JPWO2010018870A1 - 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2008年8月15日に、日本に出願された特願2008−209210号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
このように、動脈硬化の病変の診断に関する生化学的検査については多くの方法が示されているが、それらの検出マーカーはリスクマーカーがほとんどである。より本質的である動脈硬化の病変の特異的診断のためには、該病変を特異的に検出できるマーカーの更なる開発が望まれていた。
そこで本発明は、動脈硬化病変の検出の精度をさらに向上させることのできる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、動脈硬化診断用遺伝子マーカー、抗体、動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、動脈硬化マーカー遺伝子検出用DNAマイクロアレイ又はDNAチップ、及び動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キットを提供することを目的とする。
具体的な探索方法としては、病院、及び協力施設に入院した動脈硬化性病変罹患患者の血清を本人、又は家族の了解を得て下記のようにスクリーニングを行った。得られたcDNAクローンはプラスミドpBluescriptIIに組み込み塩基配列を決定した。その後プラスミドpGEXに組換えて大腸菌に導入し、IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside)により蛋白質を大量発現させて蛋白質抽出液を調製した。次いで、その蛋白質抽出液を96穴プレートに固相化し、動脈硬化患者群と、健常者群でELISA法により抗体血清レベルの測定を行い、その測定値より有意差を調べたところ、本発明のマーカーである13クローンについて、患者群と健常者群の間で有意差が見られた。さらに、蛋白質抽出液と多数の患者血清との反応をウェスタンブロット法により調べた。その結果、本発明のマーカーである5クローンが新たに動脈硬化病変罹患患者血清と陽性反応を示し動脈硬化性病変の存在、もしくは不安定性プラークの特異的マーカーとして有用であることを見い出した。そして、これらのクローンの抗原性や遺伝子のプローブを利用し、動脈硬化の検出方法を開発し、更には該検出方法に用いる診断キットの作製が可能となった。
[2][1]に記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーのアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列で示される遺伝子からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
[3]配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34もしくは36に示される塩基配列、又はその部分塩基配列で示される遺伝子からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
[6][3]に記載の遺伝子に対するアンチセンスDNAの全部又は一部を有する、[5]に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ。
[9][1]に記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを用い、被験体血中における、該動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体の発現を検出する動脈硬化の検出方法。
[10][5]又は[6]に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用い、被検細胞における、該動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブとハイブリダイズする遺伝子の発現を検出する動脈硬化の検出方法。
[12][5]又は[6]に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、[7]に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用DNAマイクロアレイ又はDNAチップ、及び[4]に記載の抗体からなる群から選択される少なくとも1つ以上を具備する動脈硬化診断用キット。
ここで、部分アミノ酸配列とは、前記配列表の各配列番号に示されるアミノ酸配列のうちの一部分の配列であり、4個以上、好ましくは5個以上、より好ましくは6個以上、更に好ましくは7個以上のアミノ酸からなる配列である。
また、部分塩基配列とは、前記配列表の各配列番号に示される塩基配列のうちの一部分の配列であり、12個以上、好ましくは15個以上、より好ましくは18個以上、更に好ましくは20個以上の塩基からなる配列である(以下、同じ。)。
前述の動脈硬化診断用遺伝子マーカーとなる遺伝子を表1にまとめる。
基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を用いることができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には基質として3,3’,5,5’−テトラメチルベンジシンを用いることができ、酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には基質としてパラニトロフェノールを用いることができる。
蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)やテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
これらの動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブは、適宜蛍光標識等の標識を付与しておいてもよい。
本発明の動脈硬化の検出方法は、前述の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを用い、被験体血中における、該動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体(動脈硬化マーカー抗体)の発現を検出する方法(以下、「検出方法(1)」という。)である。動脈硬化病変罹患患者から得られる被験体血中では、動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーとなるポリペプチドの発現により前記動脈硬化マーカー抗体が誘導されているため、動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーにより該動脈硬化マーカー抗体を検出することにより動脈硬化を検出することができる。
