeno al causar la formación de fosfolípidos oxidados biológicamente activos (m/z 594, 610, y 828) de PAPC. La paraoxonasa purificada inhibió la actividad biológica de estos fosfolípidos oxidados. La HDL de 10 de los 10 pacientes con lípidos normales con enfermedad coronaria arterial, que no fueron diabéticos ni tenían medicaciones hipolipidémicas, fallaron para inhibir la oxidación de la LDL por las células de la pared arterial y fallaron para inhibir la actividad biológica del PAPC oxidado mientras la HDL de 10 de los 10 elegidos en edad y sexo lo hicieron.
Concluimos que: (a) Se forma la LDL ligeramente oxidada en tres pasos, cada uno puede ser inhibido por la HDL normal y, (b) la HDL de al menos algunos pacientes con enfermedad coronaria arterial con niveles de lípidos normales en sangre es defectuoso en ambas, su capacidad para evitar la oxidación de la LDL por células de pared arterial y en su capacidad para inhibir la actividad biológica de PAPC oxidado.
Introducción
Descubrimos que la HDL pero no la apo A-I cuando se agregan a cocultivos de células humanas de pared arterial junto con la LDL evita la oxidación de la LDL por las células de la pared arterial. En aquellos experimentos, la apo A-I se conservó en el cultivo junto con las células de la pared arterial y la LDL (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). Posteriormente, continuando con los mecanismos para la capacidad de la HDL de proteger la LDL contra la oxidación por células humanas de la pared arterial, descubrimos que si la apo A-I se incuba con las células y entonces se elimina antes de la adición de la LDL, las células de pared arterial fueron entonces incapaces de oxidar el LDL que se agregó. Esto nos sugiere que la apo A-I podría ser capaz de eliminar de las células no solo el colesterol y los fosfolípidos sino tal vez los lípidos oxidados también. Estos hallazgos preliminares nos motivaron a desarrollar los estudios detallados en este ejemplo.
Los experimentos detallados en este ejemplo y en el ejemplo 1 nos han conducido a proponer que los lípidos activos biológicamente en la LDL ligeramente oxidada se forman en una serie de tres pasos. El primer paso es el sembrado de la LDL con productos del metabolismo del ácido linoleico y araquidónico así como con hidroperóxidos de éster de colesterilo. La evidencia para el primer paso se presentó en el ejemplo 1. En este ejemplo presentamos evidencia considerando el segundo paso es decir, atrapando la LDL en el espacio subendotelial y la liberación a esta LDL atrapada de especies de oxígeno reactivo adicional derivadas de las células de la pared arterial cercanas.
Stocker y colegas han presentado evidencia indirecta de que las lipoxigenasas median la peroxidación del linoleato de colesterilo mayormente por un proceso no enzimático (Neuzil et al. (1998) Biochem. 37: 9203-9210; Upston et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 30067-30074). Nosotros demostramos en este ejemplo que la oxidación no enzimática del linoleato de colesterilo aumenta mayormente por la presencia del ácido 13(S)- hidroperoxioctadecadienoico [13(S)-HPODE]. También proponemos en este ejemplo que el tercer paso en la formación de la LDL ligeramente oxidada es la oxidación no enzimática de fosfolípidos de la LDL que ocurre cuando se alcanza un límite crítico de "moléculas sembradas" (por ejemplo, 13(S)-HPODE y el ácido 15(S)- hidroperoxieicosatetraenoico [15(S)-HPETE] en la LDL. Presentamos evidencia en este ejemplo que indica que cuando estas "moléculas sembradas" alcanzaron un nivel crítico, causaron la oxidación no enzimática de un fosfolípido principal de la LDL, el 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PAPC). Este da como resultado la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos: 1-palmitoil-2-oxovaleril-sn-glicero-3-fosfocolina (POVPC, m/z 594), 1-palmitoil-2-glutaril-sn-glicero-3-fosfocolina (PGPC, m/z 610), y 1-palmitoil-2-(5,6-epoxiisoprostano E_{2})-sn-glicero-3-fosfocolina (PEIPC, m/z 828) (Watson (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607). Los experimentos en este ejemplo indican también que en contraste al caso para la HDL normal, la HDL tomada de pacientes con enfermedad coronaria arterial quienes mostraron niveles normales de lípidos en sangre, no eran diabéticos ni tomaban medicamentos hipolipidémicos, no protegió la LDL contra la oxidación por células humanas de pared arterial y falló al inhibir la actividad biológica del PAPC oxidado.
Métodos Materiales
El análogo de ácido araquidónico, el ácido 5,8, 11, 14-eicosatetrainoico (ETYA) se obtuvo de Biomol (Plymouth Meeting, PA). Se preparó el hidroperóxido de linoleato de colesterilo (Ch18:2:-OOH) estándar por peroxidación de linoleato de colesterilo usando hidroperóxido de tert-butilo. Se agregó el setenta por ciento de hidroperóxido de tert-butilo a la mezcla de cloroformo y metanol (2:1, v/v) que contiene 100 mg de linoleato de colesterilo. Después de la peroxidación por 48 h. a temperatura ambiente con agitación, se extrajeron los lípidos por el método de Folch (Folch et al. (1957) J. Biol. Chem. 226: 497-509) y se separaron por cromatografía de líquidos de alto desarrollo en fase reversa (RP-HPLC) como se describió antes. Todos los demás materiales provienen de fuentes descritas en el ejemplo 1.
Lipoproteínas, Cocultivos, aislamiento de Monocitos, pruebas de quimiotaxis de Monocitos, y pruebas de adhesión de monocitos
Estas se prepararon y/o desarrollaron como se describió en el ejemplo1.
Pacientes y Sujetos Normales
Se reunieron las muestras de sangre de pacientes referidos al laboratorio de caracterización cardiaca en El Centro de Ciencias de la Salud en la Universidad de California, Los Ángeles. Después de firmar una forma de consentimiento aprobada por el comité de protección a sujetos de investigación humana de la Universidad de California, Los Ángeles, el paciente donó una muestra de sangre en ayunas recogida en un tubo heparinizado. Se aislaron la LDL y/o la HDL por FPLC de las muestras de sangre recogidas de pacientes que tuvieron ateroesclerosis coronaria angiográficamente documentada pero que tienen el colesterol total normal (<200 mg/dl), Colesterol-LDL (<130 mg/dl), Colesterol-HDL (hombres >45 mg/dl, mujeres >50 mg/dl), y triglicéridos (<150 mg/dl), quienes no tenían medicamentación hipolipidémica y quienes fueron no diabéticos. Se han incluido los datos de algunos pacientes y algunos controles informados previamente por nosotros (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019) con nuevos datos adicionales. La inclusión de pacientes previamente informados está explícitamente indicada en la leyenda de la figura apropiada. Se aisló la HDL de cada individuo y se determinó la actividad paraoxonasa como se describió previamente (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019). Se determinó entonces la capacidad de la HDL de cada sujeto de proteger la LDL contra la oxidación por cocultivos de células humanas de la pared arterial usando técnicas previamente descritas (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019). La LDL usada para probar la capacidad de la HDL de proteger la LDL contra la oxidación por células humanas de pared arterial se preparó de un donador normal y se tomó una alícuota y se preservó por congelación en sucrosa como se describió previamente (Rumsey et al. (1992) J. Lipid Res. 33: 1551-1561). Para determinar la capacidad de la HDL de inactivar los fosfolípidos oxidados, en algunos casos 100 \mug/ml de PAPC oxidado (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019) se incubó con 250 \mug/ml de HDL en los tubos prueba en 10% de LPDS en M199 a 37ºC con agitación moderada. La mezcla HDL-Ox-PAPC se agregó entonces a las mono capas endoteliales y se determinó la unión de monocitos.
