JP2021528649A - 試料中のキナーゼ活性のモニタリング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は試料中のキナーゼの活性または活性化のモニタリング方法に関する。該方法は、a)キナーゼを含む試料を提供するステップと、b)試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップa)で提供したキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、c)試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、d)液体クロマトグラフィー−質量分光法によってステップc)で得られた試料を分析するステップと、およびe)ステップa)で提供したキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップe)の検出を行う。
【選択図】図4B
【選択図】図4B
Description
本発明は、試料中のキナーゼ活性のモニタリング方法に関する。
タンパク質キナーゼは、細胞連絡の中枢の役割を果たし、異常なキナーゼ活性は、癌から糖尿病や心血管疾患にわたる多様な障害と関係している。キナーゼは細胞連絡の主要調節因子であり、それらの阻害剤は、標的治療および精密医療において中心的な役割を果たす。したがって、包括的なキナーゼ動態を調べることは、細胞機能の理解および合理的な薬剤開発の進行にとって重要である。キナーゼのこの明確な関連性は、カイノーム活性状態を評価する多くの試みを引き起こしている。しかしながら、それらの多くはかなりの短所に悩まされている。
その最も素朴な用途では、キナーゼの活性は、ショットガンプロテオミクス実験で得られるそれらの存在度から抽出される。多くのタンパク質キナーゼの存在量が低いことから、キナーゼ特異的な濃縮プロトコールが使用されている。該プロトコールは主に、固定化した広い特異性キナーゼ阻害剤および/またはATP模倣物からなる。この種類のアプローチは実質的なキナーゼ濃縮をもたらすが、感度のコストで、相当な投入原料を必要とし、それによって、アプローチが細胞株に基づくモデルシステムに限定される。重要なことは、キナーゼ存在度の評価自体がキナーゼ活性を反映するのではなく、これまでに主にホスホプロテオミクスデータから主に抽出されていることである。ここで、ホスホプロテオミクスデータセットにおける過大評価または過小評価された配列モチーフのアライメントは、既知のキナーゼコンセンサス配列に関係している。しかしながら、この方法は、検出されたリン酸化部位の多くが機能性の観点から特徴付けられておらず、多くのキナーゼに対する基質特異性が冗長であるか、または単に道であることから、知識の大きなギャップを被る。
上記のように、今までいずれかのキナーゼタンパク質発現レベルまたは基質リン酸化のデータから主に抽出されていたキナーゼ活性の直接モニタリングが切迫して必要とされている。
本発明は、試料中のキナーゼ活性または活性化のモニタリング方法を提供する。該方法は、
a)キナーゼを含む試料を提供するステップと、
b)試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップa)で提供したキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、
c)試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、
d)ステップc)で得られた試料を液体クロマトグラフィー−質量分光法(LC−MS)によって分析するステップと、
e)ステップa)で提供したキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、
キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップe)の検出を行う。
a)キナーゼを含む試料を提供するステップと、
b)試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップa)で提供したキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、
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d)ステップc)で得られた試料を液体クロマトグラフィー−質量分光法(LC−MS)によって分析するステップと、
e)ステップa)で提供したキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、
キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップe)の検出を行う。
キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドを同定し、検出するために、本発明の方法は、
i)モニターすべきキナーゼを決定するステップと、
