JPH09203736A - 動脈硬化症診断薬 - Google Patents
動脈硬化症診断薬Info
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- JPH09203736A JPH09203736A JP1083096A JP1083096A JPH09203736A JP H09203736 A JPH09203736 A JP H09203736A JP 1083096 A JP1083096 A JP 1083096A JP 1083096 A JP1083096 A JP 1083096A JP H09203736 A JPH09203736 A JP H09203736A
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- JP
- Japan
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- ldl
- oxidation
- degree
- arteriosclerosis
- azo compound
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血漿中の低比重リポタンパク（ＬＤＬ）の酸
化変性度（被酸化度）を測定することによる動脈硬化症
診断薬を提供すること。 【構成】 Ｖ−７０〔2,2'-アゾビス（4-メトキシ-2,4-
ジメチルバレロニトリル）〕等のアゾ化合物からなる動
脈硬化症診断薬及び診断キット。 【効果】 本発明の診断薬及び診断キットを用いること
により、血漿中のＬＤＬの酸化変性の受けやすさ、ひい
ては動脈硬化症の発症の危険性及びその症状の軽重を短
時間で簡便、正確かつ安定的に診断できる。
化変性度（被酸化度）を測定することによる動脈硬化症
診断薬を提供すること。 【構成】 Ｖ−７０〔2,2'-アゾビス（4-メトキシ-2,4-
ジメチルバレロニトリル）〕等のアゾ化合物からなる動
脈硬化症診断薬及び診断キット。 【効果】 本発明の診断薬及び診断キットを用いること
により、血漿中のＬＤＬの酸化変性の受けやすさ、ひい
ては動脈硬化症の発症の危険性及びその症状の軽重を短
時間で簡便、正確かつ安定的に診断できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は動脈硬化症診断薬に関す
る。
る。
【０００２】
【従来の技術】動脈硬化症の発症、進行は、血液中の低
比重リポタンパク（ＬＤＬ）の酸化変性と関連すること
が知られている。したがって、ＬＤＬの酸化変性の受け
やすさ（以下、酸化変性度または被酸化性という）を測
定することにより、動脈硬化等の発症の危険性を判断し
たりその症状の軽重を診断することが可能となる。
比重リポタンパク（ＬＤＬ）の酸化変性と関連すること
が知られている。したがって、ＬＤＬの酸化変性の受け
やすさ（以下、酸化変性度または被酸化性という）を測
定することにより、動脈硬化等の発症の危険性を判断し
たりその症状の軽重を診断することが可能となる。
【０００３】酸化により変性したＬＤＬはマクロファー
ジなどにより処理されるので血液中に検知されることは
なく、ＬＤＬの酸化変性度を測定する唯一の方法は、試
験管内で、適当な酸化剤によりＬＤＬを強制的に酸化変
性させる方法である。
ジなどにより処理されるので血液中に検知されることは
なく、ＬＤＬの酸化変性度を測定する唯一の方法は、試
験管内で、適当な酸化剤によりＬＤＬを強制的に酸化変
性させる方法である。
【０００４】酸化ＬＤＬの測定には、これまでＣｕ2+に
よる酸化誘導で生成する共役ジエンを波長２３４ｎｍに
おける吸光度（Ａ234）で測定する方法が主として行わ
れてきたが、血液サンプルを予め透析する必要や酸化起
点（脂質ヒドロペルオキシドの生成起点）がはっきりし
ないなどの問題があった。
よる酸化誘導で生成する共役ジエンを波長２３４ｎｍに
おける吸光度（Ａ234）で測定する方法が主として行わ
れてきたが、血液サンプルを予め透析する必要や酸化起
点（脂質ヒドロペルオキシドの生成起点）がはっきりし
ないなどの問題があった。
【０００５】すなわち、採取した血液サンプルには凝血
防止のために必ずＥＤＴＡ等の抗凝血剤が添加されてい
るが、ＥＤＴＡはＣｕ2+とキレートすることにより、そ
の酸化活性を失わせる。これを防ぐためには血液サンプ
ルより調製したＬＤＬ中のＥＤＴＡを除くために２４〜
４８時間透析する必要があり、その間にＬＤＬの酸化変
性が進むため、Ｃｕ2+による酸化ではＬＤＬの酸化変性
の開始点が不明であり、酸化ＬＤＬの測定に支障をきた
していた。
防止のために必ずＥＤＴＡ等の抗凝血剤が添加されてい
るが、ＥＤＴＡはＣｕ2+とキレートすることにより、そ
の酸化活性を失わせる。これを防ぐためには血液サンプ