Efecto de la sobre expresión de la 15-Lipoxigenasa (15-LO) en fibroblastos sobre la eliminación de 13(S)-HPODE por la apo A-I
Los fibroblastos que se transfirieron con solo el vector o las células que sobre expresaron 15-LO fueron un generoso regalo de los Drs. Joe Witztum y Peter Reaven. En los presentes experimentos, se incubaron los fibroblastos con o sin 100 \mug/ml de apo A-I. Siguiendo 3 h. de incubación a 37ºC con agitación moderada, se retiraron los sobrenadantes del cultivo, se separó la apo A-I por FPLC y se determinó el nivel de hidroperóxidos en los extractos de lípido de los sobrenadantes de cultivo y en los extractos de lípido de la apo A-I.
Efecto de la lipoxigenasa e inhibidores de ciclooxigenasa
Se preincubaron los cocultivos de pared arterial humana con ETYA a una concentración de 10^{-8} mol/L o con cinamil-3,4-dihidroxi-\alpha-cianocinamato (CDC, de Biomol) a una concentración de 10^{-8} mol/L en M199 que contiene 10% de LPDS por 30 min. Se lavaron entonces los cocultivos y se agregaron 250 \mug/ml de la LDL y se incubó por 8 h. Se retiraron los sobrenadantes y se probaron para determinar los hidroperóxidos de lípidos y se determinó la actividad quimiotáctica de monocitos como se describió en el ejemplo 1.
Formación de fosfolípidos oxidados (POVPC, PGPC, y PEIPC) de PAPC por adición de 13(S)-HPODE o 15(S)-HPETE o peróxido de hidrógeno
Se agregó 13(S)-HPODE o 15(S)-HPETE o solo un vehículo a varias concentraciones de PAPC, se mezclaron y se evaporó formando una capa delgada y se dejó oxidar al aire. En algunos experimentos, se evaporó el PAPC formando una capa delgada y se dejó oxidar al aire con 100 \mul que contienen peróxido de hidrógeno a varias concentraciones. Se extrajeron las muestras con cloroformo/metanol (2:1, v/v) y en el caso de los experimentos de peróxido de hidrógeno por adición de 5 partes de cloroformo/metanol (2:1, v/v) por una parte de solución acuosa, se agita, y centrifuga. Se recogió la fase del cloroformo y se analizó por ESI-MS en el modo de ión positivo. El nivel del PAPC restante y los fosfolípidos que formaron se determinaron y expresaron en relación al estándar interno, el 1,2-ditetradecanoil-rac-glicerol-3-fosfocolina (DMPC, m/z 678,3).
Cromatografía líquida de desarrollo rápido (FPLC) y cromatografía líquida de alto desarrollo en fase reversa (RP-HPLC)
Se desarrollaron la cromatografía líquida (FPLC) y la cromatografía líquida de alto desarrollo en fase reversa (RP-HPLC) como se describió en el ejemplo 1. Para la detección de hidroperóxido de linoleato de colesterilo se usó una columna C18 Alltech Alltima 250 X 4,6 mm, 5 micrones RP-HPLC para separar y detectar el hidroperóxido de linoleato de colesterilo a 234 nm y el linoleato de colesterilo a 205 nm. La fase móvil consistió de acetonitrilo/2-propanol/agua (44:54:2, v/v/v) a 1 ml/min. Se resuspendieron los lípidos en la fase móvil por inyección.
Espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS)
Se desarrolló la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) en el modo de ión positivo o negativo de acuerdo al protocolo y condiciones previamente descritas (Watson (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607). Se desarrolló la ESI-MS con un analizador de masas biomolecular API III triple-cuadrupolo (Perkin-Elmer) integrado con una sonda articulada, de nebulización asistida neumáticamente y una fuente de ionización a presión atmosférica Watson (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607). Se hizo el análisis de inyección de flujo en ión positivo con acetonitrilo/agua/ácido fórmico (50/50/0,1; v/v/v) y se hizo el análisis de inyección de flujo en ión negativo con metanol/agua (50/50) conteniendo 10 mM de acetato de amonio. Para el análisis cuantitativo, se usaron como estándar interno el 1,2-ditetradecanoil-rac-glicerol-3-fosfocolina (DMPC) o el ácido heptadecanoico. Los iones se analizaron a un tamaño de paso de 0,3 Da. Se procesaron los datos por software proporcionado por PE Sciex.
Otros Métodos
Se determinó el contenido de proteína de las lipoproteínas por una modificación (Lorenzen and Kennedy (1993) Anal. Biochem. 214: 346-348) de la prueba de Lowry (Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275). Se midieron los niveles de hidroperóxido de lípido usando la prueba descrita por Auerbach et al. (1992) Anal. Biochem. 201: 375-380. En algunos experimentos, donde se indicó, se extrajo el lípido en los sobrenadantes de cultivo que contiene la LDL que fue oxidada por los cocultivos de células de pared arterial por cloroformo-metanol y se determinaron los hidroperóxidos por el método de Auerbach. Se midió la actividad paraoxonasa como se describió previamente (Gan et al. (1991) Drug Metab. Dispos. 19: 100-106). Se determinó la significancia estadística por el modelo 1 ANOVA. Se llevaron acabo los análisis usando primero ANOVA en una aplicación EXCEL para determinar si las diferencias existidas entre la media de los grupos, seguida por una prueba doble de t-Student para identificar la significante media diferente, cuando es apropiado. La significancia se define como p<0,01.
Resultados
El ejemplo 1 demostró que la LDL contiene "moléculas sembradas" necesarias para la oxidación de la LDL por las células de la pared arterial. Nosotros informamos previamente (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046; Berliner et al. (1990) J. Clin. Invest. 85: 1260-1266) que la LDL recién aislada no induce la adherencia de los monocitos a las células endoteliales y no induce la qiuimiotaxis de monocitos mientras la LDL ligeramente oxidada induce ambas (Id.). La capacidad de la LDL ligeramente oxidada de inducir la adherencia de monocitos y la quimiotaxis se basó sobre la presencia en la LDL ligeramente oxidada de tres fosfolípidos oxidados con relaciones características de m/z (m/z 594, 610, y 828) (Watson (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607). Nosotros no vimos evidencia de estos fosfolípidos oxidados en la LDL recién aislada (datos no mostrados). Por lo tanto, concluimos que las "moléculas sembradas" en la LDL recién aislada fueron por ellas mismas insuficientes para generar los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos ya sea por que el nivel de estas "moléculas sembradas" fuera menor que algún límite crítico o por que las "moléculas sembradas" adicionales y diferentes fueran requeridas para generar los fosfolípidos oxidados biológicamente activos. Así, concluimos que se requirió al menos otro paso en la formación de la LDL ligeramente oxidada además del "sembrado" inicial.