ii)目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドを決定するステップと、
iii)ステップii)で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドのみステップe)で検出されるように質量分光計の設定を調節するステップと、を含む。本発明の方法のインキュベーションステップb)の間に別のプロテアーゼが使用される場合よりも、1つのプロテアーゼとの試料のインキュベーションが、異なる目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドをもたらすことに注目すべきである。結果として、ステップii)で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドが使用したプロテアーゼに基づいて変動し得る。その結果として、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドのみ検出するために、プロテアーゼの選択がステップiii)の質量分光計の異なる設定ももたらす。すなわち、質量分光計を使用して、目的のそれらのタンパク質分解ペプチドのみ、すなわち目的のキナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドのみを同定する(選択的に選択する)。また、決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの数が異なり得ることに注目すべきである。一方で、目的のキナーゼの活性または活性化のいずれかを検出するために、複数のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドが決定される。他方で、目的のキナーゼの特異的な関連する活性または活性化のみを検出するために、例えば特定の疾患のシグナリング経路と関連している特異的なタンパク質分解ペプチドの検出のために、プロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの高選択的なサブセットが決定される。ステップii)のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの決定が、質量分光計の設定を調節するために使用される参照リストをもたらし得ることにさらに注目すべきである。すなわち、目的のプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドの同定(選択的な選択)がステップii)で得られた参照リストに基づいている。目的のタンパク質分解ペプチドの決定が、インキュベーションステップの間に使用されるプロテアーゼと組み合わせて目的のキナーゼ(すなわちモニターすべきキナーゼ)に基づいて行われることにさらに注目すべきである。
i)モニターすべきキナーゼを決定するステップと、
ii)目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドを決定するステップと、
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本発明の方法を提供することによって、リン酸化部位存在度とキナーゼ活性との間の直接の結びつけを可能にすることができることを見出した。キナーゼの活性化領域が、リン酸化される際に大部分のキナーゼを活性化する触媒ループの近くに位置する柔軟なループである。また、キナーゼの活性化領域は、t−ループとして既知であり、P+1ループと呼ばれる活性化ループの後の領域と共に、Asp−Phe−Gly(DFG)および(Ala)−prO−Glu((A)PE)モチーフに隣接した保存領域を含む。キナーゼの「保存領域」、「保存ドメイン」または「活性化領域」はキナーゼの分野で周知の用語であることに注目すべきである。例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI)は、多数のキナーゼの活性化領域を同定し、決定するいくつかのツール(例えば保存ドメインデータベースを介して)を提供する。そのようなデータベースによって提供されている情報に基づいて、本発明者らは456個のキナーゼの活性化領域を同定できた。
本発明の方法を提供することによって、これらのキナーゼの多くでの活性を開始する重要なスイッチであるリン酸化と関連している活性化領域、例えばキナーゼのt−ループリン酸化をモニターすることが可能である。特に、そのような部位の機能性、それらの高い配列類似性に基づいて、多数の代役を務めたキナーゼに直接移すことができる。先行技術の方法、例えばショットガンプロテオーーム解析では、リン酸化と関連している活性化領域、特にt−ループリン酸化が、それらの低い存在度、好ましくないLC−MSの特徴およびチロシンリン酸化の高い有病率により、悪名高くも過小評価されていることを見出した。
本発明の方法は、
f)ステップe)で検出されたリン酸化を定量するステップをさらに含み得る。
f)ステップe)で検出されたリン酸化を定量するステップをさらに含み得る。