ルより調製したＬＤＬ中のＥＤＴＡを除くために２４〜
４８時間透析する必要があり、その間にＬＤＬの酸化変
性が進むため、Ｃｕ2+による酸化ではＬＤＬの酸化変性
の開始点が不明であり、酸化ＬＤＬの測定に支障をきた
していた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＬＤＬの酸化変性（被
酸化性）の程度を測定することは動脈硬化等の発症の危
険性を判断したりその症状の軽重を診断するに際して非
常に重要であるが、上記のように、未だ十分に満足でき
る方法が提供されておらず、簡便かつ安定な測定法の開
発が切望されていた。
酸化性）の程度を測定することは動脈硬化等の発症の危
険性を判断したりその症状の軽重を診断するに際して非
常に重要であるが、上記のように、未だ十分に満足でき
る方法が提供されておらず、簡便かつ安定な測定法の開
発が切望されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、重合開始剤
であるＶ−７０〔2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメ
チルバレロニトリル)〕等のアゾ化合物を用いてＬＤＬ
の酸化変性度（被酸化度）を測定することにより上記の
問題点が解消されることを見出し、本発明を完成させる
に至った。
であるＶ−７０〔2,2'-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメ
チルバレロニトリル)〕等のアゾ化合物を用いてＬＤＬ
の酸化変性度（被酸化度）を測定することにより上記の
問題点が解消されることを見出し、本発明を完成させる
に至った。
【０００８】すなわち、本発明はアゾ化合物からなる動
脈硬化症診断薬と診断キットを提供するものであり、ア
ゾ化合物を用いて血液サンプル中のＬＤＬの酸化変性度
（被酸化度）を測定することにより、動脈硬化症の軽重
を診断することができる。アゾ化合物の酸化力は凝血防
止に用いるＥＤＴＡによる妨害を受けないので、ＬＤＬ
を含む血液サンプルからＥＤＴＡを除くための長時間の
透析は不要となり、短時間かつ簡便にＬＤＬの酸化変性
度（被酸化度）を測定することができる。また、アゾ化
合物によるＬＤＬの酸化変性の開始点はきわめて明瞭で
あるので、正確で安定した測定法でもある。
脈硬化症診断薬と診断キットを提供するものであり、ア
ゾ化合物を用いて血液サンプル中のＬＤＬの酸化変性度
（被酸化度）を測定することにより、動脈硬化症の軽重
を診断することができる。アゾ化合物の酸化力は凝血防
止に用いるＥＤＴＡによる妨害を受けないので、ＬＤＬ
を含む血液サンプルからＥＤＴＡを除くための長時間の
透析は不要となり、短時間かつ簡便にＬＤＬの酸化変性
度（被酸化度）を測定することができる。また、アゾ化
合物によるＬＤＬの酸化変性の開始点はきわめて明瞭で
あるので、正確で安定した測定法でもある。
【０００９】ＬＤＬ酸化変性度（被酸化度）の測定は、
動脈硬化症の診断をすべき被検者から採取した血液サン
プルについて行う。好ましくは、血液サンプルから得ら
れる血漿より超遠心法にてＬＤＬを含む画分を調製す
る。ＬＤＬ画分の調製は、例えば講談社刊医科学大辞典
（１９８４）の「リポタンパク質定量」の項の記載に従
って行う。この画分を、適当な緩衝液、例えばｐＨ６〜
８のリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かした後、
インキュベートしてＬＤＬを強制酸化させる。この酸化
反応によりアゾ化合物から生成する共役ジエンを測定す
る。具体的には、共役ジエンによる２３４ｎｍ付近にお
ける吸光度（Ａ234）を経時的に測定して、アゾ化合物
添加後に共役ジエンの生成が開始されるまでの潜伏時間
（lag time）を記録し、潜伏時間の長短によりＬＤＬ酸
化変性の程度を測定する。潜伏時間が短いほどＬＤＬ酸
化変性度が大きく、したがって被験者の動脈硬化が進行
していると診断される。潜伏時間の代わりに、一定時間
のインキュベート後に測定される吸光度の大小から、動
脈硬化の程度を調べてもよい。
動脈硬化症の診断をすべき被検者から採取した血液サン
プルについて行う。好ましくは、血液サンプルから得ら
れる血漿より超遠心法にてＬＤＬを含む画分を調製す
る。ＬＤＬ画分の調製は、例えば講談社刊医科学大辞典
（１９８４）の「リポタンパク質定量」の項の記載に従
って行う。この画分を、適当な緩衝液、例えばｐＨ６〜
８のリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かした後、
インキュベートしてＬＤＬを強制酸化させる。この酸化
反応によりアゾ化合物から生成する共役ジエンを測定す
る。具体的には、共役ジエンによる２３４ｎｍ付近にお