Paso 2
La Apo A-I (Pero No la Apo A-II) Hace a las Células Humanas de Pared Arterial Incapaces de Oxidar la LDL
Informamos previamente que la co-incubación de las células humanas de pared arterial con apo A-I y la LDL no protegió a la LDL contra la oxidación por las células de pared arterial (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). Como se mostró en la Figura 11, estos resultados fueron confirmados (comparar la A-I co-incubada a cultivos placebo tratado). Sin embargo, cuando los cocultivos de pared arterial humana se incubaron primero con apo A-I y se retiró entonces la apo A-I de los cocultivos antes de la adición de la LDL (Cultivos después de A-I), las células de pared arterial no fueron capaces de oxidar la LDL (Figura 11A) y se evitó la quimiotaxis de monocitos (Figura 11B). En contraste al caso para la apo A-I, cuando los cultivos se incubaron primero con apo A-II y se retiró entonces la apo A-II, los cocultivos de pared arterial retuvieron su capacidad de oxidar la LDL (Figura 11A) e indujeron la quimiotaxis de monocitos (Figura 11B) (Cultivos después de A-II).
En otros experimentos, se incubó la apo A-I con un primer conjunto de cocultivos y se retiró entonces del primer conjunto de cocultivos y se agregó a un segundo conjunto de cocultivos que han sido tratados de forma idéntica (es decir, se incubó el segundo conjunto de cocultivos con apo A-I que se retiró entonces). Cuando se agregó la LDL a este segundo conjunto de cocultivos que contenían la apo A-I del primer conjunto de cocultivos, estos cocultivos reconstituidos oxidaron fácilmente la LDL (Figura 11A) e indujeron la quimiotaxis de monocitos (Figura 11B) (Cultivos después de A-I + A-I después de cultivos).
Se desarrollaron experimentos similares con apo A-II. Se incubó la apo A-II con un primer conjunto de cocultivos y se eliminó entonces y se agregó aun segundo conjunto de cocultivos que habían sido idénticamente tratados (es decir el segundo conjunto de cocultivos había sido incubado con apo A-II la cual fue entonces retirada). Cuando se agregó al LDL a este segundo conjunto de cocultivos el cual contenía la apo A-II del primer conjunto de cocultivos, hubo un incremento significante en la oxidación de la LDL por las células de la pared arterial (Figura 11A) y un incremento significante en la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida (Figura 11B) (Cocultivos después de A-II + A-II después de cultivos).
Debido a que la reducción en la oxidación de la LDL y la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida por apo A-I requirió que la apo A-I fuera retirada de los cocultivos después de la incubación con las células y antes de la adición de LDL (comparar Cultivos después de A-I con A-I Coincubada), concluimos que la apo A-I eliminó sustancias de los cocultivos de células de pared arterial que fueron necesarias para que la LDL fuera oxidada por los cocultivos e inducir la quimiotaxis de monocitos. También concluimos que la apo A-II fue incapaz de reducir la oxidación de la LDL y la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida, y, en efecto, resaltar éstos (comparar Cultivos después de A-II con Cultivos después de A-I).
Se obtuvieron resultados similares cuando los cocultivos se trataron con un péptido mimético de apo A-I (Figura 12). Se incubaron los cocultivos con o sin el péptido mimético 37pA de la apo A-I, y se retiró entonces el péptido antes de la adición de la LDL. Se incubaron otros cocultivos con el péptido control 40P. Los cocultivos que habían sido incubados con el péptido mimético 37pA de la apo A-I que fue retirado antes de la adición de la LDL fueron incapaces de oxidar la LDL agregada (Figura 12A) y no indujo la quimiotaxis de monocitos (Figura 12B). Este no fue el caso cuando los cocultivos fueron tratados con el péptido control 40P. Siguiendo el tratamiento con el péptido control 40P, se oxidó la LDL por los cocultivos (Figura 12A) e indujo la quimiotaxis de monocitos (Figura 12B) al mismo grado que los cocultivos placebo tratados. Concluimos que el péptido mimético 37pA de la apo A-I eliminó sustancias de las células de pared arterial que fueron necesarias para que la LDL fuera oxidada por los cocultivos e inducir la quimiotaxis de monocitos.
La HDL o HDL asociada a enzimas Hace a las Células Humanas de Pared Arterial Incapaces de Oxidar la LDL
También probamos si la HDL completa y su enzima asociada la paraoxonasa (PON) podían alterar la capacidad de las células de pared arterial de oxidar la LDL. Incubamos los cocultivos de células de pared arterial con HDL, o la PON purificada y entonces retiramos éstas antes de la adición de la LDL a los cocultivos. El tratamiento de las células de pared arterial con cualquiera de estas dos hicieron a las células de pared arterial incapaces de oxidar la LDL (Figura 13A) y evitaron la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida (Figura 13B). Concluimos que además de la apo A-I, la HDL y la PON pueden evitar a las células humanas de pared arterial oxidar la LDL e inducir la quimiotaxis de monocitos.
