ES2321197T3 - Fosforilacion de proteinas en rutas de señalizacion de c-src. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en rutas de señalización de c-Src quinasa, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar la proteína de señalización relacionada con c-Src para Rab 7 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 183: (i) un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a dicha proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina 183, comprendida dentro de la secuencia de sitio de fosforilación SEC ID Nº: 64, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o (ii) un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de dicha proteína, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia de sitio de fosforilación SEC ID Nº: 64, que comprende la tirosina fosforilada 183.

Description

Fosforilación de proteína en rutas de señalización de c-Src.

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a anticuerpos y reactivos peptídicos para la detección de fosforilación de proteína y a fosforilación de proteína en cáncer.

Antecedentes de la invención

La activación de proteínas por modificación post-traduccional representa un mecanismo celular importante para regular la mayoría de los aspectos de organización y control biológico, que incluyen crecimiento, desarrollo, homeostasis y comunicación celular. Por ejemplo, la fosforilación de proteína desempeña un papel crítico en la etiología de muchas afecciones y estados patológicos, que incluyen cáncer, trastornos del desarrollo, enfermedades autoinmunes y diabetes. A pesar de la importancia de la modificación de proteína, todavía no se comprende bien a nivel molecular. Las razones de esta carencia de comprensión son, en primer lugar, que el sistema de modificación celular es extraordinariamente complejo y, en segundo lugar, que la tecnología necesaria para desenmarañar su complejidad hasta ahora no se ha desarrollado completamente.

La complejidad de modificación de proteína, que incluye fosforilación, en una escala amplia de proteoma, se produce por tres factores: el gran número de proteínas de modificación, por ejemplo, quinasas, codificadas en el genoma, el número mucho mayor de sitios en proteínas de sustrato que se modifican por estas enzimas y la naturaleza dinámica de la expresión de proteína durante crecimiento, desarrollo, estados patológicos y envejecimiento. El genoma humano codifica, por ejemplo, más de 520 proteína quinasas diferentes, haciendo que las mismas sean la clase más abundante de enzimas conocidas. Véase Hunter, Nature 411: 355-65 (2001). Cada una de estas quinasas fosforila específicamente restos de serina, treonina o tirosina localizados dentro de distintas secuencias de aminoácidos, o motivos, contenidos dentro de diferentes sustratos de proteína. La mayoría de las quinasas fosforilan muchas proteínas diferentes: se estima que un tercio de todas las proteínas codificadas por el genoma humano están fosforiladas y que muchas se fosforilan en múltiples sitios por diferentes quinasas. Véase Graves et al. Pharmacol. Ther. 82: 111-21 (1999).

Muchos de estos sitios de fosforilación regulan procesos biológicos críticos y se puede probar que son importantes dianas de diagnóstico o terapéuticas para medicina molecular. Por ejemplo, de los más de 100 oncogenes dominantes identificados hasta la fecha, 46 son proteína quinasas. Véase Hunter, anteriormente. Las quinasas oncogénicas tales como ErbB2 y Jak3, ampliamente expresadas en tumores de mama y diversas leucemias, respectivamente, transforman células en el fenotipo oncogénico al menos en parte debido a su capacidad de fosforilar proteínas celulares. La comprensión de qué proteínas están modificadas por estas quinasas expandirá en gran medida la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la transformación oncogénica. Por tanto, la capacidad para identificar sitios de modificación, por ejemplo, sitios de fosforilación, en una amplia diversidad de proteínas celulares es importante de forma crucial para comprender las proteínas de señalización clave y las rutas implicadas en la progresión de enfermedad, por ejemplo, cáncer.

Se ha ayudado a la identificación eficaz de sitios de fosforilación de proteína pertinentes a enfermedad por el desarrollo reciente de una nueva clase potente de anticuerpos, denominados anticuerpos específicos de motivo, independientes de contexto, que son capaces de unirse específicamente a motivos cortos de señalización recurrentes que comprenden uno o más aminoácidos modificados (por ejemplo, fosforilados) en muchas proteínas diferentes en las que se repite el motivo. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.441.140, Comb et al. Muchos de estos nuevos anticuerpos potentes están ahora disponibles en el mercado. Véase CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC Catálogo 2003-04. Más recientemente se ha descrito un nuevo método potente para emplear tales anticuerpos específicos de motivo en técnicas de inmunoafinidad acoplados con análisis de espectrometría de masas para identificar de forma rápida péptidos modificados de mezclas biológicas complejas. Véase la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20030044848, Rush et al.). Tales técnicas permitirán la elucidación rápida de acontecimientos de activación y fosforilación de proteína que subyacen a enfermedades; como cáncer, que se dirigen por alteraciones en la transducción de señal.

La c-Src humana, una tirosina quinasa no receptor, es una de tales moléculas de señalización que está sobre-expresada y activada en gran número de cánceres humanos. Se ha demostrado la actividad de c-Src aumentada en una diversidad de cánceres humanos, incluyendo de mama, colon, pancreático, ovárico, pulmonar, esofágico y neural. Véase, por ejemplo, Yeatman, Nature Reviews 4: 470-480 (2004); Irby et al. Oncogene 19: 5636-642 (2000). Además de su papel en la regulación de proliferación celular, c-Src, contribuye a potencial metastásico de etapa tardía de células mediante efectos sobre adhesión, invasión y motilidad. Véase, por ejemplo, Yeatman anteriormente.

La actividad de c-Src quinasa humana se regula mediante fosforilación de dos restos de tirosina críticos, Tyr419 y Tyr530. Se requiere la autofosforilación en Tyr419 en el dominio de quinasa SH1 para la actividad de c-Src completa. La Tyr530 en la cola C-terminal está implicada en la regulación negativa de c-Src. La fosforilación de Tyr530 conduce a un cambio conformacional que implica la unión C-terminal al dominio SH2, que da como resultado acceso a sustrato disminuido al dominio de quinasa catalítico y, por tanto, actividad de c-Src reducida. Véase Yeatman, anteriormente; Irby et al., anteriormente. En consecuencia, las fosfatasas que desfosforilan c-Src en el sitio Tyr530 regulador pueden activar esta quinasa incluso a niveles de expresión normales.

Se conoce que c-Src se puede activar mediante varias tirosina quinasas de receptor cadena arriba, que incluyen EGFR, PDGFR, ERBB2 y FGFR, entre otros, y las interacciones con estos receptores activados por ligando pueden conducir a activación de c-Src sinérgica. Adicionalmente se han identificado varias dianas de proteína de señalización cadena abajo de c-Src activada como implicadas potencialmente en la mediación de transformación celular, que incluyen FAK (por sí misma una tirosina quinasa no receptor implicada en la regulación de la progresión del ciclo celular, supervivencia y migración), p190 RhoGAP, p120 RasGAP y cortactina, cuya asociación con y/o fosforilación por c-Src conduce a desensamblaje de adhesión celular. Véase Yeatman, anteriormente; Irby et al., anteriormente. ERK también es una diana de señalización de c-Src/FAK y su fosforilación da como resultado la activación de MLCK, que contribuye a desensamblaje de adhesión. Véase Yeatman, anteriormente. Se conoce que c-Src activada activa el factor de transcripción, STAT3. Véase Irby et al., anteriormente. También se cree que la activación de c-Src afecta a la función de metaloproteinasa y, por tanto, al potencial invasivo de células, por la ruta de señalización de c-JUN quinasa. La c-Src también induce la actividad de VEGF, que conduce a angiogénesis aumentada. Véase Irby et al, anteriormente.

Sin embargo, a pesar de la identificación de algunas de las dianas cadena abajo de c-Src, los mecanismos moleculares que contribuyen a oncogénesis mediada por c-Src en una diversidad de cánceres humanos permanecen sin comprenderse de forma completa. Véase Yeatman, anteriormente. De hecho, mientras que recientemente ha aumentado el interés en c-Src como una diana terapéutica -Wyeth (SKI-606), Sugen (SU6656), y Ariad Pharmaceuticals (AP23464 y AP 23451) tienen cada uno inhibidores de c-Src en experimentos pre-clínicos o clínicos de Fase I- la eficacia, el mecanismo de acción y la utilidad clínica de estos compuestos en la mediación de efectos moleculares cadena abajo de c-Src todavía se tienen que observar.

La proteína Rab7 no se ha identificado como posiblemente implicada en las rutas de señalización de c-Src quinasa hasta ahora. Vitelli et al Biochem Biophys Res Comm 229(3): 887-890 (1996) y Basrur et al J Proteome Res 2(1): 69-79 (2003) mencionan ambos Rab7, pero todavía no se pronuncian con respecto a fosforilación y una vinculación con c-Src.

Se han descrito unos pocos sitios de fosforilación de tirosina en proteínas de señalización cadena abajo de c-Src que incluyen la tirosina quinasa no receptor FAK, las proteínas adaptadoras p130 CAS y Sam68, la proteína de unión a actina cortactina, la proteína de unión a fosfolípido anexina A2 y la proteína de interacción con STAM Hrs. Véase Calalb et al., Mol. Cell. Biol. 15: 954-963 (1995); Belsches et al. Front. Biosci. 2: d501-518 (1997); Bache et al. Eur. J. Biochem 269: 3881-3887 (1997); Schaller et al., Mol. Cell. Biol. 14: 1680-1688 (1994); Shen et al. Oncogene 18: 4647-4653 (1999). Sin embargo, el pequeño número de sitios de fosforilación relacionados con la ruta de señalización de c-Src que se han identificado hasta la fecha no facilitan una comprensión completa y precisa de cómo la activación de proteína cadena abajo de c-Src dirige el progreso de cánceres en los que esta quinasa está activada.

En consecuencia, existe una necesidad continua de desenmarañar los mecanismos moleculares de oncogénesis dirigida por c-Src identificando las proteínas de señalización cadena abajo que median en la transformación celular en enfermedades que implican c-Src activada. La identificación de sitios de fosforilación particulares en tales proteínas de señalización y la proporción de nuevos reactivos, tales como anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA, para detectar y cuantificar los mismos sigue siendo particularmente importante para avanzar en la comprensión de la biología de estos cánceres.

Actualmente, un puñado de compuestos dirigidos a c-Src están en o están comenzando experimentos clínicos para el tratamiento de cáncer. Aunque se puede detectar la activación y/o expresión de la propia c-Src, es evidente que todavía se tienen que elucidar otros efectores cadena abajo de señalización de c-Src, que tengan valor diagnóstico, predictivo o terapéutico. En consecuencia, la identificación de moléculas de señalización cadena abajo y sitios de fosforilación implicados en la progresión de cánceres dirigidos por c-Src y el desarrollo de nuevos reactivos para detectar y cuantificar estos sitios y proteínas puede conducir a marcadores de diagnóstico/pronóstico mejorados, así como a nuevas dianas farmacológicas, para la detección y el tratamiento de estas enfermedades.

Sumario de la invención

La memoria descriptiva describe 102 sitios de fosforilación novedosos identificados en proteínas y rutas de transducción de señal cadena abajo de c-Src y proporciona nuevos reactivos, que incluyen anticuerpos específicos de sitio de fosforilación y péptidos AQUA, para la detección y cuantificación selectivas de estos sitios/proteínas fosforilados. También se proporcionan métodos para el uso de los reactivos de la invención para la detección y cuantificación de los sitios de fosforilación descritos.

Específicamente, un aspecto de la invención proporciona un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en rutas de señalización de c-Src quinasa, comprendiendo el método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar una o más de las proteínas de señalización relacionadas con c-Src correspondientes a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando están fosforiladas en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1: un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a la proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida dentro de la secuencia de sitio de fosforilación de la SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde el anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la calificación de la proteína, comprendiendo el péptido marcado la secuencia de sitio de fosforilación SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, que comprende la tirosina fosforilada indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización relacionada con c-Src humana que se corresponde a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida dentro de la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde el anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina.