標識物質として酵素を用いる場合は、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、該基質の分解量を光学的に測定することにより酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値と比較することにより抗体量を算出することができる。あるいは酵素作用によって発光する基質を加え、微弱発光測定装置(ルミノメーター)で高感度に測定できる。
標識物質として放射性同位体を用いる場合は、該放射性同位体から発せられる放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することにより抗体量を算出することができる。標的物質として蛍光色素を用いる場合は、蛍光分光計を具備する測定装置等により蛍光量を測定することにより抗体量を算出することができる。
また、検出方法(2)では、該動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブが基板に固定化されたDNAマイクロアレイ又はDNAチップを用いてもよい。
このように、前記定量的又は半定量的PCRを行って動脈硬化マーカー遺伝子を増幅した後、その試料を用いて該動脈硬化マーカー遺伝子の発現の検出を行なうことにより、検出感度を向上させることができる。
検出方法(3)に用いる抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
また、本発明の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーについても、前述の動脈硬化の検出及び診断が行なえるような動脈硬化診断用キットとして製品化しておくことができる。
<製造例>
(試料の調製)
(1)病院及び研究協力施設を受診した頚動脈狭窄症患者を対象とし、外来受診者の中から性別・年齢(±5歳)を一致させ、正常被験者を基準(コントロール)として選択した。外来受診時又は脳神経外科入院時に、1)研究目的や研究協力の任意性等を家族に説明し、インフォームド・コンセントを得た上で、2)家族歴・既往歴・飲酒や喫煙等のライフスタイル、作業態様に関する問診を行い、3)採血を行って血清と血球成分を分離凍結保存した。さらに、4)医師の診療録を基に、臨床的重症度、治療経過、血液検査所見等を記載した。解析対象の患者血液は血清分離後マイナス80度にて研究開始まで凍結保存した。抗体及び診療録は暗号匿名化した後、使用した。
(2)血清によるスクリーニング対象は、ヒト毛細血管内皮由来のcDNAライブラリーを組み込んだ市販λZAP IIファージベクター(STRATAGENE)を用いた。
(3)発現クローニング法によるスクリーニングは、St John, T(Science, 231, 845-850, 1986)らの方法に準じて実施した。
1)上記(2)のファージベクターを大腸菌(XL1-Blue)に感染させ、NZYagar培地(φ15cm dish)上で培養した。
2)プラークが出現したのを確認後、IPTG処理したニトロセルロース膜を培地上に載せ、該ニトロセルロース膜にファージ由来蛋白質を発現、転写させた。
3)1%BSA/PBSで2000倍希釈した患者血清とニトロセルロース膜とを一夜インキュベートし、発現蛋白質と血清中抗体(血清IgG)を反応させた。
4)洗浄後、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトIgG抗体をニトロセルロース膜と反応させた。
5)発色試薬としてNBT(nitroblue terazolium)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)を用いて血清IgG認識クローンを同定した。
6)陽性クローンは二次、三次スクリーニング(φ10cm dish)を行い、偽陽性クローンを排除した。
7)選択されたファージをExAssist helper phage system(Stratagene, La Jolla, CA)によりpBlueScriptに変換した。
8)Plasmid Miniprep kit(Sigma)を用いプラスミドを精製した。
9)得られたクローンはシークエンサーにより塩基配列を決定し、公開されているデーターベースと相同性検索を行い、遺伝子を同定し、抗原蛋白質候補とした。
(4)二次スクリーニングとしてのELISA法
1)抗原蛋白質候補のインサートを含むpBluescriptの、蛋白質発現、精製用ベクターpGEX−4T(Amersham Bioscience)への組換えを行った。得られた塩基配列情報よりpBluescriptからpGEX−4Tへの組換えに適した制限酵素を選択し、BamH I, Sal I, Not I, EcoR I, Xho I, Sma Iなどの制限酵素により処理を行った。
2)アガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを精製キットGeneElute Minus EtBr Spin Columns(SIGMA)を用い切り出し、制限酵素処理されたインサート及びpGEX−4Tを回収した。
3)Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン)を用い、前記インサートとpGEX−4Tをライゲーションし、インサートを含むプラスミドを作製した。
4)クローンにより適当な制限酵素が存在しない場合には、PCR法によりインサートを作製した。あらかじめ制限酵素認識部位を持つプライマーを作製し、動脈瘤組織より抽出したRNAを鋳型に逆転写PCRを行ってcDNAを作製し、さらにPCRを行い全長のインサートを得た。以下は同様に制限酵素、ライゲーションキットによる処理を行った。
5)真核細胞蛋白質発現用に改良された大腸菌コンピテントセルBL21(ニッポンジーン)に、得られたpGEX−4Tの組換え体を形質転換した。
6)アンピシリン入りLB培地で培養し、IPTGでインサートDNA由来蛋白質の発現を誘導した。
7)大腸菌を遠心分離回収し、超音波破砕後、可溶画分と不溶画分に分離した。
8)目的蛋白質が不溶画分に入る場合は、尿素を用い可溶化を行った。
9)抗原蛋白質はglutathione-Sepharose(Amersham Pharmacia)を用いて精製した。
10)96穴ELISAプレートに10μg/mlの濃度で抗原蛋白質を注入し、一晩4℃で保存し、固相化させた。
11)PBS洗浄、10%ウシ胎児血清PBS溶液でブロッキング後、患者血清、及び対照血清(健常者の血清)を2000倍希釈し、固相化した蛋白質と反応させた。
12)PBS洗浄後、HRP標識ヤギ抗ヒトIgG抗体を加えた。
13)基質を加えて発色させ、プレートリーダーにてOD490nmの吸収を測定した。
(5)ウェスタンブロット法による二次スクリーニング