El Ácido Linoleico Pero No el Ácido Oleico Estimula a las Células Humanas de Pared Arterial a Oxidar la LDL
Como se remarcó antes, concluimos que las "moléculas sembradas" en la LDL ligeramente oxidada fueron por ellas mismas insuficientes para generar los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos que inducen la quimiotaxis de monocitos. Hacemos la hipótesis de que esto podría ser por que el nivel de estas "moléculas sembradas" fuera menor que algún límite crítico o por que las "moléculas sembradas" adicionales y diferentes fueran requeridas para generar los fosfolípidos oxidados biológicamente activos en la LDL. Pensamos que si hubiera algún límite para las mismas "moléculas sembradas" de generar los fosfolípidos oxidados y de ahí la quimiotaxis de monocitos y si estas "moléculas sembradas" fueran en parte derivadas del metabolismo del ácido linoleico, entonces enriqueciendo los cocultivos de pared arterial humana con ácido linoleico se podría esperar aumentar su capacidad de oxidar la LDL e inducir la quimiotaxis de monocitos. Por consiguiente, incubamos cocultivos de pared arterial humana con o sin ácido linoleico (C18:2), o el ácido oleico (C18:1), lavamos las células, y las dejamos metabolizar los ácidos grasos al incubarlas por 3 horas a 37ºC en medio fresco que no fue complementado con los ácidos grasos. Posteriormente, probamos la capacidad de estos cocultivos de células humanas de pared arterial para oxidar la LDL e inducir la quimiotaxis de monocitos (Figura 14A, Figura 14B, y Figura 14C). Incubando las células de pared arterial con el ácido linoleico aumentó significativamente la capacidad de las células de pared arterial de oxidar la LDL comparado al ácido oleico (Figura 4A) e inducir la quimiotaxis de monocitos (Figura 14B). Se incubaron los cocultivos en otros experimentos sin la LDL pero con (+) o sin (-) ácido linoleico (C18:2) y se lavaron las células y se incubaron entonces con o sin apo A-I (Figura 14C). Se retiraron los sobrenadantes y se separó la apo A-I por FPLC, y el lípido se extrajo de la apo A-I. Se obtuvieron también los extractos de lípido de los sobrenadantes de cultivo de las incubaciones sin apo A-I. Incubando los cocultivos con ácido linoleico incrementó dramáticamente los equivalentes de 13-HPODE en el extracto de lípido de la apo A-I (Figura 14C) (comparar el extracto de lípido de Apo A-I de las células incubadas con C18:2 al extracto de lípido de apo A-I de las células incubadas sin C18:2). Concluimos que incubando las células humanas de pared arterial con ácido linoleico aumenta marcadamente la producción celular de hidroperóxidos de lípido, es decir los equivalentes de 13-HPODE que pueden ser eliminados por la apo A-I. Concluimos además que la incubación de células humanas de pared arterial con el ácido linoleico pero no el ácido oleico estimula la oxidación de la LDL por las células de pared arterial y estimula la quimiotaxis de monocitos LDL-inducida. En otros experimentos, los estudios descritos en la Figura 14A hasta la Figura 14C se desarrollaron con ácido araquidónico. Los resultados indicaron que el ácido araquidónico fue aún más potente que el ácido linoleico al estimular la oxidación de la LDL por las células de pared arterial (datos no
mostrados).
Evidencia adicional para el papel de vías de lipoxigenasa
Jackson y Parthasarathy sugirieron un papel para la lipoxigenasa (LO) en el "sembrado" de la LDL (Thomas y Jackson (1991) J. Pharmacol. Exp. Therap. 256: 1182-1188; Parthasarathy (1994) Modified Lipoproteins in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Austin, TX; R. G. Landes Co. pp. 91-119) y Sigari y colegas demostraron que los fibroblastos sobre expresan 15-LO más fácilmente la LDL oxidada que los fibroblastos transfectado con solo el vector (Sigari et al. (1997) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 17: 3639-3645). Para establecer además la capacidad de la apo A-I de eliminar productos hidroperóxido de lípido de la vía LO de las células, incubamos fibroblastos sobre expresando LO y células que fueron transfected con solo el vector con apo A-I o sin apo A-I como se describió antes. Se retiraron los sobrenadantes, se separó la apo A-I por FPLC, y se extrajo el lípido de la apo A-I. Se obtuvieron también los extractos de lípido de los sobrenadantes de cultivo a partir de las incubaciones sin apo A-I. Sin la adición de la apo A-I, los extractos de lípido de los sobrenadantes de las células que sobre expresan LO contuvieron solo ligeramente más equivalentes de13-HPODE (5,1 veces más) que los extractos de lípido de la apo A-I incubados con las células control (datos no mostrados).
La pre-incubación de los cocultivos con el inhibidor ETYA (1x10^{-8} mol/L) de lipoxigenasa/ciclooxigenasa antes de la adición de la LDL como se describió en Métodos dio como resultado un 80 \pm7% de reducción en los niveles de hidroperóxido de lípido y un 75 \pm10% de disminución en la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida (p<0,008; datos no mostrados). La preincubación de los cocultivos de pared arterial humana con el inhibidor de lipoxigenasa CDC (1x10^{-8} mol/L) antes de la adición de la LDL como se describió en Métodos dio como resultado un 73 \pm6% de reducción en los niveles de hidroperóxido de lípido y un 74 \pm11% de disminución en la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida (p<0,01; datos no mostrados).
Tomados juntos, estos experimentos sugieren que las células de pared arterial producen especies de oxígeno reactivas, incluyendo aquellas derivadas del metabolismo del ácido linoleico y los ácidos araquidónicos, que son críticos en la oxidación de la LDL "sembrada". Estos experimentos sugieren también que la HDL, la apo A-I y la PON, pueden eliminar o destruir estas sustancias y hacer a las células de la pared arterial incapaces de oxidar la LDL "sembrada". Nuestra hipótesis también propone que cuando se alcanza un nivel crítico en la LDL por la adición adicional de especies de oxígeno reactivas por las células de la pared arterial para "sembrada" la LDL, la oxidación no enzimática de un fosfolípido principal de la LDL, el PAPC, da como resultado la formación de tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (POVPC, PGPC, y PEIPC) que induce la unión de monocitos y la quimio-
taxis.
Paso 3
El 13(S)-HPODE y el 15(S)-HPETE Aumentan Marcadamente la Oxidación de la PAPC y el Linoleato de Colesterilo
Informamos previamente que si la PAPC se expusiera al aire durante 48 horas esta sufriría auto-oxidación para producir los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (POVPC, PGPC, y PEIPC) (Watson (1999) J. Biol. Chem. 274: 24787-24798; Watson (1997) J. Biol. Chem. 272: 13597-13607). Si los productos de la vía de la lipoxigenasa estuvieran involucrados en ambos el "sembrado" inicial de la LDL circulante y el "sembrado" adicional de la LDL por las células de pared arterial necesarios para alcanzar un límite crítico que pudiera causar la oxidación no enzimática del PAPC, entonces la adición de los productos de la vía de la lipoxigenasa al PAPC debería incrementar significativamente la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (POVPC, PGPC, y PEIPC). Para probar esta hipótesis medimos la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos a partir de PAPC como una función del tiempo. Como se muestra en la Figura 15A hasta la Figura 15C la adición de 1,0 \mug de 13(S)-HPODE a 10 \mug de PAPC aumentó la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos en cada punto de tiempo muestreado (POVPC, m/z 594, Figura 15A; PGPC, m/z 610, Figura 15B; PEIPC, m/z 828, Figura 15C).
Los datos en la Figura 16A muestran que la adición de tan poco como 0,5 \mug de 13(S)-HPODE a 10 \mug de PAPC por 8 horas disminuyó significativamente la abundancia relativa de PAPC (m/z 782) e incrementó significativamente la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (m/z 594, 610, y 828). La Figura 16B demuestra que la adición de tan poco como 0,5 \mug de 15(S)-HPETE a 10 \mug de PAPC por 8 horas disminuyó significativamente la abundancia relativa de PAPC (m/z 782) e incrementó significativamente la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos (m/z 594, 610, y 828).