Otro aspecto de la invención proporciona una línea celular inmortalizada que produce un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización relacionada con c-Src humana que se corresponde a la Fila 65 de la Columna A de Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida dentro de la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde el anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina. Opcionalmente, la línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

Otro aspecto de la invención proporciona un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización relacionada con c-Src humana correspondiente a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, secuencia que comprende la tirosina fosforilable indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 - Es un diagrama que ilustra en líneas generales la metodología de aislamiento por inmunoafinidad y caracterización por espectrometría de masas (IAP) empleada para identificar los sitios de fosforilación novedosos descritos en este documento.

Fig. 2 - Es una tabla (correspondiente a la Tabla 1) que enumera los sitios de fosforilación de proteína de señalización c-Src descritos en este documento: Columna A = el nombre abreviado de la proteína precursora; Columna B = el nombre completo de la proteína precursora; Columna C = el número de acceso a SwissProt para la proteína (secuencia humana); Columna D = el tipo/clasificación de proteína; Columna F = el resto (en la secuencia de aminoácidos de proteína precursora) en el que tiene lugar la fosforilación dentro del sitio de fosforilación; y Columna G = la secuencia de sitio de fosforilación que incluye el resto fosforilable; (resto en el que tiene lugar la fosforilación (y correspondiente a la entrada respectiva en la Columna F) aparece en minúscula.

Fig. 3 - Es un espectrograma de masas ejemplar que ilustra la detección del sitio de fosforilación de tirosina 251 en CrkL (véase la Fila 15 en la Figura 2/Tabla 1), como se describe además en el Ejemplo 1 (iones de indicación rojos y azules detectados en espectro EM/EM).

Fig. 4 - Es un espectrograma de masas ejemplar que ilustra la detección del sitio de fosforilación de tirosina 35 en RIN1 (véase Fila 72 en la Figura 2/Tabla 1), como se describe además en el Ejemplo 1 (iones de indicación rojos y azules detectados en espectro EM/EM).

Fig. 5 - Es un espectrograma de masas ejemplar que ilustra la detección del sitio de fosforilación de tirosina 217 en catenina delta-1 (véase Fila 3 en la Figura 2/Tabla 1), como se describe además en el Ejemplo 1 (iones de indicación rojos y azules detectados en espectro EM/EM).

Fig. 6 - Es un espectrograma de masas ejemplar que ilustra la detección del sitio de fosforilación de tirosina 954 en MRCK beta (véase Fila 80 en la Figura 2/Tabla 1), como se describe además en el Ejemplo 1 (iones de indicación rojos y azules detectados en espectro EM/EM).

Fig. 7 - Es un espectrograma de masas ejemplar que ilustra la detección del sitio de fosforilación de tirosina 113 en Shb (véase Fila 29 en la Figura 2/Tabla 1), como se describe además en el Ejemplo 1 (iones de indicación rojos y azules detectados en espectro EM/EM).

Descripción detallada de la invención

Ahora se han descubierto 102 sitios de fosforilación de proteína novedosos en proteínas y rutas de señalización cadena abajo de c-Src. Estos sitios de fosforilación recientemente descritos se identificaron empleando las técnicas que se describen en "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides From Complex Mixtures," Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20030044848, Rush et al., usando extractos celulares de una línea celular transfectada de forma estable que expresa c-Src mutante activada de forma constitutiva, como se describirá más adelante. Los sitios de fosforilación novedosos y sus proteínas precursoras correspondientes que se describen en este documento se indican en la Tabla I. Estos sitios de fosforilación se corresponden a numerosas proteínas precursoras diferentes (cuyas secuencias completas (humanas) están todas públicamente disponibles en la base de datos SwissProt y sus números de Acceso se indican en la Columna C de la Tabla 1/Figura 2), que entran cada uno en grupos de tipos de proteína separados, por ejemplo, proteínas Adaptadoras/Armazón, proteínas de Activación de GTPasa, Helicasas y proteínas de Unión a ARN, etc. (véase la Columna D de la Tabla 1), cuya fosforilación es pertinente para la actividad de transducción de señal cadena abajo de c-Src, como se describe en este documento.

El descubrimiento de los 102 sitios de fosforilación de proteína novedosos descritos en este documento permite la producción, mediante métodos convencionales, de nuevos reactivos, tales como anticuerpos específicos de sitio de fosforilación y péptidos AQUA (péptidos marcados con isótopo pesado), capaces de detectar y/o cuantificar específicamente estos sitios/proteínas fosforilados. Tales reactivos son altamente útiles, entre otras cosas, para estudiar acontecimientos de transducción de señal que subyacen a la progresión de cánceres mediados por c-Src. En consecuencia, la invención proporciona reactivos novedosos -anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA- para la detección y/o cuantificación específica de una proteína/polipéptido de señalización relacionados con c-Src solamente cuando está fosforilado (o solamente cuando está no fosforilado) en un sitio de fosforilación particular descrito en este documento. También se proporcionan métodos para detectar y/o cuantificar una o más proteínas de señalización relacionadas con c-Src fosforiladas mediante el uso de anticuerpos específicos de sitio de fosforilación y péptidos AQUA.

En parte, la memoria descriptiva proporciona un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización relacionada con c-Src dada solamente cuando está fosforilada (o no fosforilada, respectivamente) en una tirosina particular enumerada en la Columna F de la Tabla 1/Figura 2 comprendida dentro de la secuencia de sitio de péptido fosforilable enumerada en la correspondiente Columna G. En una parte adicional, la memoria descriptiva proporciona un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización relacionada con c-Src dada, comprendiendo el péptido marcado un sitio/secuencia de péptido fosforilable particular enumerado en la Columna G de la Tabla 1/Figura 2 en este
documento.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización relacionada con Src quinasa celular (c-Src) humana correspondiente a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida dentro de la secuencia de péptidos SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, en la que dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización relacionada con c-Src correspondiente a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando no está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida dentro de la secuencia de péptidos de la SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, en la que dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando está fosforilada en dicha tirosina. Tales reactivos permiten la detección específica de fosforilación (o no fosforilación) de un sitio fosforilable novedoso descrito en este documento. La invención proporciona además líneas celulares inmortalizadas que producen tales anticuerpos. En una realización preferida, la línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o ratón.

En otra realización, la invención proporciona un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización relacionada con c-Src correspondiente a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64 indicada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, secuencia que comprende la tirosina fosforilable indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1. En ciertas realizaciones preferidas, la tirosina fosforilable dentro del péptido marcado está fosforilada, mientras que en otras realizaciones preferidas, la tirosina fosforilable dentro del péptido marcado no está fosforilada.

Los reactivos (anticuerpos y péptidos AQUA) se pueden agrupar convenientemente por el tipo de proteína de señalización relacionada con c-Src en la que hay un sitio de fosforilación dado (para el que se proporcionan reactivos). Los tipos de proteína para cada respectiva proteína (en la que se ha descubierto un sitio de fosforilación) se proporcionan en la Columna D de la Tabla 1/Figura 2 e incluyen: proteínas de Unión a Actina, proteínas Adaptadoras/Armazón, proteínas de Adhesión, proteínas de unión a Calcio, proteínas de Regulación de Ciclo Celular, proteínas de Superficie Celular, Chaperonas, proteínas del Citoesqueleto, Enzimas de Metabolismo Celular, proteína G o proteínas de Activación de GTPasa, Factores de Intercambio de Nucleótido Guanina, Helicasas, proteínas de la Superfamilia de Inmunoglobulinas, Quinasas, Ligasas, proteínas Motoras, Proteína Quinasas, Proteína Fosfatasas, proteínas Receptoras, proteínas Ribosómicas, proteínas de Unión a ARN, proteínas de Complejo Factor de Transcripción/Inicio, proteínas de Complejo Traducción Inicio, proteínas de Sistema de Conjugación con Ubiquitina y proteínas de Vesícula.

La invención también proporciona, en parte, una línea celular inmortalizada que produce un anticuerpo de la invención. En una realización preferida, la línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

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En determinadas realizaciones preferidas adicionales, un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) de la invención comprende una secuencia de sitio descrita en el que la tirosina fosforilable está fosforilada. En determinadas otras realizaciones preferidas, un péptido marcado con isótopo pesado de la invención comprende una secuencia de sitio descrita en el que la tirosina fosforilable no está fosforilada.

La invención también proporciona métodos para detectar o cuantificar una proteína de señalización relacionada con c-Src quinasa que está fosforilada en tirosina, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los reactivos que se han descrito anteriormente de la invención para detectar o cuantificar una o más proteína o proteínas de señalización relacionadas con c-Src correspondientes a la Fila 65 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina indicada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

La identificación de los sitios de fosforilación de proteína de señalización relacionada con c-Src novedosos descritos y la producción convencional y el uso de los reactivos proporcionados por la invención se describen más adelante con mayor detalle.

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TABLA 1 Sitios de Fosforilación Relacionados con c-Src Recién Descubiertos

1

2

3

4

5

6

7

8

El nombre corto para cada proteína en la que se ha identificado actualmente un sitio de fosforilación se proporciona en la Columna A y su número de acceso (humano) se proporciona en la Columna C. El tipo/grupo de proteína en el que se incluye cada proteína se proporciona en la Columna D. El resto de tirosina identificado en el que tiene lugar la fosforilación en una proteína dada se identifica en la Columna F, y la secuencia de aminoácidos del sitio de fosforilación que incluye el resto de tirosina se proporciona en la Columna G (y minúscula = la tirosina (identificada en la columna F) en la que tiene lugar la fosforilación. La anterior Tabla 1 es idéntica a la Figura 2, excepto porque la última incluye el nombre de la proteína completa (Columna B).

La identificación de estos 102 sitios de fosforilación se describe con más detalle en la siguiente Parte A y en el Ejemplo 1.

Definiciones

Como se usan en este documento, los siguientes términos tienen los significados indicados:

\quad

"Anticuerpo" o "anticuerpos" se refiere a todos los tipos de inmunoglobulinas, que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que incluyen F_{ab} o fragmentos de reconocimiento de antígeno del mismo, incluyendo anticuerpos quiméricos, policlonales y monoclonales. La expresión "que no se une" con respecto a la unión de un anticuerpo con una forma fosforilada de una secuencia significa que sustancialmente no reacciona en comparación con la unión del anticuerpo a la otra forma fosforilada de la secuencia para la que el anticuerpo es específico.

\quad

"Proteína de señalización relacionada con c-Src" significa cualquier proteína (o polipéptido obtenido de la misma) enumerada en la Columna A de la Tabla 1/Figura 2 que se describe en este documento como fosforilada en una o más línea o líneas celulares activadas en c-Src. Las proteínas de señalización relacionadas con c-Src pueden ser substratos directos de c-Src quinasa o pueden ser substratos indirectos cadena abajo en rutas de señalización de c-Src. Una proteína de señalización relacionada con c-Src también puede estar fosforilada en otras líneas de celulares que alojan actividad quinasa activada.

\quad

"Péptido marcado con isótopo pesado" (usado de forma intercambiable con péptido AQUA) significa un péptido que comprende al menos un marcador de isótopo pesado, que es adecuado para la cuantificación absoluta o detección de una proteína, como se describe en el documento WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectometry" (Gygi et al.), descrito más adelante con mas detalle.

\quad

"Proteínas" se usa de forma intercambiable con polipéptido e incluye fragmentos y dominios de proteínas así como proteína completa.

\quad

"Aminoácido fosforilable" significa cualquier aminoácido que sea capaz de modificarse por adición de un grupo fosfato e incluye ambas formas de tal aminoácido.

\quad

"Secuencia de péptido fosforilable" significa una secuencia peptídica que comprende un aminoácido fosforilable.