好ましくは、定量は、標的質量分光法(標的MS1(前駆体イオンスキャン)、MS2(タンデム質量分光法または断片イオンスキャン)またはMSn(タンデム質量分光法)など)による定量、(MSnのnは2より大きい整数)によって達成される。
好ましい実施形態では、キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドはキナーゼのt−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドを含む。キナーゼのt−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみステップe)の検出を行うことによって、試料の更なる再処理を必要とせずに、本発明の方法を適用する前に、キナーゼ活性または活性化をモニターできる。既に述べたように、活性化領域関連タンパク質分解ペプチドは、使用したプロテアーゼに応じて変動する。本発明の実施形態は、プロテアーゼは、トリプシン、エンドプロテアーゼGlu−C、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼAsp−Nからなる群より選択され得、それぞれ、トリプシン特異的タンパク質分解ペプチド(例えばトリプシン消化によって生じたペプチド)、Glu−C特異的タンパク質分解ペプチド、キモトリプシン特異的タンパク質分解ペプチド(例えばキモトリプシン消化によって生じたペプチド)およびAsp−N特異的タンパク質分解ペプチドを生じる。しかしながら、当業者に既知の他のプロテアーゼも本発明の方法の実施において同様に選択され得る。
ホスホペプチド濃縮は、好ましくは、Fe(III)−IMAC、Ga(III)−IMAC、Ti(IV)−IMACまたはZr(IV)−IMACなどの固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)、およびTiO2−MOACまたはZrO2−MOACなどの金属オキシド親和性クロマトグラフィー(MOAC)、からなる群より選択される。最も好ましい実施形態では、t−ループホスホペプチド濃縮は、Fe(III)−IMACを含む。Fe(III)−IMACの使用が、特に、t−ループリン酸化に対する高い特異性を有する方法をもたらしたことを見出した。
さらなる好ましい実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーを含み得、ナノ液体クロマトグラフィー、キャピラリーフロー液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーマイクロフロー液体クロマトグラフィーからなる群より選択され得る。一方、質量分光法は、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、並列反応モニタリング(PRM)および高分解能多重反応モニタリング(MRM−HR)からなる群より選択される質量分光法解析方法を含み得る。更なる質量分光法解析方法は、データ非依存型解析による質量分光法(DIAまたはSWATH(商標))および標的ペプチド定量(例えばQuanDirect(商標))からなる群より選択され得る。質量分光法解析方法の選択が利用可能な質量分光計に依存することに注目すべきである。上述した質量分光法解析方法のいずれか、すなわち標的質量分光法が、本発明の方法を行うために選択され得ることを見出した。更なる質量分光法は、タンデム質量分光法を含み得る。好ましくは、質量分光法は、四重極質量分光計、例えば三重四重極質量分光計、または飛行時間質量分光計の使用を含む。また、質量分光法は、イオントラップ質量分光計(Orbitrap質量分光計など)、または線形イオントラップ質量分光計の使用を含み得る。三重四重極質量分光計でナノLCとSRMモードのMS/MSとを組み合わせることによって、システム全体のt−ループリン酸化をキナーゼ活性のためのプローブとしてモニターするために、非常に特異的な方法が提供されることを見出した。
本発明の方法に基づいて、包括的なヒトカイノームのおおよそ33%を示す178個のタンパク質キナーゼでのt−ループリン酸化アッセイが提供される。技術の強さは、限定した開始材料から実質的なカイノーム範囲を可能にする感度(t−ループホスホペプチド濃縮およびLC−MS)とスループットとの組み合わせにある。そのような高感度の範囲は、(自動化した)プラットフォームを並行したホスホペプチド濃縮の96個までの試料と用いることによって、さらに促進され得る。合計で74個のt−ループリン酸化が、多数の細胞タイプ(原発および患者由来)にわたる58個のキナーゼについて検出された。標的キナーゼは、MET、ABL、SRC、BTK、JAK3およびKITなどのFDAが承認した阻害剤と臨床的に関連した多数のキナーゼを含んでいた(図1Aおよび図1Bも参照)。種々の細胞株にわたる検出されたt−ループリン酸化の完全な概観を表1に記載する。トリプシン消化によって生じたペプチドの完全なリストを図6に示す。
表1 種々の細胞株の検出されたt−ループリン酸化のリスト
表1 種々の細胞株の検出されたt−ループリン酸化のリスト