ける吸光度（Ａ234）を経時的に測定して、アゾ化合物
添加後に共役ジエンの生成が開始されるまでの潜伏時間
（lag time）を記録し、潜伏時間の長短によりＬＤＬ酸
化変性の程度を測定する。潜伏時間が短いほどＬＤＬ酸
化変性度が大きく、したがって被験者の動脈硬化が進行
していると診断される。潜伏時間の代わりに、一定時間
のインキュベート後に測定される吸光度の大小から、動
脈硬化の程度を調べてもよい。
【００１０】ＬＤＬの強制酸化のインキュベート温度は
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＬＤＬの強
制酸化に用いるアゾ化合物としては、Ｖ−４０〔1,1'-
アゾビス（シクロヘキサン-1-カルボニトリル）〔和光
純薬工業株式会社から市販されている。以下のアゾ化合
物も同様〕、Ｖ−５０〔2,2'-アゾビス（2-アミジノプ
ロパン）二塩酸塩、ＡＡＰＨ〕、Ｖ−６０〔2,2'-アゾ
ビスイソブチロニトリル、ＡＩＢＮ〕、Ｖ−７０〔2,2'
-アゾビス（4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリ
ル）〕などが挙げられるが、好適なものはＶ−７０であ
る。
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＬＤＬの強
制酸化に用いるアゾ化合物としては、Ｖ−４０〔1,1'-
アゾビス（シクロヘキサン-1-カルボニトリル）〔和光
純薬工業株式会社から市販されている。以下のアゾ化合
物も同様〕、Ｖ−５０〔2,2'-アゾビス（2-アミジノプ
ロパン）二塩酸塩、ＡＡＰＨ〕、Ｖ−６０〔2,2'-アゾ
ビスイソブチロニトリル、ＡＩＢＮ〕、Ｖ−７０〔2,2'
-アゾビス（4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリ
ル）〕などが挙げられるが、好適なものはＶ−７０であ
る。
【００１１】測定に供するＬＤＬ画分は、タンパク濃度
にして１０〜５００μｇ／ｍｌの範囲が望ましいが、好
適にはタンパク濃度にして７０μｇ／ｍｌとなるようリ
ン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。タンパク
濃度は、例えばＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社）で測定して
適当に調節する。アゾ化合物の濃度は終濃度で５０〜
１，０００μＭが好ましいが、より好ましくは５０〜２
００μＭ、最も好適には１００μＭである。ＬＤＬ濃度
がタンパク濃度にして７０μｇ／ｍｌ、Ｖ−７０の終濃
度４０ｍＭ、酸化のインキュベート温度３７℃の場合の
潜伏時間測定値の同時再現性はＣ．Ｖ．で１．８〜３．
８％であり極めて良好である。
にして１０〜５００μｇ／ｍｌの範囲が望ましいが、好
適にはタンパク濃度にして７０μｇ／ｍｌとなるようリ
ン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈する。タンパク
濃度は、例えばＢＣＡ法（ＰＩＥＲＣＥ社）で測定して
適当に調節する。アゾ化合物の濃度は終濃度で５０〜
１，０００μＭが好ましいが、より好ましくは５０〜２
００μＭ、最も好適には１００μＭである。ＬＤＬ濃度
がタンパク濃度にして７０μｇ／ｍｌ、Ｖ−７０の終濃
度４０ｍＭ、酸化のインキュベート温度３７℃の場合の
潜伏時間測定値の同時再現性はＣ．Ｖ．で１．８〜３．
８％であり極めて良好である。
【００１２】ＬＤＬの酸化変性度をより簡便に測定する
ために、本発明はアゾ化合物と適当な緩衝液を含むＬＤ
Ｌ酸化変性度測定用キットを提供する。
ために、本発明はアゾ化合物と適当な緩衝液を含むＬＤ
Ｌ酸化変性度測定用キットを提供する。
【００１３】本発明のＬＤＬ酸化変性度測定用キット
は、具体的には、ほとんど白色の結晶性粉末であるアゾ
化合物１〜５ｇとこれを溶かすためのエタノール等のア
ルコール１００〜２００ml、ｐＨ６〜８のリン酸緩衝液
生理食塩水（ＰＢＳ） ２００〜５００mlおよびＬＤＬ
調製用の密度１．００６の食塩水と食塩−臭化ナトリウ
ム液それぞれ２００〜５００mlからなる。必要に応じて
９６穴プレートが付け加わる。
は、具体的には、ほとんど白色の結晶性粉末であるアゾ
化合物１〜５ｇとこれを溶かすためのエタノール等のア
ルコール１００〜２００ml、ｐＨ６〜８のリン酸緩衝液
生理食塩水（ＰＢＳ） ２００〜５００mlおよびＬＤＬ
調製用の密度１．００６の食塩水と食塩−臭化ナトリウ
ム液それぞれ２００〜５００mlからなる。必要に応じて
９６穴プレートが付け加わる。
【００１４】アゾ化合物を含むことを特徴とする本発明
のＬＤＬ酸化変性度（被酸化度）、ひいては動脈硬化等
の発症の危険性診断薬は診断学的に許容できる担体とア