\quad

"Anticuerpo específico de sitio de fosforilación" significa un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia/epítope de péptido fosforilable solamente cuando está fosforilada o solamente cuando no está fosforilada, respectivamente. La expresión se usa de forma intercambiable con anticuerpo "fosfo-específico".

A. Identificación de Sitios de Fosforilación Relacionados con c-Src Novedosos

Los 102 sitios de fosforilación de proteína de señalización relacionada con c-Src novedosos descritos en este documento e indicados en la Tabla 1/Figura 2 se descubrieron por empleo de las técnicas de aislamiento y caracterización de péptido modificado descritos en "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides From Complex Mixtures" Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20030044848, Rush et al. usando extractos celulares de una línea celular NIH/3T3 transfectada de forma estable que expresa c-Src mutante activada de forma constitutiva (Y527F). El aislamiento y la identificación de fosfopéptidos de esta línea celular c-Src, mediante el uso de un anticuerpo específico de fosfotirosina general inmovilizado, se describe con detalle en el siguiente Ejemplo 1. Además de los 102 sitios de fosforilación de proteína previamente desconocidos descubiertos, también se identificaron muchos sitios de fosforilación conocidos (no descritos en este documento). A continuación se resume brevemente la técnica de inmunoafinidad/espectrometría de masas descrita en la Publicación de Patente '848 (el método de "IAP") - -y empleada como se describe con detalle en los ejemplos- - .

El método de IAP empleado generalmente comprende las siguientes etapas: (a) una preparación de tipo proteína (por ejemplo, un extracto celular digerido) que comprende fosfopéptidos de dos o más proteínas diferentes se obtiene de un organismo, (b) la preparación se pone en contacto con al menos un anticuerpo específico de fosfotirosina general inmovilizado; (c) se aísla al menos un fosfopéptido unido específicamente por el anticuerpo inmovilizado en la etapa (b); y (d) el péptido modificado aislado en la etapa (c) se caracteriza por espectrometría de masas (EM) y/o espectrometría de masas en tándem (EM-EM). Posteriormente, (e) se puede utilizar un programa de búsqueda (por ejemplo, Sequest) para emparejar sustancialmente los espectros obtenidos para el péptido aislado, modificado durante la caracterización de la etapa (d) con los espectros para una secuencia peptídica conocida. También se puede emplear una etapa de cuantificación que emplea, por ejemplo, SILAC o AQUA, para cuantificar péptidos aislados para comparar niveles peptídicos en una muestra con un nivel basal.

En el método de IAP empleado en este documento se usó un anticuerpo monoclonal específico de fosfotirosina general (disponible en el mercado en Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, Cat#9411 (p-Tyr-100)) en la etapa de inmunoafinidad para aislar el mayor número posible de péptidos que contienen fosfotirosina de los extractos celulares de c-Src.

Se emplearon los extractos de una línea celular NIH/3T3 activada por c-Src. Esta línea celular transfectada de forma estable expresa una forma mutantes activada constitutivamente de c-Src (Y527F), en la que están afectadas las rutas de señalización y las proteínas cadena abajo de c-Src.

Como se describe con más detalle en los Ejemplos, se prepararon lisados a partir de esta línea celular y se digirieron con tripsina después del tratamiento con DTT e yodoacetamida hasta restos de cisteína alquilados. Antes de la etapa de inmunoafinidad, los péptidos se pre-fraccionaron por extracción en fase sólida de fase inversa usando columnas Sep-Pak C_{18} para separar péptidos de otros componentes celulares. Los cartuchos de extracción en fase sólida se eluyeron con diversas etapas de acetonitrilo. Cada fracción peptídica liofilizada se redisolvió en PBS y se trató con anticuerpo fosfotirosina (P-Tyr-100, CST#9411) inmovilizado en proteína G-Sepharose. Los péptidos purificados por inmunoafinidad se eluyeron con TFA al 0,1% y una parte de esta fracción se concentró con puntas Stage y se analizó por EM/EM-CL, usando un espectrómetro de masas de captura de iones ThermoFinnigan LCQ Deca XP Plus. Los péptidos se eluyeron de una columna de fase inversa de 10 cm x 75 \mum con un gradiente lineal de 45 min de acetonitrilo. Los espectros de EM/EM se evaluaron usando el programa Sequest con la base de datos de proteína humana
NCBI.

Esto mostró un total de 102 sitios de fosforilación de tirosina novedosos en rutas de señalización afectadas por activación de c-Src. Los sitios de fosforilación identificados y sus proteínas precursoras se enumeran en la Tabla 1/Figura 2. La tirosina (secuencia humana) en la que tiene lugar la fosforilación se proporciona en la Columna F, y la secuencia de péptidos que incluye el resto de tirosina fosforilable en el sitio se proporciona en la Columna G.

Como resultado del descubrimiento de estos sitios de fosforilación, ahora se pueden producir anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA para la detección y cuantificación de estos sitios y sus proteínas precursoras mediante métodos convencionales, descritos más adelante. Se demostrará que estos nuevos reactivos son altamente útiles para estudiar las rutas de señalización y acontecimientos que subyacen a la progresión de cánceres mediados por c-Src y la identificación de nuevos biomarcadores y dianas para el diagnóstico y tratamiento de tales enfermedades.

B. Anticuerpos y Líneas Celulares

Ahora se pueden producir anticuerpos específicos de sitio de fosforilación aislados que se unen específicamente a una proteína de señalización relacionada con c-Src descrita en la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada (o solamente cuando no está fosforilada) en el correspondiente aminoácido y sitio de fosforilación indicados en las Columnas F y G de la Tabla 1 por métodos de producción de anticuerpos convencionales, tales como métodos de anticuerpos anti-péptidos, mediante el uso de información de secuencia de sitio de fosforilación proporcionada en la Columna G de la Tabla 1.

Se pueden producir anticuerpos policlonales de la invención de acuerdo con técnicas convencionales inmunizando un animal adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, etc.) con un antígeno peptídico correspondiente al sitio de fosforilación relacionado con c-Src de interés, recogiendo suero inmune del animal y separando los anticuerpos policlonales del suero inmune, de acuerdo con procedimientos conocidos. De forma similar, un péptido que comprende cualquiera de las secuencias de sitio de fosforilación proporcionadas en la Columna G de la Tabla 1 se puede emplear como un antígeno para producir un anticuerpo que se una solamente a la correspondiente proteína indicada en la Columna A de la Tabla 1 cuando está fosforilada (o cuando no está fosforilada) en el correspondiente resto indicado en la Columna F. Si se desea un anticuerpo que se une a la proteína solamente cuando está fosforilada en el sitio descrito, el antígeno peptídico incluye la forma fosforilada del aminoácido. Por el contrario, si se desea un anticuerpo que se una solamente a la proteína cuando no está fosforilada en el sitio descrito, el antígeno peptídico incluye la forma no fosforilada del aminoácido.

Se pueden diseñar, construir y emplear antígenos peptídicos adecuados para producir anticuerpos de la invención de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capítulo 5, p. 75-76, Harlow y Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)).

Se entenderá por los especialistas en la técnica que se pueden emplear antígenos de fosfopéptidos más largos o más cortos. Véase id. Por ejemplo, un antígeno peptídico puede consistir en la secuencia completa descrita en la Columna G de la Tabla 1 o puede comprender aminoácidos adicionales que flanquean tal secuencia descrita o puede comprender solamente una parte de la secuencia descrita que flanquea inmediatamente el aminoácido fosforilable (indicado en la Columna G por minúsculas de anticuerpos policlonales producidos como se describe en este documento, que se pueden explorar como se describe más adelante.

Se pueden producir anticuerpos monoclonales de la invención en una línea celular de hibridoma de acuerdo con la técnica bien conocida de Kohler y Milstein. Nature 265: 495-97 (1975), Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976), véase también, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds. (1989). Los anticuerpos monoclonales producidos de este modo son altamente específicos y mejoran la selectividad y especificidad de métodos de ensayo de diagnóstico proporcionados por la invención. Por ejemplo, se puede inyectar una solución que contiene el antígeno apropiado en un ratón u otra especie y, después de un tiempo suficiente (manteniendo con técnicas convencionales), el animal se sacrifica y se obtienen esplenocitos. Los esplenocitos después se inmortalizan fusionando los mismos con células de mieloma, típicamente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. Los hibridomas de fusión de conejo, por ejemplo, se pueden producir como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.675.063, C. Knight, Presentada el 7 de Octubre de 1997. Después, las células de hibridoma se cultivan en un medio de selección adecuado, tal como hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) y el sobrenadante se explora para anticuerpos monoclonales que tengan la especificidad deseada, como se describe más adelante. El anticuerpo secretado se puede recuperar del sobrenadante del cultivo tisular mediante métodos convencionales tales como precipitación, cromatografía de intercambio iónico o afinidad o similares.

También se pueden producir fragmentos Fab monoclonales en Escherichia coli mediante técnicas recombinantes conocidas por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 87: 8095 (1990). Si se prefieren anticuerpos monoclonales de un isotipo para una aplicación particular, se pueden preparar isotipos particulares directamente, seleccionando los mismos de la fusión inicial, o se pueden preparar secundariamente, a partir de un hibridoma precursor que secrete un anticuerpo monoclonal de isotipo diferente mediante el uso de la técnica de selección de parientes para aislar variantes de cambio de clase (Steplewski, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)).

El epítopo preferido de un anticuerpo específico de sitio de fosforilación de la invención es un fragmento peptídico que consiste esencialmente en aproximadamente de 8 a 17 aminoácidos, que incluyen la tirosina fosforilable, en el que aproximadamente de 3 a 8 aminoácidos están colocados a cada lado de la tirosina fosforilable y anticuerpos de la invención se unen, por tanto, específicamente a un polipéptido de c-Src diana que comprende tal secuencia de epítopo. Los epítopos particularmente preferidos unidos por los anticuerpos de la invención comprenden todo o parte de una secuencia de sitio fosforilable indicada en la Columna G de la Tabla 1, que incluye el aminoácido fosforilable.

Se incluyen moléculas no anticuerpo equivalentes tales como dominios de unión a proteínas o aptámeros de ácido nucleico que se unen, de un modo fosfo-específico, a esencialmente el mismo epítopo fosforilable al que se unen los anticuerpos fosfo-específicos de la invención. Véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984). Tales reactivos no anticuerpos equivalentes se pueden emplear de forma adecuada en los métodos descritos más adelante.

Los anticuerpos proporcionados por la invención pueden ser cualquier tipo de inmunoglobulinas, que incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que incluyen fragmentos F_{ab} o de reconocimiento de antígenos de las mismas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de origen, que incluye (por ejemplo) ratón, rata, conejo, caballo o ser humano o pueden ser anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, M. Walker et al. Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes producidos de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 4.474.893 (Reading) o la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567 (Cabilly et al.) Los anticuerpos también se pueden construir químicamente mediante anticuerpos específicos preparados de acuerdo con el método descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.676.980 (Segel et al.).

La invención también proporciona líneas celulares inmortalizadas que producen un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, también se proporcionan clones de hibridoma, construidos como se ha descrito anteriormente, que producen anticuerpos monoclonales para los sitios de fosforilación de proteína de señalización relacionada con c-Src descritos en este documento. De forma similar, la invención incluye células recombinantes que producen un anticuerpo de la invención, células que se pueden construir mediante técnicas bien conocidas; por ejemplo, el sitio de combinación con antígeno del anticuerpo monoclonal se puede clonar por PCR y se pueden producir anticuerpos de cadena única como anticuerpos recombinantes de presentación en fagos o anticuerpos solubles en E. coli (véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, Sudhir Paul editor.).