更なるカイノーム範囲増加が、別のプロテアーゼの採用、試料分別または核または細胞膜などの特定の細胞区画の濃縮の採用によってもたらされ得る。
(実験)
3つの異なる細胞株、すなわちJurkat、PC9およびHekのベースラインカイノーム活性状態を、いずれの刺激もなしで分析した。これによって、3つの細胞株について52個のt−ループリン酸化部位の検出がもたらされた(図2A)。キナーゼのt−ループ配列の高度に保存された性質により、代表的なトリプシン消化によって生じたペプチドは必ずしもユニークではない。これは、例えばキナーゼファミリーメンバーMark1、Mark2、Mark3およびMark4、またはチロシンキナーゼFYN、YES1およびSRCなどの多くの場合冗長な機能を示す密接に関連したキナーゼについて、ある程度の曖昧さをもたらす。この曖昧さを対処するために、タンパク質グループ分けの原理に追随し、この調査を通じてキナーゼ群これらの例を称した。観察した52個のリン酸化部位について、これは、48個のキナーゼ群をもたらす。また、t−ループが、隣接するDFGおよび(A)PEモチーフを通じて明らかに定められる一方で、リン酸化が依然として種々のまたは多数の残基で生じ得る。一方、多数のキナーゼについて活性化残基が明らかに確立され、その他については、t−ループ内のこれらの部位は知られていない。したがって、未知の事例について、種々のリン酸化部位異性体のSRMアッセイの開発をもたらす多数の可能性を考慮した。
3つの異なる細胞株、すなわちJurkat、PC9およびHekのベースラインカイノーム活性状態を、いずれの刺激もなしで分析した。これによって、3つの細胞株について52個のt−ループリン酸化部位の検出がもたらされた(図2A)。キナーゼのt−ループ配列の高度に保存された性質により、代表的なトリプシン消化によって生じたペプチドは必ずしもユニークではない。これは、例えばキナーゼファミリーメンバーMark1、Mark2、Mark3およびMark4、またはチロシンキナーゼFYN、YES1およびSRCなどの多くの場合冗長な機能を示す密接に関連したキナーゼについて、ある程度の曖昧さをもたらす。この曖昧さを対処するために、タンパク質グループ分けの原理に追随し、この調査を通じてキナーゼ群これらの例を称した。観察した52個のリン酸化部位について、これは、48個のキナーゼ群をもたらす。また、t−ループが、隣接するDFGおよび(A)PEモチーフを通じて明らかに定められる一方で、リン酸化が依然として種々のまたは多数の残基で生じ得る。一方、多数のキナーゼについて活性化残基が明らかに確立され、その他については、t−ループ内のこれらの部位は知られていない。したがって、未知の事例について、種々のリン酸化部位異性体のSRMアッセイの開発をもたらす多数の可能性を考慮した。
48個の検出されたキナーゼ群の大部分が、CDKおよびMAPK並びに2個の豊富なキナーゼPDK1およびGSK3などの、典型的な培養条件にて細胞を増殖するのに極めて重要な典型的なハウスキーピングキナーゼを示した。さらに、HIPK3などなどの、抗アポトーシスプロセスに関与するいくつかのキナーゼが活性状態で検出された。JurkatおよびPC9細胞の両方が、Hek細胞と比較して、Ca2+/DAG依存シグナリングの活性増加を示し、CaMK群およびPKCファミリーからのいくつかのキナーゼがそれらの活性状態で検出された。これらは、CaMK1D、PKCθ、およびキナーゼ群PKCα/PKCβ/PKCγを含んでいた。他方で、CaMKIV活性がJurkat細胞で独占的に検出された。
興味深いことに、多くのキナーゼが、細胞株依存活性プロファイルを示した。特に、T細胞を含む免疫システムと関連した細胞タイプで独占的に発現されるチロシンキナーゼZAP70など、それらのうちのいくつかは、組織特異的な様式で発現されることが知られている。したがって、ZAP70のt−ループリン酸化がJurkat細胞で独占的に検出された。
FAK、MET並びに2つのキナーゼ群EPHA3/4/5およびHCK/LYNなどの他のチロシンキナーゼは、Jurkat細胞で検出できなかった一方で、それらは、特にPC9細胞で高い活性を示した。これは、PC9でのチロシンキナーゼ活性の上昇を示し、活性化したEGFRシグナリングによる可能性が高い。特に、これらの活性化するリン酸化は、t−ループ配列内のチロシン残基で生じ、かなりの数のキナーゼでの主要な活性化を制御する。特に、チロシンキナーゼおよびMAPキナーゼは、十分な活性化のためにそれらのt−ループのチロシンリン酸化を必要とする一方で、多くの他のキナーゼでの主要な活性化部位はトレオニン残基である。
チロシンリン酸化は、特異的なホスホチロシン濃縮を前もって実施しない限り、ホスホプロテオーム解析において当然過小評価される。であることを見出した敏感なSRM分析と組み合わせたFe(III)−IMACホスホペプチド濃縮によって、チロシンt−ループリン酸化の実質的な回復がもたらされた。
FAKおよびMETの場合、PC9での測定で、t−ループ内のリン酸化部位局在化情報が得られた。