ゾ化合物を製剤化することにより得られる。
のＬＤＬ酸化変性度（被酸化度）、ひいては動脈硬化等
の発症の危険性診断薬は診断学的に許容できる担体とア
ゾ化合物を製剤化することにより得られる。
【００１５】
【発明の効果】本発明のアゾ化合物からなる動脈硬化症
診断薬と診断キットを用いることにより、ＬＤＬの酸化
変性の受けやすさ、ひいては動脈硬化の発症の危険性と
その症状の軽重を短時間で簡便、正確かつ安定的に測定
／診断できる。
診断薬と診断キットを用いることにより、ＬＤＬの酸化
変性の受けやすさ、ひいては動脈硬化の発症の危険性と
その症状の軽重を短時間で簡便、正確かつ安定的に測定
／診断できる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１７】実 施 例 １：Ｖ−７０終濃度によるＬ
ＤＬ酸化変性度（被酸化度）の違い 健常者の血漿より超遠心法にてＬＤＬを含む画分を調製
し、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に７０μｇタン
パク／ｍｌとなるように溶かした後、Ｖ−７０を終濃度
で１００、２００、４００μＭ加えて３７℃でインキュ
ベートし、ベックマンＤＵ−６５０型分光光度計で共役
ジエンによる２３４ｎｍにおける吸光度（Ａ234）を経
時的に測定して、アゾ化合物添加後に共役ジエンの生成
が開始されるまでの潜伏時間（lag time）を記録した。
なお、ＬＤＬを含む画分のタンパク量はＢＣＡ法（ＰＩ
ＥＲＣＥ社）により測定した。図１に示すようにＶ−７
０の終濃度が低いほど、潜伏時間（lag time）が長くな
った。動脈硬化症患者の場合は潜伏時間が短くなる。
ＤＬ酸化変性度（被酸化度）の違い 健常者の血漿より超遠心法にてＬＤＬを含む画分を調製
し、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に７０μｇタン
パク／ｍｌとなるように溶かした後、Ｖ−７０を終濃度
で１００、２００、４００μＭ加えて３７℃でインキュ
ベートし、ベックマンＤＵ−６５０型分光光度計で共役
ジエンによる２３４ｎｍにおける吸光度（Ａ234）を経
時的に測定して、アゾ化合物添加後に共役ジエンの生成
が開始されるまでの潜伏時間（lag time）を記録した。
なお、ＬＤＬを含む画分のタンパク量はＢＣＡ法（ＰＩ
ＥＲＣＥ社）により測定した。図１に示すようにＶ−７
０の終濃度が低いほど、潜伏時間（lag time）が長くな
った。動脈硬化症患者の場合は潜伏時間が短くなる。
【００１８】実 施 例 ２：Ｖ−７０によるＬＤＬ酸
化変性における潜伏時間（lag time）のばらつき 実施例１のＬＤＬ溶液にＶ−７０を最終濃度で１００μ
Ｍ加えて３７℃でインキュベートし、共役ジエン生成ま
での潜伏時間（lag time）を記録したところ、そのＣＶ
は表１に示すように同時再現性が１．８〜３．８％、日
差再現性が１．６〜２．８％であった。
化変性における潜伏時間（lag time）のばらつき 実施例１のＬＤＬ溶液にＶ−７０を最終濃度で１００μ
Ｍ加えて３７℃でインキュベートし、共役ジエン生成ま
での潜伏時間（lag time）を記録したところ、そのＣＶ
は表１に示すように同時再現性が１．８〜３．８％、日
差再現性が１．６〜２．８％であった。
【００１９】
【表１】 表 １ -------------------------------------------------- サンプル Ｎ 平均±標準偏差（分） ＣＶ（％） -------------------------------------------------- 同時再現性 -------------------------------------------------- Ａ ４ ４１．８±１．６ ３．８ Ｂ ５ ８７．８±１．６ １．８ -------------------------------------------------- 日差再現性 -------------------------------------------------- Ａ ３ ５１．４±１．４ ２．８ Ｂ ３ ８４．５±１．４ １．６ --------------------------------------------------
【００２０】実 施 例 ３：ＬＤＬ酸化変性度による
冠動脈硬化症の診断 軽症から重症の冠動脈硬化症患者１６名について、実施
例１と同様にして潜伏時間（lag time）を求め、既報
〔Hamsten A et al.: Circulation 73,1097-1110(198
6)〕に従って算出した総冠動脈硬化値との相関をみたと
ころ、両者は表２及び図２に示すように負の相関を示し
た（γ＝−０．９２；ｐ＜０．０２）。