Los anticuerpos específicos de sitio de fosforilación de la invención, policlonales o monoclonales, se pueden explorar para especificidad de epítopo y fosfo de acuerdo con técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Czernik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos se pueden explorar frente a la biblioteca de péptidos fosfo y no fosfo mediante ELISA para garantizar especificidad tanto para el antígeno deseado (es decir, el epítopo que incluye una secuencia de sitio de fosforilación enumerada en la Columna G de la Tabla 1), como para reactividad solamente con la forma fosforilada (o no fosforilada) del antígeno. Se pueden realizar ensayos de competición de péptido para confirmar la ausencia de reactividad con otros fosfo-epítopos en la proteína de señalización relacionada con c-Src dada. Los anticuerpos también se pueden ensayar por transferencia de Western frente a preparaciones celulares que contengan la proteína de señalización, por ejemplo, líneas celulares que sobre-expresan la proteína diana, para confirmar reactividad con el epítopo/diana fosforilado deseado.

También se puede examinar la especificidad frente al epítopo fosforilado deseado mediante construcción de mutantes que carezcan de restos fosforilables en posiciones fuera del epítopo deseado que se sabe que está fosforilado o mutando el fosfo-epítopo deseado y confirmando la ausencia de reactividad. Los anticuerpos específicos de sitio de fosforilación de la invención pueden mostrar cierta reactividad cruzada limitada de epítopos relacionados en proteínas no diana. Esto no es inesperado ya que la mayoría de los anticuerpos muestran cierto grado de reactividad cruzada y los anticuerpos anti-péptido a menudo tendrán reacción cruzada con epítopos que tienen alta homología con el péptido de inmunización. Véase, por ejemplo, Czernik, anteriormente. La reactividad cruzada con proteínas no diana se caracteriza fácilmente por transferencia de Western junto con marcadores de peso molecular conocido. Se pueden examinar las secuencias de aminoácidos de proteínas de reacción cruzada para identificar sitios altamente homólogos con el epítopo de proteína de señalización relacionada con c-Src para el cual el anticuerpo de la invención es específico. En ciertos casos, los antisueros policlonales pueden mostrar cierta reactividad cruzada general indeseable con fosfotirosina, que se puede eliminar mediante purificación adicional de los antisueros, por ejemplo, por una columna de fosfotiramina. Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a su proteína diana (es decir, una proteína indicada en la Columna A de la Tabla 1) solamente cuando está fosforilada (o, como puede ser el caso, solamente cuando no está fosforilada) en el sitio descrito en las correspondientes Columnas F/H y no se unen (sustancialmente) a la otra forma (en comparación con la forma para la cual el anticuerpo es específico).

Los anticuerpos se pueden caracterizar adicionalmente mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) usando tejidos normales y enfermos para examinar estado de fosforilación y activación relacionado con c-Src en tejido enfermo. La IHC se puede realizar de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, capítulo 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En resumen, se prepara tejido incluido en parafina (por ejemplo, tejido tumoral) para tinción inmunohistoquímica desparafinando secciones tisulares con xileno seguido de etanol; hidratando en agua, después PBS; desenmascarando el antígeno calentando el portaobjetos en tampón citrato sódico; incubando las secciones en peróxido de hidrógeno; bloqueando en solución de bloqueo, incubando el portaobjetos en anticuerpo primario y anticuerpo secundario y finalmente, detectando mediante el uso del método de avidina/biotina ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los anticuerpos se pueden caracterizar adicionalmente por citometría de flujo realizada de acuerdo con métodos convencionales. Véase Chow et al. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). En resumen y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para análisis citométrico: las muestras se pueden centrifugar en gradientes de Ficoll para retirar eritrocitos y después se pueden fijar las células con paraformaldehído al 2% durante 10 minutos a 37ºC seguido de permeabilización en metanol al 90% durante 30 minutos en hielo. Después, las células se pueden teñir con el anticuerpo específico de sitio de fosforilación primario de la invención (que detecta una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src enumerada en la Tabla 1), lavar y marcar con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. También se pueden añadir en este momento anticuerpos marcadores conjugados con fluorocromo (por ejemplo, CD45, CD34) para ayudar a la identificación posterior de tipos celulares hematopoyéticos específicos. Las células se analizarían después en un citómetro de flujo (por ejemplo, Beckman Coulter FC500), de acuerdo con los protocolos específicos del instrumento usado.

Los anticuerpos de la invención también se pueden conjugar ventajosamente con colorantes fluorescentes (por ejemplo, Alexa488, PE) para el uso en análisis multiparamétricos junto con otros marcadores de transducción de señal (fosfo-C rkL, fosfo-Erk 1/2) y/o anticuerpos marcadores de células (CD34).

Los anticuerpos específicos de sitio de fosforilación de la invención se unen específicamente a proteína o polipéptido de transducción de señal relacionada con c-Src humana solamente cuando está fosforilada en el sitio descrito, pero no se limita solamente a la unión a la especie humana, por sí misma. La invención incluye anticuerpos que también se unen a sitios de fosforilación conservados y altamente homólogos o idénticos en proteínas relacionadas con c-Src respectivas de otras especies (por ejemplo, ratón, rata, mono, levadura), además de la unión al sitio de fosforilación humano. Los sitios altamente homólogos conservados en otras especies se pueden identificar fácilmente mediante comparaciones de secuencia convencionales, tales como usando BLAST, con los sitios de fosforilación de proteína de transducción de señal de c-Src humana descritos en este documento.

C. Péptidos Marcados con Isótopo Pesado (Péptidos AQUA)

Los sitios de fosforilación de proteína de señalización de c-Src novedosos descritos en este documento permiten ahora la producción de péptidos marcados con isótopo pesado correspondientes para la cuantificación absoluta de tales proteínas de señalización (tanto fosforiladas como no fosforiladas en el sitio descrito) en muestras biológicas. La producción y el uso de péptidos AQUA para la cuantificación absoluta de proteínas (AQUA) en mezclas complejas se ha descrito. Véase el documento WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry", Gygi et al., y también Gerber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5 (2003).

La metodología AQUA emplea la introducción de una cantidad conocida de al menos un patrón de péptido marcado con isótopo pesado (que tiene un distintivo único detectable por cromatografía de MRS-CL) en una muestra biológica digerida para determinar, mediante comparación con el patrón de péptido, la cantidad absoluta de un péptido con la misma secuencia y modificación de proteína en la muestra biológica. En resumen, la metodología AQUA tiene dos etapas: selección de patrón interno de péptido y validación y desarrollo de método; e implementación usando patrones internos de péptido validados para detectar y cuantificar una proteína diana en la muestra. El método es una técnica potente para detectar y cuantificar un péptido/proteína dada dentro de una mezcla biológica compleja, tal como un lisado celular, y se puede emplear, por ejemplo, para cuantificar cambio en fosforilación de proteína como resultado de tratamiento farmacológico o para cuantificar diferencias en el nivel de una proteína en diferentes estados biológicos.

Generalmente, para desarrollar un patrón interno adecuado, un péptido particular (o péptido modificado) dentro de una secuencia de proteína diana se selecciona basándose en su secuencia de aminoácidos y la proteasa particular que se tiene que usar para la digestión. Después, el péptido se genera por síntesis de péptidos en fase sólida de tal forma que un resto se sustituye con el mismo resto que contiene isótopos estables (^{13}C, ^{15}N). El resultado es un péptido que es químicamente idéntico a su equivalente nativo formado por proteólisis, pero se puede distinguir de forma sencilla por EM mediante un desplazamiento de masa de 7 Da. El péptido de patrón interno AQUA sintetizado recientemente se evalúa después por EM/EM-CL. Este proceso proporciona información cualitativa con respecto a retención de péptido por cromatografía de fase inversa, eficacia de ionización y fragmentación por disociación inducida por colisión. Se seleccionan iones de fragmento informativos y abundantes para conjuntos de péptidos de patrón nativos e internos y después se controlan específicamente en sucesión rápida como una función de retención de cromatografía para formar un método de monitorización de reacción seleccionada (MRS-CL) basando en el perfil único del patrón de péptido.

La segunda etapa de la estrategia AQUA es su implementación para medir la cantidad de una proteína o proteína modificada de mezclas complejas. Los lisados celulares completos se fraccionan típicamente por electroforesis en gel de SDS-PAGE y se escinden regiones del gel que coinciden con la migración de proteína. Este proceso es seguido de proteolisis en gel en presencia de los péptidos AQUA y análisis MRS-CL. (Véase Gerber et al., anteriormente). Los péptidos AQUA se añaden a la mezcla peptídica compleja obtenida por digestión del lisado celular completo con una enzima proteolítica y se someten a purificación por inmunoafinidad como se ha descrito anteriormente. El tiempo de retención y el patrón de fragmentación del péptido nativo formado por digestión (por ejemplo, tripsinización) son idénticos a los del péptido de patrón interno AQUA que se ha determinado previamente; por tanto, el análisis EM/EM-CL que usa un experimento MRS da como resultado la medición altamente específica y sensible tanto de patrón interno como de analito directamente de mezclas de péptidos extremamente complejas. Debido a que se añade una cantidad absoluta del péptido AQUA (por ejemplo, 250 fmol), se puede usar la proporción de las áreas bajo la curva para determinar los niveles de expresión precisos de una proteína o forma fosforilada de una proteína en el lisado celular original. Además, el patrón interno está presente durante la digestión en gel ya que se forman péptidos nativos, de tal forma que la eficacia de extracción de péptido de trozos de gel, pérdidas absolutas durante el manejo de muestra (que incluyen centrifugación al vacío) y variabilidad durante la introducción en el sistema EM-CL no afectan a la proporción determinada de abundancias de péptido nativo y AQUA.

Se desarrolla un patrón de péptido AQUA para una secuencia de sitio de fosforilación conocida identificada previamente por el método IAP-EM/EM-CL dentro de una proteína diana. Se puede desarrollar un péptido AQUA que incorpore la forma fosforilada del resto particular dentro del sitio y se puede desarrollar un segundo péptido AQUA que incorpore la forma no fosforilada del resto. De este modo, los dos patrones se pueden usar para detectar y cuantificar tanto las formas fosforiladas como no fosforiladas del sitio en una muestra biológica.

Los patrones internos de péptido también se pueden generar examinando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de los péptidos producidos por escisión con proteasa. Alternativamente, una proteína se puede digerir realmente con una proteasa y después se puede secuenciar un fragmento peptídico particular producido. Las proteasas adecuadas incluyen, pero sin limitación, serina proteasas (por ejemplo, tripsina, hepsina), metaloproteasas (por ejemplo, PUMP1), quimiotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.

Una secuencia peptídica dentro de una proteína diana se selecciona de acuerdo con uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como un patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las probabilidades de que la secuencia peptídica se repita en cualquier otro lugar en otras proteínas no diana. Por tanto, un péptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionización. Por tanto, no se prefieren péptidos más largos de aproximadamente 20 aminoácidos. El intervalo preferido es de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos. También se selecciona una secuencia peptídica que probablemente no será químicamente reactiva durante la espectrometría de masas, por tanto, se evitan secuencias que comprendan cisteína, triptófano o metionina.

Una secuencia peptídica que no incluye una región modificada de la región diana se puede seleccionar de tal forma que el patrón interno peptídico se puede usar para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Alternativamente, puede ser deseable un patrón interno peptídico que incluya un aminoácido modificado para detectar y cuantificar solamente la forma modificada de la proteína diana. Los patrones de péptido para regiones tanto modificadas como no modificadas se pueden usar de forma conjunta, para determinar el alcance de una modificación en una muestra particular (es decir, para determinar qué fracción de la cantidad total de la proteína está representada por la forma modificada). Por ejemplo, se pueden usar patrones de péptido para la forma tanto fosforilada como no fosforilada de una proteína que se sabe que está fosforilada en un sitio particular para cuantificar la cantidad de forma fosforilada en una muestra.