非刺激細胞のいくつかのt−ループリン酸化の検出に成功した後、カイノームの大部分が不活性(非リン酸化)状態で存在することから、方法をさらに微調整して、選択した刺激による定常状態のバックグランドからの特異的なキナーゼの活性化を明らかにした。Jurkat細胞をTNFαで8時間処理し、細胞死を増加させた。TNFαの刺激により、受容体相互作用タンパク質セリン−トレオニンキナーゼ(RIPK)がTNF受容体複合体に入り、アポトーシスを仲介する(図2B)。TNFα処理により、セリンS161でのRIPK1リン酸化が再現性よく検出され、リン酸化は非処理Jurkat細胞で検出できなかった(図2C)。
細胞死でのRIPK1のよく特徴付けられた役割にもかかわらず、細胞ライセートからのRIPK1t−ループリン酸化のMSによる直接検出が本発明の方法によって可能であることを見出した。したがって、RIPK1アッセイは、新しい堅固な読み出しをもたらして、細胞死の複雑な調節をモニターする一方で、発明者らの技術の類いまれな感度も実証する。
種々の位置異性体に存在する合計51個のペプチド配列を含む本発明の方法に基づいてアッセイを開発した。それらのうちの41個が2個の異なるアイソフォームに存在し、10個が3個の異なるアイソフォームに存在した。リン酸化部位局在化異性体の多数が逆相LCでのクロマトグラフの保持時間によって区別できないと一般に考えられているが、本発明の方法を用いて、ベースラインのクロマトグラフィーの分離が、51個の配列のうち47個についてのすべての位置異性体で示された。キナーゼDDR2の3つのリン酸化部位についての一例を図3Aに示す。リン酸化部位局在化の特異的な推移を用いることによって、別の2個のペプチド配列が、複合資料における異なるリン酸化部位局在化の明確な区別を可能にする部分的なクロマトグラフィーの分離を示した。一例は、図3Bに示すJAK3の残基Y980およびY981のチロシンリン酸化である。
主要な細胞からカイノーム動態の徹底解析を行うことによって、キナーゼ活性プロファイリングアプローチの感度が利用された。本発明の技術が血小板活性化のメカニズムを調べるのに適用された。プロテアーゼ活性化受容体1(PAR1)に結合するヘキサペプチド模倣トロンビンによって活性化した血小板を、1分間および5分間分析し、それらのキナーゼ活性プロフィールを未感作血小板と比較した。ホスホペプチド濃縮当たり300μgのタンパク質の投入量を用いることによって、25個のキナーゼ群の31個のt−ループリン酸化が検出され、定量された。活性化血小板と未感作血小板との間の比較定量分析によって、PAR1活性化によるカイノーム活性レベルの劇的な変化が明らかとなった。
図4Aは、1分間および5分間の活性化それぞれのボルケーノプロットとして定量的な違いを示す。血小板活性化は種々の細胞内シグナリング事象を伴い、その大半は、図4Bに示す共通経路に集束する。ここでは、2個のTecファミリーチロシンキナーゼBtkおよびTecでのt−ループリン酸化の検出が注目に値し、それらの両方が血小板活性化と関連している。特に、PLCγ2の主要な活性化因子としてのBtkの役割がよく確立されている一方で、Tecは、例えばX連鎖無ガンマグロブリン血症の場合など、Btkが存在しないか、または正常に機能しない場合に、より代償的な役割に関係している。ここで提示したキナーゼ活性プロファイルは、血小板活性化におけるBtkおよびTecについてこれらの必須の役割を裏付ける。
興味深いことに、キナーゼ活性化の規模および動態が、2つのTecファミリーキナーゼの間で異なっていたことを見出した。Btk活性が1分のPar1活性化によりほぼ4倍増加し、5分にて増加を維持した場合、Tecは、はるかに低い活性化を示し、時間とともに欠如し、これはBtkの主要な役割の裏付けとなる(図4C)。
下流では、刺激後の中心の集束点は、細胞内Ca2+の増加をもたらし、それによって、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ(CaMK)の活性を増加させるホスホリパーゼC(PLC)の活性化である。t−ループ内の2個の隣接したリン酸化部位の定量によって、CaMK2の活性化状態をモニターできることを見出した(T305およびT306、図4D)。リン酸化部位の両方が、1分のPAR1活性化により非常に急な山形を示し、5分後に大幅に低下した。これは、キナーゼ活性化に関与する短期間を実証する。興味深いことに、両方のリン酸化部位の特異的な動態がわずかに異なっていた。一方、T306リン酸化が1分後に10倍より多く増加し、5分後にほとんどベースラインに戻り、T305の急な山形はあまり強くなかったが、より遅い減衰を示した。これは、CaMK2 t−ループで発生する2つのリン酸化事象の動的調節を示唆する。