La Figura 16C muestra que 8 mM de peróxido de hidrógeno agregado a 10 \mug PAPC por 8 horas disminuyó dramáticamente la abundancia relativa de PAPC e incrementó la formación de los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos, mientras que 2 mM y 4 mM de peróxido de hidrógeno no tuvieron efecto. Debido a que el peso molecular de PAPC es 782 la relación molar requerida para el aumento de oxidación de PAPC por el peróxido de hidrógeno fue aproximadamente de 62:1 (H_{2}O_{2}: PAPC) en el experimento descrito en la Figura 16C. Debido que el peso molecular del 13(S)-HPODE es 311 y el peso molecular del 15(S)-HPETE es 336,5 la relación molar a la que estos productos de la vía de la lipoxigenasa promovieron la oxidación de la PAPC es aproximadamente 1:8. Así, sobre una base molar la capacidad del 13(S)-HPODE y el 15(S)-HPETE para oxidar al PAPC fue más de dos órdenes de magnitud mayor que el peróxido de hidrógeno bajo estas condiciones. Tomando juntos estos datos indican que el 13(S)-HPODE y el 15(S)-HPETE, productos del metabolismo del ácido linoleico y araquidónico, respectivamente, actúan como potentes agentes oxidantes y promueven la oxidación no catalítica del PAPC para producir los tres fosfolípidos oxidados biológicamente activos encontrados en la LDL ligeramente oxidada.
Stocker y colegas (Neuzil et al. (1998) Biochem. 37: 9203-9210; Upston et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 30067-30074) presentaron evidencias indirectas para sugerir que la lipoxigenasa medió la oxidación del linoleato de colesterilo principalmente por un proceso no enzimático que involucra los productos de la vía de la lipoxigenasa. Los experimentos en la Figura 17 demuestran que la presencia de 13(S)-HPODE estimularon marcadamente la formación no enzimática de hidroperóxido del linoleato de colesterilo (Ch18:2-OOH).
La Paraoxonasa destruye la Actividad Biológica de los Tres Fosfolípidos Oxidados, m/z 594, 610, y 828
Informamos previamente que los antioxidantes y la HDL podían evitar la formación de la LDL ligeramente oxidada biológicamente activa, pero que una vez formada, la HDL y los antioxidantes no podían disminuir la actividad biológica de la LDL ligeramente oxidada (Navab et al. (1991) J. Clin. Invest. 88: 2039-2046). En estos experimentos en contraste a aquellos reportados anteriormente donde se incubó la HDL con los cocultivos antes de que la LDL fuera agregada a los cocultivos, nosotros habíamos agregado previamente la HDL junto con la LDL a los cocultivos. En otros estudios, informamos que PAF-AH (Watson et al. (1995) J.Clin. Invest. 95: 774-782), y la PON (Watson et al. (1995) J.Clin. Invest.96: 2882-2891) podría destruir la actividad biológica de la LDL ligeramente oxidada si las enzimas se incubaran con la LDL antes de agregarse a las células. Se desarrollaron estos estudios con la LDL ligeramente oxidada, no los fosfolípidos específicos oxidados (es decir, PAPC oxidadado o POVPC, PGPC, PEIPC). Para probar directamente la capacidad de la paraoxonasa de destruir la actividad biológica de cada uno de los tres fosfolípidos oxidados incubamos el PAPC oxidado (Ox-PAPC), o POVPC, m/z 594; PGPC, m/z 610; o PEIPC, m/z 828 con o sin paraoxonasa purificada como se describió en Métodos. Se separaró la enzima de las mezclas y se agregaron los compuestos a los cocultivos de pared arterial humana. La incubación de Ox-PAPC, o POVPC, m/z 594; PGPC, m/z 610; o PEIPC, m/z 828 con paraoxonasa purificada seguida por la separación de la paraoxonasa de los compuestos antes de la presentación a los cocultivos de células de pared arterial dio como resultado la destrucción de la actividad biológica de cada uno, i. e. la pérdida de la capacidad de inducir la actividad quimiotáctica de monocitos (Figura 18). Dos preparaciones de PON recombinante mutante, un generoso regalo de los Drs. Robert Sorenson y Bert N. La Du (Sorenson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7187-7191) fueron incapaces de inactivar los fosfolípidos biológicamente activos en este sistema de prueba (datos no mostrados). La PON que fue inactivada al hervir a 100ºC no tuvo efecto sobre la actividad de los fosfolípidos oxidados (datos no
mostrados).
La HDL de Pacientes con Enfermedad Coronaria Arterial, Con niveles normales de lípidos en la Sangre, Que No Eran Diabéticos ni tenían Medicación Hipolipidémica, Falló al Evitar la Oxidación de la LDL por las Células de Pared Arterial y Falló Destruir la Actividad Biológica de PAPC Oxidada
Informamos (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019) que después de monitorear más de 250 pacientes con enfermedad coronaria arterial angiográficamente documentada, identificamos 14 pacientes con enfermedad coronaria arterial angiográficamente documentada a pesar de los niveles normales de lípidos en sangre y de la ausencia de diabetes. Estos 14 tuvieron en media niveles más bajos de actividad de paraoxonasa a pesar de sus niveles normales de Colesterol-HDL comparados a los 19 control elegidos en sexo y edad (Id.). Sin embargo, las diferencias entre la actividad paraoxonasa de los pacientes y los controles normales no alcanzaron significancia estadística (Id.). Ahora hemos identificado otros 10 pacientes con niveles normales de lípidos (es decir colesterol total <200 mg/dl, colesterol-LDL <130 mg/dl, colesterol-HDL > 45 mg/dl para hombres y > 50 mg/dl para mujeres, y triglicéridos <150 mg/dl) quienes tuvieron enfermedad coronaria arterial angiográficamente documentada, quienes no fueron diabéticos ni tenían medicación hipolipidémica. Combinando los datos previamente reportados con los nuevos datos ahora vemos una diferencia en el significado estadístico en la actividad paraoxonasa entre pacientes (n = 24) y los control (n = 29) (Figura 19A).
Previamente fuimos solo capaces de obtener muestra suficiente de 5 de los 14 pacientes originales para probar en nuestro sistema de cocultivo (Navab et al. (1997) J. Clin. Invest. 99: 2005-2019). Informamos que la HDL de estos cinco no protegió contra la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida en el sistema de cocultivo de pared arterial humana, mientras la HDL de los 4 sujetos control lo hizo. En nuestros estudios en curso obtuvimos la HDL de 10 pacientes adicionales con lípidos normales con enfermedad coronaria arterial angiográficamente documentada, quienes no fueron diabéticos ni tenían medicación hipolipidémica. La capacidad de la HDL de estos diez pacientes y diez sujetos normales elegidos en edad y sexo de modificar la oxidación de una LDL control (es decir la LDL obtenida de un sujeto normal que se uso en todos los experimentos) se muestra en la Figura 19B. Como se muestra en la Figura 19B, la HDL tomada de los 10 de 10 de los pacientes no protegió la LDL control contra la oxidación por células humanas de pared arterial. Incluso, un promedio de la HDL de paciente en realidad incrementó la oxidación de la LDL control, mientras que la HDL de los 10 de 10 sujetos normales elegidos en edad y sexo redujeron marcadamente la oxidación de la LDL control por las células de pared arterial.