El péptido se marca usando uno o más aminoácidos marcados (es decir, el marcador es una parte real del péptido) o menos preferiblemente, los marcadores se pueden unir después de la síntesis de acuerdo con métodos convencionales. Preferiblemente, el marcador es un marcador de alteración de masa seleccionado basándose en las siguientes consideraciones: la masa debe ser única para desplazar masas de fragmentos producidos por análisis EM a regiones del espectro con fondo bajo; el componente de distintivo de masa iónica es la parte del resto marcador que muestra preferiblemente un distintivo de masa iónica único en análisis EM; la suma de las masas de los átomos constituyentes del marcador es preferiblemente diferente de forma única a los fragmentos de todos los posibles aminoácidos. Como resultado, los aminoácidos marcados y péptidos se distinguen fácilmente de los no marcados por el patrón iónico/masa en el espectro de masa resultante. Preferiblemente, el componente de distintivo de masa iónica imparte una masa a un fragmento de proteína que no coincide con la masa de resto de cualquiera de los 20 aminoácidos naturales.

El marcador debe ser robusto en las condiciones de fragmentación de EM y no someterse a fragmentación desfavorable. La química de marcado debe ser eficaz en una diversidad de condiciones, particularmente condiciones desnaturalizantes y la etiqueta marcada permanece preferiblemente soluble en el sistema de tampón EM de selección. El marcador preferiblemente no suprime la eficacia de ionización de la proteína y no es químicamente reactivo. El marcador puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente distintas para generar un patrón de espectrometría de masas único en cada posición de fragmento marcado. Los isótopos estables, tales como ^{2}H, ^{13}C, ^{15}N, ^{17}O, ^{18}O o ^{34}S, están entre los marcadores preferidos. También se pueden preparar pares de patrones internos de péptido que incorporan un marcador de isótopo diferente. Los restos aminoacídicos preferidos en los que se puede incorporar un marcador de isótopo pesado incluyen leucina, prolina, valina y fenilalanina.

Los patrones internos de péptidos se caracterizan de acuerdo con su proporción de masa a carga (m/z) y, preferiblemente, también de acuerdo con su tiempo de retención en una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de HPLC). Los patrones internos que co-eluyen con péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como patrones internos óptimos. Después, el patrón interno se analiza fragmentando el péptido mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, por disociación inducida por colisión (CID) usando, por ejemplo, argón o helio como un gas de colisión. Después se analizan los fragmentos, por ejemplo, por espectrometría de masas multi-etapa (MS^{n}) para obtener un espectro de ión de fragmento, para obtener un distintivo de fragmentación de péptido. Preferiblemente, los fragmentos peptídicos tienen diferencias significativas en proporciones m/z para permitir que se separen bien los picos correspondientes a cada fragmento y se obtiene un distintivo que es único para el péptido diana. Si no se obtiene un distintivo de fragmento adecuado en la primera etapa, se realizan etapas adicionales de EM hasta que se obtiene un distintivo único.

Los iones de fragmento en los espectros EM/EM y MS^{3} típicamente son altamente específicos para el péptido de interés y, junto con métodos CL, permiten un medio altamente selectivo para detectar y cuantificar un péptido/proteína diana en una mezcla de proteínas complejas, tal como un lisado celular, que contiene muchos miles o decenas de miles de proteínas. Cualquier muestra biológica que contenga potencialmente una proteína/péptido diana de interés se puede ensayar. Se emplean preferiblemente extractos celulares en bruto o parcialmente purificados. Generalmente, la muestra tiene al menos 0,01 mg de proteína, típicamente una concentración de 0,1-10 mg/ml, y se puede ajustar hasta una concentración de tampón y pH deseados.

Después se añade una cantidad conocida de un patrón interno de péptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomol, correspondientes a una proteína diana a detectar/cuantificar a una muestra biológica, tal como un lisado celular. Después, la muestra añadida se digiere con una o más proteasas durante un periodo de tiempo adecuado para permitir la digestión. Después se realiza una separación (por ejemplo, por HPLC, HPLC de fase inversa, electroforesis capilar, cromatografía de intercambio iónico, etc.) para aislar el patrón interno marcado y su péptido diana correspondiente de otros péptidos en la muestra. La CL microcapilar es un método preferido.

Después, cada péptido aislado se examina mediante el control de una reacción seleccionada en el EM. Esto implica el uso de un conocimiento previo obtenido por la caracterización del patrón interno de péptido y requiriendo después a la EM controlar continuamente un ión específico en el espectro EM/EM o EM^{n} tanto para el péptido de interés como el patrón interno. Después de la elución, se calcula el área bajo la curva (ABC) tanto para el patrón de péptido como los picos de péptido diana. La proporción de las dos áreas proporciona la cuantificación absoluta que se puede normalizar para el número de células usado en el análisis y el peso molecular de las proteínas, para proporcionar el número de copias preciso de la proteína por célula. Se describen detalles adicionales de la metodología AQUA en Gygi et al. y Gerber et al. anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, ahora se pueden producir patrones de péptido interno AQUA (péptidos marcados con isótopo pesado), como se ha descrito anteriormente, para los sitios de fosforilación de proteína de señalización relacionada con c-Src novedosos descritos en este documento (véase Tabla 1/Figura 2). Se pueden producir patrones de péptido para un sitio de fosforilación dado tanto para las formas fosforiladas como no fosforiladas del sitio y tales patrones se pueden emplear en la metodología AQUA para detectar y cuantificar ambas formas de tal sitio de fosforilación en una muestra biológica.

Las secuencias de péptidos de sitio de fosforilación descritas en este documento (véase Columna G de la Tabla 1/Figura 2) son particularmente bien adecuadas para el desarrollo de péptido AQUA correspondiente, ya que el método IAP por el que se identificaron (véase la anterior Parte A y el Ejemplo 1) confirmaron de forma inherente que tales péptidos se producen, de hecho, por digestión enzimática (tripsinización) y, de hecho, se fraccionan/ionizan de forma adecuada en EM/EM. Por tanto, se pueden sintetizar fácilmente equivalentes marcados con isótopo pesado de estos péptidos (tanto en forma fosforilada como no fosforilada) y se determina su distintivo único de EM y MRS-CL, de tal forma que los péptidos se validan como péptidos AQUA y están preparados para el uso en experimentos de cuantificación.

En consecuencia, la invención proporciona péptidos marcados con isótopos pesados (péptidos AQUA) para la detección y/o cuantificación del sitio de fosforilación relacionado con c-Src descrito en la fila 65 de la Tabla 1 (véase Columna G) y/o su proteína/polipéptido precursor correspondiente (véase Columna A). De forma óptima, un péptido AQUA de la invención consiste en una secuencia de sitio de fosforilación enumerada en la Tabla 1.

Sin embargo, se entenderá que también se puede construir un péptido AQUA de mayor tamaño que comprenda la secuencia de sitio de fosforilación descrita (y restos adicionales cadena abajo o cadena arriba de la misma). De forma similar, alternativamente se puede construir un péptido AQUA de menor tamaño que comprenda menos de todos los restos de una secuencia del sitio de fosforilación descrita (pero que todavía comprenda el resto fosforilable enumerado en la Columna F de la Tabla 1/Figura 2). Tales péptidos AQUA de mayor tamaño están dentro del alcance de la presente invención y la selección y producción de péptidos AQUA preferidos se puede realizar como se ha descrito anteriormente (véase Gygi et al. Gerber et al., anteriormente).

El Ejemplo 4 se proporciona para ilustrar adicionalmente la construcción y el uso, mediante métodos convencionales que se han descrito anteriormente, de péptidos AQUA ilustrativos.

También se pueden emplear péptidos AQUA de la invención dentro de un kit que comprende uno o más péptido o péptidos AQUA múltiples proporcionados en este documento (para la cuantificación de una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src descrita en la Tabla 1) y, opcionalmente, un segundo reactivo de detección conjugado con un grupo detectable. Por ejemplo, un kit puede incluir péptidos AQUA para la forma tanto de fosforilación como no fosforilada de un sitio de fosforilación descrito en este documento. Los reactivos también pueden incluir agentes auxiliares tales como agentes de tamponamiento y agentes estabilizantes de proteína, por ejemplo, polisacáridos y similares. El kit puede incluir además, si es necesario, otros miembros del sistema de producción de señal, sistema del cual el grupo detectable es un miembro (por ejemplo, sustratos de enzima), agentes para reducir la interferencia de fondo en un ensayo, reactivos de control, aparato para realizar un ensayo y similares. El kit de ensayo se puede envasar de cualquier modo adecuado, típicamente con todos los elementos en un único recipiente junto una hoja de instrucciones impresa para realizar el ensayo.

Los péptidos AQUA proporcionados por la invención serán altamente útiles en el estudio adicional de anormalidades de transducción de señal que subyacen a cáncer, que incluye cánceres mediados por c-Src y para identificar biomarcadores/diagnósticos de estas enfermedades, nuevas dianas de fármacos potenciales y/o para controlar los efectos de compuestos de ensayo en proteínas y rutas de transducción de señal relacionadas con c-Src.

D. Formatos de inmunoensayo

Los anticuerpos proporcionados por la invención se pueden emplear ventajosamente en una diversidad de ensayos inmunológicos convencionales (el uso de péptidos AQUA proporcionados por la invención se ha descrito por separado anteriormente). Los ensayos pueden ser ensayos homogéneos o ensayos heterogéneos. En un ensayo homogéneo, la reacción inmunológica implica habitualmente un anticuerpo específico de sitio de fosforilación de la invención), un analito marcado y la muestra de interés. La señal que surge del marcador está modificada, directamente o indirectamente, después de la unión del anticuerpo al analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del alcance de la misma se realizan en una solución homogénea. Los marcadores inmunoquímicos que se pueden emplear incluyen radicales libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos, coenzimas, etc.

En una estrategia de ensayo heterogéneo, los reactivos son habitualmente la muestra, un anticuerpo específico de sitio de fosforilación de la invención y medios adecuados para producir una señal detectable. Se pueden usar muestras similares como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo se inmoviliza generalmente sobre un soporte, tal como una perla, placa o portaobjetos, y se pone en contacto con la muestra de la que se sospecha que contiene el antígeno en una fase líquida. Después, el soporte se separa de la fase líquida y la fase de soporte o la fase líquida se examinan para una señal detectable que emplea medios para producir tal señal. La señal se relaciona con la presencia del analito en la muestra. Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, etc. Por ejemplo, si el antígeno a detectar contiene un segundo sitio de unión, se puede conjugar un anticuerpo que se una a ese sitio con un grupo detectable y añadir a la solución de reacción en fase líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable sobre el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de ensayo. Los ejemplos de inmunoensayos adecuados son el radioinmunoensayo, métodos de inmunofluorescencia, inmunoensayos ligados a enzimas y similares.

Los formatos de inmunoensayo y variaciones de los mismos que pueden ser útiles para realizar los métodos descritos en este documento se conocen bien en la técnica. Véase, de forma general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla); véase también, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.727.022 (Skold et al., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); Patente de Estados Unidos Nº 4.659.678 (Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"); Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110 (David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"). Las condiciones adecuadas para la formación de los complejos de reactivo-anticuerpo están bien descritas. Véase id. Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden usar en un ensayo de "dos sitios" o "sándwich", sirviendo una única línea celular como una fuente tanto para el anticuerpo monoclonal marcado como el anticuerpo monoclonal unido. Tales ensayos se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110. La concentración de reactivo detectable debe ser suficiente de tal forma que la unión de una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src diana sea detectable en comparación con el
fondo.