冠動脈硬化症の診断 軽症から重症の冠動脈硬化症患者１６名について、実施
例１と同様にして潜伏時間（lag time）を求め、既報
〔Hamsten A et al.: Circulation 73,1097-1110(198
6)〕に従って算出した総冠動脈硬化値との相関をみたと
ころ、両者は表２及び図２に示すように負の相関を示し
た（γ＝−０．９２；ｐ＜０．０２）。
【００２１】
【表２】 表 ２ -------------------------------------------------- 被験者 ＬＤＬ被酸化性 総冠動脈硬化値 潜伏時間（lag time、分） -------------------------------------------------- ａ ６２ ３．０ ｂ １０５ ０．１ ｃ ７４ ３．１ ｄ ７１ ４．１ ｅ ９５ ０．５ ｆ ８７ １．５ ｇ ６６ ３．９ ｈ ７０ ２．７ ｉ ５９ ４．２ ｊ ６５ ２．４ ｋ ９２ ０．５ ｌ ７９ ２．６ ｍ ６１ ４．１ ｎ ４３ ４．９ ｏ ７０ ２．５ ｐ ７０ ３．０ --------------------------------------------------
【図１】Ｖ−７０終濃度がＬＤＬ酸化変性度の測定にお
ける潜伏時間に及ぼす影響を示すグラフである。
ける潜伏時間に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】表２の結果を図示するグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｖ−７０〔2,2'-アゾビス(4-メトキシ-
2,4-ジメチルバレロニトリル)〕を酸化剤として含む、
動脈硬化症診断用キット。 - 【請求項２】 血液サンプルおよびＶ−７０を溶解する
ための同一または別々の溶媒、および／または測定標準
物質も含む、請求項１のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083096A JPH09203736A (ja) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | 動脈硬化症診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1083096A JPH09203736A (ja) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | 動脈硬化症診断薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09203736A true JPH09203736A (ja) | 1997-08-05 |
Family
ID=11761285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1083096A Pending JPH09203736A (ja) | 1996-01-25 | 1996-01-25 | 動脈硬化症診断薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09203736A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010018870A1 (ja) | 2008-08-15 | 2010-02-18 | 藤倉化成株式会社 | 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット |
-
1996
- 1996-01-25 JP JP1083096A patent/JPH09203736A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010018870A1 (ja) | 2008-08-15 | 2010-02-18 | 藤倉化成株式会社 | 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット |
| EP3021121A1 (en) | 2008-08-15 | 2016-05-18 | Fujikura Kasei Co., Ltd. | Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis |
| US9366681B2 (en) | 2008-08-15 | 2016-06-14 | Fujikura Kasei Co., Ltd. | Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis |
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