Añadiendo los datos sobre la quimiotaxis de monocitos de los diez nuevos pacientes y los diez sujetos normales a aquellos de los 5 pacientes previamente reportados y los cuatro sujetos normales elegidos en edad y sexo produce un total de 15 pacientes y 14 sujetos normales que ahora se han estudiado en el sistema de cocultivos. En los experimentos mostrados en la Figura 19C, la HDL de 15 de estos 15 pacientes fue incapaz de proteger contra la actividad quimiotáctica de monocitos LDL-inducida, mientras que 14 de los 14 control tuvieron HDL que lo hizo.
Previamente, no hemos probado directamente la capacidad de la HDL de este subconjunto de pacientes de destruir la actividad biológica de PAPC oxidado. La Figura 19D demuestra que los pacientes (ninguno previamente reportado) tiene HDL que no pudiera inhibir la actividad biológica del PAPC oxidado (10 de 10 pacientes tuvieron HDL que no inhibió la actividad biológica del PAPC oxidado). Incluso, la HDL de los 10 pacientes en promedio incrementó la adherencia de monocitos Ox-PAPC-inducida a HAEC (Figura 19D). En contraste, la HDL de 10 de los 10 sujetos normales elegidos en edad y sexo disminuyó marcadamente la capacidad de Ox-PAPC de inducir la adherencia de monocitos a HAEC (Figura 19D). Tomados juntos estos datos indican que la HDL de este subconjunto de pacientes con enfermedad coronaria arterial parece defectuosa a pesar de sus niveles normales de colesterol-HDL en
plasma.
Discusión
Hemos demostrado en este ejemplo que la apo A-I y un mimético de la apo A-I fueron capaces de actuar directamente sobre las células humanas de pared arterial e influenciar profundamente su capacidad de oxidar la LDL (Figura 11 y Figura 12). En contraste, la apo A-II fue incapaz de evitar a las células humanas de pared arterial oxidar a la LDL (Figura 11). Similar al caso para la LDL (ver ejemplo 1), tratando a las células humanas de pared arterial con la HDL o la PON hicieron a las células de pared arterial incapaces de oxidar a la LDL (Figura 13). Estos experimentos indicaron que la HDL y sus enzimas asociadas pueden inhibir a las células humanas de pared arterial de contribuir las especies de oxígeno reactivas adicionales necesarias para que la LDL circulante alcance el límite crítico requerido para oxidar el PAPC a los fosfolípidos biológicamente activos.
Los datos en este ejemplo confirman un papel para los productos de las vías de la lipoxigenasa en las células de pared arterial en el segundo paso de la formación de la LDL ligeramente oxidada y concuerdan con los recientes hallazgos de Cyrus et al. que el trastorno del gen de lipoxigenasa 12/15 disminuye la ateroesclerosis en los ratones deficientes de apoE (Cyrus et al. (1999) J. Clin. Invest. 103: 1597-1604). Ellos concluyeron que varios mecanismos podrían explicar sus hallazgos pero favorecieron uno en el que "...los hidroperóxidos derivados de la lipoxigenasa o de especies de lípidos reactivos secundarios se pueden transferir a través de la membrana celular para ``sembrar'' la LDL extracelular, la cual podría entonces ser más susceptible a una variedad de mecanismos que podrían promover la peroxidación de lípidos".
La oxidación no enzimática de PAPC para formar los tres fosfolípidos biológicamente activos (POVPC, PGPC, y PEIPC) fue mayormente aumentada por el 13-HPODE y el 15- HPETE (Figura 15 y Figura 16). Incluso, la capacidad del 13-HPODE y el 15-HPETE para oxidar el PAPC a estos tres fosfolípidos biológicamente activos fue más de dos órdenes de magnitud más potente que aquel del peróxido de hidrógeno (Figura 16). Estos resultados concuerdan con los hallazgos de Montgomery, Nathan y Cohn (Montgomery et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6631-6635) quienes encontraron que la cantidad de peróxido de hidrógeno necesaria para producir la oxidación de la LDL fue dos órdenes de magnitud mayor que aquel producido por células endoteliales que oxidaron la LDL. La capacidad del 13-HPODE de estimular la formación no enzimática de hidroperóxido de linoleato de colesterilo (Ch18:2-OOH) (Figura 17) concuerda con los resultados de Stocker y colegas (Neuzil et al. (1998) Biochem. 37: 9203- 9210; Upston et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 30067-30074) y sugieren que los productos de la vía de la lipoxigenasa pueden ser centrales en la formación de una variedad de lípidos oxidados como lo hipotizó Cyrus et al. (1999) J. Clin. Invest. 103: 1597-1604.
Stocker y colegas (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6080-6087; Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095) también demostraron que ambas la apo A-I y la apo A-II pueden reducir hidroperóxidos de éster de colesterilo vía un mecanismo que involucra la oxidación de residuos específicos de metionina (Garner et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 6088-6095. En nuestros experimentos solo la apo A-I y no la apo A-II fue capaz de reducir la oxidación de la LDL después de la inyección en ratones (ver ejemplo 1). Además, solo la apo A-I y no l apo A-II fue capaz de disminuir la capacidad de las células humanas de pared arterial de oxidar la LDL (Figura 11).
La destrucción de la actividad biológica del Ox-PAPC y sus componentes (POVPC, PGPC, y PEIPC) por la PON (Figura 18) y por la HDL normal pero no por la HDL de pacientes con ateroesclerosis comprobada angiográficamente a pesar de los niveles normales de colesterol-HDL en plasma (Figura 19), sugiere que una anormalidad en la HDL puede ser la responsable, al menos en parte, para la ateroesclerosis en este subconjunto relativamente raro de pacientes. Un papel para la PON en la patogénesis de la ateroesclerosis se sugirió primero en el trabajo de Mackness y Durrington (Mackness et al. (1998) FEBS Let. 423: 57-60; Ayub et al. (1999) Arterioscler. Thromb. Vascul. Biol. 19: 330-335) y ha sido respaldado por el trabajo de un número de laboratorios incluyendo el nuestro (Shih et al. (1996) J. Clin. Invest. 97: 1630-1639; Shih et al. (1998) Nature 394: 284-287; Castellani et al. (1997) J. Clin. Invest. 100: 464-474). Informamos en este ejemplo que pacientes con lípidos normales con enfermedad coronaria arterial quienes no fueron diabéticos ni tenían medicación hipolipidémica tuvieron niveles significativamente mas bajos de actividad de PON comparados a los sujetos normales elegidos en edad y sexo (Figura 19A). Sin embargo, hubo coincidencias en las actividades de PON de los pacientes y los sujetos normales. En contraste, la HDL de 10 de los 10 pacientes falló en proteger la LDL control contra la oxidación por células humanas de pared arterial (Figura 19B) y falló en inhibir la actividad biológica del PAPC oxidado (Figura 19D) mientras que la HDL de 10 de los 10 sujetos normales elegidos en edad y sexo lo hizo. Estos hallazgos nos sugirieron que la diferencia en la HDL de pacientes y la HDL control no se puede explicar completamente por diferencias en la actividad de
PON.