Los anticuerpos específicos de sitio de fosforilación descritos en este documento se pueden conjugar a un soporte sólido adecuado para un ensayo de diagnóstico (por ejemplo, perlas, placas, portaobjetos o pocillos formados a partir de materiales tales como látex o poliestireno) de acuerdo con técnicas conocidas como tales como precipitación. Los anticuerpos u otras proteínas diana o reactivos de unión a sitio diana, se pueden conjugar asimismo con grupos detectables tales como radiomarcadores (por ejemplo, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina) y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína) de acuerdo con técnicas conocidas.

Los anticuerpos de la invención también se puedan optimizar para el uso en un ensayo de citometría de flujo para determinar el estado de activación/fosforilación de una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src diana en pacientes antes, durante, y después del tratamiento con un fármaco dirigido para inhibir la fosforilación en una proteína de este tipo en el sitio de fosforilación descrito en este documento. Por ejemplo, se pueden analizar células de médula ósea o células de sangre periférica de pacientes mediante citometría de flujo para fosforilación de proteína de transducción de señal relacionada con c-Src diana, así como para marcadores que identifican diversos tipos de células hematopoyéticas. De este modo, se puede caracterizar específicamente el estado de activación de las células malignas. La citometría de flujo se puede realizar de acuerdo con métodos convencionales. Véase, por ejemplo Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). En resumen y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para análisis citométrico: fijación de las células con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a 37ºC seguido de permeabilización en metanol al 90% durante 30 minutos en hielo. Después, las células se pueden teñir con el anticuerpo primario (un anticuerpo fosfo-específico de la invención), lavar y marcar con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. Alternativamente, las células se pueden teñir con un anticuerpo primario marcado fluorescentemente. Después, las células se analizarían en un citómetro de flujo (por ejemplo, un Beckman Coulter EPICS-XL) de acuerdo con los protocolos específicos del instrumento usado. Un análisis de este tipo identificaría la presencia de proteína o proteínas de transducción de señal relacionadas con c-Src activada de las células malignas y mostraría la respuesta al fármaco de la proteína dirigida.

Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos de la invención en tinción inmunohistoquímica (IHC) para detectar diferencias en la transducción de señal o actividad de proteína usando tejidos normales y enfermos. La IHC se puede realizar de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente. En resumen, se prepara tejido incluido en parafina (por ejemplo tejido tumoral) para tinción inmunohistoquímica desparafinando secciones tisulares con xileno seguido de etanol; hidratando en agua, después PBS; desenmascarando el antígeno mediante el calentamiento del portaobjetos en tampón citrato sódico, incubando las secciones en peróxido de hidrógeno; bloqueando en solución de bloqueo; incubando el portaobjetos en anticuerpo primario y anticuerpo secundario; y finalmente, detectando mediante el uso del método de avidina/biotina ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los anticuerpos de la invención también se puede optimizar para el uso en otras aplicaciones clínicamente adecuadas, por ejemplo, ensayos de tipo múltiplex basados en perlas, tales como formatos de ensayo IGEN, Luminex^{TM} y/o Bioplex^{TM} u optimizar de otro modo para formatos de matrices de anticuerpos, tales como aplicaciones de matriz de fase inversa (véase, por ejemplo, Paweletz et al., Oncogene 20 (16); 1981-89 (2001)). En consecuencia, en otra realización, se proporciona un método para la detección múltiplex de fosforilación de proteína relacionada con c-Src en una muestra biológica, comprendiendo el método la utilización de dos o más anticuerpos o péptidos AQUA para detectar la presencia de dos o más proteínas de señalización relacionadas con c-Src fosforiladas enumeradas en la Columna A de la Tabla 1/Figura 2. En una realización preferida, de dos a cinco anticuerpos o péptidos AQUA se emplean en el método. En otra realización preferida, se emplean de seis a diez anticuerpos o péptidos AQUA, mientras que en otra realización preferida se emplean de once a veinte de tales reactivos.

Los anticuerpos y/o los péptidos AQUA de la invención también se pueden emplear dentro de un kit que comprende al menos un anticuerpo específico de sitio de fosforilación o péptido AQUA de la invención (que se une a o detecta una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src descrita en la Tabla 1) y, opcionalmente, un segundo anticuerpo conjugado con un grupo detectable. En algunas realizaciones, el kit es adecuado para ensayos múltiplex y comprende dos o más anticuerpos o péptidos AQUA y, en algunas realizaciones, comprende de dos a cinco, de seis a diez o de once a veinte reactivos. El kit también puede incluir agentes auxiliares tales como agentes de tamponamiento y agentes de estabilización de proteína, por ejemplo, polisacáridos y similares. El kit puede incluir adicionalmente, si es necesario, otros miembros del sistema productor de señal, sistema del cual el grupo detectable es un miembro (por ejemplo, sustratos enzimáticos), agentes para reducir interferencia de fondo en un ensayo, reactivos de control, aparatos para realizar un ensayo y similares. El kit de ensayo se puede envasar de cualquier modo adecuado, típicamente con todos los elementos en un único recipiente junto con una hoja de instrucciones impresa para realizar el ensayo.

Ejemplo 1 Aislamiento de Péptidos que Contienen Fosfotirosina de Extractos de Células NIH/3T3 Activadas e Identificación de Sitios de Fosforilación Novedosos

Para descubrir sitios de fosforilación de proteína de transducción de señal relacionada con c-Src previamente desconocidos se emplearon técnicas de aislamiento con IAP para identificar péptidos que contienen fosfotirosina en extractos celulares de células NIH/3T3 que expresan una forma mutante activada de c-Src quinasa (Y527F). Se ha demostrado la actividad de c-Src aumentada en una diversidad de cánceres humanos, que incluyen de mama, colon, pancreático, ovárico, de pulmón, esofágico y neural. Véase, por ejemplo, Yeatman, anteriormente. Por tanto, la línea celular 3T3 activada por c-Src se seleccionó para imitar actividad de ruta de señalización en cánceres que implican c-Src activada.

Se purificaron péptidos de fosfotirosina de tripsina y se analizaron de extractos de línea celular 3T3 del siguiente modo. Se cultivaron células en medio DMEM suplementado con suero bovino al 10% y penicilina/estreptomicina con selección (1,5 \mug/ml de puromicina). Las células con aproximadamente el 80% de confluencia se dejaron sin nutrientes en medio sin suero durante 3 horas. Después de la aspiración completa de medio de las placas, las células se retiraron por raspado de la placa en 10 ml de tampón de lisis por 2 x 10^{8} células (suplementado con pirofosfato sódico 2,5 mM, \beta-glicerol-fosfato 1 mM) y se sonicaron.

Los lisados de células sonicadas se aclararon por centrifugación a 20.000 x g y las proteínas se redujeron con DTT hasta una concentración final de 4,1 mM y se alquilaron con yodoacetamida a 8,3 mM. Para la digestión con tripsina, los extractos de proteínas se diluyeron en HEPES 20 mM pH 8,0 hasta una concentración final de urea 2 M y se añadió TLCK-tripsina inmovilizado (Pierce) a 1-2,5 ml de perlas (200 unidades TAME de tripsina/ml) por 10^{9} células. La digestión se realizó durante 1-2 días a temperatura ambiente.

Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) a los productos de digestión de proteína hasta una concentración final del 1%, se eliminó el precipitado por centrifugación y los productos de digestión se cargaron en columnas Sep-Pak C_{18} (Waters) equilibradas con TFA al 0,1%. Se usó un volumen de columna de 0,7-1,0 ml por 2 x 10^{8} células. Las columnas se lavaron con 15 volúmenes de TFA al 0,1%, seguido de 4 volúmenes de acetonitrilo al 5% (MeCN) en TFA al 0,1%. La fracción de péptido I se obtuvo eluyendo las columnas con 2 volúmenes cada uno de MeCN al 8, 12 y 15% en TFA al 0,1% y combinando los eluatos. Las fracciones II y III eran una combinación de eluatos después de eluir las columnas con MeCN al 18, 22, 25% en TFA al 0,1% y con MeCN al 30, 35, 40% en TFA al 0,1%, respectivamente. Todas las fracciones de péptidos se liofilizaron.

Los péptidos de cada fracción correspondiente a 2 x 10^{8} células se disolvieron en 1 ml de tampón IAP (Tris 20 mM/HCl o MOPS 50 mM pH 7,2, fosfato sódico 10 mM, NaCl 50 mM) y el material insoluble (principalmente en fracciones de péptido III) se eliminó por centrifugación. Se realizó IAP para cada fracción de péptido por separado. El anticuerpo monoclonal de fosfotirosina P-Tyr-100 (Cell Signaling Technology, Inc. número de catálogo 9411) se acopló a 4 mg/ml de perlas con agarosa-proteína G (Roche). Se añadió anticuerpo inmovilizado (15 \mul, 60 \mug) como suspensión 1:1 en tampón IAP a 1 ml de cada fracción de péptido y la mezcla se incubó durante una noche a 4ºC con rotación cuidadosa. Las perlas de anticuerpo inmovilizado se lavaron tres veces con 1 ml de tampón IAP y dos veces con 1 ml de agua, todo a 4ºC. Los péptidos se eluyeron de las perlas por incubación con 75 \mul de TFA al 0,1% a temperatura ambiente durante 10 min.

Análisis por Espectrometría de Masas MALDI-TOF

Se aplicó una capa fina de matriz de ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico (ACHA) a una diana MALDI de 384 puntos Bruker dispersando 5 \mul de una solución saturada en MeCN/agua (2/1 v/v) a lo largo de una fila entera de puntos sobre la diana; el secado tuvo lugar en 2-5 s. El eluato de IAP (10 \mul) se cargó en una C-18 Zip Tip de 0,2 \mul (Millipore), que se después se lavó con ácido fórmico al 5%. El péptido se eluyó con 1 ml de ACHA 10 mg/ml en metanol al 60%, ácido fórmico al 5% en la diana MALDI que contenía la capa fina de matriz. Las muestras se analizaron en un instrumento Bruker BiFlex III MALDI-TOF en modo de ión positivo.

Análisis por Espectrometría de Masas EM/EM-CL

40 \mul del eluato IAP se purificaron por puntas de Stage de 0,2 \mul. Los péptidos se eluyeron de las microcolumnas con 1 \mul de MeCN al 40%, TFA al 0,1% (fracciones I y II) o 1 \mul de MecN al 60%, TFA al 0,1% (fracción III) en 7,6 \mul de ácido acético al 0,4%/ácido heptafluorobutírico al 0,005%. Esta muestra se cargó en una columna capilar FicoFrit de 10 cm x 75 \mum (New Objective) llena de resina de fase inversa Magic C18 AQ (Michrom Bioresources) usando un automuestreador Famos con una válvula de inyección de muestra inerte (Dionex). Después, la columna se desarrolló con un gradiente lineal durante 45 min de acetonitrilo suministrado a 200 nl/min (Ultimate, Dionex), y se recogieron espectros de masas en tándem de un modo dependiente de los datos con un espectrómetro de masas de captura de iones de LCQ Deck XP Plus esencialmente como se ha descrito por Gygi et al., anteriormente.

Análisis & Asignaciones de Base de Datos

Los espectros de EM/EM se evaluaron usando TurboSequest en el programa Sequest Browser (v. 27, rev. 12) suministrado como parte de BioWorks 3.0 (ThermoFinnigan). Se extrajeron espectros individuales de EM/EM del archivo de datos sin procesar mediante el uso del programa de Sequest Browser CreateData, con los siguientes ajustes: PM inferior, 700; PM superior, 4.500; número mínimo de iones, 20; TIC mínimo, 4 x 10^{5}; y estado de carga de precursor, no especificado. Los espectros se extrajeron del comienzo del archivo de datos sin procesar antes de la inyección de muestra al final del gradiente de elución. Los programas IonQuest y VuDta no se usaron para seleccionar adicionalmente espectros EM/EM para análisis Sequest. Los espectros EM/EM se evaluaron con los siguientes parámetros TurboSequest: tolerancia de masa de péptido, 2,4; tolerancia de ión de fragmento, 0,0; número máximo de aminoácidos diferenciales por modificación, 4; precursor de tipo de masa, promedio; fragmento de tipo de masa, promedio; número máximo de sitios de escisión internos, 10; pérdidas neutras de agua y amonio de iones b e y se consideraron en los análisis de correlación. La enzima proteolítica se especificó excepto para espectros recogidos de productos de digestión con elastasa.