PLC活性の別の標的はPKCであり、PKCはp38を活性化する。PKCδ、PKCθ並びにPKCα、PKCβおよびPKCγの冗長なt−ループ配列を含むPKCファミリーメンバーのいくつかのt−ループリン酸化を定量することが可能であることを見出した。興味深いことに、それらのうちどれもいずれの有意な差異を示さなかった一方で、それらの下流の標的p38Aが非常に劇的に変化した。P38Aは、十分なキナーゼ活性のために、T179およびY181での二重リン酸化を必要とし、特に見られた状態は1分後の顕著なPar1活性化であり、この活性化は5分後に劇的に減少した(図4E)。同時に、Y181でのみリン酸化したp38Aが1分後にベースラインレベルのままであり、5分後にわずかに増加したのみであった。これは、先の研究に沿って、p38Aの急速な二重リン酸化に続いて、より遅い部分的な脱リン酸化が5分後に見られたY181単独のリン酸化の上方制御をもたらすことを示唆する。観察したPKCとp38t−ループリン酸化とを組み合わせると、PKC活性の極めて速い急伸が既に1分未満で既に消えるが、さらに下流でp38を活性化できることを示すか、またはPKC活性レベルと比較して大きな山のp38活性化のシグナル増幅を示す。
別のよく研究された細胞内Ca2+濃度増加の効果が、細胞膜への転座によるRASの活性化およびその後のMAPKカスケードの活性化である。血小板が、成長、分化または増殖する可能性がない無核細胞であることから、血小板でのMAPKカスケードの役割は十分に解明されていない。しかしながら、それは、上昇した細胞内Ca2+濃度の維持に関連する因子であると思われる。キナーゼ活性の増加がMAPKシグナリングカスケードの個別のメンバーについて示された。RAF活性のわずかな増加が1分間のPar1活性化により見られ、Erk1およびErk2の強い活性化をもたらした(図4F)。最後に、別の血小板活性化経路で機能するキナーゼについてのいくつかのt−ループリン酸化が見られた、例えばFyn、Lyn、Yes、MKK4、JNK2およびFAK2、しかしながらリン酸化の実質的な違いが見られず、これはベースライン活性の存在を示唆する。
主要な細胞でのキナーゼ活性化の効果的な分析に続いて、疾患でのキナーゼの不安定な活性を調べることへの本発明の方法の有用性を調査した。キナーゼは、特に癌において薬剤標的の主要なクラスとなっており、25個のキナーゼ標的化薬が承認されており、多数の候補が臨床評価の下にある。しかしながら、これらの候補の同定において、合成致死性評価によって、カイノームの残りに対する1つのキナーゼの阻害の(長期間の)効果が多くの場合無視される。これは、一貫して、シグナリングネットワークの適合による標的キナーゼ阻害にタイする治療耐性をもたらす。
本発明の方法の可能性を実証するために、メラノーマの後天性薬剤耐を調査した。メラノーマの大半は、BRAFの常時活性をもたらすBRAFV600E変異によって引き起こされる。初期の成功にもかかわらず、BRAF阻害剤(BRAFi)による患者の治療は、通常、後天性薬剤耐性の急速な獲得をもたらす。ここで、患者由来異種移植片から確立した治療未感作、治療感受性および耐性の腫瘍状態からの一致した患者由来メラノーマ細胞株でのt−ループリン酸化を調査した(図5A)。ここで、後天性薬剤耐性はNRASQ61K変異に基づいている。
すべての3つの状態のカイノーム活性の差異の比較によって、39個のリン酸化部位が検出され、36個のキナーゼ群のt−ループリン酸化が定量された(図5B〜5D)。
定量したキナーゼのいくつかが、治療未感作および感受性の細胞と比較して耐性細胞株での活性増加を示した。これらのキナーゼは、CaMKIV、PKCキナーゼファミリーのいくつかのメンバー(PKCδ、PKCμ/νなど)、MAPKカスケードに関連するいくつかのメンバー(p38A、Erk2、Erk4およびMKK4など)並びにMAPKエフェクターキナーゼNLKおよび細胞周期関連キナーゼCDK2/3およびChk2を含んでいた。驚いたことに、薬剤耐性細胞株において特異的に活性化したいくつかのキナーゼが、Chk2、p38AおよびErk4などの腫瘍抑制活性に主に関連していた。
キナーゼ Erk4について〆最も強い 活性化 が見られ〆、Erk4は、同様に見られたErk3と共に、活性化ループ内のチロシンドメインを欠いていることから、〆 非定型的な MAPK ファミリーに属する 〆。これまで、MK5 のみが Erk3およびErk4の両方の既知の基質である。MK5 は、p53およびFOXO3の活性化などの 腫瘍 抑制 機能 について主に知られている。しかしながら、最近の 研究は、例えば JNK活性の阻害 および 血管新生の支持によって、Erk3/Erk4/MK5 モジュールについて発がん性の 可能性がある ことも示した 〆。さらに、MK5のmRNA発現の増加は 、 転移の発達の可能性の増加に関連していた。
興味深いことに、ERK3/ERK4発現の動態は、BRAFV600Eおよび発がん性RASの両方の発現増加に関連しており、Erk3およびErk4それぞれの発現増加をもたらす。データは、BRAFV600Eの阻害が、Erk3のt−ループリン酸化の低下と並行して進み、MK5の低下を伴うことを明らかにした(図5E)。後天性薬剤耐性により、Erk3レベルが回復し、著しく、発がん性RASがErk4t−ループリン酸化を、未感作および感受性の細胞と比較して劇的に20倍超上昇させる。包括的に、これは、治療未感作細胞と比較した場合に、耐性細胞でのより高いMK5のキナーゼ活性をもたらす。結果は、メラノーマでのNRAS誘発BRAFi耐性におけるERK3/ERK4/MK5システムのあり得る興味深い役割を示し、標的腫瘍治療により変化したカイノーム活性を検出する本発明の方法の可能性を強調する。
Claims (17)