Los datos presentados en este ejemplo y en el ejemplo 1 demuestran un papel para la HDL y sus componentes, la apo A-I, y la PON al regular cada paso en un proceso de tres pasos que conduce a la formación de la LDL ligeramente oxidada y de la cual se hace un diagrama en la Figura 20. Entendiendo los mecanismos de la formación de la LDL ligeramente oxidada y el papel de la HDL y sus componentes al evitar la formación e inhibir la actividad biológica de la LDL ligeramente oxidada puede conducir a nuevas estrategias terapéuticas para la prevención y tratamiento de ateroesclerosis y los síndromes clínicos que resultan de este proceso inflamatorio.
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Ejemplo 2 Revisión de Inmunoafinidad de la HDL
Las pruebas descritas aquí usan los siguientes materiales y protocolos:
Materiales y protocolos Preparación de anti-apo A-I humana en perlas de Sepharose 4B Materiales
La preparación de anti-apo A-I humana en perlas de Sepharose 4B usó el siguiente equipo y materiales: Sepharose 4B Bromuro de Cianógeno activada, 1 mM de HCl, Anti-apo A-I humana (Roche/BM), solución tampón de acoplamiento (500 mM de NaCl, 100 mM de NaHCO_{3}, pH 8,3), Labquake (agitador) y refrigerador a 4ºC, solución tampón de bloqueo 0,2 M de glicina, pH 8,0 (0,7507 g/50 ml + algunos granos de TRIS), solución tampón de lavado de acetato, 0,1 M, 0,5 M de NaCl, pH 4,0 (1,36 g de acetato de sodio, 2,9 g de NaCl, ácido acético a pH 4, 100 ml agua doblemente destilada), y una centrífuga.
Protocolo
Se dejan hinchar durante 15 min (cerca de 4,7 ml de perlas hinchadas) 1,35 g de Sepharose 4B Bromuro de Cianógeno activada Sigma C9142 que se combinaron con 45 ml de HCl 1 mM y entonces se lavaron con 300 ml de HCl 1 mM. Se agregan a 4,5 ml de solución tampón de acoplamiento 200 \mul de anti-apo A-I humana. Se combinaron las perlas lavadas y los anticuerpos en solución tampón de acoplamiento y se incubaron a 4ºC toda la noche con agitación por los extremos. Las perlas son granuladas (250 X g durante 5 min) y se aspiró el sobrenadante. Los sitios restantes se bloquearon al agregar 10 X volumen (45 ml) de 0,2 M de glicina por 2 h a temperatura ambiente con agitación.
Se elimina la solución tampón de bloqueo al lavar las perlas sobre un filtro de placa porosa. Se lavaron las perlas con la solución tampón de acoplamiento, seguido por la solución tampón de acetato y seguido por la solución tampón de acoplamiento. Se repitió el ciclo de lavado cuatro veces más para eliminar las proteínas no enlazadas. Se resuspendieron las perlas en solución salina 0,015 M, 20 mM de TRIS, 0,02% de NaN_{3}, pH 7,4, y se conservó
a 4ºC.
Prueba DCF de la HDL enriquecida por afinidad de inmunosorción de anti-apo A-I Materiales
La prueba DCF descrita aquí usa los siguientes materiales: DCF (10 mg H_{2}DCFDA (D-399, Molecular Probes, OR) en 5,0 ml de metanol recién abierto degasificado, alejado de la luz y almacenado a -20ºC), crioviales, un agitador, una incubadora a 37ºC, anti-apo A-I Sepharose 4B (como se describió antes), solución tampón para FPLC, lector de placas fluorescentes y placas, muestras de plasma, y estándares de plasma (HDL, plasma).
Protocolo
Se combinaron el plasma y las perlas de Sepharose (200 \mul de plasma humano por 1,0 ml de gel empacada en 2,0 ml de volumen final de anti-apo A-I de afinidad) y se incubó a 4ºC toda la noche (o 2 h a temperatura ambiente) con rotación por los extremos en 0,15 M de TRIS/solución salina, pH 7,4 + 0,02% de NaN_{3}. Se realizó un lavado con 0,015 M de Tris; 0,5 M de cloruro de sodio, pH 7,4 al diluir las perlas más el plasma a 15 ml y granular por centrifugación a 1500 rpm X 5 min a temperatura ambiente. Se resuspendieron las perlas con solución tampón para FPLC a 2,0 ml de volumen final (50% de perlas empacadas). Entonces se inyectaron 10 \mul (20 \mug) de solución tampón de almacenamiento de DCF usando una jeringa Hamilton por criovial excepto para los blancos y se evaporó bajo argón la DCF.
Se preparó una serie de diluciónes de las perlas como se indicó en la Tabla 1 en los crioviales contienendo DCF y vórtices.
TABLA 1 Series de dilución para la prueba
Tratamiento Dilución
1 1,0 ml de perlas (50% de volumen empaquetado)
2 500 \mul de perlas + 500 \mul de sol. tampón
3 250 \mul de perlas + 75 \mul de sol. tampón
4 125 \mul de perlas + 875 \mul de sol. tampón
5 63 \mul de perlas + 937 \mul de sol. tampón
6 32 \mul de perlas + 968 \mul de sol. tampón
7 16 \mul de perlas + 984 \mul de sol. tampón
Plasma estándar 1,3 \mul de plasma + 968 \mul de sol. tampón y agregado a un vial DCF-tratado
HDL estándar Combinar 25-50 \mug/ml de colesterol y 1,0 ml de sol. tampón de QS y agregar a un vial
DCF-tratado
Blanco 1,0 ml de sol. tampón en un vial no tratado (no DCF)
Se transfirieron 50 \mul usando orificio de boca ancha a las placas. Se incubaron las placas durante 4 horas a 37ºC con agitación moderada. Las placas se leyeron en el tiempo de 0, 1, 2, y 4 horas. Se leyeron los datos con el blanco restado. Debe haber inhibición de la fluorescencia en el suero y en la HDL control.
Aislamiento de la HDL por inmuno-afinidad
Los anticuerpos policlonales de la principal proteína de la HDL la apo A-I se unieron a perlas de Sepharose 4B CNBr-activadas. Se agregó plasma humano normal (200 \mul) a 1,0 ml de perlas de Sepharose apo A-I empacadas en 0,15 M Tris/salina, pH 7,4 + 0,002% de NaN_{3} y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. Se lavó entonces la mezcla con 0,015 M de Tris, 0,5 M de cloruro de sodio, pH 7,4 al diluir las perlas y el plasma a 15 ml y granular por centrifugación a 1500 rpm por 5 min a temperatura ambiente. Se resuspendió la pastilla con solución salina normal a 2,0 ml de volumen final (50% de perlas empacadas). Se empacó una alícuota en una pequeña columna y se eluyó la HDL usando una solución tampón de pH = 2,0. Se sometió la HDL a SDS-PAGE seguido por tinción con Azul Brillante de Coomassie (Figura 21). Además de los marcadores de peso molecular, el plasma inicial y la HDL purificada por inmuno afinidad, se incluyó la apo A-I purificada comercialmente disponible.