Las búsquedas se realizaron frente a la base de datos de proteína humana NCBI (para todos los demás estudios) (publicada el 29 de abril de 2003 y que contiene 37.490 secuencias de proteína). La carboxamidometilación de cisteína se especificó como modificación estática y se permitió la fosforilación como una modificación variable en restos de serina, treonina y tirosina o solamente en restos de tirosina. Se determinó que la restricción de fosforilación a restos de tirosina tenía poco efecto sobre el número de sitios de fosforilación asignados.

En proteómica es deseable validar identificaciones de proteína basadas solamente en la observación de un único péptido en un resultado experimental, para indicar que la proteína, de hecho, está presente en una muestra. Esto ha conducido al desarrollo de métodos estadísticos para validar asignaciones de péptidos que no están afectados de forma universalmente y directrices para la publicación de resultados de identificación de proteína y péptido (véase Carr et al. Mol Cell Proteomics 3: 531-533 (2004)) que se siguieron en este Ejemplo. Sin embargo, debido a que la estrategia de inmunoafinidad separa péptidos fosforilados de péptidos no fosforilados, la observación de solamente un fosfopéptido de una proteína es un resultado común, ya que muchas proteínas fosforiladas tienen solamente un sitio fosforilado en tirosina. Por esta razón, es apropiado usar criterios adicionales para validar las asignaciones de fosfopéptidos. Las asignaciones probablemente serán correctas si se cumple cualquiera de estos criterios adicionales (i) la misma secuencia se asigna a iones de co-elución con diferentes estados de carga, ya que el espectro de EM/EM cambia de forma marcada con el estado de carga; (ii) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencia peptídica debido a que la secuencia se solapa por proteólisis incompleta o uso de proteasas diferentes de tripsina; (iii) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencia peptídica debido a isoformas de proteína homólogas pero no idénticas; (iv) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencia peptídica debido a proteínas homólogos pero no idénticas entre especies; y (v) sitios validados por análisis EM/EM de fosfopéptidos sintéticos correspondientes a secuencias asignadas, ya que el espectrómetro de masas de captura de iones produce espectros EM/EM altamente reproducibles. El último criterio se emplea de forma rutinaria para confirmar asignaciones de sitio novedosos de interés particular.

Todos los espectros y todas las asignaciones de secuencias realizadas por Sequest se importaron a una base de datos relacional. Las secuencias asignadas se aceptaron o rechazaron siguiendo un proceso conservativo, de dos etapas. En la primera etapa, un subconjunto de asignaciones de secuencia de alta puntuación se seleccionó filtrando por valores XCorr de al menos 1,5 para un estado de carga de +1, 2,2 para +2, y 3,3 para +3, dejando un valor de RSp máximo de 10. Las asignaciones en este subconjunto se rechazaron si se cumplía cualquiera de los siguientes criterios: (i) el espectro contenía al menos un pico principal (al menos el 10% tan intenso como el ión más intenso en el espectro) que no se podría mapear a la secuencia asignada como un ión a, b o y, como un ión que surge de pérdida neutra de agua o amonio de un ión b o y o como un ión múltiplemente protonado; (ii) el espectro no contenía ninguna serie de iones b o y equivalente a al menos seis restos no interrumpidos; o (iii) la secuencia no se observó al menos cinco veces en todos los estudios realizados (excepto por secuencias solapantes debido a proteólisis incompleta o el uso de proteasas diferentes a tripsina). En la segunda etapa, las asignaciones con puntuaciones por debajo del límite se aceptaron si el espectro de puntuación baja mostraba un alto grado de similitud con un espectro de alta puntuación recogido en otro estudio, que simula una estrategia de búsqueda en genoteca de referencia verdadera. Todos los espectros que confirman la lista final de 102 secuencias asignadas enumeradas en la Tabla 1/Figura 2 en ese documento se revisaron por al menos tres personas para establecer su credibilidad.

Ejemplo 2 Producción de Anticuerpos Policlonales Fosfo-específicos para la Detección de Fosforilación de Proteína de Señalización relacionada con c-Src

Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src solamente cuando está fosforilada en el sitio de fosforilación respectivo descrito en este documento (véase la Tabla 1) se producen de acuerdo con métodos convencionales construyendo en primer lugar un antígeno de péptido sintético que comprende la secuencia de sitio de fosforilación e inmunizando después un animal para generar anticuerpos contra el antígeno, como se describe con más detalle más adelante. Más adelante se proporciona la producción de anticuerpos policlonales ilustrativos.

A. Shb (tirosina 113)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, RAMCRLDy*CGGGGGG (SEC ID Nº 28) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 113 en la proteína Shb humana (véase Fila 29 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Después, este péptido se acopla a KLH y se usa para inmunizar animales para producir (y posteriormente explorar) anticuerpos policlonales de Shb (tyr1134) fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Exploración más adelante.

B. Rab7 (tirosina 183)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, QETEVELy*NEFPEPI (SEC ID Nº 64) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 183 en la proteína Rab7 humana (véase Fila 65 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Después, este péptido se acopla a KLH y se usa para inmunizar animales para producir (y posteriormente explorar) anticuerpos policlonales de Rab7 (tyr183) fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Exploración más adelante.

C. Cortactina (tirosina 215)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, KSAVGFEy*QGKTEKH (SEC ID Nº 58) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 215 en proteína Cortactina humana (véase la Fila 59 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Después, este péptido se acopla a KLH y se usa para inmunizar animales para producir (y posteriormente explorar) anticuerpos policlonales de Cortactina (tyr215) fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Exploración más adelante.

Inmunización/Exploración

Un antígeno de fosfo-péptido sintético como se ha descrito anteriormente en A-C se acopla a KLH y a conejos se inyecta por vía intradérmica (ID) en el lomo antígeno en adyuvante completo de Freund (500 \mug de antígeno por conejo). Los conejos se refuerzan con el mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund (250 \mug de antígeno por conejo) cada tres semanas. Después del quinto refuerzo se recoge sangre. Los sueros se purifican por cromatografía de afinidad en Proteína A mediante métodos convencionales (véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, anteriormente). Las inmunoglobulinas eluídas se cargan adicionalmente en una columna Knotes de resina para antígeno de péptido sintético no fosforilado para extraer anticuerpos que se unen a la forma no fosforilada del sitio de fosforilación. La fracción de flujo continuo se recoge y aplica a una columna de resina de antígeno de fosfo-péptido sintético para asilar anticuerpos que se unen a la forma fosforilada del sitio. Después de lavar exhaustivamente la columna, los anticuerpos unidos (es decir, anticuerpos que se unen a un péptido fosforilado como se ha descrito anteriormente en A-C, pero que no se unen a la forma no fosforilada del péptido, se eluyen y mantienen en tampón de almacenamiento de anticuerpo.

Después, el anticuerpo aislado se ensaya para fosfo-especificidad usando un ensayo de transferencia de Western que usa una línea celular apropiada que expresa (o sobreexpresa) fosfoproteína diana (es decir, Shb, Rab7 o Cortactina fosforilada, por ejemplo, células NIH/3T. Las células se cultivan en DMEM suplementado con FCS al 10% y 5 U/ml de IL-3. Antes de la estimulación, las células se dejan sin nutrientes en medio de DMEM sin suero durante 4 horas. Después, las células se estimulan con ligando (por ejemplo 50 ng/ml) durante 5 minutos. Las células se recogen, lavan con PBS y se lisan directamente en tampón de lisis celular. La concentración de proteína de los lisados celulares se mide después. El tampón de carga se añade al lisado celular y la mezcla se lleva a ebullición a 100ºC durante 5 minutos. Después se añaden 20 \mul (10 \mug de proteína) de muestra a gel de SDS-PAGE al 7,5%.

Se puede realizar una transferencia de Western convencional de acuerdo con el Protocolo de Inmunotransferencia expuesto en el CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC. Catálogo 2003-04, pág. 390. El anticuerpo fosfo-específico aislado se usa a dilución 1:1000. La especificidad del sitio de fosforilación del anticuerpo se mostrará por la unión de solamente la forma fosforilada de la proteína diana. El anticuerpo policlonal fosfo-específico aislado no reconoce la proteína diana cuando no está fosforilada en el sitio de fosforilación apropiado en las células no estimuladas (por ejemplo, Shb no está unida cuando no está fosforilada en la tirosina 113).

Para confirmar la especificidad del anticuerpo aislado se preparan diferentes lisados celulares que contienen diversas proteínas de transducción de señal fosforiladas diferentes a la proteína diana. El ensayo de transferencia de Western se realiza de nuevo usando estos lisados celulares. Se usa el anticuerpo policlonal fosfo-específico aislado como se ha descrito anteriormente (dilución 1:1000) para ensayar reactividad con las diferentes proteínas no diana fosforiladas en membrana de transferencia de Western. El anticuerpo fosfo-específico no tiene reacción cruzada significativa con otras proteínas de transducción de señal fosforiladas, aunque ocasionalmente se puede observar una ligera unión a un sitio de fosforilación altamente homólogo en otra proteína. En tal caso, el anticuerpo se puede purificar adicionalmente usando cromatografía de afinidad o la inmunorreactividad específica se puede clonar por tecnología de hibridoma de conejo.

Ejemplo 3 Producción de Anticuerpos Monoclonales Fosfo-específicos para la Detección de Fosforilación de Proteína de Señalización Relacionada con c-Src

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src solamente cuando está fosforilada en el sitio de fosforilación respectivo descrito en este documento (véase la Tabla 1) se producen de acuerdo con métodos convencionales construyendo en primer lugar un antígeno peptídico sintético que comprende la secuencia de sitio de fosforilación e inmunizando después un animal para generar anticuerpos contra el antígeno y recogiendo esplenocitos de tales animales para producir hibridomas de fusión, como se describe con más detalle más adelante. Más adelante se proporciona la producción de anticuerpos monoclonales ilustrativos.

A. eIF4H (tirosina 45)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, TEPPYTAy*VGNLPFN (SEC ID Nº 94) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 45 en la proteína elF4H humana (véase Fila 95 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Después, este péptido se acopla a KLH y se usa para inmunizar animales y recoger esplenocitos para generación (y posterior exploración) de los anticuerpos eIF4H (tyr45) monoclonales fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Fusión/Exploración más adelante.

B. PTP-delta (tirosina 677)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, QLEKWTEy*RITVTAH (SEC ID Nº 84) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 677 en PTP-delta fosfata humana (véase Fila 85 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Después, este péptido se acopla a KLH y se usa para inmunizar animales y recoger esplenocitos para generación (y posterior exploración) de anticuerpos PTP-delta (tyr677) monoclonales fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Fusión/Exploración más adelante.

C. Dinamina-1 (tirosina 354)

Un antígeno de fosfo-péptido de 15 aminoácidos, SGDQIDTy*ELSGGAR (SEC ID Nº 102) (donde y* = fosfotirosina), que se corresponde al sitio de fosforilación en tirosina 354 en la proteína Dinamina-1 humana (véase Fila 103 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, anteriormente; Merrifield, anteriormente. Este péptido se acopla después a KLH y se usa para inmunizar animales y recoger esplenocitos para generación (y posterior exploración) de anticuerpos de Dinamina-1 (tyr354) monoclonales fosfo-específicos como se describe en Inmunización/Fusión/Exploración más adelante.