1)上記で得られた抗原蛋白質候補のインサートを含むpBluescript又はpGEX−4Tにより形質転換した大腸菌(SOLR、JM109、BL21)をLBアンピシリン(50μg/ml)2mlで1夜培養した。
2)LBアンピシリン20mlに移し換えた後、1時間培養後、IPTGを終濃度1mMとなるように加えたものと、コントロール(IPTGを加えないもの)とをさらに3時間培養した。
3)培養液を遠心後、大腸菌を回収し、SDSサンプルバッファーにて溶解、ウェスタン法のサンプルとした。
4)10%ポリアクリルアミドゲル上で前記サンプルを電気泳動後、転写装置でニトロセルロース膜に蛋白質を転写した。
5)1%スキムミルクでブロッキング後、2000倍希釈した患者血清を一次抗体として加え、1夜インキュベートした。
6)PBST(20 mM Tris-HCl, (pH 7.6), 50 mM NaCl, 0.1% Tween-20)で洗浄後、3万倍希釈HRP標識ヤギ抗ヒトIgG抗体を加え、20分間反応させた。
7)PBSTで洗浄後、発光試薬Immobilon Western(MILLIPORE)を用いて発光させた。
8)フィルムに露光させ現像した。
9)IPTG処理に依存して検出されるバンドを抗原蛋白質と推定した。
検出したクローンの遺伝子(動脈硬化診断用遺伝子マーカー)の塩基配列決定をシークエンシングにより行った。それにより得られた塩基配列を、公開されている遺伝子データーベース上の塩基配列と照合した結果、得られたクローンの遺伝子は、前記動脈硬化診断用ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列と一致した。
[ELISA法による抗体価の測定]
上記製造例の実験手順を用いて、検出した18種類のうち13種類のクローンの動脈硬化診断用遺伝子マーカー候補について、ELISA法による抗体価の測定を行い、動脈硬化患者における血清抗体の上昇を確認した。その測定結果を表2に示す。
[ウェスタンブロット法による動脈硬化マーカー遺伝子発現の確認]
上記発現クローニング法により同定されたマーカー候補遺伝子のうち実施例1で用いたものを除く5種のクローンについて、ウェスタンブロット法により、動脈硬化患者における動脈硬化マーカー遺伝子の発現を確認した。その検出結果(ウェスタンブロット法による陽性シグナル:図中の矢印)を図1に示す。図1(a)がクローン名:S16D2(配列表の配列番号22)、図1(b)がクローン名:S27D3(配列表の配列番号24)、図1(c)がクローン名:S36E1(配列表の配列番号26)、図1(d)がクローン名:S39D6(配列表の配列番号28)、図1(e)がクローン名:TS27B2(配列表の配列番号30)の結果を示したものである。
また、図1に示すように、本実施例のスクリーニングで得られた5種類については、ウェスタンブロット法により特異的反応陽性シグナルが確認された。
Claims (13)
- 配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33もしくは35に示されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー。
- 請求項1に記載のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列で示される遺伝子からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
- 配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34もしくは36に示される塩基配列、又はその部分塩基配列で示される遺伝子からなる動脈硬化診断用遺伝子マーカー。
- 請求項1に記載のポリペプチドを抗原とする、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 請求項2又は3に記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの全部又は一部を有する動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ。
- 請求項3に記載の遺伝子に対するアンチセンスDNAの全部又は一部を有する、請求項5に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ。
- 基板に、請求項5に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、及び/又は請求項6に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブが固定化された動脈硬化マーカー遺伝子検出用DNAマイクロアレイ又はDNAチップ。
- 請求項4に記載の抗体を用い、被検試料における、該抗体に特異的に結合する動脈硬化マーカーポリペプチドの発現を検出する動脈硬化の検出方法。
- 請求項1に記載の動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを用い、被験体血中における、該動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する動脈硬化マーカー抗体の発現を検出する動脈硬化の検出方法。
- 請求項5又は6に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用い、被検細胞における、該動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブとハイブリダイズする動脈硬化マーカー遺伝子の発現を検出する動脈硬化の検出方法。
- 配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34もしくは36に示される塩基配列に基づいてプライマーを構築し、該プライマーを用いてPCRを行い、動脈硬化マーカー遺伝子の発現を検出する動脈硬化の検出方法。
- 請求項5又は6に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブ、請求項7に記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用DNAマイクロアレイ又はDNAチップ、及び請求項4に記載の抗体からなる群から選択される少なくとも1つ以上を具備する動脈硬化診断用キット。
- 配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33もしくは35に示されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列で示されるポリペプチドからなる動脈硬化診断用ポリペプチドマーカーを具備する動脈硬化診断用キット。
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