Inhibición de incremento en la fluorescencia de DCF
El anticuerpo policlonal de la principal proteína de la HDL la apoA-I se unió a perlas de Sepharose 4B CNBr activadas. Se agregó plasma humano normal (200 \mul) a 1,0 ml de perlas de Sepharose apo A-I empacadas en 0,15 M Tris/salina, pH 7,4 + 0,02% NaN_{3} y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. Se lavó entonces la mezcla con 0,015 M de Tris, 0,5 M de cloruro de sodio, pH 7,4 al diluir las perlas y el plasma a 15 ml y granular por centrifugación a 1500 rpm por 5 min a temperatura ambiente. Se resuspendieron los gránulos con solución salina normal a 2,0 ml de volumen final (50% de perlas empacadas). Se administró el DCF (10 \mul conteniendo 20 \mug) por criovial y se evaporó bajo argón. Se agregaron y evaporaron bajo argón 20 \mug por tubo de palmitoil-araquidonoil-fosforilcolina (PAPC) y 1,0 \mug por tubo del ácido 13(S)-hidroperoxididecaenoico (13(s)-HPODE). Esto fue seguido de la adición en un rango de concentración de la HDL unida a perlas de Sepharose o la adición de perlas tratadas con solución tampón únicamente. Se leyó la fluorescencia siguiendo 4 horas de incubación a temperatura ambiente. Los datos son la media \pmSD de las muestras por triplicado (Figura 22).
ID de secuencia No: 1
\vskip1.000000\baselineskip
DWL KAF YDK VAE KLK EAF PDW LKA FYD KVA EKL KEA F

Claims (27)

1. Un método de evaluar el riesgo de ateroesclerosis en un mamífero, dicho método comprendiendo:
poner en contacto una lipoproteína de alta densidad (HDL) contenida en una muestra biológica de dicho mamífero con un fosfolípido oxidado; y
medir un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde la ausencia de cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado indica que el mamífero tiene un riesgo de ateroesclerosis.
2. Un método de evaluar el riesgo de ateroesclerosis en un mamífero, dicho método comprendiendo:
poner en contacto una lipoproteína de alta densidad (HDL) contenida en una muestra biológica de dicho mamífero con un fosfolípido; sometiendo el fosfolípido a condiciones de oxidación; y midiendo un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado indica que el mamífero presenta riesgo de ateroesclerosis.
3. Un método de evaluar el riesgo para una patología inflamatoria crónica, dicho método comprendiendo:
poner en contacto una lipoproteína de alta densidad (HDL) contenida en una muestra biológica de dicho mamífero con un fosfolípido; y
medir un cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o no oxidado donde la ausencia de cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado indica que el mamífero presenta el riesgo de una patología inflamatoria crónica.
4. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 3, donde dicho fosfolípido oxidado es un fosfolípido oxidado que causa una reacción monocítica.
5. El método de la reivindicación 4, donde dicho fosfolípido es una forma oxidada de un lípido que se elige del grupo que consiste de 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina(Ox-PAPC), 1-palmitoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (POVPC), 1-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (PGPC), 1-palmitoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina(PEIPC), 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SAPC), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SOVPC), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SGPC), 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (SEIPC), 1-estearoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (Ox-SAPE), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina(SOVPE), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SGPE), y 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3- fosforiletanolamina (SEI PE).
6. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 3, donde dicho fosfolípido oxidado es un componente de una lipoproteína de baja densidad.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciónes 1 a 3, donde dicho detección comprende un método que se elige del grupo que consiste de espectrometría de masas, cromatografía de líquidos, cromatografía de capa fina, fluorimetría, detección de radioisótopos, detección de anticuerpos, y detectar una señal de un marcado que indica un fosfolípido oxidado.
8. El método de la reivindicación 7 cuando dependiendo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha detección comprende el detectar una señal de un marcado fluorescente.
9. El método de la reivindicación 8, donde dicho marcado se elige del grupo que consiste de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina, rodamina, ácido cis-parinarico, NBD, éster colesterilo del ácido cis-parinarico, y ácido propiónico difenilhexatrieno.
10. El método de la reivindicación 7 cuando dependiendo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicha detección comprende un método de cromatografía que se elige del grupo que consiste de cromatografía líquida de rápido desarrollo (FPLC).
11. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicha muestra biológica es sangre entera.
12. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicha muestra biológica es sangre fraccionada.
13. El método de la reivindicación 11 que comprende el aislamiento de la HDL de la muestra sanguínea.
14. El método de la reivindicación 1, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL que se sabe reduce los niveles de fosfolípido oxidado.
15. El método de la reivindicación 1, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido por poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL que se sabe es deficiente en la capacidad de reducir los niveles de fosfolípido oxidado.
16. El método de la reivindicación 1, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado producido al desarrollar el mismo experimento sin una HDL.
17. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho mamífero se elige del grupo que consiste de humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos, porcinos, y largomorphs.
18. El método de la reivindicación 17, donde dicho mamífero es un humano diagnosticado de tener una relación HDL:LDL baja.
19. El método de la reivindicación 17, donde dicho mamífero es un humano diagnosticado de tener riesgo de ateroesclerosis.
20. El método de la reivindicación 2, donde dicho fosfolípido es un fosfolípido en una lipoproteína de baja densidad (LDL).
21. El método de la reivindicación 2, donde dicho fosfolípido es un fosfolípido, que, cuando se oxida, causa una reacción monocítica.
22. El método de la reivindicación 21, donde dicho fosfolípido se elige del grupo que consiste de 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (Ox-PAPC), 1-palmitoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (POVPC), 1-palmitoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina(PGPC), 1-palmitoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (PEIPC), 1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SAPC), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforilcolina(SOVPC), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforilcolina (SGPC), 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforilcolina (SEIPC), 1-estearoil-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (Ox-SAPE), 1-estearoil-2-oxovaleroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SOVPE), 1-estearoil-2-glutaroil-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SGPE), y 1-estearoil-2-epoxiisoprostano-sn-glicero-3-fosforiletanolamina (SEI PE).
23. El método de la reivindicación 2, donde dicho sometimiento del fosfolípido a condiciones de oxidación comprende poner en contacto el fosfolípido con un agente del grupo que consiste de peróxido de hidrógeno, 13(S)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE, y HETE.
24. El método de la reivindicación 2, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con la HDL que se sabe reduce los niveles de fosfolípido oxidado.
25. El método de la reivindicación 2, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado producido al poner en contacto el fosfolípido oxidado con HDL que se sabe es deficiente en la capacidad de reducir los niveles de fosfolípido oxidado.
26. El método de la reivindicación 2, donde dicha medición comprende comparar dicho cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado con el cambio en la cantidad de fosfolípido oxidado o fosfolípido no oxidado producido por la misma prueba sin la HDL presente.
27. El método de la reivindicación 3, donde dicha patología se elige del grupo que consiste de artritis reumatoide, fibrosis pulmonar idiopática, y lupus.
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