Inmunización/Fusión/Exploración

Un antígeno de fosfo-péptido sintético como se ha descrito anteriormente en A-C se acopla a KLH y a ratones BALB/C se inyecta por vía intradérmica (ID) en el lomo antígeno en adyuvante completo de Freund (50 \mug de antígeno por ratón). Los ratones se refuerzan con el mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund (25 \mug de antígeno por ratón) cada tres semanas. Después del quinto refuerzo, los animales se sacrifican y se recogen los bazos.

Los esplenocitos recogidos se fusionan con células de compañero de fusión de mieloma de ratón SP2/0 de acuerdo con el protocolo convencional de Kohler y Milstein (1975). Las colonias que se originan a partir de la fusión se exploran por ELISA para reactividad a las formas de fosfo-péptido y péptido no fosfo del antígeno y mediante análisis de transferencia Western (como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1). Las colonias que se observó que eran positivas por ELISA al fosfo-péptido aunque negativas al péptido no fosfo se caracterizaron adicionalmente por análisis de transferencia de Western. Las colonias que se observó que eran positivas por análisis de transferencia de Western se subclonaron por dilución limitada. Se produce ascitis en ratón a partir de un único clon obtenido por subclonación y se ensaya para fosfo-especificidad (frente al antígeno de fosfo-péptido elF4H, PTP-delta o Dinamina-1, como puede ser el caso con ELISA.). Los clones identificados como positivos en análisis de transferencia de Western usando sobrenadante de cultivo celular como que tenían fosfo-especificidad, como se indica por una banda intensa en el carril inducido y una banda débil en el carril no inducido de la transferencia, se aíslan y subclonan como clones que producen anticuerpos monoclonales con la especificidad deseada.

El líquido ascítico de clones aislados se puede ensayar adicionalmente por análisis de transferencia de Western. El líquido ascítico debe producir resultados similares en análisis de transferencia de Western como se ha observado previamente con el sobrenadante de cultivo celular, indicando fosfo-especificidad frente a la diana fosforilada (por ejemplo, elF4H fosforilada en tirosina 45).

Ejemplo 4 Producción y Uso de Péptidos AQUA para la Cuantificación de Fosforilación de Proteína de Señalización Relacionada con c-Src

Se producen péptidos marcados con isótopo pesado (péptidos AQUA (patrones internos)) para la detección y cuantificación de una proteína de transducción de señal relacionada con c-Src solamente cuando está fosforilada en el respectivo sitio de fosforilación descrito en este documento (véase la Tabla 1) de acuerdo con la metodología AQUA convencional (véase Gygi et al., Gerber et al., anteriormente) construyendo en primer lugar un patrón de péptido sintético correspondiente a la secuencia de sitio de fosforilación e incorporando un marcador de isótopo pesado. Posteriormente, el distintivo de EM^{n} y MRS-CL del patrón de péptido se valida y el péptido AQUA se usa para cuantificar el péptido nativo en una muestra biológica, tal como un extracto celular digerido. A continuación se proporcionan la producción y el uso de péptidos AQUA ilustrativos.

A. DAB2 (tirosina 342)

Un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación en tirosina 342 en la proteína DAB2 humana, PLNVDTDy*FGQQFDQ (donde y* = fosfotirosina), (véase la Fila 16 en la Tabla 1 (SEC ID Nº 15)), pero que incorpora leucina marcada con ^{14}C/^{15}N (indicada por L en negrita) se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, anteriormente) como se describe con más detalle más adelante en Síntesis & Distintivo de EM/EM. Después, el péptido AQUA DAB2 (tyr342) se añade a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de DAB2 (tyr342) fosforilada en la muestra, como se describe con más detalle más adelante en Análisis & Cuantificación.

B. NEDD5 (tirosina 17)

Un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación en tirosina 17 en la proteína NEDD5 humana, INPETPGy*VGFANLP (donde y* = fosfotirosina), (véase la Fila 42 en la Tabla 1 (SEC ID Nº 41)), pero que incorpora prolina marcada con ^{14}C/^{15}N (indicada por P en negrita) se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, anteriormente) como se describe con más detalle más adelante en Síntesis & Distintivo de EM/EM. Después, el péptido AQUA NDD5 (tyr17) se añade a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de NDD5 (tyr17) fosforilada en la muestra, como se describe con más detalle más adelante en Análisis & Cuantificación.

\newpage

C. PL10 (tirosina 67)

Un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación en tirosina 67 en la proteína Helicasa PL10 humana, WSKDKDAy*SSFGSRS (donde y* = fosfotirosina), (véase la Fila 76 en la Tabla 1 (SEC ID Nº 75)), pero que incorpora fenilalanina marcada con ^{14}C/^{15}N (indicada por F en negrita) se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, anteriormente) como se describe con más detalle más adelante en Síntesis & Distintivo de EM/EM. Después, el péptido AQUA PL10 (tyr67) se añade a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de PL10 (tyr67) fosforilada en la muestra, como se describe con más detalle más adelante en Análisis & Cuantificación.

D. P130Cas (tirosina 228)

Un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación en tirosina 228 en la proteína P130Cas humana, RVGQGYVy*EAAQTEQ (donde y* = fosfotirosina), (véase la Fila 109 en la Tabla 1) (SEC ID Nº 108), pero que incorpora valina marcada con ^{14}C/^{15}N (indicada por V en negrita) se construye de acuerdo con técnicas de síntesis convencionales usando, por ejemplo, un sintetizador de péptidos Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, anteriormente) como se describe con más detalle más adelante en Síntesis & Distintivo de EM/EM. Después, el péptido AQUA P130Cas (tyr228) se añade a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de P130Cas (tyr228) fosforilada en la muestra, como se describe con más detalle más adelante en Análisis & Cuantificación.

Síntesis & Espectros de EM/EM

Se pueden obtener monómeros de aminoácidos derivatizados con fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en AnaSpec (San Jose, CA). Los monómeros de isótopo estable derivatizados con Fmoc que contienen un ^{15}N y de cinco a nueve átomos de ^{13}C se pueden obtener en Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA). Se pueden obtener resinas Wang precargadas en Applied Biosystems. Las escalas de síntesis pueden variar de 5 a 25 \mumol. Los aminoácidos se activan in situ con 1-H-benzotriazolio, 1-bis(dimetilamino) metileno]-hexafluorofosfato(1-),3-óxido-1-hidroxibenzotriazol hidrato y se acoplan con un exceso molar de 5 veces con respecto al péptido. Cada ciclo de acoplamiento está seguido de recubrimiento con anhídrido acético para evitar la acumulación de subproductos de péptido de deleción de un resto. Después la síntesis, las resinas con péptidos se tratan con una solución de escisión de ácido trifluoroacético (TFA)-agua que contiene un eliminador convencional, y los péptidos se precipitan por adición a éter frío. Los péptidos (es decir, un péptido AQUA deseado descrito anteriormente en A-D) se purifican por HPLC C18 de fase inversa usando gradientes convencionales de TFA/acetonitrilo y se caracterizan por EM de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (Biflex III, Bruker Daltonics, Billerica, MA) y captura de iones (ThermoFinnigan, LCQ DecaXP).

Los espectros de EM/EM para cada péptido AQUA deben mostrar un fuerte pico de ión de tipo y como el ión de fragmento más intenso que es adecuado para el uso en un control/análisis por MRS. Se preparan columnas microcapilares de fase inversa (0,1 \ring{A}\sim 150-220 mm) de acuerdo con métodos convencionales. Se puede usar un cromatógrafo líquido Agi lent 1100 para desarrollar y suministrar un gradiente de disolvente [ácido acético al 0,4%/ácido heptafluorobutírico al 0,005% (HFBA)/metanol al 7% y ácido acético al 0,4%/HFBA al 0,005%/metanol al 65%/acetonitrilo al 35%] a la columna microcapilar mediante un divisor de flujo. Después, las muestras se ponen directamente cargadas sobre la columna microcapilar mediante el uso de un automuestreador capilar inerte FAMOS (LC Packings, San Francisco) después de la división de flujo. Los péptidos se reconstituyen en ácido acético al 6%/TFA al 0,01% antes de la inyección.

Análisis & Cuantificación

La proteína diana (por ejemplo, una proteína fosforilada de los anteriores A-D) en una muestra biológica se cuantifica usando un péptido AQUA validado (como se ha descrito anteriormente). Después, el método de IAP se aplica a la mezcla compleja de péptidos obtenidos de escisión proteolítica de extractos celulares en bruto a los que se han añadido los péptidos AQUA.

Después se realiza MRS-CL de toda la muestra. Se puede realizar EM/EM mediante el uso de un espectrómetro de masas ThermoFinnigan (San Jose, CA) (captura de iones LCQ DecaXP o TSQ Quantum triple quadrupole). En el DecaXP, los iones precursores se aíslan con una anchura de 1,6 m/z, limitándose el tiempo de inyección de iones a 150 ms por microexploración, promediándose dos microexploraciones por péptido y con un ajuste de AGC de 1 x 10^{8}; en el Quantum; Q1 se mantiene en 0,4 y Q3 en 0,8 m/z con un tiempo de exploración de 200 ms por péptido. En ambos instrumentos, el analito y el patrón interno se analizan de forma alterna dentro de una ventana de retención de fase inversa conocida previamente; los pares bien separados de patrón interno y analito se analizan en segmentos de retención separados para mejorar el coeficiente de utilización. Los datos se procesan integrando los picos apropiados en un cromatograma iónico extraído (60,15 m/z del fragmento controlado) del patrón nativo e interno, seguido de cálculo de la proporción de áreas máximas multiplicadas por la cantidad absoluta de patrón interno (por ejemplo,
500 fmol).

<110> Cell Signaling Technology, Inc.

\hskip1cm

MORITZ, Albrecht

\hskip1cm

RUSH, John

\hskip1cm

LEE, Kimberly

\hskip1cm

POLAKIEWICZ, Roberto

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<120> REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN DE FOSFORILACIÓN DE PROTEÍNA EN RUTAS DE SEÑALIZACIÓN DE C-SRC

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<130> CST-216 PCT

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<140> Todavía no asignada

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<141> 12-08-2004

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<150> US 10/777.893

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<151> 12-02-2004

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<160> 102

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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9

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<213> Homo sapiens

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 2

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10

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<213> Homo sapiens

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 3

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11

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<210> 4

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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13

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 6

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14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 8

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 9

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17

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 10

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18

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 11

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19

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<212> PRT

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 12

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20

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<210> 13

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 13

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 14

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<210> 16

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

28

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\newpage

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<400> 21

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

31

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<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

33

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

34

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<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

35

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\hskip1cm

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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37

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

38

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<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

39

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<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

43

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

44

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<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

45

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<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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46

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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47

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

48

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

49

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<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

51

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

52

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

54

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\hskip1cm

55

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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<400> 48

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

67

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8).. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (88)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8).. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

85

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8).. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

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<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\hskip1cm

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\hskip1cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN; tirosina en posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\hskip1cm

110

Claims (5)

1. Un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en rutas de señalización de c-Src quinasa, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar la proteína de señalización relacionada con c-Src para Rab 7 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 183:

(i)

un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a dicha proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina 183, comprendida dentro de la secuencia de sitio de fosforilación SEC ID Nº: 64, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o

(ii)

un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de dicha proteína, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia de sitio de fosforilación SEC ID Nº: 64, que comprende la tirosina fosforilada 183.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un anticuerpo específico de sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a la proteína de señalización relacionada con c-Src humana Rab7 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 183, comprendida dentro de la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina.

3. Una línea celular inmortalizada que produce el anticuerpo de la reivindicación 2.

4. La línea celular de la reivindicación 3, en la que dicha línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

5. Un péptido marcado con isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de la proteína de señalización relacionada con c-Src humana Rab7, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia de péptido fosforilable SEC ID Nº: 64, secuencia que comprende la tirosina fosforilable 183.