- a)キナーゼを含む試料を提供するステップと、
b)前記試料をプロテアーゼとインキュベートして、ステップa)で提供されたキナーゼをプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドに切断するステップと、
c)試料にホスホペプチド濃縮を適用するステップと、
d)ステップc)で得られた試料を液体クロマトグラフィー−質量分光法によって分析するステップと、
e)ステップa)で提供されたキナーゼのリン酸化を検出するステップと、を含み、
前記キナーゼの活性化領域と関連しているタンパク質分解ペプチドが同定される場合のみ、ステップe)の検出が行われることを特徴とする試料中のキナーゼの活性または活性化のモニタリング方法。 - i)モニターすべきキナーゼを決定するステップと、
ii)目的のキナーゼの活性化領域と関連しているプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドを決定するステップと、
iii)ステップii)で決定したプロテアーゼ特異的タンパク質分解ペプチドのみステップe)で検出するように、質量分光計の設定を調節するステップと、をさらに含む請求項1に記載の方法。 - f)ステップe)で検出されたリン酸化を定量するステップをさらに含む請求項1または2に記載の方法。
- ステップf)において、前記定量は、標的質量分光法によって達成される請求項3に記載の方法。
- ステップf)において、前記定量は、標的MS1、MS2またはMSnに基づく定量によって達成される(nは2より大きい整数)請求項3または4に記載の方法。
- 前記キナーゼの活性化領域と関連している前記タンパク質分解ペプチドは、前記キナーゼのt−ループと関連しているタンパク質分解ペプチドを含む請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、トリプシン、エンドプロテアーゼGlu−C、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼAsp−Nからなる群より選択される請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記ホスホペプチド濃縮が、Fe(III)−IMAC、Ga(III)−IMAC、Ti(IV)−IMACまたはZr(IV)−IMACなどの固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)、およびTiO2−MOACまたはZrO2−MOACなどの金属オキシド親和性クロマトグラフィー(MOAC)からなる群より選択される請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記ホスホペプチド濃縮がFe(III)−IMACを含む請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーを含む請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーが、ナノ液体クロマトグラフィー、キャピラリーフロー液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーマイクロフロー液体クロマトグラフィーからなる群より選択される請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記質量分光法が、選択反応モニタリング、多重反応モニタリング、並列反応モニタリングおよび高分解能多重反応モニタリングからなる群より選択される質量分光法解析方法を含む請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記質量分光法が、データ非依存型解析(DIA)に基づく質量分光法および標的ペプチド定量からなる群より選択される質量分光法解析方法を含む請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記質量分光法が、タンデム質量分光法を含む請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記質量分光法が、四重極質量分光計または飛行時間質量分光計の使用を含む請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記質量分光法が、Orbitrap質量分光計、または線形イオントラップ質量分光計などのイオントラップ質量分光計の使用を含む請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- ステップd)において、液体クロマトグラフィー−質量分光法が、三重四重極質量分光計での選択反応モニタリングモードにおけるMS/MSとナノ液体クロマトグラフィーとを組み合わせて使用することを含む請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
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